Optimierung der Isolation und Kultivierung primärer boviner Hepatozyten mit besonderer Berücksichtigung des Wachstumshormonrezeptors

(1)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Optimierung der Isolation und Kultivierung primärer boviner Hepatozyten mit besonderer

Berücksichtigung des Wachstumshormonrezeptors

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Stefanie Witte

Lünen

Hannover 2017

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Frau JProf. Dr. Marion Schmicke (Tierärztliche Hochschule Hannover,

Klinik für Rinder, Endokrinologisches Labor)

1. Gutachterin: Frau JProf. Dr. Marion Schmicke

2. Gutachterin: Frau Prof. Dr. Christiane Pfarrer

Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2017

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Für meine geliebten Eltern

Was wir wissen, ist ein Tropfen, was wir nicht wissen, ein Ozean.

Isaac Newton

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Teile dieser Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt:

• S. Witte, Y. Brockelmann, M. Schmicke (Piechotta)

Primäre bovine Hepatozyten als Modell zur Untersuchung pathogenetischer Mechanismen der Ketose bei der Milchkuh

DVG VET-Kongress 2017 (Buiatrik) 09.11. - 12.11.2017

Effects of pre-culture conditions on primary bovine hepatocyte viability and cell yield

25. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und klinische Labordiagnostik“ der DVG, S. A17

03.02. - 04.02.2017

Kultivierung primärer boviner Hepatozyten und Einflussfaktoren auf Zellzahl und Viabilität der gewonnen Zellen

Internes Symposium zu „Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch“

der Tierärztlichen Hochschule Hannover 02.02.2017

(5)

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1.1 Ausgangsmaterial ... 3

Ischämiezeit ... 3

Alter der Spendertiere ... 7

2.1.2 Isolationsablauf zur Gewinnung primärer Hepatozyten ... 8

2.2.1 Zellzusammensetzung und Organisation der Leber in vivo ... 11

2.2.2 Kultivierungsmodelle ... 13

2.3.1 Möglichkeiten zur Bewertung der Zellvitalität primärer Hepatozyten .. 17

Morphologisches Erscheinungsbild primärer Hepatozyten ... 17

Vimentin als Marker für Dedifferenzierung primärer Hepatozyten ... 18

Aktivität der Laktatdehydrogenase im Kulturmedium als indirekter Vitalitätsparameter primärer Hepatozyten ... 20

NF-κB als Entzündungsparameter primärer Hepatozyten... 20

2.3.2 Leberspezifische Funktionen primärer Hepatozyten ... 22

Metabolische Funktionen primärer Hepatozyten ... 22

HNF4α als leberspezifischer Transkriptionsfaktor ... 24

2.3.3 Endokrinologische Funktionen primärer boviner Hepatozyten ... 25

3 Material und Methoden ... 29

Lebergewinnung nach langer warmer Ischämiezeit ... 29

Lebergewinnung nach mittlerer warmer Ischämiezeit ... 30

Lebergewinnung nach kurzer warmer Ischämiezeit ... 30

3.1.2 Entnahme von Blutproben und Bestimmung klinisch-chemischer Blutparameter ... 31

(6)

II

3.1.3 Isolationsablauf ... 31

Isolation nach Ehrhardt und Schmicke (2016) ... 32

Modifikationen der Isolation primärer boviner Hepatozyten ... 35

3.1.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer boviner Hepatozyten ... 40

3.1.5 Entnahme von Zellproben nach der Dichtegradientenzentrifugation .. 42

3.2.1 Kultivierungsmodelle: Monolayer- und Sandwichkultur ... 42

3.2.2 Entnahme von Zell- und Mediumproben von kultivierten Hepatozyten ... 46

3.3.1 Effekt von Dexamethason auf primäre bovine Hepatozyten in Monolayerkultur ... 49

3.3.2 Effekt von Insulin und Dexamethason auf primäre bovine Hepatozyten in Sandwichkultur ... 50

3.3.3 Effekt von Glucose auf primäre bovine Hepatozyten in Sandwichkultur ... 51

3.3.4 Laboranalysen ... 53

Aktivität der Laktatdehydrogenase ... 53

LIVE/DEAD^®-Färbung ... 54

Harnstoff ... 55

Glucose ... 57

3.3.5 Genexpressionsanalyse ... 57

Extraktion der RNA ... 58

Qualitäts- und Konzentrationsmessung der RNA ... 59

Quantitative Reverse Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion ... 60

3.3.5.3.1 DNase-Verdau und Reverse Transkription der RNA ... 60

3.3.5.3.2 Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion ... 61

4 Ergebnisse ... 69

(7)

Inhaltsverzeichnis

III

Untersuchung von klinisch-chemischen Blutparametern in vivo als Indikatoren für den Isolationserfolg von primären bovinen Hepatozyten ... 69

Einfluss der warmen Ischämiezeit auf die Viabilität und Zellzahl ... 70

4.1.2 Isolationsablauf ... 72

Modifikation der Puffer für die Isolation primärer boviner Hepatozyten ... 72

Einfluss des Isolationsablaufs auf die Viabilität und Zellzahl ... 78

4.3.1 Effekt von Dexamethason auf primäre bovine Hepatozyten in Monolayerkultur ... 82

Aktivität der Laktatdehydrogenase im Kulturmedium ... 83

Ergebnisse der Genexpressionsanalyse... 83

LIVE/DEAD^®-Färbung und Morphologie primärer boviner Hepatozyten in Sandwichkultur ... 87

Harnstoffkonzentration im Kulturmedium ... 93

4.3.3 Effekt von Glucose auf primäre bovine Hepatozyten in Sandwichkultur ... 99

Harnstoffkonzentration im Kulturmedium ... 102

Glucoseumsatz ... 106

5 Diskussion ... 108

(8)

IV

Untersuchung von klinisch-chemischen Blutparametern in vivo als Indikatoren für den Isolationserfolg von primären

bovinen Hepatozyten ... 109

Einfluss der warmen Ischämiezeit auf Viabilität und Zellzahl ... 111

5.1.2 Bedeutung der Modifikationen des Isolationsablaufs auf Viabilität und Zellzahl primärer boviner Hepatozyten ... 113

5.3.1 Zellvitalität primärer boviner Hepatozyten in Kultur ... 122

5.3.2 Leberspezifische Funktionen primärer boviner Hepatozyten ... 129

5.3.3 Endokrinologische Funktionen primärer boviner Hepatozyten und das hepatische GHR/IGF-I-System ... 137

5.3.4 Repolarisation der primären bovinen Hepatozyten in Sandwichkultur ... 142

6 Zusammenfassung... 145

7 Summary ... 148

8 Literaturverzeichnis ... 151

9 Anhang ... 174

(9)

Inhaltsverzeichnis

V

9.8.2 Effekt unterschiedlicher Glucosekonzentrationen auf primäre bovine Hepatozyten in Sandwichkultur ... 184 10 Danksagung ... 187

(10)

VI

Abkürzungsverzeichnis

AS Aminosäuren

AST Aspartat-Aminotransferase ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

Chol Cholesterin

Ct Threshold cycle

D Dexamethason

DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate

E Effizienz

EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat EZM Extrazelluläre Matrix

FBS Fetales bovines Serum

FFS Freie Fettsäuren

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GBi Gesamtbilirubin

GEW Gesamteiweiß

GGT Gamma-Glutamyltransferase

GHR Wachstumshormon-Rezeptor, engl. Growth hormone receptor GHR1A Growth hormone receptor, Variante 1A

GHRtot Growth hormone receptor, alle Varianten GLDH Glutamatdehydrogenase

GOI Gene of interest

HEPES Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure HNF4α Hepatocyte nuclear factor 4 alpha

IA Isolationsablauf

IGF Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, engl. Insulin-like growth factor IGFBP IGF-Bindungsprotein, engl. IGF-binding protein

(11)

Abkürzungsverzeichnis

VII ITS Insulin-Transferrin-Selenium

IκBα Nuclear factor-kappa-B-Inhibitor alpha LDH Laktat-Dehydrogenase

LPS Lipopolysaccharide

mRNA Messenger Ribonukleinsäure MuLV Murine Leukemia Virus

n Anzahl

n.s. Nicht signifikant

NAD Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid

NADH Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrid NADP Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat

NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Hydrid NF-κB Nuclear factor-kappa-B

Ø Durchmesser

P Phosphat

PBH Primäre bovine Hepatozyten PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PEPCK-C zytosolische Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase Perf I Perfusionspuffer I

Perf II Perfusionspuffer II

PPIA Peptidylprolyl-Isomerase A

qPCR quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

Ref Referenzgen

ROS Reaktive Sauerstoffspezies

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

RT-qPCR Quantitative Reverse Transkriptase Echtzeit-Polymerase- Kettenreaktion

SCFA Short chain fatty acids ß-HBS ß-Hydroxybuttersäure

V Viabilität

(12)

VIII

VZ Quotient: Viabilität/ Zellzahl x 100.000

WIZ Warme Ischämiezeit

Z Zellzahl

ZO-1 Zona occludens-1

ZV Quotient: Zellzahl/ (Viabilität x 100.000)

(13)

Abbildungsverzeichnis

IX

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1. Zellpolarität von klassischen Epithelzellen und von Hepatozyten. ... 13 Abbildung 2. Gewinnung des Ausgangsmaterials für die Isolation primärer

boviner Hepatozyten. ... 38 Abbildung 3. Ablauf der Isolation primärer boviner Hepatozyten im Zellkulturlabor

der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover. ... 39 Abbildung 4. Darstellung des Zählgitters einer Neubauer-Zählkammer ... 41 Abbildung 5. Formel zur Bestimmung der Zellzahl in einer Neubauer-

Zählkammer ... 41 Abbildung 6. Formel zur Bestimmung der Zellviabilität mit Trypanblau ... 42 Abbildung 7. Modell von primären Hepatozyten in Monolayer- und

Sandwichkultur. ... 43 Abbildung 8. Zeitlicher Ablauf der Kultivierung primärer boviner Hepatozyten in

Monolayer- und Sandwichkultur. ... 45 Abbildung 9. Formel zur Bestimmung der Aktivität der Laktatdehydrogenase im

Kulturmedium ... 54 Abbildung 10. Formel zur Bestimmung der Harnstoffkonzentration im

Kulturmedium ... 56 Abbildung 11. Ergebnisse einer beispielhaften Primeretablierung für IGFBP-2. ... 66 Abbildung 12. Formel zur Berechnung der relativen Genexpression nach Pfaffl

(2004). ... 66 Abbildung 13. Effekt der warmen Ischämiezeit auf Viabilität und Zellzahl der

gewonnenen primären bovinen Hepatozyten. ... 72 Abbildung 14. Effekt des Isolationsablaufs auf Viabilität und Zellzahl der

gewonnenen primären bovinen Hepatozyten. ... 79 Abbildung 15. Kultivierung primärer boviner Hepatozyten in Monolayer- und in

Sandwichkultur. ... 82 Abbildung 16. Effekt von Dexamethason auf die Aktivität der

Laktatdehydrogenase im Kulturmedium primärer boviner

Hepatozyten in Monolayerkultur. ... 83 Abbildung 17. Effekt von Dexamethason auf die relative mRNA-Expression

verschiedener Gene primärer boviner Hepatozyten in

Monolayerkultur. ... 85 Abbildung 18. Effekt von Insulin und Dexamethason auf die Aktivität der

Laktatdehydrogenase im Kulturmedium primärer boviner

Hepatozyten in Sandwichkultur. ... 87 Abbildung 19. Einfluss von Insulin und Dexamethason auf Vitalität und

Morphologie primärer boviner Hepatozyten in Sandwichkultur. ... 93

(14)

X

Abbildung 20. Effekt von Insulin und Dexamethason auf die

Harnstoffkonzentration im Kulturmedium primärer boviner

Hepatozyten in Sandwichkultur. ... 94 Abbildung 21. Effekt von Insulin und Dexamethason auf die relative mRNA-

Expression verschiedener Gene primärer boviner Hepatozyten in Sandwichkultur. ... 98 Abbildung 22. Effekt unterschiedlicher Glucosekonzentrationen auf die Aktivität

der Laktatdehydrogenase im Kulturmedium primärer boviner

Hepatozyten in Sandwichkultur. ... 101 Abbildung 23. Effekt unterschiedlicher Glucosekonzentrationen auf die

Harnstoffkonzentration im Kulturmedium primärer boviner

Hepatozyten in Sandwichkultur. ... 103 Abbildung 24. Effekt unterschiedlicher Glucosekonzentrationen auf die relative

mRNA-Expression verschiedener Gene primärer boviner

Hepatozyten in Sandwichkultur. ... 106 Abbildung 25. Effekt unterschiedlicher Glucosekonzentrationen auf den

Glucoseumsatz primärer boviner Hepatozyten in Sandwichkultur. 107

(15)

Tabellenverzeichnis

XI

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1. Gegenüberstellung des Ausgangsmaterials zur Isolation primärer

boviner Hepatozyten. ...29 Tabelle 2. Zusammensetzung der von Ehrhardt und Schmicke (2016)

verwendeten Puffer zur Isolation primärer boviner Hepatozyten. ...34 Tabelle 3. Zusammensetzung der Stammlösungen für die modifizierten Puffer. ...36 Tabelle 4. Modifizierte Zusammensetzung der für die Isolation primärer boviner

Hepatozyten verwendeten Puffer. ...37 Tabelle 5. Zusammensetzung von Vollmedium und Medium 1 für die Kultivierung

primärer boviner Hepatozyten in Anlehnung an Ehrhardt und

Schmicke (2016). ...46 Tabelle 6. Versuchsplan A zur Untersuchung des Effekts von Dexamethason auf

primäre bovine Hepatozyten in Monolayerkultur. ...49 Tabelle 7. Zusammensetzung von Medium 2A zur Untersuchung des Effekts von

Dexamethason auf primäre bovine Hepatozyten in Monolayerkultur. ...49 Tabelle 8. Versuchsplan B zur Untersuchung des Effekts von Insulin und

Dexamethason auf primäre bovine Hepatozyten in Sandwichkultur...50 Tabelle 9. Zusammensetzung von Medium 2B zur Untersuchung des Effekts von

Insulin und Dexamethason auf primäre bovine Hepatozyten in

Sandwichkultur. ...51 Tabelle 10. Versuchsplan C zur Untersuchung des Effekts von Glucose auf

primäre bovine Hepatozyten in Sandwichkultur. ...52 Tabelle 11. Zusammensetzung von Medium 2C zur Untersuchung des Effekts

von Glucose auf primäre bovine Hepatozyten in Sandwichkultur. ...52 Tabelle 12. Reaktionsmix zur Bestimmung der Aktivität der Laktatdehydrogenase

im Kulturmedium ...54 Tabelle 13. Reaktionsmix zur Bestimmung der Harnstoffkonzentration im

Kulturmedium ...56 Tabelle 14. Zusammensetzung der Mastermixe für die Reverse Transkription der

RNA. ...61 Tabelle 15. Protokoll für die Reverse Transkription der RNA zur Erstellung der

komplementären DNA ...61 Tabelle 16. Zusammensetzung des Mastermix für die quantitative Echtzeit-

Polymerase-Kettenreaktion. ...64 Tabelle 17. Drei-Schritt Protokoll für den Programmablauf der quantitativen

Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion im Thermocycler CFX96 ...64 Tabelle 18. Informationen zu den in der quantitativen Echtzeit-Polymerase-

Kettenreaktion verwendeten Primern. ...65

(16)

XII

Tabelle 19. Korrelationskoeffizient r zwischen klinisch-chemischen

Blutparametern und der Viabilität und Zellzahl der gewonnenen

primären bovinen Hepatozyten. ...70 Tabelle 20. Gegenüberstellung der Volumina und Temperaturen der Puffer

verwendet für den modifizierten Isolationsablauf und für den

Isolationsablauf nach Ehrhardt und Schmicke (2016; Original). ...74 Tabelle 21. Gegenüberstellung der Zusammensetzung der Puffer verwendet für

den modifizierten Isolationsablauf und für den Isolationsablauf nach Ehrhardt und Schmicke (2016; Original). ...75 Tabelle 22. Ergebnisse der Messung der Glucosekonzentration in Medium 2C ...178 Tabelle 23. Ergebnisse der Messungen der klinisch-chemischen Blutparameter ...179 Tabelle 24. Ergebnisse der Isolationen primärer boviner Hepatozyten in

Abhängigkeit von der Länge der warmen Ischämiezeit. ...180 Tabelle 25. Ergebnisse der Isolationen primärer boviner Hepatozyten in

Abhängigkeit vom Isolationsablauf. ...181 Tabelle 26. Ergebnisse zur Aktivität der Laktatdehydrogenase im Kulturmedium

in Abhängigkeit von der Mediumzusammensetzung und vom

Zeitpunkt der Kultivierung...182 Tabelle 27. Ergebnisse zur Harnstoffkonzentration im Kulturmedium in

Abhängigkeit von der Mediumzusammensetzung und vom Zeitpunkt der Kultivierung ...183 Tabelle 28. Ergebnisse zur Aktivität der Laktatdehydrogenase im Kulturmedium

in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration in Medium 2C und vom Zeitpunkt der Kultivierung ...184 Tabelle 29. Ergebnisse zur Harnstoffkonzentration im Kulturmedium in

Abhängigkeit von der Glucosekonzentration in Medium 2C und vom Zeitpunkt der Kultivierung...185 Tabelle 30. Ergebnisse zum Glucoseumsatz in Abhängigkeit von der

Glucosekonzentration in Medium 2C und vom Zeitpunkt der

Kultivierung ...186

(17)

Einleitung

1

1 Einleitung

Die Leber ist das zentrale Stoffwechselorgan der Milchkuh und trägt durch Koordination und Interkonversion der Nährstoffe zur erforderlichen metabolischen Adaption während der Trächtigkeit und der Laktation bei (Seal und Reynolds, 1993;

van Dorland et al., 2009). Eine hohe Milchleistung zu Beginn der Laktation führt zu einer katabolen Stoffwechsellage und damit einhergehend wird die Mobilisation von körpereigenen Fettdepots initiiert. Eine gesteigerte und überschießende Lipomobilisation geht wiederum häufig mit Erkrankungen wie Ketosen und schließlich Leberverfettung einher (Baird, 1981). Damit der Organismus körpereigenes Fettgewebe mobilisieren kann, kommt es unter anderem peripartal zu einem Abfall der hepatischen Expression des Growth hormone receptor 1A (GHR1A) und damit auch zu einem Abfall der Insulin-like growth factor I (IGF-I)-Konzentration (Kobayashi et al., 1999; Kim, 2014). Durch den fehlenden negativen Feedback-Mechanismus von IGF-I wird vermehrt Growth hormone (GH) aus der Adenohypophyse freigesetzt. Man spricht auch von einer hepatischen GH-Resistenz (Radcliff et al., 2003; Piechotta et al., 2014).

In der frühen Laktation konnte im Rahmen von in-vivo-Studien festgestellt werden, dass es durch die Infusion supraphysiologischer Insulinkonzentrationen zu einem Anstieg der hepatischen GHR1A und IGF-I mRNA-Expression kommt (Butler et al., 2003; Rhoads et al., 2004). Allerdings ist bis heute unklar, ob Insulin oder andere Mechanismen oder Faktoren initial zur hepatischen GH-Resistenz führen.

Aufgrund der peripartal komplexen metabolischen und auch endokrinologischen Zusammenhänge, die es nicht erlauben einzelne Faktoren zu untersuchen, ist die nähere Untersuchung der „Entkopplung der somatotropen Achse“, wie die peripartale GH-Resistenz bei der Milchkuh auch genannt wird, in einem in-vitro-Modell sinnvoll.

Derzeit sind allerdings lediglich bovine fetale Zelllinien verfügbar, welche nicht die hepatischen Stoffwechselvorgänge eines ruminierenden Tieres widerspiegeln (Talbot et al., 2015; Gleich et al., 2016). Der Lebermetabolismus wird stark durch das Einsetzen der Pansenfunktionen beeinflusst. Beim Milchkalb kommt es zur Resorption von Glucose aus dem Dünndarm ins Blut, wohingegen es beim Rind im Pansen zur Fermentation der Glucose durch Mikroorganismen kommt. Beim Rind, anders als beim Milchkalb, wird der Leber Energie nicht in Form von Glucose, sondern von short chain

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2

fatty acids (SCFA) bereitgestellt. Beim Rind mit entwickelter Pansenfunktion stehen deshalb andere Stoffwechselwege im Vordergrund und Glucose wird ausschließlich durch eine permanent ablaufende Gluconeogenese gebildet (Bergman, 1990; Baldwin et al., 2004). Aus diesem Grund ist es fraglich, ob die von nicht-ruminierenden Kälbern stammenden Hepatozyten, die oftmals für in-vitro-Studien am Rind herangezogen werden (Zhang et al., 2012; Jiang et al., 2013), vergleichbare Eigenschaften aufweisen wie reife Hepatozyten aus Lebern von Rindern und sich somit für Untersuchungen von endokrinologischen Zusammenhängen bei der Milchkuh eignen. Ehrhardt und Schmicke (2016) ist es bereits gelungen primäre Hepatozyten vom Rind aus Lebern vom Schlachthof zu gewinnen. Allerdings war die erreichte Viabilität und Zahl der Hepatozyten nach der Isolation lediglich moderat und bei der Kultivierung der Hepatozyten konnte ein deutlicher Abfall der Expression des GHR festgestellt werden.

Letzteres stellte insbesondere die Eignung der Primärhepatozyten für die Untersuchungen zum GHR deutlich in Frage.

Ziel dieser Arbeit war es deshalb die Isolation und Kultivierung primärer Hepatozyten vom Rind zu verbessern, da für adulte Hepatozyten sowohl das Kultivierungsmodell als auch die Zusammensetzung des Mediums wichtig sind, um Vitalität und leberspezifische Funktionen in Kultur zu erhalten (Hewitt et al., 2007; Godoy et al., 2013). Ein besonderes Augenmerk lag auf der Untersuchung der GHR-Expression in Kultur, um die gewonnenen primären Hepatozyten vom Rind als in-vitro-Modell für zukünftige Studien zur Charakterisierung des hepatischen GHR/IGF-I-Systems der Milchkuh heranziehen zu können.

(19)

Literaturübersicht

3

2 Literaturübersicht

Isolation primärer boviner Hepatozyten

2.1.1 Ausgangsmaterial

Für die Isolation primärer boviner Hepatozyten (PBH) wurde in bisherigen Studien unterschiedliches Ausgangsmaterial verwendet, welches sich vor allem in der Länge der Ischämiezeit des Lebergewebes vor der Isolation und im Alter der Spendertiere unterschied. Auf diese Eigenschaften des Ausgangsmaterials wird im Folgenden näher eingegangen.

Ischämiezeit

Für die Isolation vitaler, primärer Hepatozyten ist die Dauer der sogenannten Ischämiezeit von besonderer Bedeutung (Ikeda et al., 1992; Fisher et al., 1997;

Hughes et al., 2006). In Anlehnung an die Transplantationsmedizin lässt sich laut dem National Cancer Institute der National Institutes of Health die warme Ischämiezeit (WIZ) definieren als „die Zeit, in welcher ein Gewebe, Organ oder Körperteil bei Körpertemperatur verbleibt, nachdem die Blutzufuhr vermindert oder komplett unterbunden wurde, bis es gekühlt […] wird“. Die kalte Ischämiezeit wird hingegen vom National Cancer Institute der National Institutes of Health als „die Zeit, die zwischen dem Kühlen eines Gewebes, Organs oder Körperteils nach dem Abtrennen von der Blutzufuhr […] und der erneuten Aufwärmung durch Wiederherstellung der Blutzufuhr liegt“ festgelegt. Durch das Ausbleiben der Blutzufuhr ist das Organ in dieser Zeit vor allem einer die Zellen schädigenden Hypoxie ausgesetzt (Rauen und Groot, 2002).

Primäre humane Hepatozyten werden bereits als essentielles in-vitro-Modell zur Erforschung von Arzneimitteln und deren Toxizität sowie für Forschungszwecke im Rahmen von Lebertransplantationen genutzt (Guillouzo et al., 1993; Wang et al., 2002;

Hughes et al., 2006; Godoy et al., 2013). Allerdings ist die Verfügbarkeit von humanem Lebergewebe für die Gewinnung primärer Hepatozyten stark limitiert, weshalb Forscher auf Lebern zurückgreifen, die für eine orthotopische Lebertransplantation nicht geeignet sind, oder Leberresektate verwenden, die im Rahmen von

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4

Hepatektomien anfallen (Hewitt et al., 1997; Donini et al., 2001; Bhogal et al., 2011;

Ibars et al., 2016). Allerdings unterliegt das Lebergewebe dabei oft nicht nur einer warmen sondern zusätzlich einer kalten Ischämiezeit. Beide Ischämiezeiten zusammen vermindern mit zunehmender Länge die Viabilität der isolierten, primären Hepatozyten (Hughes et al., 2006). Während der Ischämie können aufgrund der Hypoxie keine sauerstoffabhängigen Phosphorylierungen stattfinden, so auch nicht die Phosphorylierung von energiereichen Phosphatverbindungen, mit dem Ergebnis, dass der Gehalt an Adenosintriphosphat (ATP) in der Zelle sinkt (Farkouh et al., 1971). Laut Lambotte (1977) können ATP-abhängige Membranpumpen das Membranpotenzial nicht mehr aufrechterhalten und eine Verschiebung von Ionenkonzentrationen ist die Folge. Um dem entgegenzuwirken, ist in der Transplantationsmedizin schon seit Jahrzehnten der sogenannte „cold storage“ ein Mittel zur Erniedrigung der genannten Enzymaktivitäten und damit einhergehend zur Reduktion des Hypoxieschadens der Zellen (Sicular und Moore, 1961). Dabei entspricht ein Temperaturabfall von 10°C einer Verringerung der Enzymaktivität um den Faktor 1,5 - 2 (Sicular und Moore, 1961;

Belzer und Southard, 1988). Die Autoren betonten, dass ein Organ nach dem Versiegen der Blutzufuhr schnell vom Zustand der warmen Ischämie in den Zustand der kalten Ischämie gebracht werden müsse, um die Viabilität und Funktion des Gewebes für längere Zeit zu konservieren.

Die kalte Ischämiezeit, während der das Lebergewebe sowohl der Hypoxie als auch der Hypothermie ausgesetzt ist, führt zu einem geringeren Verbrauch von ATP (Harvey et al., 1988). Zwar sind während der Dauer der Hypothermie Enzymaktivitäten erniedrigt, aber ein Stillstand des Metabolismus kann auch durch die niedrigen Temperaturen nicht erreicht werden (Belzer und Southard, 1988; Clavien et al., 1992).

Laut Harvey et al. (1988) kommt es während der kalten Ischämiezeit, anders als bei der WIZ, vermehrt zu einer Dephosphorylierung von ATP zu Adenosinmonophosphat, während bei der WIZ die Bildung von Hypoxanthinen und Xanthinen im Vordergrund steht. Bei der Reperfusion des Lebergewebes im Anschluss an die kalte Ischämiezeit kommt es durch die erneute Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff zur Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) aus Xanthinen (McCord, 1985). Rauen und De Groot (1998) gehen hingegen davon aus, dass die Hypothermie selbst der Auslöser

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Literaturübersicht

5

für die ROS-Freisetzung ist. ROS sind freie Radikale mit einem Sauerstoffatom oder einem Äquivalent und haben eine hohe Reaktivität mit anderen Molekülen (Toyokuni, 1999). Die am häufigsten in Zellen entstehenden freien Radikale sind laut Powers und Jackson (2008) O2·- und Stickstoffmonoxid. Durch die exzessive Bildung von ROS, wie beim Ischämie-Reperfusions-Schaden (Toyokuni, 1999; Bhogal et al., 2010), kommt es zur Störung der Redox-Homöostase, wodurch es zu oxidativem Stress der Zelle und zu einer Schädigung intrazellulärer Komponenten kommt (Zuo et al., 2015). Dabei steht Lipidperoxidation im Vordergrund, welche die Zellmembran schädigt und bis hin zum Verlust der Barrierefunktion der Zellmembran führen kann (Halliwell, 2006). Die ROS können durch Antioxidantien in weniger reaktive Metabolite umgewandelt werden (Toyokuni, 1999; Halliwell, 2006).

Zur Untersuchung der Auswirkung des „cold storage“ auf die Viabilität von Hepatozyten und Nicht-Parenchymzellen konnten Caldwell-Kenkel et al. (1989, 1991) nach einer kalten Ischämiezeit von 24 h eine Reduktion der Viabilität der Nicht-Parenchymzellen um 40 % feststellen. Im Gegensatz dazu wurde die Viabilität der Hepatozyten nach dieser Zeit nicht beeinträchtigt. Auch Ikeda et al. (1992) konnten darstellen, dass vor allem sinusoidale Endothelzellen und auch Kupffer-Zellen empfindlicher auf die kalte Ischämiezeit und Reperfusion reagieren als Hepatozyten.

Caldwell-Kenkel et al. (1989, 1991) schlussfolgerten aus diesen Ergebnissen, dass der Grund für das Scheitern einer Lebertransplantation nach einer langen kalten Ischämiezeit vorrangig durch den Schaden der sinusoidalen Endothelzellen bedingt ist.

Für die Isolationen von primären Hepatozyten vom Rind und Kalb wurden bisher Ausgangsmaterialien mit unterschiedlichen WIZ verwendet. Dazu zählen auch Lebern, die keiner WIZ ausgesetzt waren. Dies ist immer dann der Fall, wenn die Lebern den Spendertieren in Narkose entnommen wurden. Hierbei wurde entweder die gesamte Leber oder ein Teilstück des Lobus caudatus entfernt und die Tiere im Anschluss euthanasiert (van ’t Klooster et al., 1992; Donkin und Armentano, 1993; Nakagawa- Tosa et al., 1994; Alsemgeest et al., 1996; Zhang et al., 2012; Jiang et al., 2013). In den meisten Studien wurde das Lebergewebe direkt nach der Gewinnung mit kaltem Puffer gespült und war daraufhin einer kalten Ischämiezeit ausgesetzt. Bei Donkin und

(22)

6

Armentano (1993) und Zhang et al. (2012) erfolgte im Anschluss an die Gewinnung eines Leberteilstücks direkt die Perfusion mit 37°C warmen Puffern ohne Unterbrechung der thermoneutralen Zone der Zellen. Die so gewonnenen Hepatozyten waren während der Isolation demnach weder einer WIZ noch einer kalten Ischämiezeit ausgesetzt. Genauere Angaben zur Länge der kalten Ischämiezeit fehlten in den übrigen Studien (van ’t Klooster et al., 1992; Nakagawa-Tosa et al., 1994; Alsemgeest et al., 1996; Jiang et al., 2013). Eine weitere Möglichkeit die WIZ zu umgehen, wurde durch eine Lobektomie mit anschließendem Verschluss der Wundränder der Leber gewählt. Dadurch konnte das Überleben der Spendertiere sichergestellt werden (Witzel et al., 1975; Shull et al., 1986; Liu et al., 2014). Auch bei letztgenanntem Ausgangsmaterial unterlag das Gewebe keiner WIZ aber einer kalten Ischämiezeit, da sofort nach Gewinnung eine Kühlung des Lebergewebes stattfand.

Allerdings wurde auch in diesen Studien die Länge der kalten Ischämiezeit nicht benannt.

Eine andere Möglichkeit haben Forsell et al. (1985) gewählt, die nach der Euthanasie der Spendertiere ein Teilstück des Lobus caudatus gewonnen haben. Aufgrund des Ausbleibens der Blutzufuhr nach dem Tod des Spendertieres unterlag das Lebergewebe bei Forsell et al. (1985) einer WIZ von 15 min, die durch die Spülung des Gewebes mit eiskaltem Puffer beendet wurde. Auch hier machten die Autoren keine konkreten Angaben zur Länge der kalten Ischämiezeit. Als letzte Variante wurden auch Lebern von Rindern aus dem Schlachthof verwendet (Clouet et al., 1998;

Kuilman et al., 1998; Spotorno et al., 2006; Wu et al., 2010; Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015; Ehrhardt und Schmicke, 2016). Die Länge der WIZ reicht auch bei diesen Lebern vom Eintritt des Todes bis zur Kühlung des Lebergewebes und richtet sich in diesen Fällen nach dem Ablauf des Schlachtprozesses. Bei Panda et al. (2015) unterlag das Ausgangsmaterial für die Isolation von PBH während der Transportzeit vom Schlachthof zum Labor einer kalten Ischämiezeit von drei bis vier Stunden. Bei Wu et al. (2010) belief sich die kalte Ischämiezeit des Lebergewebes vor der Isolation auf eine Stunde, bei Spotorno et al. (2006) auf 30 min.

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Literaturübersicht

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Auch nach eingehender Literaturrecherche konnte keine Arbeit gefunden werden, die den Einfluss der WIZ auf den Ausgang der Isolation von PBH untersucht hat. Diese Auswertung war daher Gegenstand der hier beschriebenen Dissertation.

Alter der Spendertiere

Hinsichtlich des Alters der Spendertiere ist vor allem bei Rindern zu beachten, dass sich der Leberstoffwechsel neonataler Kälber und ausgewachsener Rinder aufgrund der noch ausstehenden Ausbildung der Vormagenfunktionen unterscheidet (Leat, 1970). Nach der Geburt sind die Vormägen bei Kälbern funktionell und anatomisch noch nicht voll ausgebildet. Warner et al. (1956) konnten zeigen, dass das Volumen des Pansens bei Kälbern innerhalb der ersten sechzehn Wochen nach der Geburt im Verhältnis zum Körpergewicht deutlich zunahm, während das Volumen des Labmagens im Verhältnis zum Körpergewicht annähernd gleich blieb. Erst ab dem 30. Lebenstag befinden sich laut Longenbach und Heinrichs (1998) im Pansen Protozoen und Bakterien in einer ausreichenden Zahl, so dass deren Enzyme die ruminale Verdauung der Nahrung ermöglichen. Bis dahin ähnelt der Metabolismus noch nicht-ruminierender Kälber dem der Monogastrier (Leat, 1970). Bei noch nicht-ruminierenden Kälbern wird die mit der Milch anfallende Glucose im Dünndarm resorbiert und steht als Energiequelle für den Organismus zur Verfügung (Blum, 2006).

Mit Einsetzen der Pansenfunktionen wird ein Großteil der in der Nahrung enthaltenen Glucose durch die Mikroorganismen direkt im Pansen abgebaut und Nährstoffe werden in Form von SCFA im Blut bereitgestellt (Bergman, 1990). Um diese SCFA als Energiequelle nutzen zu können, kommt es durch Anpassung des hepatischen Stoffwechsels zu einer kontinuierlichen Gluconeogenese (Baldwin et al., 2004).

Bisher wurden sowohl PBH von ruminierenden Tieren (van ’t Klooster et al., 1992;

Kuilman et al., 2000; Panda et al., 2015; Ehrhardt und Schmicke, 2016) als auch von neonatalen, noch nicht-ruminierenden Kälbern verwendet (Donkin und Armentano, 1993; Wu et al., 2010; Zhang et al., 2012; Deng et al., 2014; Shi et al., 2015). Zhang et al. (2012) begründen die Verwendung von neonatalen Kälbern für ihre Studien unter anderem mit einer besseren Proliferation der Zellen in Kultur. Außerdem wurden für

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die Gewinnung von PBH auch Kälber herangezogen, die 8 - 12 Wochen alt bzw.

100 - 125 kg schwer waren (Shull et al., 1986; Donkin und Armentano, 1993; Strang et al., 1998; Mashek et al., 2002). Laut Swanson und Harris (1958) hat die Aufnahme von wiederkäuergerechtem Futter, unabhängig vom Alter, entscheidenden Einfluss auf die Ausbildung der Pansenfunktionen. Die Autoren dieser letztgenannten Studien beschreiben eine rohfaserreiche Fütterung der Kälber in den Wochen vor der Gewinnung eines Teilstücks der Leber und gehen somit davon aus, dass die Eigenschaften der gewonnenen Hepatozyten mit denen vom ruminierenden Tier vergleichbar sind.

Vergleicht man die Eigenschaften der Hepatozyten von noch nicht-ruminierenden mit denen von ruminierenden Kälbern, so konnten Donkin und Armentano (1995) feststellen, dass die Gluconeogenese bei PBH von noch nicht-ruminierenden Kälbern durch Insulin herunterreguliert wurde, nicht aber bei PBH von bereits ruminierenden Kälbern. Dies führen Baldwin et al. (2004) darauf zurück, dass bei Rindern keine Glucose aus dem Pansen bereitgestellt wird und deshalb eine konstante Gluconeogenese in der Leber nötig ist, um die Energieversorgung des Organismus sicherzustellen. Bei einer Studie von Zhu et al. (2000) konnte ein Unterschied in der Aktivität der Arginase zwischen PBH von noch nicht-ruminierenden Kälbern und PBH von ruminierenden Kälbern festgestellt werden.

2.1.2 Isolationsablauf zur Gewinnung primärer Hepatozyten

Den Grundstein für die Perfusionstechnik zur Gewinnung primärer Hepatozyten legten Berry und Friend (1969) mit der Benutzung von Kollagenase, um Zellen enzymatisch aus einem Zellverband herauszulösen. Die Kollagenase hydrolysiert Peptidbindungen in interzellulärem Kollagen (Johnson et al., 1996) und ermöglicht so die Freisetzung der Hepatozyten aus dem Zellverband (Berry und Friend, 1969).

Laut Johnson et al. (1996) stellt der Einsatz von Kollagenase allerdings auch einen kritischen Punkt während der Isolation dar. Die häufig verwendete Collagenase P, die aus Clostridium histolyticum gewonnen wird, enthält ein Gemisch aus sechs verschiedenen Kollagenasen und mindestens noch sechs weitere Enzyme. Je nach

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Literaturübersicht

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Charge kann eine nur geringe Kollagenaseaktivität aber zum Beispiel eine hohe Proteaseaktivität vorliegen, wodurch laut Berry et al. (1997) die Effizienz der Isolation im Hinblick auf die Zellzahl und -viabilität sinkt. Ein weiterer Aspekt sind Verunreinigungen der Kollagenase mit bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS;

Tirmenstein et al., 2000; Paine und Andreakos, 2004). Diese LPS können eine Entzündungsreaktion in den Hepatozyten induzieren, die vor allem durch die Aktivierung von Entzündungsparametern, wie Nuclear factor-kappa-B (NF-κB; siehe auch Kapitel 2.3.1.4), bestimmt ist und der damit verbundenen Ausschüttung von Zytokinen (Elaut et al., 2006; Vinken et al., 2014).

Die anfangs erwähnte Ein-Schritt Perfusion zur Isolation primärer Hepatozyten, bei der das Leberstück lediglich mit Kollagenaselösung perfundiert wurde, konnte Seglen (1972, 1973a; b) durch einen zusätzlichen Schritt weiter verbessern. Bei der Zwei-Schritt Perfusion von Seglen (1972, 1973a; b) wurde der Perfusion mit einem Kollagenase-haltigen Puffer die Perfusion mit einem calciumfreien, Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat (EGTA)-haltigen Puffer vorangestellt. EGTA bindet freies Calcium und durch die Abwesenheit des Calciums kommt es zur Invagination von Desmosomen, wodurch Zellverbindungen gelockert werden (Berry und Friend, 1969). Laut Berry et al. (1997) ist diese Invagination der Desmosomen irreversibel, weshalb beim zweiten Perfusionsschritt mit Kollagenase dem Puffer wieder Calcium hinzugefügt werden kann, um die enzymatische Aktivität der Kollagenase, welche calciumabhängig ist, zu optimieren (Berry et al., 1997).

Fast alle bisher beschriebenen Isolationstechniken zur Gewinnung von PBH aus dem Rind basieren auf der Arbeit von Forsell et al. (1985), welche sich wiederum an Techniken orientierten, mit denen erfolgreich Hepatozyten anderer Spezies wie Ratten, Menschen und Ziegen isoliert werden konnten (Seglen, 1972, 1973a; b; Reese und Byard, 1981; Strom et al., 1982). Aufgrund des speziesspezifisch deutlich größeren Lebervolumens von Rindern im Gegensatz zum Lebervolumen von Ratten konnten Forsell et al. (1985) zur Gewinnung einer ausreichenden Zahl von PBH Puffer und vor allem Kollagenase einsparen, indem anstelle der ganzen Leber des Rindes nur ein Teilstück des Lobus caudatus des Processus caudatus für die Isolation verwendet wurde.

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Zudem wird der Zwei-Schritt Perfusion häufig noch eine Spülung des Gewebes mit eiskaltem Puffer am Ort der Gewinnung des Leberstücks vorangestellt (van ’t Klooster et al., 1992; Nakagawa-Tosa et al., 1994; Wu et al., 2010; Panda et al., 2015; Ehrhardt und Schmicke, 2016). Laut Forsell et al. (1985) könne dadurch die WIZ beendet und eine höhere Viabilität der PBH erreicht werden (siehe auch Kapitel 2.1.1.1). Des Weiteren verhindere der Zusatz von EGTA die Gerinnung des in den Gefäßen befindlichen Blutes und ermögliche so eine effektive Blutentfernung aus den Gefäßen (Forsell et al., 1985; Godoy et al., 2013). Dies führe später zu einer gleichmäßigen Perfusion des Lebergewebes (Forsell et al., 1985; Godoy et al., 2013). Außerdem werde durch Bindung des freien Calciums die Zelldissoziation gefördert (Forsell et al., 1985; Berry et al., 1997; Godoy et al., 2013).

Kultivierung primärer boviner Hepatozyten

In der Literatur werden primäre Hepatozyten als ein wertvolles in-vitro-Modell zur Erforschung leberspezifischer Funktionen angeführt, allerdings mit dem Nachteil, dass sie nur eine kurze Lebensspanne aufweisen und in Kultur einer raschen Dedifferenzierung unterliegen (Guguen-Guillouzo und Guillouzo, 2010).

Die Zelllinien boviner Hepatozyten, welche von fetalen Zellen abstammen, können in Kultur nur in Medium, welches fetales bovines Serum (FBS) enthält, kultiviert werden (Talbot et al., 2015). FBS enthält viele Hormone, wie GH, was bei endokrinologischen Studien zum GHR Untersuchungen unmöglich macht (Mense, 2014). Gleich et al.

(2016) transduzierten die fetalen bovinen Hepatozyten zusätzlich retroviral mit dem SV40 large T-antigen. Beim SV40 large T-antigen handelt es sich um ein Onkoprotein, welches vom Polyomavirus SV40 abstammt und die Immortalität der fetalen bovinen Hepatozyten sicherstellt und somit ihre Kulturzeit verlängern soll (Gleich et al., 2016).

Eine genauere Charakterisierung der Hepatozyten zeigte aber, dass den Zellen nach der Transduktion einige leberspezifische Eigenschaften von Rinderhepatozyten fehlen, wie die Expression des Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4α; Gleich et al., 2016). HNF4α ist ein Transkriptionsfaktor, welcher in Hepatozyten die Ausbildung leberspezifischer Funktionen bedingt (Gonzalez, 2008; siehe auch Kapitel 2.3.2.2). In

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Literaturübersicht

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einigen Arbeiten wurde bereits an der Optimierung der Kultivierung primärer Hepatozyten gearbeitet, um das Überleben und die Funktion der Hepatozyten in vitro weiter zu verbessern (Dunn et al., 1989; van ’t Klooster et al., 1992; Godoy et al., 2010). Diese werden im Folgenden näher erläutert.

2.2.1 Zellzusammensetzung und Organisation der Leber in vivo

Die Leber setzt sich aus Parenchymzellen und Nicht-Parenchymzellen zusammen, wobei zur Gruppe der Nicht-Parenchymzellen sinusoidale Endothelzellen, Lymphozyten, Kupffer-Zellen, Gallengangsepithelzellen und Ito-Zellen gehören (Racanelli und Rehermann, 2006). Die Hepatozyten bilden die Gruppe der Parenchymzellen und machen einen Volumenanteil von 80 % an den Gesamtzellen aus, während die Nicht-Parenchymzellen 6,5 % darstellen (Kmiec, 2001). Die übrigen 13,5 % des Lebervolumens werden vor allem durch Lebersinusoide, den Disse’schen Raum und Gallengänge gebildet (Blouin et al., 1977). Der zelluläre Anteil der Hepatozyten liegt bei 60 – 80 %, während die Nicht-Parenchymzellen 20 – 40 % der Zellen darstellen und in den Lebersinusoiden lokalisiert sind (Racanelli und Rehermann, 2006). Die Gefäßwände der Lebersinusoide werden von flachen Endothellzellen gebildet, welche fenestriert und damit diskontinuierlich sind, um einen direkten Kontakt und damit optimalen Austausch von Stoffen zwischen dem sinusoidalen Blut und den Hepatozyten zu ermöglichen (Wisse, 1972).

Im Gegensatz zu anderen klassischen Epithelzellen, wie Lungen- und Drüsenepithelien, welche mit einer basalen Seite Kontakt zu einer Basalmembran haben, mit einer lateralen Seite Kontakt zu Nachbarzellen aufnehmen und mit einer apikalen Seite perpendikular zu einem Lumen ausgerichtet sind (Abbildung 1a), weisen Hepatozyten eine abweichende Polarität auf (Abbildung 1b; Dunn et al., 1989;

Decaens et al., 2008; Treyer und Müsch, 2013). Aufgrund des Fehlens von Laminin als obligate Komponente einer Basalmembran und Nidogen als Matrix-Quervernetzer einer Basalmembran in der adulten Leber (Baloch et al., 1992; Kikkawa et al., 2005) befindet sich zwischen Hepatozyten und sinusoidalen Endothelzellen im Disse’schen Raum eine extrazelluläre Matrix (EZM), die von Basalmembranen anderer Gewebe

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abweicht (Martinez-Hernandez, 1984). Schuppan et al. (2001) bezeichneten diese auch als Basalmembran mit geringer Dichte und die Autoren hoben hervor, dass diese wichtig für den Erhalt der differenzierten Funktionen der Leberzellen sei. Hepatozyten liegen zudem in Reihen nebeneinander und bilden so Platten, welche sich von der Portalregion des Leberläppchens bis hin zur Zentralvene ausdehnen (Elias, 1952). In diesen Platten liegen die Hepatozyten entweder ein- oder maximal zweischichtig zueinander, so dass sie mit ein oder zwei basalen Seiten an den Disse’schen Raum angrenzen und Kontakt zum sinusoidalen Blut aufnehmen können (Elias, 1952). Mit ihrer lateralen Seite befinden sich die Hepatozyten auf Höhe ihrer Nachbarzellen und bilden einen interzellulären Spalt aus (Fawcett, 1955). In diesem interzellulären Spalt werden die lateralen Membrananteile durch „Tight junctions“ von den apikalen Membrananteilen der Hepatozyten getrennt (Fawcett, 1955; Abbildung 1b). Die „Tight junctions“ bilden eine dichte Verbindung der Hepatozyten mit denen der Nachbarhepatozyten, wodurch im Bereich der apikalen Membrananteile Gallengänge entstehen, in welche die Hepatozyten Gallensäuren sezernieren (Farquhar und Palade, 1963; Heath und Wissig, 1966). Bei anderen klassischen Epithelzellen bilden die „Tight junctions“ im apikolateralen Übergang einen Gürtel um die Zelle, um eine dichte Verbindung mit den Nachbarzellen zu erreichen und einen selektiven Molekülaustausch zwischen den Kompartimenten zu ermöglichen (Farquhar und Palade, 1963; Stevenson und Paul, 1989).

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Literaturübersicht

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Abbildung 1. Zellpolarität von klassischen Epithelzellen und von Hepatozyten. a) Klassische Epithelzellen mit einer basalen, einer lateralen und einer apikalen Seite. b) Einschichtige Platte von Hepatozyten, welche dementsprechend zwei basale Seiten aufweisen, die Kontakt zum Disse’schen Raum haben. Des Weiteren haben die Hepatozyten eine laterale Membran unterbrochen durch apikale Membranteile. Mit den apikalen Membranen formen benachbarte Hepatozyten Gallengänge. Modifiziert nach Treyer und Müsch (2013). = basal, = lateral, = apikal, = Basalmembran

2.2.2 Kultivierungsmodelle

Die Kultivierung von primären Rinderhepatozyten wurde in verschiedenen Modellen erforscht. So nahm die Viabilität der PBH in Zellsuspension schnell ab und die metabolische Aktivität sank deutlich (Shull et al., 1986). Shull et al. (1986) schlussfolgerten aus den Ergebnissen, dass sich PBH, welche im Monolayer kultiviert werden, besser für toxikologische Studien eignen, als wenn sich diese in Suspension befinden. Auch in endokrinologischen Studien zeigten PBH, die im Monolayer kultiviert wurden, eine höhere metabolische Aktivität und eine sensitivere, hormonelle Ansprechbarkeit als PBH, die in Zellsuspension gehalten wurden (Donkin und Armentano, 1993). Bei Versuchen von Howard und Pesch (1968) nahm die metabolische Aktivität der Hepatozyten in Suspension schon nach 3 - 4 h deutlich ab,

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weshalb die Autoren für längere Versuche die Kultivierung primärer Hepatozyten auf Zellkulturplatten empfahlen.

Dabei spielt die Beschichtung der Platten mit einer der EZM-ähnlichen Matrix eine erhebliche Rolle, da die Beschichtung der Platten für eine unterschiedlich effektive Anheftung der Hepatozyten sorgt und zudem die Genexpression der Hepatozyten beeinflusst (Rubin et al., 1981; Ben-Ze’ev et al., 1988; Bissell und Choun, 1988;

Lindblad et al., 1991; Knobeloch et al., 2012). Aus Studien an humanen Hepatozyten ist bekannt, dass Zellkulturplatten mit einer Proteinmatrix beschichtet sein müssen, um in-vivo-ähnliche Verhältnisse für die Zellen zu schaffen und damit ihre leberspezifischen Funktionen zu erhalten (Knobeloch et al., 2012). Für die Kultivierung von humanen Hepatozyten und Rattenhepatozyten eignet sich Fibronektin nicht, wohingegen Kollagen zu einer effektiven Anheftung der Hepatozyten führt (Bissell et al., 1986; Knobeloch et al., 2012). Kollagen vom Typ I ist der Hauptbestandteil des gewonnenen Kollagens bei der Herstellung aus Rattenschwanzsehnen und findet oft bei der Kultivierung primärer Hepatozyten Anwendung (Rajan et al., 2006; Godoy et al., 2013).

Bei der Kultivierung von PBH in Monolayerkultur wurden häufig unbeschichtete Platten (Donkin und Armentano, 1993; Alsemgeest et al., 1996; Zhang et al., 2012) oder kollagenbeschichtete Platten (Shull et al., 1986; Giantin et al., 2012) verwendet. Panda et al. (2015) konnten bei der Untersuchung verschiedener EZM zeigen, dass bei der Kultivierung von PBH mit Büffel-Fibroblasten als sogenannter „feeder layer“ die Teilungsfähigkeit der Zellen bis Tag 5 in Kultur erhalten blieb. Aber auch die Kultivierung zwischen zwei Kollagenschichten, in der sogenannten Sandwichkultur, war erfolgreich (Panda et al., 2015). Die Überlebenszeit von PBH in Sandwichkultur war länger als in Monolayerkultur (Ehrhardt und Schmicke, 2016), was sich auch mit Ergebnissen aus Studien an Rattenhepatozyten deckt (Dunn et al., 1989, 1991).

Dabei waren vor allem im Verlauf der Kultivierung unterschiedliche morphologische Ausprägungen der Hepatozyten von Rind und Ratte in Monolayer- und Sandwichkultur zu erkennen (Tchaparian et al., 2011; Panda et al., 2015; Ehrhardt und Schmicke, 2016): Laut verschiedener Autoren nahmen die Hepatozyten nach 24 h in Monolayerkultur eine polygonale Form an und bildeten erste Zell-Zell-Kontakte. In

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Literaturübersicht

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Sandwichkultur waren die Hepatozyten nach 24 h noch vornehmlich von runder Form und lagen vereinzelt. Im weiteren Zeitverlauf wurden die Unterschiede zwischen Monolayer- und Sandwichkultur in serumfreiem Medium deutlicher, da Hepatozyten an Tag 4 in Monolayerkultur stärker abgeflacht waren sowie fibroblastenartige Fortsätze und ein granuliertes Zytoplasma entwickelten. Hepatozyten in Sandwichkultur hingegen wiesen an Tag 4 eine in-vivo-ähnliche, polygonale Morphologie auf und bildeten Cluster aus mehreren Hepatozyten (Tuschl und Mueller, 2006; Hewitt et al., 2007; Tchaparian et al., 2011).

Die von oben und unten die Hepatozyten begrenzende Kollagenmatrix in der Sandwichkultur vermindert ein Abflachen der primären Hepatozyten von Ratten und unterstützt den Zellkontakt benachbarter Zellen (Dunn et al., 1989). Laut Dunn et al.

(1989) wird bei Kultivierung im Sandwich-Modell die in-vivo-Umgebung der Hepatozyten besser nachgebildet als in Monolayerkultur, was zu einer längeren in-vivo-ähnlichen Funktionalität der Hepatozyten in Kultur führt (siehe auch Kapitel 2.2.1).

Laut Literaturangaben wird durch die zwei Kollagenschichten vor allem die Repolarisation der Hepatozyten gefördert, da die Zellen in der Sandwichkultur so auf zwei Seiten Kontakt zu einer EZM haben und in Kultur eine in-vivo-ähnliche Morphologie und Polarität ausbilden (Berthiaume et al., 1996). Im Zuge des Kontakts zu den Nachbarzellen kommt es zur Ausbildung von Gallengängen durch apikale Membrananteile der Hepatozyten (LeCluyse et al., 1994), welche als helle, lichtbrechende Strukturen im Phasenkontrastmikroskop sichtbar werden (Tuschl und Mueller, 2006; Knobeloch et al., 2012). Talamini et al. (1997) konnten zeigen, dass Rattenhepatozyten an Tag 1 in Kultur „Tight junctions“ im apikolateralen Übergang fehlten, aber im Verlauf der Sandwichkultur bis Tag 5 ausgebildet wurden. An Tag 4 in Sandwichkultur konnte die funktionelle Polarität der Hepatozyten durch den Nachweis von Fluorescein-Diacetat erbracht werden, welches verstoffwechselt und in sichtbare Gallengänge sezerniert wurde (Talamini et al., 1997). Zeigerer et al. (2017) konnten bei primären murinen Hepatozyten in Sandwichkultur ebenfalls Zona occludens-1 (ZO-1) als Marker für „Tight junctions“ in der apikalen Membran der Zellen in vitro nachweisen. Zudem konnten die Autoren eine hohe Dichte von Aktinfilamenten im

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Bereich der apikalen Membran darstellen, was zusammen für eine in-vivo-typische Polarität der Hepatozyten spricht (Zeigerer et al., 2017). Im Gegensatz dazu war die Ausbildung von ZO-1 und Aktinfilamenten bei murinen Hepatozyten in Monolayerkultur nicht an den apikalen Bereich gebunden, sondern ungerichtet über die Zellen verteilt (Zeigerer et al., 2017). Die Autoren untersuchten dabei auch die Repolarisation im zeitlichen Verlauf und stellten fest, dass fünf Tage nach der Isolation, im Gegensatz zu 35 h nach der Isolation, eine deutlich stärkere Ausbildung von ZO-1 in apikalen Membranteilen vorzufinden war. Das Wiedererlangen der Polarität in vitro ist laut Talamini et al. (1997) und Zeigerer et al. (2017) für primäre Hepatozyten entscheidend, um wichtige Zellfunktionen aufrechtzuerhalten bzw. wiederzuerlangen. Wang und Boyer (2004) beschrieben dabei die besondere Bedeutung der Ausbildung von Transportern für Gallensäuren in der apikalen Membran, um eine Störung im Gallensäurestoffwechsel und einer damit einhergehenden Cholestase in den Hepatozyten zu vermeiden. Zeigerer et al. (2017) konnten zudem zeigen, dass primäre murine Hepatozyten in Sandwichkultur an Tag 5 in Kultur Gluconeogenese betrieben und eine ausgeprägtere Insulinsensitivität aufwiesen. In Monolayerkultur war die Insulinsensitivität hingegen nicht wieder ausgebildet worden. Aktuell schlussfolgern Zeigerer et al. (2017), dass die Sandwichkultur ein vielversprechendes Modell darstellt, um die Repolarisation der Hepatozyten in vitro zu erreichen, welche wichtig für die Ausbildung vieler leberspezifischer Funktionen ist.

Die Kultivierung von primären murinen Hepatozyten zwischen zwei Kollagenschichten fördert einerseits die Repolarisation der Zellen und verhindert zudem eine Dedifferenzierung der Zellen in Sandwichkultur im Gegensatz zur Monolayerkultur (Godoy et al., 2009). Als Marker für die Dedifferenzierung der primären Hepatozyten in Kultur kann die Expression des Intermediärfilaments Vimentin herangezogen werden (siehe auch Kapitel 2.3.1.2).

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Literaturübersicht

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Charakterisierung primärer Hepatozyten in Kultur

2.3.1 Möglichkeiten zur Bewertung der Zellvitalität primärer Hepatozyten

Um die Vitalität von primären Hepatozyten beurteilen zu können, eignen sich sowohl morphologische Eigenschaften der Zellen, die durch die Kulturbedingungen beeinflusst werden können, als auch Entzündungsparameter, da inflammatorische Stimuli die PBH schädigen können (Godoy et al., 2009; Vinken et al., 2014).

Zudem können sowohl leberspezifische, metabolische Funktionen und endokrinologische Funktionen zur Bewertung des Zellstatus herangezogen werden (Hewitt et al., 2007; Godoy et al., 2013). Diese werden im Folgenden näher erläutert.

Morphologisches Erscheinungsbild primärer Hepatozyten

Direkt nach der Isolation erscheinen lebende Hepatozyten im Lichtmikroskop rund mit einem hellen Zytoplasma, einem nur andeutungsweise erkennbaren Zellkern und einer lichtbrechenden und dadurch deutlich erkennbaren Zellmembran. Sie liegen meist einzeln oder in kleinen Gruppen von zwei bis fünf Zellen vor (Klaunig et al., 1981).

Als Antwort auf eine anhaltende Hypoxie bilden sich auf der Oberfläche der Hepatozyten zytoplasmatische Ausstülpungen der Plasmamembran, die im Englischen auch als „blebs“ bezeichnet werden (Kim und Southard, 1999). Kim und Southard (1999) konnten eine zunehmende Ausbildung dieser „blebs“ während der kalten Ischämiezeit feststellen, welche sie auf eine Störung des Zytoskeletts zurückführten. Nach Herman et al. (1988) lässt sich die Bildung von „blebs” in drei Grade einteilen. Grad 1 beschreibt die Ausbildung mehrerer, kleiner „blebs“, die bei Grad 2 an Volumen zunehmen und zu größeren Ausstülpungen der Zellmembran fusionieren. Bei Grad 3 kommt es zur Schädigung der Plasmamembran, wodurch diese für ungerichtete Ionenströme durchlässig wird. „Blebs“ vom Grad 1 und 2 sind bei Reoxygenierung reversibel, wohingegen die des dritten Grades auch bei Reoxygenierung irreversibel sind und zum Zelltod führen (Herman et al., 1988). Frisch isolierte Hepatozyten mit nur einigen kleinen „blebs“ und einer Viabilität von über 70 %

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wurden von Hewitt (2010) nach Trypanblau-Färbung als Hepatozyten mit guter Qualität für die Kultivierung und Kryokonservierung definiert.

Laut Literatur haben verschiedene Faktoren einen Effekt auf die Morphologie primärer Hepatozyten in Kultur. Auf den Einfluss der EZM im Zusammenhang mit den verschiedenen Kultivierungsmodellen Monolayer- und Sandwichkultur wurde schon in Kapitel 2.2.2 eingegangen.

Aber auch die Inhaltsstoffe des Kulturmediums haben einen Einfluss auf die Morphologie der primären Hepatozyten. Laishes und Williams (1976a) erkannten schon früh die Notwendigkeit einer komplexen Mediumzusammensetzung für erfolgreiche Studien an primären Rattenhepatozyten. Bei Zusatz des Glucocorticoids Dexamethason zum Kulturmedium zeigten primäre Hepatozyten an Tag 6 in Monolayerkultur eine polygonale Morphologie und die Zellen lagen in Nestern dicht zusammen (Laishes und Williams, 1976a). Dagegen waren die Hepatozyten ohne Zusatz von Dexamethason vereinzelt und wiesen längliche Zellformen auf. War Insulin dem Medium zugesetzt, so bildeten die kultivierten Zellen zytoplasmatische Ausläufer aus. Laishes und Williams (1976a) erhoben den Verdacht, dass es einen Zusammenhang zwischen der Änderung der Morphologie der Hepatozyten unter Insulin und der Erhaltung der in-vivo-ähnlichen Morphologie unter Dexamethason mit der Überlebenszeit der Hepatozyten in Kultur gibt. Denn analog zur hepatozytenspezifischen Morphologie überlebten die mit Dexamethason kultivierten Zellen deutlich länger als die mit Insulin kultivierten Hepatozyten.

Vimentin als Marker für Dedifferenzierung primärer Hepatozyten

Ein viel diskutiertes und bereits erwähntes Problem bei der Kultivierung primärer Hepatozyten ist die Dedifferenzierung der Zellen in Kultur (Godoy et al., 2009, 2010).

Godoy et al. (2009) führten Vimentin als Marker der Dedifferenzierung bei primären murinen Hepatozyten an. Die Expression von Vimentin ist typisch für mesenchymale Zellen und nicht für epitheliale Zellen (Moll, 1998; Omary, 2004) und sollte daher in primären Hepatozyten nicht nachweisbar sein (Godoy et al., 2009). Im Englischen wird die Ausbildung mesenchymaler Eigenschaften durch epitheliale Zellen auch als

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Literaturübersicht

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„epithelial-mesenchymal transition“, kurz EMT, bezeichnet. Diese Änderung des Zelltyps kann während der Embryogenese bei der Entwicklung der verschiedenen Keimblätter beobachtet werden (Thiery und Sleeman, 2006). Im Gegensatz zu diesem physiologischen Prozess findet EMT laut Thiery und Sleeman (2006) auch bei Krankheitsprozessen statt, wie bei der Ausbildung von Fibrosen und bei der Entwicklung von Tumoren. Zur Untersuchung der EMT greift man in Studien und auch bei der Untersuchung des Ursprungsgewebes eines Tumors auf einige molekulare Unterschiede zwischen epithelialen und mesenchymalen Zellen zurück (Moll, 1998;

Omary, 2004).

Bei Untersuchungen zur EMT an primären Hepatozyten konnte unter anderem eine erhöhte Expression von Vimentin bei kultivierten Hepatozyten, im Gegensatz zu Hepatozyten direkt nach der Isolation, beobachtet werden (Ju et al., 2006; Godoy et al., 2009). Bei primären murinen Hepatozyten an Tag 4 in Monolayerkultur war die Expression von Vimentin deutlich erhöht im Vergleich zu Hepatozyten an Tag 4 in Sandwichkultur, was sich auch an der geänderten fibroblastenartigen Morphologie der Hepatozyten in Monolayerkultur widerspiegelte (Godoy et al., 2009). Schon nach 12 h in Monolayerkultur konnten Baker et al. (2001) eine deutlich verstärkte Expression von Vimentin in primären Hepatozyten von Ratten feststellen und interpretierte dies als Folge der Dedifferenzierung.

In Studien zur EMT von murinen Hepatozyten konnte nicht nur durch die Kultivierung im Sandwich, sondern auch durch Zusatz von Dexamethason in das Kulturmedium eine verminderte Expression des mesenchymalen Markers Vimentin erreicht werden (Godoy et al., 2010). Bei Hepatozyten in Sandwichkultur folgte auf den Zusatz von Insulin eine höhere Expression von Vimentin als ohne Zusatz von Insulin oder Dexamethason und die Kombination aus Insulin und Dexamethason ins Medium erbrachte die niedrigste Expression von Vimentin (Godoy et al., 2010).

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Aktivität der Laktatdehydrogenase im Kulturmedium als indirekter Vitalitätsparameter primärer Hepatozyten

Die Laktatdehydrogenase (LDH) ist ein lösliches, zytoplasmatisches Enzym, welches in nahezu allen Geweben vorkommt, und bei Schädigung der Plasmamembran in den extrazellulären Raum austreten kann. Aus diesem Grund lässt sich aus der Höhe der LDH-Aktivität im Zellkulturmedium auf die Menge der kultivierten Zellen rückschließen, welche Membranschäden aufweisen, was auf einen nekrotischen Zelltod hinweist (Mitchell et al., 1980; Maes et al., 2015). Die LDH-Aktivität im Medium wird deshalb als indirekter Marker der Zellvitalität verwendet.

Während der Kultivierung von primären Hepatozyten im Monolayer kam es im Vergleich zum Sandwich im zeitlichen Verlauf zu einer stärkeren Freisetzung von LDH ins Kulturmedium, was auf eine schlechtere Vitalität der Hepatozyten im Monolayer schließen lässt (Puviani et al., 1998). Auch Tuschl et al. (2009) konnten ab Tag 5 in Kultur eine höhere LDH-Aktivität im Medium bei Rattenhepatozyten in Monolayerkultur im Vergleich zur Sandwichkultur feststellen, was auf schlechtere Kultivierungsbedingungen in Monolayerkultur schließen lässt. Sidhu et al. (2004) konnten zeigen, dass Dexamethason einen großen Einfluss auf die Vitalität von primären Rattenhepatozyten hat. Bei Zusatz von Dexamethason in das Kulturmedium waren die LDH-Aktivitäten im Medium bei Hepatozyten in Sandwichkultur deutlich niedriger als ohne das Hormon (Sidhu et al., 2004).

NF-κB als Entzündungsparameter primärer Hepatozyten

Im Rahmen dieser Dissertation wurde NF-κB als Entzündungsparameter herangezogen, um die Vitalität von PBH im Verlauf der Kultivierung einschätzen zu können. In anderen Studien konnte im Rahmen der Isolation primärer Hepatozyten bereits die Aktivierung von NF-kB gezeigt werden. Paine und Andreakos (2004) brachten dies unter anderem mit einer Verunreinigung der Kollagenase mit bakteriellen LPS in Verbindung. Laut verschiedener Studien führen LPS zu Entzündungsreaktionen in den Hepatozyten, die vor allem durch die Aktivierung von Entzündungsparametern, wie NF-κB, bestimmt sind und der damit verbundenen

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Ausschüttung von Zytokinen (Elaut et al., 2006; Vinken et al., 2014). NF-κB ist ein Transkriptionsfaktor, welcher zuerst in B-Zellen als Enhancer von kappa-Leichtketten entdeckt wurde (Sen und Baltimore, 1986). Später fand man funktionelle Bindungsstellen von NF-κB in den Promotoren vieler Gene, von denen die meisten nicht B-Zell-spezifisch waren (Baldwin, 1996). Als ubiquitärer Transkriptionsfaktor bindet NF-κB sequenzspezifisch an die genomische Desoxyribonukleinsäure (DNA) im Bereich von Promotoren von mehr als 150 Genen, um die Umsetzung der DNA in Ribonukleinsäure (RNA) zu regulieren und ist so in Prozesse des Zellzyklus, der Zell- und Gewebedifferenzierung, der DNA-Reparatur und der Immunantwort involviert (Panday et al., 2016). Dabei wird die Rolle von NF-κB als Mediator von Entzündungsprozessen als besonders wichtig eingeschätzt, da die NF-κB-Aktivierung im Zusammenhang mit vielen Erkrankungen beobachtet werden konnte (Baltimore, 2009). Immunologische Stimuli, die zur NF-κB-Aktivierung führen, sind zum Beispiel TNF, IL-1, LPS und T-Zell-Aktivatoren (Baldwin, 1996). Darüber hinaus werden auch ROS als mögliche Aktivatoren von NF-κB angeführt (Baldwin, 1996; Panday et al., 2016). Des Weiteren konnte an PBH neonataler Kälber gezeigt werden, dass durch die Kultivierung mit SCFA und mit erhöhten Glucosekonzentrationen eine Aktivierung des NF-κB-Signalwegs mit Ausschüttung von proinflammatorischen Zytokinen ausgelöst werden konnte, was für die Initiation einer Entzündungsreaktion durch SCFA und durch erhöhte Glucosekonzentrationen in PBH spricht (Shi et al., 2015; Li et al., 2016).

Die NF-κB-Familie besteht aus folgenden fünf Mitgliedern, welche alle eine gut konservierte Rel-Homologie-Domäne tragen: NF-κB 1 (p50/p105), NF-κB 2 (p52/p100), RelA (p65), RelB und c-Rel (Baldwin, 1996). Diese Rel-Homologie-Domäne ermöglicht die Bildung von Dimeren innerhalb der NF-κB-Familie, wobei das am häufigsten in nahezu allen Zelltypen vorkommende Dimer aus einer p50- und p65-Untereinheit besteht (Panday et al., 2016). Die Bildung dieser Dimere aus den beschriebenen Untereinheiten und ihre anschließende Translokation aus dem Zytoplasma in den Nucleus der Zelle werden durch die konstante Bindung von Inhibitorproteinen, den IκBs, und von den Vorläufern p100 und p105 verhindert (Baeuerle und Baltimore, 1988; Beg und Baldwin, 1993; Hayden und

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Ghosh, 2008). Diese Inhibition beruht auf einer Bindung der Ankyrin-Repeat-Proteine der Inhibitoren an homologe Ankyrin-Repeat-Proteine der Dimere (Siebenlist et al., 1994; Baeuerle und Henkel, 1994). Entscheidend für die NF-κB-Aktivierung ist ein Stimulus, der die IκB-Kinase aktiviert, welche das Inhibitorprotein phosphoryliert, welches anschließend durch Ubiquitinierung degradiert wird (Henkel et al., 1993;

Alkalay et al., 1995). Durch Entfernung des Inhibitorproteins kann sich ein Dimer ausbilden und in den Zellkern gelangen. Laut Krappmann und Scheidereit (1997) stellt die schnelle Resynthese von IκBα einen Feedback-Mechanismus dar, um NF-κB nach einem Stimulus zu inaktivieren. Aufgrund dieses Mechanismus ließ sich in Studien durch Messung der relativen Genexpression von IκBα indirekt auf die NF-κB-Aktivierung rückschließen (Bottero et al., 2003; Paciolla et al., 2011).

2.3.2 Leberspezifische Funktionen primärer Hepatozyten Metabolische Funktionen primärer Hepatozyten

Zum Nachweis leberspezifischer Funktionen während der Kultivierung können laut Literatur verschiedene Enzymaktivitäten, die eine leberspezifische Stoffwechselleistung anzeigen oder hepatozytenspezifische Metabolite, die ins Zellmedium abgegeben werden, herangezogen werden.

In Kapitel 2.1.1.2 wurde bereits erwähnt, dass beim ruminierenden Tier die mit der Nahrung aufgenommene Glucose im Pansen durch Mikroorganismen vorwiegend zu SCFA abgebaut wird und deshalb in der Leber ein hohes Maß an Gluconeogenese nötig ist (Bergman, 1990; Baldwin et al., 2004). In der Literatur wird daher die Expression der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) herangezogen, um Änderungen der Gluconeogeneserate zu messen, da PEPCK eine umsatzsteuernde Reaktion bei der Gluconeogenese katalysiert (Rognstad, 1979; Pilkis und Granner, 1992). PEPCK setzt dabei Oxalacetat und Guanosintriphosphat zu Phosphoenolpyruvat, Guanosindiphosphat und Kohlenstoffdioxid um (Hanson und Garber, 1972). Es gibt zwei PEPCK-Typen, die anhand ihrer Lokalisation in der Zelle unterschieden werden, wobei ein Typ im Zytoplasma und ein anderer in den Mitochondrien vorkommt. Die mitochondriale PEPCK wird konstitutiv exprimiert,

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wohingegen die messenger RNA (mRNA)-Expression der zytoplasmatischen Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK-C) durch Insulin herunterreguliert werden kann (Hanson und Garber, 1972), was an PBH vom Kalb gezeigt werden konnte (Zhang et al., 2016a). Hohe Gluconeogeneseraten in Form einer erhöhten Expression der PEPCK-C werden in vivo mit einer erhöhten Bereitstellung von Substraten, hier vor allem Propionat, in Verbindung gebracht (Greenfield et al., 2000;

Reynolds et al., 2003). Laut Young (1977) und Bergman (1990) stellt Propionat beim ruminierenden Tier den wichtigsten Ausgangsstoff für die Gluconeogenese dar. In einer Studie zur Untersuchung der Gluconeogeneserate an PBH von Kälbern konnte in vitro, ähnlich zu den in-vivo-Verhältnissen, ebenfalls eine Steigerung der PEPCK-C mRNA-Expression nach Zugabe von Propionat beobachtet werden (Zhang et al., 2016a). Die PEPCK-C mRNA-Expression wurde auch im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgrund seiner Schlüsselfunktionen bei der Gluconeogenese zur Beurteilung der metabolischen Funktionen der PBH in Kultur herangezogen.

Weitere Metaboliten, die zur Beurteilung leberspezifischer Funktionen von primären Hepatozyten während der Kultivierung herangezogen wurden, sind Harnstoff und Albumin.

In vivo wird in Hepatozyten das aus dem Aminosäurestoffwechsel stammende Ammoniak zu Harnstoff umgewandelt und in das sinusoidale Blut abgegeben, um in Folge über die Nieren ausgeschieden zu werden (Meijer et al., 1990). Die Harnstoffsynthese und –sekretion ins Kulturmedium wird zur Bewertung der hepatozytenspezifischen Funktion von primären Rinderhepatozyten in Kultur herangezogen (Donkin und Armentano, 1993; Knobeloch et al., 2012; Shulman und Nahmias, 2012; Zhang et al., 2012; Ehrhardt und Schmicke, 2016).

Die Expression und Sekretion von Albumin in das Kulturmedium dienen ebenfalls zur Bewertung der leberspezifischen Funktionen von primären Hepatozyten in Kultur, da Albuminsynthese in vivo in Hepatozyten stattfindet (Spotorno et al., 2006; Zhang et al., 2012; Jiang et al., 2013; Shulman und Nahmias, 2013; Panda et al., 2015).

Vergleicht man nun die oben beschriebenen Kultivierungsmodelle anhand der metabolischen Sekretion von Harnstoff und Albumin, so konnten Dunn et al. (1991) bei