Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss des bovinen Trächtigkeitssignals
Interferon-τ auf maternale hepatische Funktionen im Modell primärer Hepatozyten
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Kai Josef Endriß
Sigmaringen
Hannover 2019
Wissenschaftliche Betreuung: Frau JProf. Dr. Marion Schmicke (geb. Piechotta) Tierärztliche Hochschule Hannover,
Klinik für Rinder, AG Endokrinologie
1. Gutachterin: Frau JProf. Dr. Marion Schmicke (geb. Piechotta) 2. Gutachterin: Frau Prof. Dr. Maren von Köckritz-Blickwede
Tag der mündlichen Prüfung: 25.04.2019
Gefördert durch J & G Bruns Stiftung
Für meine Familie
I
Teile dieser Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt bzw. zur Vorstellung eingereicht:
K. Endriß, M. Schmicke (Piechotta)
Einfluss des bovinen Trächtigkeitssignals Interferon-tau (IFNτ) auf maternale hepatische Funktionen im Modell primärer Hepatozyten In Makrophagen-Kokulturen
Seminarreihe Buiatrik der Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 12.06.2018
K. Endriß, M. Schmicke (Piechotta)
Frühe embryonale Mortalität: Primäre bovine Hepatozyten als Modell zur Untersuchung embryo-maternaler Kommunikation
Agrarwissenschaftliches Symposium 2018: Bedürfnisse der Nutztiere - erkennen, verstehen, handeln
Freising 27.09.2018
K. Endriß, M. Meyerholz, M. Schmicke (Piechotta)
Applicability of bovine hepatocytes in co-cultivation with macrophages to mimic systemic effects of embryo-maternal interaction in-vitro
52. Jahrestagung Physiologie und Pathologie der Fortpflanzung Göttingen 20.02.2019 bis 22.02.2019
K. Endriß, M. Schmicke (Piechotta)
Influence of the bovine pregnancy signal interferon tau (IFNτ) on maternal liver studied in a primary hepatocyte model
3rd Symposium of the Virtual Center for Replacement/Complementary Methods to Animal Testing of the University of Veterinary Medicine Hannover Hannover 28.03.2019
II
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ... 1
2 LITERATUR ... 5
2.1 Leber ... 5
2.2 Leberzellkultur ... 7
2.3 Typ-1 Interferone ... 11
2.3.1 Allgemeine Einführung Typ-1 Interferone ... 11
2.3.2 Interferon-tau ... 15
2.3.2.1 Geschichte ... 15
2.3.2.2 Wirkung von Interferon-τ ... 21
2.3.3 Typ-1-Interferon-Rezeptor ... 28
3 MATERIAL UND METHODEN ... 33
3.1 Isolation der Leberzellen und der NPC ... 33
3.2 Gewinnung vitaler boviner primärer Hepatozyten ... 38
3.3 Gewinnung boviner Kupffer`scher Sternzellen ... 40
3.4 Vorbereitung der Kulturplatten ... 41
3.5 Kultivierung der Zellen ... 42
3.5.1 Hepatozytenkultur als Sandwich-Monokultur ... 42
3.5.2 Hepatozytenkultur als indirekte Sandwich-Ko-Kultur mit Kupffer`schen Sternzellen ... 42
3.5.3 Allgemeines Vorgehen während der Kultivierung ... 43
3.5.4 Ende der Kultivierung und Gewinnung der Proben ... 44
3.6 Versuchsansätze ... 45 3.6.1 Basalwerte für die Genexpression in Hepatozyten vor der Kultivierung 45
III
3.6.2 Bestimmung der Genepression von Hepatozyten in Mono- und Ko-Kultur
ohne Stimulation ... 46
3.6.3 Bestimmung der Genexpression von Hepatozyten in Mono- und Ko- Kultur nach Stimulation mit IFNτ ... 47
3.6.4 Bestimmung des Einflusses der Stimulation von Hepatozyten mit IFNα und IFNτ in Mono-und Ko-Kultur ... 49
3.6.5 Einfluss von Imrestor® auf die Genexpression der Hepatozyten bei gleichzeitiger Stimulation mit IFNτ in Ko-Kultur ... 51
3.6.6 Einfluss verschiedener Konzentrationen von P4 auf die Genexpression der Zielgene in Hepatozyten ... 53
3.7 Morphologische Beurteilung der Hepatozytenkultur ... 55
3.8 Laboranalysen ... 55
3.8.1 Harnstoff ... 55
3.8.2 Laktat Dehydrogenase ... 56
3.9 Analyse der Genexpression in Hepatozyten ... 57
3.9.1 RNA-Extraktion ... 57
3.9.2 Bestimmung der RNA Konzentration ... 58
3.9.3 cDNA- Synthese nach DNase Verdau ... 58
3.9.4 Quantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion... 60
3.10 Auswertung der Ergebnisse ... 63
4 ERGEBNISSE ... 65
4.1 Beurteilung der Viabilität kultivierter Hepatozyten ... 65
4.1.1 Morphologische Bewertung der Hepatozyten ... 65
4.1.2 Harnstoffkonzentration ... 67
4.1.3 Laktat Dehydrogenase Konzentration ... 68
4.1.4 Albumin mRNA Expression ... 69
IV
4.2 Auswertung der Genexpression der einzelnen Versuchsansätze ... 70 4.2.1 Versuchsansatz 1: Basale Genexpression in Hepatozyten nach der Gewinnung und Dichtegradientenzentrifugation ... 70 4.2.2 Versuchsansatz 2: Bestimmung der Genexpression von Hepatozyten in Mono- und Ko-Kultur ohne Stimulation ... 73
4.2.2.1 Relative Genexpression von MX-1, ISG-15, CXCL-5, CXCL-10 .... 73 4.2.2.2 Relative Genexpression von IGF-1 und IGFBP-2 ... 77 4.2.3 Versuchsansatz 3: Bestimmung der Genexpression von Hepatozyten in Mono- und Ko-Kultur nach unterschiedlicher Stimulation mit IFNτ ... 80
4.2.3.1 Relative Genexpression nach Stimulation der Kultur an Tag 3 ... 80 4.2.3.1.1 Relative Genexpression von MX-1, ISG-15, CXCL-5, CXCL-10 80 4.2.3.1.2 Relative Genexpression von IGF-1 und IGFBP-2 ... 84 4.2.3.2 Relative Genexpression nach Stimulation der Kultur an Tag 4 ... 86 4.2.3.2.1 Relative Genexpression von MX-1, ISG-15, CXCL-5, CXCL-10 86 4.2.3.2.2 Relative Genexpression von IGF-1 und IGFBP-2 ... 91 4.2.4 Versuchsansatz 4: Bestimmung des Einflusses der einzelnen und zeitgleichen Stimulation von Hepatozyten mit IFNα und IFNτ in Mono- und Ko- Kultur ... 93 4.2.4.1 Relative Genexpression von MX-1, ISG-15, CXCL-5, CXCL-10, IFNAR-1, IFNAR-2 ... 93 4.2.4.2 Relative Genexpression von IGF-1 und IGFBP-2 ... 100 4.2.5 Versuchsansatz 5: Einfluss von Imrestor® auf die Genexpression der Hepatozyten in Ko-Kultur bei gleichzeitiger Stimulation mit IFNτ ... 103
4.2.5.1 Relative Genexpression von MX-1, ISG-15, CXCL-10, TNFαR ... 104 4.2.5.2 Relative Genexpression von IGF-1 ... 108 4.2.6 Versuchsansatz 6: Einfluss verschiedener Konzentrationen von P4 auf die ISG-Expression in Hepatozyten ... 109
V
4.2.6.1 Relative Genexpression von MX-1, ISG-15, CXCL-5, CXCL-10 .. 109
4.2.6.2 Relative Genexpression von IGF-1, IGFBP-2 ... 114
5 DISKUSSION ... 116
5.1 Vergleichbarkeit der Hepatozytenkulturen gewonnen aus unterschiedlichen Spendertieren ... 116
5.2 Erfolgreiche Kultivierung der Hepatozyten ... 120
5.3 Vergleich der unterschiedlichen Kultivierungsmethoden ... 123
5.4 Einfluss der unterschiedlichen Kultivierungsdauern auf die Zielgenexpression ... 127
5.5 Stimulation der primären bovinen Hepatozyten mit IFNτ ... 132
5.6 Einfluss einer gleichzeitigen Stimulation mit IFNτ und IFNα ... 135
5.7 Einfluss von Imrestor® auf die Zielgenexpression in Hepatozyten ... 139
5.8 Einfluss von P4 auf die ISG-Expression in primären bovinen Hepatozyten .... ... 141
6 AUSBLICK ... 148
7 ZUSAMMENFASSUNG ... 151
8 SUMMARY ... 155
9 LITERATURVERZEICHNIS ... 159
10 ANHANG ... 187
10.1 Geräte ... 187
10.2 Verbrauchsmaterialien ... 188
10.3 Chemikalien ... 189
10.4 Kits ... 191
11 DANKSAGUNG ... 192
VI
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
S 18 18S Ribosomal
Abb. Abbildung
AG Arbeitsgruppe
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CaCl2 Calciumchlorid
CARD- Domain Caspase-recruitment-Domain
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid
Cl Corpus luteum, Gelbkörper
cm Centimeter
CXCL-5 C-X-C motif chemokine ligand 5 CXCL-10 C-X-C motif chemokine ligand 10
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate dsRNA Double-stranded ribonucleic acid
EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat eIF2 Eukaryotischer Initiationsfaktor 2
FBS Fetales bovines Serum
g Gramm
GH Growth Hormon
GHR-1A Growth Hormon Receptor-1A
h Stunden
HEPES Hydroxyethylpiperazin-Ethansulfonsäure
IFN Interferon
IFNα Interferon-alpha
VII
IFNβ Interferon-beta
IFNγ Interferon-gamma
IFNτ Interferon-tau
IFNAR-1 Typ 1 Interferonrezeptoruntereinheit 1 IFNAR-2 Typ 1 Interferonrezeptoruntereinheit 2 IGF-1 Insulin-like-growth-factor-1
IGFBP-2 Insulin-like-growth-factor-binding-protein-2 IRF 9 Interferon regulatory factor 9
ISG Interferon stimulated genes
ISG-15 Interferon-stimuliertes Gen 15 kDA ISRE Interferon-stimulated response element ITS Insulin-Transferrin-Selen
Jak 1 Janus Kinase 1
KH Kaliumhydrid
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
LDH Laktatdehydrogenase
MDA5 Melanom-Differenzierungsantigen 5
min Minuten
ml Milliliter
mM Milli-Mol
mRNA Messenger ribonucleic acid
mU Milli-Units
MuLV Murine Leukemia Virus
MX-1 Myxovirus-resistentes Protein-1 MX-2 Myxovirus-resistentes Protein-2
NaCl Natriumchlorid
NaOH Natriumhydroxid
ncpBVDV Nicht-cytopathogenes Bovine Virusdiarrhoe-Virus NF-κB Nuclear factor-kappa-B
ng Nanogramm
VIII
nmol Nanomol
NPC Nicht-parenchymale Zellen
NRT Non Reverse Transkriptase
OAS1 2´-5´Oligoadenylat-Synthetase 1
P4 Progesteron
PBS Phosphate Buffered Saline
PEG bG-CSF Pegylierter boviner Granulozyten-Kolonie stimulierender Faktor
PGE Prostaglandin E
PGF Prostaglandin F
PGF2α Prostaglandin F2α
PGFM 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α
PKR Proteinkinase R
qRT- PCR Quantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion RIG-I Retinoic-acid-inducible Gene I
RNA Ribonucleic acid
RNase Ribonuklease
sek Sekunden
STAT 1 Signal transducer and activator of transcription 1 STAT 2 Signal transducer and activator of transcription 2 TNFαR Tumor Necrosis Factor-Alpha Receptor
Tyk 2 Tyrosin Kinase 2
WEM William`s E Medium
IX
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Veranschaulichung der Fragestellung ... 4 Abbildung 2: Anatomischer Aufbau der Leber eines Rindes... 5 Abbildung 3: Unterschiedliche Kultivierungsformen von primären Hepatozyten: 1) Hepatozytenkultur als Monolayer, Kollagenschicht auf der sich die Hepatozyten befinden, bedeckt von einem Erhaltungsmedium; 2) Hepatozytenkultur als Sandwich- Monokultur, Hepatozyten zwischen zwei Kollagenschichten und darüber das Erhaltungsmedium; 3) Hepatozytenkultur als direkte Sandwich-Ko-Kultur, Hepatozyten und Kupffer`sche Sternzellen in direktem Kontakt zwischen zwei Schichten Kollagen und darüber das Erhaltungsmedium; 4) Hepatozytenkultur als indirekte Sandwich-Ko-Kultur, Hepatozyten zwischen 2 Kollagenschichten und über der zweiten Kollagenschicht Kupffer`sche Sternzellen, darüber das Erhaltungsmedium; Himmelblau: Kollagenschicht, Orange: Hepatozyten, Schwarz:
Kupffer`sche Sternzellen, Pink: Nährmedium ... 10 Abbildung 4: Einteilung der Interferone aufgrund struktureller und funktioneller Eigenschaften in drei Gruppen nach Tizard (2018) ... 13 Abbildung 5: Dreidimensionale Struktur des ovinen Interferon-tau (grün und blau) im Vergleich zum humanen Interferon-alpha-2b (cyan und gold) Roberts 2007 modifiziert nach Endriß 2019 (Ct-2b: C-Terminus des humanen Interferon-alpha-2b;
Nt-2b: N-Terminus des humanen Interferon-alpha-2b; Ct-tau: C-Terminus des ovinen Interferon-tau; Nt-tau: N-Terminus des ovinen Interferon-tau) ... 20 Abbildung 6: Darstellung der Abläufe bei der Bindung von Interferon an den Rezeptor Uzé et al. 2007 modifiziert nach Endriß 2019 ... 29 Abbildung 7: Darstellung der Entnahmelokalisation des Leberteilstücks (a, b ), Spülen des Lobus caudatus (c,d), Durchführung der 3-Schritt Kollagenaseperfusion (e,f,g) bis zur Gewinnung des Zellpelett (h) ... 37 Abbildung 8: 50 ml Falcon® Röhrchen nach Percoll-Dichtegradientenzentrifugation, im Pellet befinden sich vitale Hepatozyten und im Überstand geschädigte Zellen und nicht-parenchymale Zellen... 39
X
Abbildung 9: Veranschaulichung von Versuchsansatz 2 zur Untersuchung der Genexpression von Hepatozyten in Mono- und Ko-Kultur ohne Stimulation im zeitlichen Kulturverlauf ... 46 Abbildung 10: Veranschaulichung von Versuchsansatz 3 zur Untersuchung der Genexpression von Hepatozyten in Mono- und Ko-Kultur nach Stimulation mit Interferon-tau (IFNτ) ... 48 Abbildung 11: Veranschaulichung von Versuchsansatz 4 zur Untersuchung des Einflusses der Stimulation von Hepatozyten mit Interferon-alpha (IFNα) und Interferon-tau (IFNτ) in Mono-und Ko-Kultur ... 50 Abbildung 12: Veranschaulichung von Versuchsansatz 5 zur Untersuchung des Einflusses von Imrestor® auf die Genexpression der Hepatozyten bei gleichzeitiger Stimulation mit Interferon-tau (IFNτ) in Ko-Kultur ... 52 Abbildung 13: Veranschaulichung von Versuchsansatz 6 zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Konzentrationen von Progesteron auf die Genexpression in Hepatozyten, bei gleichzeitiger Stimulation mit Interferon-tau (IFNτ) ... 54 Abbildung 14: Mikroskopische Aufnahme einer Hepatozyten Ko-Kultur an Tag 4 mit polygonaler Form der Zellen, Ausbildung von Zell-Zellkontakten und Entstehung von Gallenkanälchen. Aufgenommen mittels des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M. ... 66 Abbildung 15: Mikroskopische Aufnahme von Kupffer`schen Sternzellen bei separater Kultivierung an Tag 4 mit Ausbildung sternförmiger Zellausläufer.
Aufgenommen mittels des inversen Phasenkontrastmikroskops Axiovert 200M. ... 66 Abbildung 16: Harnstoffkonzentration [nmol/well] in den Mediumüberständen der Hepatozytenkultur an Tag 4 der Kultivierung gruppiert entsprechend der Versuchsansätze ... 67 Abbildung 17: Laktat Dehydrogenase (LDH) Konzentration [mU/well] in den Mediumüberständen der Hepatozytenkultur an Tag 4 der Kultivierung gruppiert nach den einzelnen Versuchsansätzen ... 68 Abbildung 18: Relative Genexpression von Albumin in Bezug auf das Housekeeper- Gen ribosomal RNA S 18 in den Hepatozyten zum Zeitpunkt des Endes der Kultivierung gruppiert nach dem entsprechenden jeweiligen Versuchsansatz. ... 69
XI
Abbildung 19: Relative Expression der Gene Myxovirus-resistentes Protein-1 (MX- 1), Interferon-stimuliertes Gen 15 kDA (ISG-15), Chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL-5) und Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten direkt nach Isolation und Dichtegradientenzentrifugation. ... 70 Abbildung 20: Relative Genexpression der Gene Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) und Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP-2) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten direkt nach Isolation und Aufreinigung . 71 Abbildung 21: Relative Genexpression von Myxovirus-resistentes Protein-1 (MX-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko- Kultur an den Tagen 1, 2, 3, 4 nach Kultivierung ... 74 Abbildung 22: Relative Genexpression von Interferon-stimuliertes Gen-15 kDA (ISG-15) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur an den Tagen 1, 2, 3, 4 nach Kultivierung ... 75 Abbildung 23: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL-5) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur an den Tagen 1, 2, 3, 4 nach Kultivierung ... 76 Abbildung 24: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur an den Tagen 1, 2, 3, 4 nach Kultivierung ... 77 Abbildung 25: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko- Kultur an den Tagen 1, 2, 3, 4 nach Kultivierung ... 78 Abbildung 26: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP-2) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur an den Tagen 1, 2, 3, 4 nach Kultivierung ... 79 Abbildung 27: Relative Genexpression von Myxovirus-resistentes Protein-1 (MX-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko- Kultur mit und ohne vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden an Tag 3 nach Kultivierung ... 80
XII
Abbildung 28: Relative Genexpression von Interferon-stimuliertes Gen 15 kDA (ISG- 15) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur mit und ohne vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden an Tag 3 nach Kultivierung ... 81 Abbildung 29: Relative Genexpression von Chemokie (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL- 5) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur mit und ohne vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden an Tag 3 nach Kultivierung ... 82 Abbildung 30: Relative Genexpression von Chemokie (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur mit und ohne vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden an Tag 3 nach Kultivierung ... 83 Abbildung 31: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur mit und ohne vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden an Tag 3 nach Kultivierung ... 84 Abbildung 32: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP-2) relativ zum 2eferenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur mit und ohne vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden an Tag 3 nach Kultivierung ... 85 Abbildung 33: Relative Genexpression von Myxovirus-resistentes Protein-1 (MX-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko- Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden, mit 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden und mit 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 87 Abbildung 34: Relative Genexpression von Interferon-stimuliertes Gen 15 kDA (ISG- 15) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden, mit 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden und mit 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 88
XIII
Abbildung 35: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL-5) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden, mit 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden und mit 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 89 Abbildung 36: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden, mit 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden und mit 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 90 Abbildung 37: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden, mit 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden und mit 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 91 Abbildung 38: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP-2) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) für 2 Stunden, mit 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden und mit 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 92 Abbildung 39: Relative Genexpression von Myxovirus-resistentes Protein-1 (MX-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko- Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 94 Abbildung 40: Relative Genexpression von Interferon-stimuliertes Gen 15 kDA (ISG- 15) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 95
XIV
Abbildung 41: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL-5) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 96 Abbildung 42: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon- alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 97 Abbildung 43: Relative Genexpression von Type I Interferon Receptor Subunit 1 (IFNAR-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon- alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 98 Abbildung 44: Relative Genexpression von Type I Interferon Receptor Subunit 2 (IFNAR-2) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon- alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 99 Abbildung 45: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon-alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 100 Abbildung 46: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP-2) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 0,6 ng/ml Interferon- alpha (α), mit 0,06 ng/ml α, mit 0,6 ng/ml α + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 0,06 ng/ml α + 0,06 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 102
XV
Abbildung 47: Relative Genexpression von Myxovirus-resistentes Protein-1 (MX-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 333 ng/ml Imrestor®, mit 33.333 ng/ml Imrestor®, mit 333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 33.333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 104 Abbildung 48: Relative Genexpression von Interferon-stimuliertes Gen 15 kDA (ISG- 15) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 333 ng/ml Imrestor®, mit 33.333 ng/ml Imrestor®, mit 333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 33.333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 105 Abbildung 49: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Ko- Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 333 ng/ml Imrestor®, mit 33.333 ng/ml Imrestor®, mit 333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 33.333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 106 Abbildung 50: Relative Genexpression von Tumor Necrosis Factor-Alpha Receptor (TNFαR) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Ko- Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 333 ng/ml Imrestor®, mit 33.333 ng/ml Imrestor®, mit 333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 33.333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 107 Abbildung 51: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 333 ng/ml Imrestor®, mit 33.333 ng/ml Imrestor®, mit 333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 33.333 ng/ml Imrestor® + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 108 Abbildung 52: Relative Genexpression von Myxovirus-resistentes Protein-1 (MX-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko- Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 5 ng/ml Progesteron (P4), mit 10 ng/ml P4, mit 5 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 10 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 110
XVI
Abbildung 53: Relative Genexpression von Interferon-stimuliertes Gen15 kDA (ISG- 15) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 5 ng/ml Progesteron (P4), mit 10 ng/ml P4, mit 5 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 10 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 111 Abbildung 54: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL-5) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 5 ng/ml Progeserton (P4), mit 10 ng/ml P4, mit 5 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 10 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 112 Abbildung 55: Relative Genexpression von Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL-10) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 5 ng/ml Progesteron (P4), mit 10 ng/ml P4, mit 5 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 10 ng/ml P4
+ 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 113 Abbildung 56: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 5 ng/ml Progesteron (P4), mit 10 ng/ml P4, mit 5 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 10 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 114 Abbildung 57: Relative Genexpression von Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP-2) relativ zum Referenzgen 18 S ribosomal RNA (S 18) in Hepatozyten Mono- und Ko-Kultur ohne und mit vorheriger Stimulation mit 5 ng/ml Progestern (P4), mit 10 ng/ml P4, mit 5 ng/ml P4 + 0,6 ng/ml Interferon-tau (τ) und mit 10 ng/ml P4
+ 0,6 ng/ml τ für 6 Stunden an Tag 4 nach Kultivierung ... 115
XVII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Zusammensetzung der Stammlösungen und der daraus hergestellten Perfussionspuffer (A-C), A) Konzentrationen der Stammlösungen, B) Herstellerangaben der Zusätze, C) Zusammensetzung der Konzentrationen der
daraus hergestellten Perfussionslösungen ... 34
Tabelle 2: Zusammensetzung des Adhäsions- und Erhaltungsmediums ... 43
Tabelle 3: Spendertiere der Lebern für die Bestimmung der Basalexpression von Zielgenen ... 45
Tabelle 4: Tabellarische Darstellung von Versuchsansatz 3 zur Veranschaulichung der Untersuchung der Genexpression von Hepatozyten in Mono- und Ko-Kultur nach Stimulation mit Interferon-tau (IFNτ) ... 48
Tabelle 5: Tabellarische Darstellung von Versuchsansatz 4 zur Veranschaulichung der Untersuchung des Einflusses der einzelnen und zeitgleichen Stimulation von Hepatozyten mit Interferon-alpha (IFNα) und Interferon-tau (IFNτ) in Mono- und Ko- Kultur ... 50
Tabelle 6: Tabellarische Darstellung von Versuchsansatz 5 zur Veranschaulichung der Untersuchung des Einflusses von Imrestor® auf die Genexpression der Hepatozyten bei gleichzeitiger Stimulation mit Interferon-tau (IFNτ) in Ko-Kultur ... 52
Tabelle 7: Tabellarische Darstellung von Versuchsansatz 6 zur Veranschaulichung der Untersuchung des Einflusses verschiedener Konzentrationen von Progesteron (P4) auf die Genexpression in Hepatozyten, bei gleichzeitiger Stimulation mit Interferon-tau (IFNτ) ... 54
Tabelle 8: Urea Assay Kit: Zusammensetzung der Reaktionsmixes ... 56
Tabelle 9: Zusammensetzung des Mastermixes für die cDNA-Synthese ... 60
Tabelle 10: Zusammensetzung des Mastermixes für die qRT-PCR ... 61
Tabelle 11: Primer für die qRT-PCR ... 62
Tabelle 12: Viabilität der Hepatozyten nach Percoll-Dichtegradientenzentrifugation 65 Tabelle 13: Ratio der einzelnen Zielgene bezogen auf das jeweilige Spendertier ... 72
EINLEITUNG
1
1 EINLEITUNG
In der modernen Rinderhaltung nimmt die Bedeutung der Problematik embryonaler Mortalität zu. So zeigen Studien der Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter e.V., dass im Jahr 2011 bis zu 21% der Abgänge auf deutschen Milchviehbetrieben allein auf eine mangelhafte Fruchtbarkeit zurück zu führen sind (ADR 2013). Da die Befruchtungsraten bei Kühen mit über 80% sehr hoch sind, die Trächtigkeitsraten jedoch teilweise sogar unter 50% liegen, liegt die Vermutung nahe, dass die maternale Erkennung des Embryos und lokale Schutzmechanismen in den ersten Wochen der Trächtigkeit bei der Milchkuh dysreguliert sein könnten (Lonergan et al.
2016; Wiltbank et al. 2016; Zhao et al. 2018; Humblot 2001; Diskin et al. 2006). Ein wichtiger Faktor spielt in diesem Zusammenhang das trächtigkeitserhaltende Glykoprotein Interferon-tau (IFNτ) (Imakawa et al. 2017; Walker et al. 2009; Roberts et al. 2008). IFNτ wird von den mononukleären Zellen des Trophoblasten gebildet und ins uterine Lumen abgegeben (Bazer et al. 1997). IFNτ sorgt auf parakrinem Weg für die Erkennung der frühen Gravidität durch den maternalen Organismus und somit auch für den Erhalt des für die Trächtigkeitsetablierung und -aufrechterhaltung essenziell wichtigen Gelbkörpers (Corpus luteum, Cl) (Demmers et al. 2001; Bazer et al. 1997; Forde et al. 2017; Thatcher et al. 1997). Dies unterscheidet IFNτ von anderen Typ-1 Interferonen. So hat IFNτ nicht nur eine antivirale, immunsuppressive und antiproliferative Wirkung, wie andere Typ-1 Interferone, sondern besitzt vor allem auch antiluteolytische Eigenschaften (Roberts 1989; Bazer et al. 1997; Roberts 2007;
Zhao et al. 2018). IFNτ vermindert die Expression von Oxytozinrezeptoren (Demmers et al. 2001; Robinson et al. 2001) und hemmt auf diesem Wege die endometriale Freisetzung von Prostaglandin F2α (PGF2α). Auf diese Weise wird die Regression des Cl verhindert (Riley et al. 1995; Bazer 2013; Thatcher et al. 1997; Bazer et al.
2008). IFNτ wird im Vergleich zu anderen Typ-1 Interferonen fast ausschließlich vom Konzeptus gebildet. Die anderen Typ-1 Interferone hingegen werden hauptsächlich nach Kontakt des Organismus mit Viren oder anderen Noxen von verschiedenen Immunzellen und Fibroblasten gebildet. Die Expression von IFNτ hingegen ist in diesem Zusammenhang sehr gering (Martal et al. 1979; Martal et al. 1998; Roberts
EINLEITUNG
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et al. 2008; Roberts et al. 1991). Diese Expressionrate von IFNτ erreicht beim Rind bereits an Tag 16 bis Tag 18 nach der Konzeption ein Maximum (Wolf et al. 2003;
Balhara et al. 2013; Farin et al. 1990). Jedoch konnten Meyerholz et al. 2016 nachweisen, dass die Wirkung von IFNτ nicht nur auf das Endometrium begrenzt ist.
Es konnte gezeigt werden, dass in Leberbiopsien von tragenden Färsen der Rasse Holstein Friesian, die an Tag 18 der Trächtigkeit entnommen wurden, eine signifikant höhere Expression von Interferon-stimulierten Genen (ISG), im speziellen von Interferon-stimuliertem Gen 15 kDA (ISG-15) und Myxovirus-resistentem Protein-1 (MX-1) im Vergleich zu nicht tragenden Färsen vorliegt. Daraus lässt sich herleiten, dass es auch zu einer Veränderung der Genexpression in der maternalen Leber auf Grund der Trächtigkeit kommt und somit extrauterine embryo-maternale Interaktionen stattfinden. Ruhmann et al. (2017) verfolgten die These einer Beeinflussung maternaler Leberzellen durch IFNτ weiter und untersuchten in ihrer Studie, ob die vermehrte Expression von ISG auf die parenchymalen Zellen, die Hepatozyten oder auf die nicht-parenchymalen Zellen zurückzuführen ist. Als nicht- parenchymale Zellen der Leber gelten vor allem Endothelzellen, Lymphozyten und Kupffer`sche Sternzellen. Hierfür wurden Leberbiopsien von tragenden und nicht tragenden Färsen immunhistologisch auf die Bildung von 2´-5´Oligoadenylat- Synthetase 1 (OAS1) untersucht. Bei den tragenden Tieren zeigte sich eine deutliche Syntheserate im Bereich der Hepatozyten. Diese konnte bei den nicht tragenden Tieren nicht beobachtet werden, was auf einen bestehenden Zusammenhang zwischen der Trächtigkeit und der Expression dieser Gene in den maternalen Hepatozyten hin deutet (Ruhmann et al. 2017). Außerdem wurde mittels einer Kultivierung von primären Hepatozyten und einer Stimulation dieser mit rekombinantem bovinem IFNτ gezeigt, dass auch noch andere ISG auf eine Stimulation mit IFNτ hin, in Hepatozyten exprimiert werden. So konnte nach Stimulation von primären bovinen Hepatozyten ein Anstieg der Expression von ISG-15, MX-1, Myxovirus-resistentes Protein-2 (MX-2) und OAS1 beobachtet werden (Ruhmann et al. 2017). Für die Versuche wurden Hepatozyten in einer Monolayerkultur verwendet und die Zellen für 24 Stunden vor einer Stimulation mit IFNτ kultiviert. Hierbei werden die Hepatozyten auf eine, mit Kollagen beschichtete,
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Platte gegeben und verbleiben in dieser Form. In neueren Studien hat sich gezeigt, dass diese Form der Kultivierung nicht die tatsächlichen Verhältnisse in der Leber widerspiegeln kann und dass dieses Model der Monolayerkultur daher nur begrenzte Aussagekraft besitzt. So konnte gezeigt werden, dass sich für weitere Versuche das Model einer Sandwich-Kultur gut eignet. In dieser Kultivierungsform befinden sich die Hepatozyten zwischen zwei Schichten aus Kollagen und kommen somit nur indirekt mit dem Kulturmedium in Kontakt. (Witte 2017). Zudem wurden in einer Vorarbeit von Fischbach (2018) verschiedene Kultivierungsmethoden von Hepatozyten in Sandwich Kultur zusammen mit Kupffer`schen Sternzellen in Ko-Kulturen miteinander verglichen, um genauere Aussagen über die tatsächlichen Abläufe und Interaktionen zwischen Hepatozyten und Makrophagen treffen zu können. In der Ko- Kultur mit Makrophagen werden die strukturellen Gegebenheiten der Leber noch näher widergespiegelt, indem über die zweite Schicht Kollagen Kupffer`sche Sternzellen gegeben werden. Somit soll erreicht werden, dass die Verhältnisse im Model möglichst denen im Organismus entsprechen (Fischbach 2018).
EINLEITUNG
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Zur Erforschung extrauteriner embryo-maternaler Interaktionen sind folgende Hypothesen, auf Basis der erwähnten Vorversuche, Bestandteil dieser Arbeit (Abb.
1):
Die Basisexpression der ISG ist unmittelbar nach der Gewinnung der Hepatozyten unabhängig vom Spendertier vergleichbar.
Tag 4 der Kultivierung eignet sich für Stimulationsversuche mit Interferonen an Hepatozyten am besten. Die Kultivierung in Form einer Hepatozyten Ko-Kultur erlaubt genauere Aussagen über die physiologischen Abläufe im Organismus Rind als eine reine Monokultur von Hepatozyten im Sandwich Modell.
IFNτ unterscheidet sich von anderen Typ-1 Interferonen in der Höhe der Expression einzelner ausgewählter ISG in Hepatozyten, sowie im Hinblick auf die Expressionshöhe der Typ-1 Interferon-Rezeptoruntereinheiten.
Das Immunstimulanz Imrestor® beeinflusst die durch IFNτ induzierte ISG-Expression in den maternalen Hepatozyten.
Progesteron (P4) beeinflusst bei gleichzeitiger Stimulation mit IFNτ die Höhe der Expression einzelner Zielgene in der maternalen Leber und spielt auch extrauterin im Hinblick auf die IFNτ induzierte Genexpression in der frühen Trächtigkeit eine elementare Rolle.
Abbildung 1: Veranschaulichung der Fragestellung
LITERATUR
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2 LITERATUR
2.1 Leber
Die Leber stellt für das Säugetier eines der wichtigsten Organe dar und ist für die Homöostase des Organismus elementar wichtig (Donkin et al. 1993). Die Leber ist die größte Drüse des Körpers. Das Aussehen und die Gestalt unterscheiden sich von Tierart zu Tierart. Beim Rind kann man die Leber in einen Lobus hepatis dexter, einen Lobus hepatis sinister, einen Lobus quadratus und einen Lobus caudatus mit einem Processus caudatus und einem Processus papillaris unterteilen (Abb. 2) (Vollmerhaus et al. 2004).
Abbildung 2: Anatomischer Aufbau der Leber eines Rindes
Die Leber ist in ihrer Gesamtheit von einer kollagenfaserigen Kapsel umschlossen (Liebich 2010). Von dieser Kapsel ausgehend ziehen lockere Kollagenfaserbündel in das Leberparenchym und bilden das interstitielle Gewebe und das Grundgerüst der Leber. Sie enthalten die Gefäße, Gallengänge und Nerven, welche zusammen auch als Lebertrias bezeichnet werden. So teilen diese Fasern die Leber in eine große Anzahl einzelner kleinen Leberläppchen (Vollmerhaus et al. 2004). Die Definition dieser einzelnen Läppchen unterscheidet sich je nach der Betrachtungsweise und der Einteilung der genauen Funktion. So ist von dem „periportalen Läppchen mit Lebertrias“ (Liebich 2010) die Rede, sobald der funktionelle Charakter der Leber als exokrine Drüse betrachtet wird. Damit ist die Fläche zwischen dreier Zentralvenen angrenzender Leberläppchen gemeint. Im Zentrum dieser Verbindungslinien befinden sich der Gallengang und die Gefäße, die zwischen den einzelnen Leberläppchen verlaufen. Betrachtet man die Leber hingegen mit vermehrtem Fokus
LITERATUR
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auf die vaskuläre, funktionelle Stoffwechselaktivität, so spricht man von der Einteilung in „terminale Gefäße mit Leberazini“ (Liebich 2010). Hierbei wird der Bereich zwischen zwei Zentralvenen, welcher zu einem Trapez durch die Gefäße zwischen den Leberläppchen ergänzt wird, betrachtet. Mit dieser Einteilung können genauere Aussagen über die Stoffwechselaktivität getroffen werden. Abschließend kann die Leber strukturell-deskriptiv betrachtet werden, wobei es sich um
„polygonalen Läppchen mit Zentralvene“ handelt (Liebich 2010). Bei dieser werden einzelne Leberläppchen mit ihrer Zentralvene als Einheit definiert (Liebich 2010).
Mikroskopisch lassen sich zwei große Zellgruppen in der Leber unterscheiden. Mit 60-70 Prozent stellen hierbei die Hepatozyten, auch als Parenchymzellen der Leber bezeichnet, den größten Anteil am Lebergewebe dar. Die verbleibenden 30 Prozent bestehen aus nicht-parenchymalen Zellen (NPC). Hierzu gehören Endothelzellen, Kupffer`sche Sternzellen, Ito- und Pit-Zellen (Liebich 2010).
Durch diese verschiedenen Zelltypen besitzt die Leber eine Vielzahl an wichtigen Funktionen im Körper. In Bezug auf den Stoffwechsel ist die Leber zentral für den Kohlenhydratstoffwechsel von großer Bedeutung, da vor allem beim Wiederkäuer die nötige Glukoneogenese und auch Glykolyse in der Leber stattfindet. Gerade beim Rind ist der Lipidstoffwechsel, im Speziellen die Ketogenese von großer Bedeutung.
Letztlich ist die Leber auch am Proteinstoffwechsel beteiligt und übernimmt im ruminohepatischen Kreislauf die Rolle der Harnstoffsynthese (von Engelhardt et al.
2010). Jedoch hat die Leber nicht nur Stoffwechselaufgaben. Die Leber dient außerdem als Speicherorgan beispielsweise für das bereits erwähnte Glykogen oder Lipide, aber auch für fettlösliche Vitamine. Des Weiteren spielt die Leber eine wichtige Rolle bei der Entgiftung des Organismus indem über die Galle Toxine und endogene Stoffwechselprodukte sowie schädigende Xenobiotika und Endobiotika ausgeschieden werden (von Engelhardt et al. 2010). Eine elementare Rolle spielen in diesem Zusammenhang auch die Kupffer`schen Sternzellen, welche Teil des mononukleären Phagozytose-Systems sind und phagytotische Aufgaben übernehmen. Mit Hilfe von Endozytose phagozytieren diese Zellen im Blut zirkulierende pathogene Bestandteile wie beispielsweise geschädigte Blutzellen,
LITERATUR
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Immunkomplexe, Fibrin oder auch Bakterien. Außerdem besitzen die Kupffer`schen Sternzellen eine hohe Peroxidase-Aktivität. Ebenfalls von großer Bedeutung ist eine sezernierende Funktion der Kupffer`schen Sternzellen, denn diese Zellen bilden verschiedene Faktoren wie beispielsweise Prostaglandine, Interleukine, Interferone und Tumor-Nekrose-Faktoren und können somit auch die Genexpression der Hepatozyten beeinflussen (Liebich 2010; Bilzer et al. 2006; Altin et al. 1988).
2.2 Leberzellkultur
Zu Beginn der Erforschung der Physiologie der Leber beschränkte sich die Forschung vor allem auf in-vivo Studien. Doch schon sehr früh begannen die ersten Versuche, Leberzellen zu kultivieren um in-vitro genauere Untersuchungen einzelner Abläufe durchführen zu können. So gibt es bereits aus dem Jahr 1953 erste Veröffentlichungen, welche sich mit der Kultivierung von Leberzellen beschäftigen (Anderson 1953). Im Jahr 1969 folgte eine Studie von Friend et al. (1969) in der zum ersten Mal eine zweistufige Perfusion einer Leber beschrieben wurde, mit welcher die parenchymalen Zellen mittels Kollagenase und Hyaluronidase gelöst werden konnten (Friend et al. 1969). Rund zwei Jahrzehnte später begannen die ersten Studien über verschiedene Kultivierungsverfahren der aus der Leber gewonnen Zellen. So verglichen Donkin et al. (1993) die Kultivierung in Form einer Zellsuspension mit der eines Monolayers. Für die Zellsuspension wurde begaster Puffer in einem Erlenmeyerkolben mit Hepatozyten versetzt und diese Suspension bei 37°C inkubiert. Bei Kultivierung in Form eines Monolayers wurden hingegen Hepatozyten auf Kulturplatten gegeben. Nach 4 Stunden Adhäsionszeit wurden die Platten gespült und die losen Zellen entfernt. Alle 24 Stunden wurden das Medium der Platten gewechselt und vitale Zellen waren am Boden der Kulturplatte adhärent.
Deutlich sichtbar waren in dieser Kultivierungsform eine höhere Glukoneogeneserate, sowie eine höhere Ureagenese im Vergleich zu den Hepatozyten in Suspension. So schlussfolgerten Donkin et al. (1993), dass eine Kultivierung der Hepatozyten in Form eines Monolayers ein geeignetes Modell für Studien der chronischen und akuten hormonellen Regulation der Leber darstellt
LITERATUR
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(Donkin et al. 1993). Diese Perfusionstechnik und Kultivierung von Hepatozyten wurde im Laufe der Jahre weiterverfolgt, erforscht und stetig optimiert. Bereits 1996 folgte ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung moderner Zellkulturen. Bader et al.
(1996) etablierten in einer Studie das 3-D Ko-Kulturmodel bestehend aus Hepatozyten und NPC. Hierfür bestückte er mit Kollagen beschichtete Platten mit Hepatozyten, auf welche eine weitere Schicht Kollagen folgte. Auf diese zweite Schicht Kollagen wurde eine NPC-Fraktion zusammen mit einem Nährmedium gegeben (Bader et al. 1996). Jindal et al. (2009) arbeiteten in ihren Versuchen mit einer anderen Methode der Kultivierung. Hierfür mischten Jindal et al. das Kollagen für die erste Kollagenschicht mit der Zellsuspension und gaben diese Mischung in Kulturplatten. Dadurch erreichten Jindal et al. eine Einlagerung der Hepatozyten in die Kollagenschicht (Jindal et al. 2009). Ehrhardt und Schmicke (2016) übertrugen die Methode von Bader et al. (1996) auf die Hepatozytenkultur von Rindern und wendeten die Bilayer-Kultur erstmals bei Rinderhepatozyten an. Diese Kulturform wird auch als sogenannte „Sandwich-Kultur“ bezeichnet. In dieser Kultivierungsform konnte man, im Vergleich zum Monolayer, ebenfalls beim Rind, typische polygonale Strukturen der Hepatozyten erreichen. Außerdem bilden die Hepatozyten in der Sandwich-Kultur Zell-Zell-Kontakte, es zeigen sich deutliche Zellgrenzen und es entstehen Gallengänge. So zeigt sich, dass die Sandwich-Kultur primärer boviner Hepatozyten die Verhältnisse in der Leber in-vivo gut darstellt und die Zellen deutlich funktionaler sind als in einem Monolayer-Kultursystem (Ehrhardt und Schmicke 2016). Witte et al. (submitted 2019) verbesserten das Protokoll von Erhardt und Schmicke (2016) für die Gewinnung von primären Hepatozyten beim Rind nochmals erfolgreich und konnten mehr vitale Zellen gewinnen. Zudem erforschten Witte et al.
(submitted 2019) außerdem den Einfluss der warmen Ischämiezeit, also der Dauer von der Tötung des Tieres bis zur Gewinnung der Hepatozyten. So konnte gezeigt werden, dass es auf Grund einer längeren warmen Ischämiezeit zu einer Schädigung der Hepatozyten kommt (Witte et al., submitted 2019). Einen weiteren Schritt, die physiologischen Verhältnisse in der Leber von Rindern noch genauer im Modell darzustellen, verfolgte Fischbach (2018) in ihrer Arbeit. In dieser Arbeit wurde das von Witte et al. verbesserte Protokoll zur Gewinnung primärer boviner Hepatozyten
LITERATUR
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vom Rind verwendet und jeweils unter und über der zweiten Schicht Kollagen wurde eine weitere Schicht, bestehend aus den Kupffer`schen Sternzellen, den Makrophagen der Leber hinzugegeben (Fischbach 2018). So verglich Fischbach (2018) eine alleinige Kultivierung der Hepatozyten in einer Sandwich-Kultur mit der direkten Hepatozyten-Ko-Kultur, bei welcher sich die Makrophagen ebenfalls unter der zweiten Schicht Kollagen befinden. Außerdem untersuchte Fischbach (2018) die indirekte Hepatozyten-Ko-Kultur, bei welcher die Hepatozyten und die Markrophagen durch die zweite Schicht Kollagen getrennt sind (Abb. 3). Fischbach (2018) stellte die These auf, dass durch diese Form der Ko-Kultur noch genauere Aussagen über die Interaktionen in der Leber und die Synthese einzelner Gene getroffen werden können. So konnte Fischbach (2018) in ihrer Arbeit zeigen, dass die Stoffwechselfunktion der Hepatozyten im gesamten Verlauf der Kultivierung bei der indirekten Ko-Kultur im Vergleich zu den anderen beiden Kultivierungsformen verbessert ist (Fischbach 2018).
Daher lassen sich in der Literatur zum Zeitpunkt der Erstellung dieser Arbeit vier verschiedene Kultivierungsformen unterscheiden, die für die Kultivierung von primären bovinen Hepatozyten genutzt werden und auch Anwendung finden. Diese verschiedenen Kultivierungsformen bieten unterschiedliche Vorteile und Nachteile (Fischbach 2018; Witte et al. 2018; Witte 2017; Ehrhardt und Schmicke 2016; Strang et al. 1998; Yagi et al. 1998; Mashek et al. 2004; Deng et al. 2014). In Abb. 3 sind die verschiedenen Kultivierungsformen dargestellt: Monolayer, Sandwich-Monokultur, Sandwich-Ko-Kultur mit direktem Kontakt der Hepatozyten zu den Kupffer`schen Sternzellen und Sandwich-Ko-Kultur in der die Hepatozyten nur in indirektem Kontakt zu den Makrophagen stehen (Bader et al. 1996; Strang et al. 1998).
LITERATUR
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Abbildung 3: Unterschiedliche Kultivierungsformen von primären Hepatozyten: 1) Hepatozytenkultur als Monolayer, Kollagenschicht auf der sich die Hepatozyten befinden, bedeckt von einem
Erhaltungsmedium; 2) Hepatozytenkultur als Sandwich-Monokultur, Hepatozyten zwischen zwei Kollagenschichten und darüber das Erhaltungsmedium; 3) Hepatozytenkultur als direkte Sandwich- Ko-Kultur, Hepatozyten und Kupffer`sche Sternzellen in direktem Kontakt zwischen zwei Schichten Kollagen und darüber das Erhaltungsmedium; 4) Hepatozytenkultur als indirekte Sandwich-Ko-Kultur, Hepatozyten zwischen 2 Kollagenschichten und über der zweiten Kollagenschicht Kupffer`sche Sternzellen, darüber das Erhaltungsmedium; Himmelblau: Kollagenschicht, Orange: Hepatozyten, Schwarz: Kupffer`sche Sternzellen, Pink: Nährmedium
LITERATUR
11 2.3 Typ-1 Interferone
2.3.1 Allgemeine Einführung Typ-1 Interferone
Isaacs et al. entdeckten und beschrieben 1957 als erste Wissenschaftler die Gruppe der Interferone (Isaacs et al. 1957). Die Autoren versetzten dazu die Chorioallantoismembran von Hühnereiern mit hitze-deaktiviertem Influenza Virus.
Danach wurden die Membranen gespült, um nicht absorbierte Virusanteile zu beseitigen und bei 37°C für einige Stunden inkubiert. Die Membranfragmente wurden danach aus der Kulturflüssigkeit entfernt und neue Membranen hinzugefügt, welche wiederum für 18 bis 24 Stunden bei 37 °C inkubiert wurden. Anschließend wurde aktives Influenzavirus in das Medium gegeben. Die Replikation des aktiven Virus wurde jedoch gehemmt. Als Grund hierfür wurde ein Faktor beschrieben, der durch das mit dem inaktivierten Virus versetzen Gewebe gebildet wird. Dieser Faktor interferiert mit dem aktiven Virus und so entstand der Name Interferon (Isaacs et al.
1957). Erste Erkenntnisse über die Diversität der Gruppen der Interferone erlangten Gresser et al. 1974, die nachweisen konnten, dass das humane Leukozyten- Interferon eine deutlich höhere Aktivität bei Rinder- und Schweinezellen auslöst als das humane Fibroblasten-Interferon. Diese Begebenheit spricht für die Expression unterschiedlicher Interferone durch die unterschiedlichen Ursprungszellen (Gresser et al. 1974; Havell et al. 1975). Auf Basis dieser Erkenntnis wurden die Interferone zu dieser Zeit aufgrund ihres Bildungsortes in Gruppen eingeteilt. Es zeigte sich aber, dass diese ursprüngliche Einteilung der Interferone nach den Ursprungszellen keine geeignete Variante darstellte, da die Diversität der Gruppe der Interferone dadurch nicht abgebildet werden konnte. Aus diesem Grund beschloss 1980 eine Gruppe von Wissenschaftlern die Nomenklatur und Einteilung der Interferone zu überarbeiten und neu zu definieren (Stewart 1980). So werden seit 1980 die Leukozyten- Interferone als Interferonα (IFNα) und die Fibroblasten-Interferone als Interferonβ (IFNβ) bezeichnet. IFNα ist hierbei definiert über die Größe, die Ladung und die Sequenzen einzelner Aminosäuren. Ebenfalls von Bedeutung ist die Stabilität dieses Interferons bei pH 2 und die Tatsache, dass die Expression von IFNα von körperfremden Zellen induziert werden kann. IFNβ hingegen ist definiert über seine Herkunft von Fibroblasten und seine Stabilität bei pH 2. Auf Grund der großen
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Ähnlichkeit dieser beider Interferone werden sie als Typ-1 Interferone zusammen gefasst (Stewart 1980; Kirchner 1984). Interferone sind Glykoproteine und gehören zur Gruppe der Zytokine. Neben den Interferonen sind Chemokine, Interleukine und Wachstumsfaktoren ebenfalls Teil dieser sogenannten Gewebshormongruppe (Stark et al. 1998; Capobianchi et al. 2015). Nach dem aktuellen Wissensstand unterscheidet man 3 Gruppen von Interferonen: Typ 1, 2 und 3 (Tizard 2018; López de Padilla et al. 2016; Gastl et al. 1988; De Andrea et al. 2002; Boxx et al. 2016). Die Gruppe der Typ-1 Interferone besteht derzeit aus α-, β-, ε-, κ-, ω- Interferonen, sowie aus IFNτ (Capobianchi et al. 2015; Roberts et al. 1998). Zu den Typ-2 Interferonen zählt Interferon-γ und zu den Typ-3 Interferonen Interferon-λ und das Interleukin 10 (Gastl et al. 1988; De Andrea et al. 2002). Abb. 4 veranschaulicht die Aufteilung der einzelnen Interferon Klassen. In dieser Arbeit soll im Folgenden der Schwerpunkt auf der Gruppe der Typ-1 Interferone liegen, da zu dieser Gruppe nicht nur IFNα und IFNβ, sondern wie bereits erwähnt auch IFNτ gehört. Typ-1 Interferone gelten als Schlüsselzytokine in der Immunantwort eines Organismus. Vor allem IFNα und IFNβ nehmen in diesem Zusammenhang eine elementare Rolle ein (Uzé et al. 2007;
Severa et al. 2007). Sie werden sehr schnell als Antwort auf eine Virusinfektion vom Körper in fast allen kernhaltigen Zellen synthetisiert (Gastl et al. 1988; Pitha et al.
2007). In Versuchen an Mäusen, denen sowohl IFNα/β als auch IFNγ- Rezeptoren fehlen, konnte gezeigt werden, dass eine hohe Empfindlichkeit des Organismus gegen Infektionserreger ohne diese Rezeptoren vorliegt und dass keine adäquate Immunantwort bei einer Infektion stattfindet (van den Broek et al. 1995).
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Abbildung 4: Einteilung der Interferone aufgrund struktureller und funktioneller Eigenschaften in drei Gruppen nach Tizard (2018)
Zwei verschiedene Klassen von zellulären Rezeptoren erkennen im Falle einer viralen Infektion die intrazellulären viralen Nukleinsäuren. Hierzu zählen einerseits die Toll-like Rezeptoren, welche sich im endosomalen Kompartiment von Immunzellen befinden und virale DNA und RNA erkennen. Andererseits erkennen RNA-Helikasen mit Hilfe von CARD-Domains, RIG-I und MDA5 ebenfalls viral produzierte doppelsträngige RNA. Sobald diese körperfremden Sequenzen erkannt wurden, folgt eine Aktivierung einer Signalkaskade, die zu einer erhöhten Transkription des „Nuclear factor-kappa-B“ (NFκB) und „Interferon-regulatory-factor“- Familien führt und somit die Aktivierung einer frühen entzündlichen Reaktion herbeiführt (O’Neill 2006; Yoneyama et al. 2004; Barton et al. 2006). In diesem Zusammenhang werden vermehrt Typ-1 Interferone sezerniert, die auf parakrinem
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oder endokrinem Wege eine Modulation der humoralen und zellulären Immunantwort bedingen (Severa et al. 2007). Außerdem sorgen Interferone auch direkt für eine verminderte Replikationsrate des Virus indem mehrere Signalwege induziert werden, welche die Vermehrung von Viren im Organismus hemmen. Als Beispiel hierfür wird durch die doppelsträngige-RNA-abhängige Proteinkinase (dsRNA-dependent PKR) die Transkription und Translation des Virus gehemmt. Die PKR ist in der Regel inaktiv und wird durch dsRNA, welche an die PKR bindet, aktiviert. Es folgt eine Phosphorylierung der α-Untereinheit des Initiationsfaktors eIF2 und schließlich eine schnelle Hemmung der Translation des Virus (Stark et al. 1998; Meurs et al. 1992;
Carpick et al. 1997). Ein weiterer Weg für die Interferon induzierte Abwehr gegen Viren ist die Aktivierung von Mx-Proteinen (Arnheiter et al. 1996). Mx-Proteine interferieren mit der viralen Replikation und beeinträchtigen so die Vermehrung von negativ geladenen RNA-Viren auf Basis der Hemmung der viralen Transkription (Stark et al. 1998). Die Zerstörung von viralem Genom wird durch das sogenannte 2-5 A System erreicht. Hierbei handelt es sich um eine multienzymatische Kaskade in der zuerst eine Serie von kurzen 2´5´-Oligoadeylat-Segmenten gebildet wird, welche dann wiederum die 2´5´-Oligoadeylat-abhängige Ribonuklease L aktivieren.
Diese sorgt für eine Spaltung der einzelsträngigen Virus-RNA (Kerr et al. 1978;
Wreschner et al. 1981; Zhou et al. 1997). Jedoch ist die Bekämpfung von Viren nicht der einzige Effekt den Interferone auslösen. So inhibieren Typ-1 Interferone ebenfalls das Zellwachstum, indem sie die Zellteilung während des Zellzyklus zum Zeitpunkt der G0/G1 Phase hemmen (Resnitzky et al. 1992). Dies geschieht vor allem bei der Suppression von Tumorzellen. Aus diesem Grund werden Interferone bereits in der Therapie von Neoplasien eingesetzt (Lefkowitz 1981; Capon et al. 1985).
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15 2.3.2 Interferon-tau
2.3.2.1 Geschichte
Die Erforschung der Implantation beim Wiederkäuer begann bereits 1952. Chang (1952) untersuchte in seiner Studie Uteri von früh tragenden Hereford-Kühen. Er selektierte hierfür Uteri von frisch tragenden Kühen am Schlachthof anhand eines vorhandenen Cl und gleichzeitigen Fluktuation im ipsilateralen Uterushorn. Diese Uteri eröffnete er von der Hornspitze aus, spülte danach die darin enthaltenen Blastozysten heraus und beurteilte diese morphologisch. Anhand dieser Untersuchung konnte bereits damals die Entwicklung des Rinderembryos zu Beginn der Trächtigkeit näher beschrieben und definiert werden. Jedoch konnte Chang in seiner Untersuchung keinen Mechanismus finden, der den Fortbestand der Trächtigkeit erklären würde, da sich der Embryo zu Beginn der Trächtigkeit frei im Uterus befindet. In seiner Studie, die er mit weiteren ähnlichen Versuchsansätzen bei anderen Tierarten verglich, zeigte sich, dass es beim Rind im Vergleich zu anderen Tierarten (Affen oder Ratten) zu einer vergleichsweise späteren Implantation kommt (Chang 1952). Im Jahr 1964 begann die Forschungsgruppe um Moor an der University of Cambridge die Abläufe während der Implantation näher zu erforschen.
So zeigte sich in Moors Studie, dass bei einer operativen Entnahme des Schafembryos bis zum Tag 12 nach der Ovulation, eine zyklische Regression des Cl folgt. Findet die Entnahme jedoch an Tag 13 oder Tag 14 nach der Ovulation statt, so verlängert sich der Erhalt des Cl merklich (Moor et al. 1964). Diese Beobachtung verfolgte Moor et al. weiter und so versuchten die Forscher 1966 bei nicht tragenden Schafen mit Hilfe von Embryotransferversuchen zu erforschen, durch welche Begebenheiten ein Fortbestand des Cl erreicht werden kann. Sie platzierten hierfür Embryonen in mehreren Versuchen an unterschiedlichen Stellen im Uterus von nicht tragenden Schafen. Im ersten Versuch wurden beispielsweise die Embryonen einmal im ipsilateralen und einmal im contralateralen Uterushorn, bezogen auf den vorhandenen Cl, positioniert. Blieb eine erneute Brunst bis 25 Tage nach Embryotransfer aus, wurden die Schafe daraufhin seziert. Bezüglich der Lokalisation des Embryos (ipsilaterales oder contralaterales Uterushorn), im Vergleich zum Cl, konnten keine Unterschiede festgestellt werden. In beiden Fällen war eine normale
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Trächtigkeit im jeweiligen Uterushorn zu beobachten. Daraus folgerten Moor et al., dass der Embryo in der Lage ist, den Cl auch auf der contralateralen Seite vor einer Regression zu schützen (Moor et al. 1966). Noch im selben Jahr gelang der gleichen Forschungsgruppe ein weiterer wichtiger Schritt, um die Prozesse während der Implantation genauer zu verstehen. Hierfür wurden bei zyklischen Schafen Katheter in die Uterushornspitze gelegt und an Tag 12 nach der Ovulation damit begonnen, über diesen Katheter verschiedene Substanzen in den Uterus zu applizieren. In dem Versuchsansatz wurden sechs Gruppen unterschieden. Gruppe 1 erhielt eine einmalige Infusion von gefrorenem und wieder erwärmtem Homogenat aus 14 bis 15 Tage alten Schafembryonen. Gruppe 2 erhielt dieses Homogenat über mehrere Tage hinweg. Im Vergleich hierzu erhielt eine dritte Gruppe nach gleichem Schema ein Homogenat von 25 Tage alten Schafembryonen. Die vierte Gruppe erhielt täglich ein Homogenat aus 14 Tage alten Schweineembryonen. Bei Gruppe 5 handelte es sich um eine Kontrollgruppe, die über mehrere Tage hinweg nur Pufferlösung über den Katheter verabreicht bekam. Bei der letzten Gruppe wurde ein hitze-deaktivierter Embryo in den Uterus der Versuchstiere transferiert. Der Versuch führte zu Tage, dass ausschließlich bei Gruppe 2, welche das Homogenat von Tag 14 und 15 Schafembryonen über mehrere Tage hinweg erhielten, eine Verlängerung des Zyklus und ein Erhalt des Cl sichtbar war. So konnte nachgewiesen werden, dass in den Homogenaten von Tag 14 und 15 eine Substanz enthalten sein muss, die die Regression des Cl verhindert und damit die Gravidität schützt. Bei den gleichen Homogenaten von Tag 25, sowie bei Homogenaten aus Schweineembryonen war kein Effekt sichtbar. In einem Vorversuch hatte sich außerdem bereits gezeigt, dass eine intramuskuläre Injektion mit dem Embryonenhomogenat keinen Einfluss hat. So schlossen Moor et al. (1967) aus diesen Versuchen, dass es sich bei dem Faktor, der für den Erhalt des Cl zuständig zu sein scheint, um einen kältestabilen Stoff handeln muss, der Spezies-spezifisch ist und der zu einer gewissen Zeit vom Embryo gebildet wird und nur zu einer gewissen Zeit am Uterus den erwünschten Effekt auslösen kann (Moor et al. 1967). Diese These verfolgten Martal et al. (1977) weiter und untersuchten, ebenfalls an Schafen, welche Effekte eine unterschiedliche Behandlung der Homogenate vor der Implantation auslösen. Hierzu behandelte die
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Forschungsgruppe beispielsweise einen Teil der Homogenate mit Proteasen oder erhitzte diese auf 80 °C für 30 Minuten (min). Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Substanz, die für den Erhalt des Cl nötig ist, um ein Protein handeln muss, dass zu einer gewissen Zeit von dem Trophoblasten gebildet wird. Dieser Zeitraum ist relativ knapp begrenzt, denn Martal et al. konnten in ihren Versuchen zeigen, dass bereits an Tag 21, keine Expression dieser Substanz mehr nachweisbar ist. Martal et al. definierte folglich dieses Protein auf Grund seiner Herkunft als „Trophoblastin“. Dieses von der Forschungsgruppe neu entdeckte Protein ist hitzeempfindlich, wird von Proteasen abgebaut und wird ab Tag 14-16 von dem embryonalen Trophektoderm gebildet. Dieses Protein ist für den Erhalt des Cl und der frühen Gravidität von elementarer Bedeutung (Martal et al. 1979). Ein Jahr später konnte eine Forschungsgruppe aus Wisconsin diese Beobachtungen ebenfalls auf das Rind übertragen. Sie konnten in ähnlichen Versuchen zeigen, dass Rinder ebenfalls zwischen den 15 und 17 Tag der Trächtigkeit ein Protein synthetisieren, welches die Lebenszeit des Cl verlängert (Northey et al. 1980). Durch eine zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese konnten Godkin et al. 1982 dieses Protein näher beschreiben. Hierfür inkubierten sie Schafblastozyten von Tag 13 bis Tag 21 in einem Medium und konnten darin eine Proteinsekretion der Blastozysten feststellen. Bei Blastozysten von Tag 23 oder später war eine Expression dieses Proteins nicht mehr nachzuweisen. Godkin et al. benannten dieses Protein „Protein X“ und stellten es in den Zusammenhang mit der Trächtigkeitserhaltung beim Schaf. Sie konnten außerdem eine hohe Expression eines großen Glykoprotiens in Höhe von bis zu 50 µg in 24 Stunden feststellen.
Ebenfalls konnten Godkin et al. mit Hilfe von immunohistochemischen Methoden zeigen, dass das „Protein X“ mit dem Endometrium eines graviden Uterus in Verbindung gebracht werden kann (Godkin et al. 1982). Masters et al. (1982) stützten in ihrer Arbeit diese Erkenntnisse und erweiterte sie, in dem sie nicht nur die Vorgänge beim Schaf betrachteten, sondern ebenfalls die Genexpression von Blastozysten von Schweinen und Rindern untersuchten. Auch beim Rind konnten die Forscher eine Expression eines Glykoproteins von hohem molekularen Gewicht am Tag 19 nach der Ovulation beschreiben (Masters et al. 1982). Jedoch war bis zu
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diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig geklärt, ob die Verlängerung der Gravidität allein auf das Vorhandensein des „Trophoblastins“ oder zusätzlich, auf weitere Interaktionen des Trophoblasten mit dem Uterus zurück zu führen ist. Dieser Fragestellung widmeten sich Godkin et al. 1984. Hierzu kultivierten die Forscher erneut Schafblastozysten, verwendeten im weiteren Versuch aber nur noch das Kulturmedium, indem sie die Blastozysten kultivierten. Die Blastozytsen selbst wurden im weiteren Versuch nicht mehr verwendet. Somit konnten Godkin et al.
sichergehen, dass der Effekt nur von dem zwischen Tag 13 und Tag 23 produzierten
„Trophoblastin“, welches in das Medium abgegeben wurde, induziert werden konnte.
Das Medium applizierten Godkin et al. wiederum täglich in den Uterus zyklischer Schafe am Tag 12 nach der Ovulation beginnend. Die Studie zeigte deutlich, dass der Zyklus der Tiere durch Applikation des Mediums verlängert wurde. Außerdem stellten Godkin et al. die These auf, dass das „Trophoblastin“ mit dem Endometrium interagiert und somit den Erhalt des Cl ermöglicht (Godkin et al. 1984). Den genauen Mechanismus, durch welchen das „Trophoblastin“ dies ermöglicht untersuchten ein Jahr später Thatcher et al. (1985). Hierfür entnahmen Thatcher et al. Blutproben bei Rindern, denen die Forschungsgruppe über einen Uteruskatheter zuvor sogenannte
„conceptus secretory proteins“ appliziert hatte. Es konnte festgestellt werden, dass die Konzentration von 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α (PGFM), welches die metabolisierte Form von PGF2α darstellt, nach einer Therapie deutlich niedriger war als bei der Kontrollgruppe. Hieraus schlossen Thatcher et al., dass es in Folge einer Trächtigkeit und der Produktion von Proteinen aus dem Konzeptus zu einer geringeren Expression von PGF2α kommt und somit der Cl erhalten bleibt. Ebenfalls konnten Tatcher et al. zeigen, dass Östradiol die Synthese von PGF2α stimuliert (Thatcher et al. 1985). Diese Beobachtungen konnten Knickerbocker et al. (1986) in ihrer Studie bestätigen. Außerdem stellten Knickenbocker et al. fest, dass der kultivierte Konzeptus an Tag 17 die dreifache Menge an Proteinen synthetisiert, im Vergleich zu dem Konzeptus an Tag 16,5. Das Gewicht des Konzeptus verändert sich in dieser Phase jedoch kaum. Daraus schlossen Knickerbocker et al., dass in dieser Phase, zwischen Tag 16 und Tag 17, ein Maximum an Proteinsekretion erreicht wird, die Elongation des Konzeptus aber erst daraufhin erfolgt
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(Knickerbocker et al. 1986). Jedoch hat nicht nur Östradiol einen zusätzlichen Einfluss auf die Synthese von PGF2α. Lafrance et al. (1985) konnten in ihrer Studie belegen, dass das ebenfalls antiluteolytisch wirkende Oxytozin während der beginnenden Trächtigkeit seine Wirkung verliert und kein PGF2α gebildet wird (Lafrance et al. 1985).
Im Jahr 1987 gelang es erstmals Imakawa et al. anhand von Genanalysen die Aminosäuresequenz des ovinen Trophoplastenproteins zu bestimmen. Hierbei wurde deutlich, dass es sich bei dem trächtigkeitserhaltenden Protein höchst wahrscheinlich um ein Protein der Klasse der Interferone handelt. Es besitzt eine Homologie von 45-55% zu Interferonen der IFNα Gruppe. Im Speziellen konnten Imakawa et al. eine große Ähnlichkeit von 70,3% zu dem bovinen IFNα feststellen. Dies war in der Geschichte des heutigen IFNτ der erste Moment, indem das trächtigkeitserhaltende Glykoprotein seiner eigentlichen Familie zugeordnet werden konnte (Imakawa et al.
1987). Hatte dieses Protein bis zu diesem Zeitpunkt viele verschiedene Namen, so war ab diesem Moment eindeutig klar, dass sich die Forschungen im Bereich des
„Trophoblastin“, des „Protein X“ oder der „conceptus secretory proteins“ alle mit demselben Protein aus der Familie der Interferone beschäftigten (Roberts et al.
1989; Godkin et al. 1982; Bartol et al. 1985). Roberts et al. beschlossen aus diesem Grund 1992 einen neuen Namen zu definieren, der die Gesamtheit aller dieser Begriffe darstellen sollte und so benannten Roberts et al. in ihrem Review das trächtigkeitserhaltende Protein der Wiederkäuer IFNτ. Durch die Struktur wird IFNτ der Familie der Typ-1 Interferone zugeordnet (Roberts et al. 1992). Abb. 5 veranschaulicht die dreidimensionale Struktur von IFNτ im Vergleich zu IFNα und zeigt die große strukturelle Ähnlichkeit dieser beiden IFN.
