Untersuchungen zur Prostaglandin E
2- beeinflussten Differenzierung boviner Monozyten in Makrophagen
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Anna Düvel
Hameln
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth AG Immunologie
PD Dr. med. vet. A. Schnapper Anatomisches Institut
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof.’in Dr. med. vet. M. Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 17.05.2010
Gefördert durch die Firma Pfizer Animal Health durch Personal- und Sachmittel
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung und Zielsetzung ...9
2 Literaturübersicht ...12
2.1 Anatomischer Aufbau der Milchdrüse ...12
2.2 Immunzellen in der bovinen Zitze...13
2.3 Expression immunrelevanter Gene in der Zitze...15
2.4 Monozyten und Makrophagen ...16
2.4.1 Makrophagen-Subpopulationen ...17
2.4.2 Die LPS-Toleranz von Makrophagen...18
2.4.3 Der Transkriptionsfaktor PPARγ...20
2.4.4 Makrophagen im bovinen Euter...22
2.4.5 Makrophagen-spezifische Antikörper ...23
2.5 Prostaglandine ...26
2.5.1 Antiinflammatorische Eigenschaften der Prostaglandine...27
2.5.2 Prostaglandin E2 und dessen Wirkung auf Immunzellen ...28
3 Material und Methoden...32
3.1 Versuchstiere...32
3.2 Probennahme, Fixierung und Einbettung von Gewebeproben ...34
3.2.1 Probennahme...34
3.2.2 Fixierung...35
3.2.3 Präparation der Zitzen ...36
3.2.4 Einbettung in Paraffin...36
3.3 Histologische Färbungen ...37
3.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ...37
3.3.2 Trichrom-Färbung nach Masson-Goldner ...38
3.3.3 Toluidinblau-Färbung...39
3.4 Immunhistochemische Nachweise ...39
3.5 Dokumentation und Auswertung der histologischen und histochemischen Befunde...43
3.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ...43
3.7 Immunfluoreszenz an Makrophagen ...48
3.8 Dokumentation und Auswertung der Immunfluoreszenz an Makrophagen ...49
3.9 Plasmid für die Herstellung von Standardreihen...51
3.10 Genspezifische Primer für die quantitative real time PCR ...52
3.11 Gewinnung einzelner Leukozytensubpopulationen des Blutes ...53
3.12 Herstellung und Stimulation von Makrophagen aus Blutmonozyten in vitro ...57
3.13 Durchflusszytometrie...57
3.13.1 Quantifizierung vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode...58
3.13.2 Bestimmung der Apoptose neutrophiler Granulozyten...59
3.14 Aufbereitung von mRNA aus bovinen Leukozyten für die real time PCR ...63
3.14.1 Herstellung externer Standardreihen für die real time PCR ...65
3.14.2 Quantitative real time PCR (qrtPCR)...72
3.15 Statistische Auswertung...77
4 Ergebnisse ...79
4.1 Semiquantitative histologische Auswertung von Immunzellpopulationen in der bovinen Zitze...79
4.2 Semiquantitative Analyse von Makrophagenpopulationen in der bovinen Zitze mittels Immunhistochemie an adulten, eutergesunden laktierenden Rindern (K2) ...90
4.3 Analyse der Makrophagendifferenzierung in vitro ...98
4.3.1 PGE2–vermittelte Effekte während der Differenzierung boviner Makrophagen in vitro ...99
4.3.2 Effekte von PGE2 auf in vitro differenzierte bovine MdM ...109
4.3.3 Einfluss sezernierter Produkte in vitro generierter Makrophagen auf die Vitalitat neutrophiler Granulozyten ...114
5 Diskussion...117
5.1 Funktionelle Anatomie des distalen Zitzenabschnittes ...117
5.2 Immunzellpopulationen in der Zitze ...118
5.3 Differenzierung von Makrophagenpopulationen in der Zitze...130
5.4 Modulation von Makrophagen durch PGE2...133
5.5 Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten ...141
5.6 Offene Fragen und Ausblick ...142
6 Zusammenfassung ...144
7 Summary...147
8 Literaturverzeichnis ...150
9 Anhang...174
9.1 Tiergruppen...174
9.2 Geräte...176
9.3 Klinikbedarf ...177
9.4 Laborbedarf...178
9.5 Reagenzien ...179
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
A Adenin
Abb. Abbildung
cAMP Cyklisches Adenosin-5´-monophosphat ANOVA analysis of variance
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) ATP Adenosin-5′-triphosphat
BAL Bronchio-Alveoläre-Lavage
Bcl-2 B-cell lymphoma 2 (anti-apoptotisches Protein) bp base pairs (Basenpaare)
C Cytosin
C5a opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C5 CCL β-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle in Folge („CC“) CD cluster of differentiation
cDNA complemetary DNA
CFU colony forming units
CGRP Calcitonin-gene related peptide
CO2 Kohlenstoffdioxid
ConA Concavalin A
CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin (unmethylierte DNA-Motive v.a. aus Bakterien) CRH Corticotropin-Releasing-Hormon
Ct cycle threshold
CXCL α-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle werden von beliebiger Aminosäure (X) getrennt
CXCL8 Interleukin-8
DAG Diacylglycerol
DISC death inducing signalling complex
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates dsDNA doppelsträngige DNA
E. coli Escherichia coli
EDTA ethylendiamine-tetraacetic acid (Ethylendiamintetraacetat) FABP Fatty-acid binding protein
FACScan® fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät) FCCP Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazon
FCM flow cytometer (Durchflusszytometer) FCS fetal calf serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm;
FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm;
FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm
for forward
FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
G Guanin
G-CSF granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor)
GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (Granulozyten-Makrophagen- Wachstumsfaktor)
HBSS Hanks Balanced Salt Solution
His Histidin
HETE Hydroxyeicosatetraenoic Acid HODE Hydroxyoctadecadienoic Acid
I0+ Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz ohne Serum
I10F+ Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem Kälberserum
ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül)
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
iNOS Induzierbare NO Synthase IP3 Inositoltriphosphat
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
JC-1 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid
kB kilo Basen
kDA kilo Dalton
LAMPS Lysosome-associated mucin-like protein
LB lysogeny broth
LBP Lipopolysaccharid-binding protein LFA Leukocyte function-associated antigen
LPS Lipopolysaccharid
MACS magnetic associated cell sorting mAK monoklonaler Antikörper MdM monocyte derived macrophages
Met Methionin
MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MIF Membranimmunfluoreszenz MMP Mitochondrienmembranpotential
MNC mononuclear cells (mononukleäre Zellen)
mRNA messenger RNA
MW molecular weight (Molekulargewicht)
n= die Anzahl der Einzelbeobachtungen bei Berechnung des Mittelwertes
NaCl Natriumchlorid
NFΚB nuclear factor-kappa B (Transkriptionsfaktor)
p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen PAMP pathogen associated molecular pattern (Molekulare Muster von Erregern) PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PCR polymerase chain reaction
PE Phycoerythrin
PGD2 Prostaglandin D2 PGE2 Prostaglandin E2 PGH2 Prostaglandin H2 PGJ2 Prostaglandin J2
PJ Propidiumjodid
PMA Phorbol-12 Myristate-13 Acetat
PMN polymorphonuclear leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten) PRR pattern recognition receptor
PTX3 Pentraxin 3
qrtPCR quantitative real time PCR
r Korrelationskoeffizient
rev reverse
ROS reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies)
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur
Staph. aureus Staphylococcus aureus
SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes) SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® spp. subspecies (lateinisch: Unterarten)
T Thymin
Tab. Tabelle
TBE Tris Boric Acid EDTA-Puffer
TLR toll-like-receptor (Toll-ähnlicher-Rezeptor) TNF tumor necrosis factor (Tumornekrosefaktor)
TXA2 Thromboxan A2
UV ultra violett
v/v Volumen pro Volumen
VCAM vascular cell adhesion molecule (vaskuläres Zelladhäsionsmolekül)
w/v Gewicht pro Volumen
x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)
Xaa variable Aminosäure
1 Einleitung und Zielsetzung
Die Mastitis stellt eine der bedeutendsten Erkrankungen des Rindes dar. Die Konsequenzen dieser Erkrankung zeigen sich in beträchtlichen ökonomischen Verlusten infolge einer Verminderung der Milchqualität und –quantität, hohen tierärztlichen Behandlungskosten und Tierverlusten. Die Erkrankung ist durch eine entzündliche Antwort der Milchdrüse charakterisiert, verursacht durch metabolische und physiologische Einwirkungen, Traumata, kontagiöse oder umweltassoziierte Pathogene, die galaktogen aszendieren und sich in der Milchdrüse vermehren (OVIEDO-BOYSO et al. 2007). In Erwiderung dieser Reize kommt es zur Aktivierung des Immunsystems mit dem Ziel der Pathogeneliminierung. Die Abwehrmechanismen des Euters beinhalten dabei das Zusammenwirken anatomischer, zellulärer und löslicher Faktoren. Die Effizienz der angeborenen und erworbenen Abwehrmechanismen bestimmt so die Anfälligkeit und Widerstandsfähigkeit des Euters gegen grampositive und gramnegative Bakterien.
Der peripartale Zeitraum der Kuh stellt eine kritische Phase dar, in dem die Kuh durch Überbeanspruchung mehrerer Organsysteme in eine Art immunsupprimierten Zustand gerät und besondere Anfälligkeit für E. coli-verursachte Mastitiden zeigt (BURVENICH et al.
2007). Zunehmende Resistenzen der Bakterienstämme sowie mit antiinfektiöser Chemotherapie einhergehende Nebenwirkungen, wie z.B. Wartezeit auf tierische Erzeugnisse, rücken vermehrt Therapieansätze in den Fokus, die eine Effizienz der endogenen Erregerbekämpfung zum Ziel haben.
Ausgehend von einer galaktogenen Infektion stellt sich die Frage, inwieweit die Zitze als distales Kompartiment des Euters am Infektionsgeschehen beteiligt ist, und ob bereits dort die Weichen für adaptive und angeborene Immunmechanismen gestellt werden, die auch im Euterparenchym das entzündliche Geschehen beeinflussen. Hier sollte zunächst anatomisch- histologisch geprüft werden, welche Leukozytenpopulationen in der Zitze wie verteilt vorkommen und ob das Alter der Tiere sowie eine vorausgegangene experimentelle Belastung mit Lipopolysaccharid darauf einen Einfluss hat.
Vor dem Hintergrund einer möglichen intrazisternalen Vakzinierung oder Immunmodulation, sollten Monozytenabkömmlinge (dendritische Zellen, Makrophagen) im Fokus der Betrachtungen stehen, finden sich diese Zellen doch als Sensor- und Effektorzellen am
Beginn einer Vielzahl von Immunprozessen. Insbesondere bietet die bei Mensch und Maus beschriebene funktionelle Plastizität von Makrophagen (MANTOVANI et al. 2004; MOSSER u. ZHANG 2008) interessante Ansatzpunkte für immunmodulatorische Strategien.
Makrophagen sind maßgeblich sowohl an der Induktion als auch an der Resolution von Entzündungen beteiligt.
Zur Entstehung funktionell unterschiedlicher Makrophagen werden zwei wesentliche Konzepte diskutiert. Das eine besagt, dass Makrophagen, die nach Stimulation mit bestimmten Zytokinen, Immunkomplexen und/oder bakteriellen Produkten einen ganz bestimmten funktionellen Phänotyp aufweisen. So entsteht der klassische, proinflammatorische Makrophage (M1) durch umgebende Stimuli wie IFN-γ und LPS. Er zeichnet sich durch Sekretion proinflammatorischer Zytokine, wie z.B. TNF-α und IL-6 aus.
Zur Entwicklung eines alternativen Makrophagen (M2) sind Zytokine wie IL-4, IL-13 oder IL-10 nötig. Ihre funktionelle Rolle ist u.a. geprägt durch die Sekretion von PTX3 und Matrixproteinen. M2 Makrophagen phagozytieren Zelldebris, fördern Angiogenese und Gewebewiederherstellung (MANTOVANI et al. 2004).
Das zweite Konzept besagt, dass Monozyten, die ins Gewebe einwandern, dort einer Reihe von Wirts- und Pathogenfaktoren ausgesetzt sind, die ihre Entwicklung in eine ganz bestimmte Richtung lenken. Eindrucksvoll wurde dies kürzlich für humane Monozyten gezeigt, die unter dem Einfluss von Prostaglandin E2 in stark proinflammatorische dendritische Zellen differenzierten. Des Weiteren wurde beschrieben, dass PGE2- differenzierte dendritische Zellen die T-Zell Differenzierung in Richtung Th17-polarisierte Zellen fördern (KHAYRULLINA et al. 2008). Th17 Zellen sind, neben Monozyten und Makrophagen, an entzündlichen Prozessen sowie Autoimmunerkrankungen beteiligt. Beide Konzepte finden Anwendung auf die hier vorliegende Arbeit. Dabei sollte geprüft werden, ob auch in der bovinen Zitze unterschiedliche Makrophagenpopulationen vorhanden sind. Dazu wurden zwei Makrophagen-Antikörper ausgwählt, die unterschiedliche Makrophagenantigene erkennen, deren Expression eine spezielle Polarisierung anzeigen soll (BRANDTZAEG et al.
1988). Der Vergleich einzelner, zu verschiedenen Populationen zugehörigen Makrophagen, sollte mittels dieser Antikörper anhand von histologischen Serienschnitten durchgeführt werden. Ziel war es, Aussagen über eine spezielle Verteilung unterschiedlicher Makrophagensubtypen in der Zitze treffen zu können.
Prostaglandine sind potente Metaboliten des Fettsäurestoffwechsels, die Schlüsselfunktionen immunologischer Reaktionen maßgeblich beeinflussen (HARRIS et al. 2002). Prostaglandin E2 werden überdies sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften zugeschrieben (KUNKEL et al. 1981). PGE2 greift in die Differenzierung von Monozyten zu dendritischen Zellen ein, in dem PGE2-differenzierte dendritische Zellen ein proinflammatorisches Expressionsprofil aufweisen (KHAYRULLINA et al. 2008). Die Polarität von Makrophagen, die unter dem Einfluss von PGE2 ausdifferenzieren, ist noch ungeklärt. Daher sollte in dieser Arbeit näher analysiert werden, welchen Phänotyp in vitro differenzierte Makrophagen unter Einfluss von PGE2 aufweisen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: Zum Einen sollte die Situation eines frisch in das Gewebe rekrutierten Monozyten simuliert werden, der direkt nach Austritt aus dem Blutgefäß dem Entzündungsmediator PGE2 begegnet und unter dessen Einfluss Chemokine und Zytokine sezerniert. Zum Anderen sollten Effekte von PGE2 am Ende der Differenzierung eines Makrophagen untersucht werden. Die Möglichkeit die Differenzierung von Makrophagen durch bestimmte Faktoren gezielt zu steuern, soll mittlelfristig die Grundlagen für eine prophylaktische Immunmodulation beim Rind schaffen, in der die Zitze als erster Ort des Kontaktes mit Erregern so vorbereitet wird, dass funktionell
‚passende‘ Makrophagen als mitentscheidende Sensor- und Effektorzellen adäquat reagieren können.
2 Literaturübersicht
2.1 Anatomischer Aufbau der Milchdrüse
Die Milchdrüse stellt eine modifizierte Hautdrüse dar. Sie ist ein zusammengesetztes Organ, das aus dem zentralen Drüsenkomplex mit bindegewebiger Lobulierung (Interstititum) besteht und dessen Ausführungsgangsystem peripher in der Zitze mündet. Entsprechend des Aufbaus des Ausführungsgangsystem und dessen kugelförmigen Drüseneinheiten handelt es sich bei der Milchdrüse um eine zusammengesetzte tubuläre Drüse mit verzweigten, alveolären Endstücken. Das Drüsenparenchym besteht aus den Alveolen (Milchbildung und Milchabgabe), den Ductus lactiferi (Transport der Milch im Gangsystem) und den Sinus lactiferi (Milchsammelräume). Die Zitze ist beim Wiederkäuer als Eversionszitze ausgebildet.
Man unterscheidet einen Zitzenteil der Milchzisterne (Zitzenzisterne) und den nach außen führenden Zitzenkanal (Strichkanal, Ductus papillaris). Im Bereich der Zitzenzisterne ist die Zitzenwand von einem zweischichtigen isoprismatischen Epithel ausgekleidet, das beim Wiederkäuer allmählich in das mehrschichtige Plattenepithel des Strichkanals wechselt. In die Zitzenwand sind kollagene und elastische Fasernetze sowie glatte Muskelzellen eingelagert.
Von innen nach aussen ändert sich die Anordnung dieser Wandschichten in typischer Weise.
Zum Lumen sind glatte Muskelzellen gehäuft und zirkulär orientiert, in den mittleren Wandabschnitten verlaufen diese vorwiegend längs und strahlen zur Oberfläche in radiärer Anordnung allmählich aus. Beim Rind formieren die Radiärfasern eine 5-8-fache Rosette, die sich in das Lumen des Strichkanals einfaltet (Fürstenberg’sche Rosette). An dieser Stelle ist der Musculus sphincter papillaris als Verschlusseinrichtung der Zitze entwickelt. Im Bereich des Ostium papillare schlägt die Epidermis in das Zitzenlumen um und bildet eine mehrschichtiges, verhorntes Plattenepithel (LIEBICH 2010).
Kommt es zu einer Penetration des Strichkanals durch Bakterien, stellt der Strichkanal die
„first line of defense“ dar (OVIEDO-BOYSO et al. 2007). Die Auskleidung des Strichkanals mit Keratin ist eine zusätzliche physikalische Barriere, um von distal einwandernde Bakterien zu hemmen (CHANDLER et al. 1969; CAPUCO et al. 1994; SORDILLO u. STREICHER 2002). In Verbindung mit dem Keratin fungieren freie und veresterte Fettsäuren (Myristinsäure, Palmitolensäure, Linolsäure) als bakteriostatische Komponenten. Weiterhin
sind kationische Proteine in Verbindung mit Keratin in der Lage, an Pathogene zu binden und so deren Empfindlichkeit auf Veränderungen der Osmolarität zu erhöhen (MILLER et al.
1992; PAULRUD 2005).
Die Zitze spielt als Eintrittspforte für galaktogene Infektionen der Milchdrüse eine wichtige Rolle. Das Epithel des Strichkanals der Fürstenberg’schen Rosette und der Zitzenzisterne mit dem subepithelialen Gewebe stellen so erste Adhäsionsflächen und korrespondierendes Gewebe für aszendierende Erreger dar. Im folgenden Abschnitt wird die Situation der innerhalb des Zitzengewebes lokalisierten Zellen beschrieben.
2.2 Immunzellen in der bovinen Zitze
Lymphoide Zellen
In der bovinen Zitze wurden Lymphozyten und Immunglobulin-produzierende Plasmazellen beschrieben (NICKERSON 1988). Die Zellen wurden in das distale Zitzenende mittels intrazisternaler miniosmotischer Interleukin-2-Pumpen (NICKERSON et al. 1989) in Staph. aureus-positiven und –negativen Vierteln rekrutiert. In gesunden Vierteln fand sich im distalen Zitzengewebe eine moderate Anzahl an Zellen bis hin zur Infiltration großer Mengen lymphoider Zellen mit mitotisch aktiven Plasmazellen. In anderen Bereichen zeigten sich sehr viele, direkt subepithelial gelegene Plasmazellen. Die höchste Anzahl infiltrierter Lymphozyten wurde in Staph. aureus negativen, IL-2 stimulierten Vierteln gefunden.
Nach dem Kontakt von Zellwandbeständen von Staph. aureus mit immunkompetenten, lymphoiden Zellen kommt es zu deren Sensibilisierung (TARGOWSKI u. BERMAN 1975).
Nickerson et al. erwägen diese residenten, sensibilisierten, lymphoiden Zellen als
„Instrument“ zur Veranlassung einer unmittelbaren Antigen-induzierten Immunantwort (NICKERSON u. NONNECKE 1986).
Makrophagen
Makrophagen konnten im distalen Bereich der Zitze nachgewiesen werden (NICKERSON u.
NONNECKE 1986). Nach intrazisternaler Applikation von Mycobacterium bovis zeigten sich vermehrt Makrophagen im perivaskulären Gewebe kleiner Blutgefäße in der Zitzenzisterne und im Bindegewebe. Des Weiteren akkumulierten sie zwischen der apikalen und basalen
Epithelzellschicht, oft mit phagozytierten Erythrozyten, die aus dicht gefüllten Kapillaren austraten.
Neutrophile Granulozyten
Neben dem dorsalen Drüsenparenchym nimmt auch die Zitzenzisterne am Influx neutrophiler Granulozyten während einer inflammatorischen Reaktion teil (NICKERSON et al. 1991).
Hierbei scheint die Infiltration neutrophiler Granulozyten sowohl in Staph. aureus-infizierten wie auch in gesunden Vierteln zunächst in der Zitzenzisterne, später in der Fürstenberg’schen Rosette stattzufinden (NICKERSON u. PANKEY 1984).
Die Fürstenberg’schen Rosetten gesunder Viertel waren mit einem zweischichtiges Epithel ausgekleidet. Darunter befand sich lockeres Bindegewebe, kleine Blutgefäße sowie lymphoide Zellen. Die Epithelzellen waren säulenartig und mit einem apikalen Mikrovillisaum versehen. Die basalen Epithelzellen waren von kubischer Form und fest im umgebenden Bindegewebe verankert. Im Zitzengewebe infizierter Viertel migrierten neutrophile Granulozyten aus dem Bindegewebe in Richtung Fürstenberg’sche Rosette. In das subepitheliale Stroma wanderten neutrophile Granulozyten durch Adhäsion und Penetration epithelnaher Blutgefäße (NICKERSON u. PANKEY 1984). Weiterhin wanderten neutrophile Granulozyten zielgerichtet in Richtung Epithel und subepitheliales Gewebe, wo sie frei die Basallamina durchtreten konnten und zwischen basalen Zellen des Epithels lokalisiert waren.
Einmal im Epithel angekommen, scheint eine freie Bewegung der neutrophilen Granulozyten zwischen dem zweischichtigen Epithel gut möglich. Tendenziell akkumulierten die neutrophilen Granulozyten eher in der luminalen Schicht des Epithels. In intraepithelialen Freiräumen in der Nähe degenerierter Epithelzellen waren ebenfalls neutrophile Granulozyten zu finden, welche neben den Epithelzellen in das Lumen der Zitzenzisterne hineinragten. Oft waren diese intraepithelial lokalisierten neutrophilen Granulozyten in der Nähe von Lymphozyten zu finden. Andere neutrophile Granulozyten fanden sich zwischen intakten, gesunden Epithelzellen mit freiem Zugang zum Lumen der Zitzenzisterne. Der Übertritt in die Milch auf Höhe der Fürstenberg’schen Rosette geschah durch zytoplasmatische Disintegration einzelner Epithelzellen, die somit Raum bilden für übertretende neutrophile Granulozyten. Nickerson et al. (1984) nannten die Möglichkeit der Interaktion neutrophiler Granulozyten und Lymphozyten mit intakten Epithelzellen als eine Art „signaling“ zur Penetration des Epithels. Auch die „Verdrängung“ alternder, ausgedienter Epithelzellen als
vornehmliches Ziel zur Durchdringung des Epithels wird angeführt. Eine weitere Möglichkeit der Migration ist das Durchbrechen von tight junctions zwischen intakten, luminalen Zellen (HARMON u. HEALD 1982; NICKERSON u. PANKEY 1984). Als dritte Möglichkeit wurde eine Beteiligung neutrophiler Granulozyten an der metaplastischen Veränderung basaler Zellschichten genannt, um oberflächliche Zellschichten von tieferen Zellschichten mit dem Ziel der Abschilferung und Freisetzung neutrophiler Granulozyten zu separieren (NICKERSON u. HEALD 1982; NICKERSON u. PANKEY 1984). Darüber hinaus konnte die Migration ins Lumen auch durch epitheliale Spalten, verursacht durch Lysis der Alveolarzellen, stattfinden (SEELIG u. BEER 1978; HARMON u. HEALD 1982). Generell wurde gezeigt, dass neutrophile Granulozyten in den infizierten Vierteln vorherrschend im distalen Gewebe der Fürstenberg’schen Rosette zu finden waren (NICKERSON u. PANKEY 1984; TRINIDAD et al. 1990).
2.3 Expression immunrelevanter Gene in der Zitze
Um signifikant regulierte Gene im Entzündungsgeschehen des Euters nachzuweisen, wurden in jüngster Zeit holistische Transkriptomanalysen nach experimenteller Inokulation mit Staph.
aureus (LUTZOW et al. 2008a) und E. coli (RINALDI et al. 2009; MITTERHUEMER et al.
2010) durchgeführt. Diese bezogen sich im Wesentlichen auf die Analyse der Genexpression im Bereich der Drüse. RINALDI et al. (2009) fokussierten sich zum ersten Mal auf die Lokalisations-spezifische Expression im distalen Kompartiment des Euters. Unter den hochregulierten Genen in der Fürstenberg’schen Rosette nach 12-stündiger E. coli-Infektion fanden sich die Chemokine CCL20, CXCL8 sowie das Enzym NOS2. In der Zitzenzisterne dominierte neben CCL20 und CXCL8 die hochregulierte Expression von IL-1β und S100A12. Nach 24-stündiger Inokulation mit E. coli waren die genannten Gene in beiden Lokalisationen wieder deutlich herunterreguliert. CXCL8 und CXCL8-Rezeptor hingegen wurden nach 24-stündiger Inokulation in der lobulär-alveolären Region des Euters signifikant hochreguliert. In der Fürstenberg’schen Rosette, der Zitzenzisterne, der Drüsenzisterne und der lobulär-alveolären Region wurden Gene, verantwortlich für die Inaktivierung von Prostaglandinen und anderer Lipidmediatoren (Hydroxyprostaglandin-Dehydrogenase und Lipoprotein-Lipase) signifkant herunterreguliert. Die prominente Regulation der NOS2 in der Fürstenberg’schen Rosette wurde als wichtiger Aspekt hervorgehoben. Die Produktion von
NO und dessen antibakterielle Effekte in Assoziation mit anderen kompetenten Immunzellen an der Eintrittsstelle für Keime unterstreicht die Bedeutung zellulärer Abwehrmechanismen in der Frühphase einer Mastitis in jenem distalen Bereich der Zitze. Zu Beginn der Inokulation wurden frühe Immunmechanismen, wie Leukozytenmigration, Sekretion inflammatorischer Mediatoren und Aktivierung von Immunzellen reguliert. Nach 12 h wurden Gene, involviert in Apoptose, antiinflammatorische Zellantworten und verminderte Zellproliferation reguliert.
Nach 24 h wiederum wurden Gene, verantwortlich für Geweberegeneration, Resolution der Entzündung und hormonelle Signaltransduktion reguliert. Generell zeigten die Gene der Drüsenzisterne nach 12 h die stärkste Antwort auf die Infektion, die Gene des lobulär- alveolären Gewebes wurden am stärksten nach 24 h reguliert, so dass regionale Unterschiede der Genexpression die funktionelle Erwiderung hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs einer bakterieller Infektion bedeuten. Die somatische Zellzahl stieg erst ab 24 h nach Infektion an.
Bis zu diesem Zeitpunkt existierte nur ein minimaler Influx von Immunzellen in das Gewebe.
Möglicherweise repräsentieren die Daten der regulierten Gene, verantwortlich für die Chemotaxis in Zitzen- und Drüsenzisterne, eher die Stimulation residenter Immunzellen, denn den Influx migrierender Immunzellen in das Gewebe. Weiterhin wurde nach 12 h ein Peak in der Expression von TLR2 und TLR4 in der Zitze gemessen. Jenes beweist nicht nur die Präsenz der TLR-Rezeptoren während einer E. coli Infektion, sondern beweist auch die Bedeutung der Pathogenerkennung in allen Bereichen des Euters (RINALDI et al. 2009).
2.4 Monozyten und Makrophagen
Bei Säugetieren sind Makrophagen direkt nach der Geburt in allen Geweben zu finden (POLLARD 2009). Makrophagen sind 12-20 µm große, meist einkernige Zellen. Sie stellen die gereifte Form von Monozyten dar, welche im peripheren Blut zirkulieren und zu Makrophagen differenzieren, sobald sie in Gewebe einwandern. Sie sind Teil der angeborenen Immunabwehr die den phagozytierenden Zellen angehören. Sie nehmen Krankheitserreger auf, zerstören sie in intrazellulären Vesikeln und präsentieren zusätzlich Antigene an ihrer Oberfläche. Eine Besonderheit dieser Zellen ist ihre Plastizität, von der myeloiden Vorläuferzelle unter verschiedenen Stimuli zur hochdifferenzierten Antigen-präsentierenden Zelle zu reifen. Bereits im Blut zirkulieren verschiedene Monozyten-Subpopulationen, die anhand ihrer Oberflächenmoleküle charakterisierbar sind (AUFFRAY et al. 2009). So wurde
bei murinen Monozyten eine unterschiedliche Expression der Chemokinrezeptoren CX3CR1 und CCR2 nachgewiesen (GEISSMANN et al. 2003), die je nach Expressionsdichte dieser Rezeptoren in inflammatorisches und nicht erkranktes Gewebe „homen“ (MANTOVANI et al. 2004). Zudem scheint der Zeitpunkt, an dem Monozyten das Blutgefäß verlassen und in Gewebe einwandern, für deren Determinierung von entscheidender Bedeutung zu sein (MOSSER u. EDWARDS 2008).
2.4.1 Makrophagen-Subpopulationen
Im Gewebe angekommen, differenzieren Monozyten, je nach Stimuli der Mikroumgebung, zu funktionellen Effektorzellen, die anhand ihres Chemokinspektrums sowie ihrer Oberflächenrezeptoren zu unterschiedlichen Phänotypen heranreifen. Dieser physiologische Prozess ermöglicht eine spezifische und effektive Pathogenbekämpfung (ZHANG u.
MOSSER 2008), der eine Aktivierung des Makrophagen voraussetzt. In der Regel sind dazu zwei Signale nötig, wobei eines von Zellen des angeborenen Immunsystem bereitgestellt wird (z.B. IFN von NK-Zellen) und als „priming step“ fungiert (MOSSER u. ZHANG 2008). Das zweite Signal wird als Pathogen-associated-molecular-pattern vom Pathogen exprimiert und versetzt den Makrophagen über dessen pattern recognition receptor (z.B. Toll-like receptor) in einen aktivierten Zustand.
Der klassisch aktivierte Makrophage stellt eine stark proinflammatorisch geprägte und mikrobizide Zelle dar. Einhergehend mit der Aktivierung sind eine verstärkte Pinozytoserate sowie ein ausgestreckter Zellkörper und Reduktion der Expression des Fc-Rezeptors für IgG (FcγR II) (EZEKOWITZ u. GORDON 1984).
Makrophagen lassen sich in M1 und M2-Subtypen einteilen, wobei M2 Makrophagen aus weiteren drei Subtypen bestehen (MANTOVANI et al. 2004). Der M1 Makrophage repräsentiert den inflammatorisch polarisierten Zelltyp, der in einem Interferon- und LPS- geprägtem Milieu entzündungsfördernde Zytokine wie IL-1 und TNF-α sezerniert und intrazellulär phagozytierte Pathogene mittels reaktiver Sauerstoffspezies abtötet. Der klassisch proinflammatorische M1 Makrophage fördert weiterhin eine Th-1-vermittelte Zellantwort und ist mit Autoimmunerkrankungen assoziiert (MOSSER 2003), da intrazellulär synthetisierte toxische Radikale und inflammatorische Mediatoren Gewebeschädigungen zur Folge haben können. Die M2 Makrophagen hingegen waren durch Stimuli wie IL-4, IL-13
sowie Immunkomplexe in Kombination mit TLR-Liganden induzierbar. M2 Makrophagen zeichnen sich durch eine hohe IL-10 und geringe IL-12 Sekretion aus sowie durch die Sekretion von TGF-β und des löslichen pattern-recognition receptors PTX3. IL-10 spielt bei diesem Zelltyp eine entscheidende Rolle, da wichtige antiinflammatorische und zellprotektive Effekte mit IL-10 assoziiert sind (POLLARD 2009). Die Präsenz des Enzyms Arginase überwog gegenüber dem M1-charakteristischen Enzym iNOS, welches die Fähigkeit der M2 Makrophagen zur intrazellulären Pathogenbekämpfung limitiert (FAIRWEATHER u.
CIHAKOVA 2009). M2 Makrophagen sind in Th-2 vermittelte Immunantworten, Allergiegeschehen sowie Geweberegeneration und -erneuerung durch Synthese von Fibronectin und dem Matrix-assoziierten Protein βIG-H3 involviert (GRATCHEV et al.
2001). Oft wurden die M2 Makrophagen auch als „alternativ-aktivierte“ Makrophagen beschrieben (VAN GINDERACHTER et al. 2008), denen antiinflammatorische Eigenschaften zugeschrieben wurden. Der Begriff „alternativ“ geht zurück auf die erhöhte Expression des Mannose-Rezeptors dieser Zellen (MOSSER u. EDWARDS 2008). Die hemmende Aktivität der M2 Makrophagen erstreckt sich auch auf T-Zellen, welche in Anwesenheit von M2 Makrophagen eine signifikant verminderte proliferative und sekretorische Zellantwort zeigten (SCHEBESCH et al. 1997). Weiterhin gibt es die Möglichkeit einer Änderung des Phänotyps einer bereits bestehenden Makrophagenpopulation (MOSSER u. EDWARDS 2008; FAIRWEATHER u. CIHAKOVA 2009). Es ist unklar, ob es sich bei dieser phänotypischen Abänderung um eine De- Differenzierung zurück zu ruhenden Zellen handelt oder um einen Ersatz durch ins Gewebe einwandernde, phänotypisch neue Makrophagen. Die Änderung der Polarisierung einer Makrophagenpopulation ist dabei eng mit pathologischen Erscheinungen wie z.B. malignen Neoplasien oder Autoimmunerkrankungen assoziiert.
2.4.2 Die LPS-Toleranz von Makrophagen
Lipopolysaccharide (LPS) als Bestandteil Gram-negativer Bakterien vermitteln über den Toll- like Rezeptor 4 (TLR4) die Induktion einer Entzündung (TAKEDA et al. 2003). Die inflammatorische Antwort erfordert eine strenge Regulation, um überschießende und schädigende Einwirkungen einer TLR-vermittelten Entzündung in Ausmaß und Dauer zu begrenzen. Diese Regulation beinhaltet die Inhibierung des TLR-signalling durch
induzierbare, negative Regulatoren, die Produktion antiinflammatorischer Zytokine sowie Veränderungen in der Struktur des TLR-Komplexes (LIEW et al. 2005). Insgesamt führten diese Mechanismen zu dem Phänomen der „LPS-Toleranz“, jener Unempfindsamkeit von Zellen oder Organismen auf wiederholte oder verlängerte Stimuli mit LPS (BEESON 1947a, b; WEST u. HEAGY 2002; CAVAILLON u. ADIB-CONQUY 2006).
LPS-Toleranz wurde lange als eine Art „hyporesponsive state“ von Makrophagen angesehen, resultierend aus einer Desensibilisierung des Rezeptors (MEDVEDEV et al. 2000;
DOBROVOLSKAIA u. VOGEL 2002; MEDVEDEV et al. 2002; FUJIHARA et al. 2003).
Bei der Signalübertragung mittels TLR waren jedoch sehr viele verschiedene Gene mit unterschiedlichen Funktionen beteiligt (HUANG et al. 2001), deren Regulation auf die diverse Funktionalität abgestimmt sein muss. So sollte z.B. in toleranten Makrophagen die Möglichkeit bestehen, proinflammatorische Gene vorübergehend zu deaktivieren, um Gewebeschäden zu begrenzen. Andererseits sollten Gene, die verantwortlich für mikrobizide Effekte und Proteine sind, auch nach mehrfacher TLR-Stimulation induzierbar sein, um den Organismus kontinuierlich vor Pathogenen zu schützen (FOSTER et al. 2007). Es wurden zwei TLR-induzierte Gensätze, basierend auf deren Funktion und regulatorischen Aufgaben, kategorisiert: Nach wiederholter LPS-Exposition zeigt sich eine Gruppe von TLR-induzierten Genen in vorübergehend ruhendem Zustand (T-Gene, nicht induzierbare Gene in toleranten Makrophagen, z.B. das Gen Bpil2). Ziel dieser „Ruhigstellung“ war das Verhindern einer exzessiven Verschlimmerung einer entzündlichen Reaktion. Die zweite Gruppe beinhaltete Gene, die auf wiederholten LPS-Stimulus induzierbar blieben und weiterhin mikrobizide Effekte vermittelten, um den Organismus vor Infektionen zu schützen (NT-Gene, induzierbare Gene in toleranten Makrophagen, z.B. das Gen Lipg). Nach einer einmalig verabreichten Dosis LPS kam es zu einer Veränderung der NT-Gene, die daraufhin auf eine zweite Dosis LPS eine schnellere Kinetik der Ansprechbarkeit zeigten. Dieses Phänomen wurde als „transkriptionelles Gedächtnis“ bezeichnet und zeichnete sich durch dessen Effizienz in der schnellen Erregerbekämpfung aus. Weiterhin fand die Regulation eher auf Gen-spezifischer, denn auf Signal-spezifischer Ebene statt (FOSTER et al. 2007). Im Detail beinhaltete diese Regulation den Umbau von Histonen und die Neugestaltung von Nukleosomen (NARLIKAR et al. 2002; CHI 2004).
Diese Klassifizierung reflektiert das funktionelle Prinzip der Genregulation: Die unterschiedliche Ansprechbarkeit eines Gens und dessen codierter Produkte fungiert in Abhängigkeit der daraus resultierenden Vor- oder Nachteile für den Organismus (FOSTER et al. 2007).
2.4.3 Der Transkriptionsfaktor PPARγ
PPARγ ist ein Ligand-abhängiger, nukleärer Hormonrezeptor, der eine Vielzahl zellulärer Prozesse moduliert (CHINETTI et al. 2000). Er spielt eine besondere Rolle in der Adipogenese, in der Lipid- und Glucose-Homöostase sowie in der Funktion von Makrophagen (COCK et al. 2004; EVANS et al. 2004; LEHRKE u. LAZAR 2005).
Weiterhin kommt PPARγ eine Rolle im entzündlichen Geschehen zu (YOUSSEF u. BADR 2004). Einige Autoren postulierten die Hemmung proinflammatorischer Mediatoren durch die Aktivierung von PPARγ (JIANG et al. 1998; RICOTE et al. 1998; RICOTE et al. 1999;
CUZZOCREA et al. 2002). Andere hingegen widerlegten die antiinflammatorische Aktivität und beschrieben proinflammatorische Wirkungen von PPARγ (TONTONOZ et al. 1998;
THIERINGER et al. 2000; DELERIVE et al. 2001).
Lymphozyten und dendritische Zellen exprimieren PPARγ und unterstreichen so dessen Rolle in der Regulation einer Immunantwort (STANDIFORD et al. 2005). Auch Makrophagen enthalten große Mengen an PPARγ, dessen Expression in dem Differenzierungsprozess aus Monozyten stark induziert wurde (CHINETTI et al. 1998). Bezüglich Makrophagen sind funktionelle Zusammenhänge zwischen der Expression von PPARγ und der Makrophagenpolarisierung hinsichtlich einer M2 Population beschrieben: Die PPARγ Expression war mit der Expression von M2-Markern, wie z.B. CCL18, Mannoserezeptor und IL-10 positiv korreliert, hingegen wurde keine Korrelation zwischen der Expression von PPARγ und M1-Markern wie CCL2, TNF-α und IL-6 beobachtet (BOUHLEL et al. 2007).
Des Weiteren findet sich die PPARγ-abhängige Unterdrückung inflammatorischer Antwort- Gene in Makrophagen wie iNOS, COX2 und IL-12 (RICOTE et al. 1998; CHUNG et al.
2000; WELCH et al. 2003). Wurden M1 Makrophagen mit Zellkulturüberständen von M2 Makrophagen inkubiert, so resultierte daraus eine Hemmung der sezernierten, typisch proinflammatorischen Zytokine wie CCL2 und TNF-α. Dieser hemmende Effekt konnte durch die Zugabe eines PPARγ-Agonisten noch verstärkt werden und gibt so deutliche
Hinweise auf ein PPARγ-abhängiges Priming von Makrophagen in Richtung M2-Population (BOUHLEL et al. 2007). Der Mechanismus dieser Hemmung der Zytokinausschüttung durch PPARγ-Agonisten ist noch nicht hinreichend geklärt, jedoch deutet sich an, dass die prinzipiellen Mechanismen prätranslational in Assoziation mit dem activator-protein AP-1 ablaufen (JIANG et al. 1998). Weiterhin produzierten M2 Makrophagen durch IL-4- abhängige Aktivierung der 12/15 Lipoxygenase mehr endogene PPARγ-Liganden als M1 Makrophagen (CONRAD et al. 1992; HEYDECK et al. 1998; HUANG et al. 1999). Die 13/15 Lipoxygenase generiert durch Oxidation von Linolsäure und Arachidonsäure die PPARγ-Liganden 13-HODE und 15-HETE (COSTE et al. 2003; BERRY et al. 2007).
Weiterhin förderte das M2-assoziierte Zytokin IL-13 Phospholipase A2-abhängig die Produktion des Liganden 15d-PGJ2 (KUHN 1996; HEYDECK et al. 1998). Die in vivo Relevanz von PPARγ in Makrophagen zeigte sich an PPARγ-defizienten Mäusen:
Unstimulierte Makrophagen dieser Tiere wiesen eine erhöhte Produktion inflammatorischer Zytokine auf, was vermuten lässt, dass endogene PPARγ-Liganden Makrophagen unter
„steady-state“-Bedingungen halten (VAN GINDERACHTER et al. 2008). Darüber hinaus zeigten diese Tiere eine erhöhte Rekrutierung von Makrophagen in inflammatorische Gewebe sowie eine Überreaktion dieser Zellen in Erwiderung auf inflammatorische Stimuli, welches eine Verschlimmerung der Entzündung zur Folge hatte (SHAH et al. 2007). Jedoch muss erwähnt werden, dass auch in PPARγ–defizienten Makrophagen Liganden-vermittelte, antiinflammatorische Eigenschaften beschrieben wurden, so dass auch PPARγ–unabhängig antiinflammatorische Effekte vermittelt werden können (CHAWLA et al. 2001). In LPS- belasteten Schweinen zeigte sich nach Gabe eines PPARγ-Agonisten ebenfalls eine verstärkte proinflammatorische Antwort, einhergehend mit einer stark erhöhten TNF-α- und IL-6- Sekretion. Trotzdem steht die Kontrolle der Expression proinflammatorischer Gene durch PPARγ in einem komplexen Zusammenhang, an dem auch andere Transkriptionsfaktoren wie NF-κB, STAT-1 und AP-1 beteiligt waren (LIU et al. 2009). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Regulation von PPARγ durch pro- oder antiinflammatorische Signale ein wichtiger Faktor bei der Triggerung der Makrophagenpolarisierung ist. Entscheidend ist hierbei jedoch auch das Ursprungsgewebe der Makrophagen sowie deren Aktivierungszustand vor PPARγ-Aktivierung. In bovinen, mammären Epithelzellen konnte mit dem natürlichen PPARγ-Agonist 15d-PGJ2 eine partielle, proinflammatorische Antwort
ausgelöst werden, die sich in einer verstärkten Expression von CXCL6 und CXCL8 zeigte (LUTZOW et al. 2008b).
Zu den PPARγ–regulierten Genen gehört auch Pentraxin 3. Pentraxin 3 gehört zusammen mit den Akute-Phase Proteinen C-reaktives Protein und Serumamyloid A zur Familie der Pentraxine und stellt einen löslichen pattern-recognition-receptor dar. Diverse Zelltypen, unter anderem glatte Muskelzellen (KLOUCHE et al. 2004), Endothelzellen (BREVIARIO et al. 1992), Monozyten und Makrophagen (DONI et al. 2003) synthetisieren PTX3 in Erwiderung auf Toll-like Rezeptor Agonisten (LPS) und proinflammatorische Signale wie IL- 1β und TNF-α (IMAMURA et al. 2007). In ausdifferenzierten Makrophagen war die Expression von PTX3 durch LPS induzierbar. In unstimulierten Makrophagen war PTX3 jedoch nicht nachweisbar (SALIO et al. 2008). In bovinen, in vitro kultivierten mammären Epithelzellen war PTX3 durch LPS und LTA induzierbar und LUTZOW et al. (2008) postulieren so eine Rolle für PTX3 in der initialen Antwort des Eutergewebes auf bakterielle Infektionen.
2.4.4 Makrophagen im bovinen Euter
Im Euter des Rindes regulierten Makrophagen nach einer Infektion des Euters mit E. coli oder Staph. aureus die Synthese von Akute Phase Proteinen und förderten den Influx von Monozyten aus dem peripheren Blut in das Euter (OVIEDO-BOYSO et al. 2007). Darüber hinaus vollzogen sich von der initialen Phase einer entzündlichen Reaktion im Euter bis zur Resolution der Entzündung morphologische Veränderungen der Makrophagen. So wiesen 90% der dort ansässigen Makrophagen zu Beginn eines inflammatorischen Geschehens im Euter morphologische Ähnlichkeiten zu Blut-Monozyten auf. Diese Monozyt-ähnlichen Makrophagen waren durch einen ovoiden Zellkern, homogenes, fein-granuläres Zytoplasma mit vielen Mitochondrien sowie durch die Abwesenheit von Lysosomen charakterisiert. Sie stellten frisch aus dem Blut in das Gewebe migrierte Zellen dar. 48-72 Stunden nach Infektion wurden Makrophagen mit phagozytierten, apoptotischen neutrophilen Granulozyten im Euter detektiert (SLADEK et al. 2006). Nach der Phagozytose apoptotischer Neutrophiler kam es zu keiner Sekretion proinflammatorischer Mediatoren von Seiten des Makrophagen (MEAGHER et al. 1992). Jedoch wurden postphagozytotische Faktoren sezerniert, welche für die Migration neutrophiler Granulozyten in das Euter verantwortlich waren (CRAVEN 1983). In
der Resolutionsphase der Entzündung fand man hauptsächlich große, vakuolisierte Makrophagen, mit dichten intrazytoplasmatischen Phagolysosomen mit Resten vorverdauderten Materials phagozytierter apoptotischer Neutrophiler. Lange Pseudopodien waren ebenfalls charakteristisch für Makrophagen der Resolutionsphase einer Entzündung (SLADEK et al. 2006). Die unterschiedlichen Makrophagenformen reflektieren so nicht nur deren morphologische Vielfalt, sondern auch deren funktionelle Heterogenität und Plastitzität in den verschiedenen Stadien einer Entzündung.
2.4.5 Makrophagen-spezifische Antikörper
Anti-CD68
Der Nachweis von Makrophagen ist mittels eines anti-CD68-Antikörpers möglich (CHRISTGAU et al. 1998; WANGOO et al. 2005; OLIVEIRA u. HANSEN 2008). Der CD68-Antikörper erkennt auf Makrophagen ein Transmembran-Glykoprotein, inklusive Alveolarmakrophagen, Kupffer Zellen der Leber und Monozyten (WARNKE et al. 1989;
PULFORD et al. 1990; SMITH et al. 1991). Es steht in enger Beziehung zu der Familie der Lysosomal-assoziierten, Mucin-ähnlichen Peptide (LAMPS) (KUNISCH et al. 2004).
Obwohl CD68 vorwiegend in lysosomalen Membranen vorkommt, ist eine kleine Fraktion des Proteins auch an der Zelloberfläche gebunden (STROBL et al. 1995; UMINO et al. 1999).
CD68 agiert als scavenger receptor für Lipoproteine niederer Dichte (RAMPRASAD et al.
1996) und ist involviert in Zell-Zell-Interaktionen (STROBL et al. 1995). CD68 ist z.B. auch auf neoplastischen Zellen, neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen vorhanden (FALINI et al. 1993; KUNISCH et al. 2004) und kann aus diesem Grund nicht als exklusiver Marker für Monozyten/Makrophagen gesehen werden (LAU et al. 2004).
Antikörper MAC387
Der Antikörper MAC387 erkennt das L1 Protein Calprotectin, ein S100 Protein. Der Name
„Calprotectin“ beschreibt die antimikrobielle Eigenschaft dieses Proteins aufgrund seiner Calcium-bindenden Eigenschaften (STEINBAKK et al. 1990). S100 Proteine gehören zu den damage-associated molecular pattern (DAMP), welche von aktivierten oder beschädigten Zellen unter stressbedingten Umständen als „Alarmine“ freigesetzt werden (OPPENHEIM u.
YANG 2005). Auch in der Folge von Zelltod und Zelldisruption kommt es zur Freisetzung der S100 Proteine. Diese finden sich auch auf nichtkeratinisierten, mehrschichtigen
Plattenepithelien (VOGANATSI et al. 2001). S100A8 (Calgranulin A) und S100A9 (Calgranulin B) sind zytoplasmatischer Bestandteil neutrophiler Granulozyten, mononukleärer Zellen, aber auch von Epithelzellen (FOELL et al. 2007). S100A8 und A9 liegen intrazellulär vorzugsweise als Heterokomplex vor, genannt „Calprotectin“ (PERERA et al. 2010). Nach Phagozytose und der damit einhergehenden Zellaktivierung interagiert der A8-A9-Heterokomplex mit einer Neuanordnung des Zytoskeletts in Assoziation mit Veränderungen des intrazellulären Calcium-Spiegels, so z.B. nach der transendothelialen Migration von Leukozyten (PERERA et al. 2010). Des Weiteren kam es über den A8-A9 Heterokomplex in neutrophilen Granulozyten zur Aufnahme ungesättigter Fettsäuren wie z.B.
Arachidonsäure sowie deren anschließender Freisetzung (KLEMPT et al. 1997). Dieser Arachidonsäure-Calprotectin-Komplex kann von benachbarten Zellen aufgenommen werden, die wiederum neue Eicosanoide synthetisieren und somit zum inflammatorischen Geschehen beitragen (NACKEN et al. 2003). Die Sekretion der S100 Proteine findet über das endoplasmatische Reticulum und den Golgi Apparat der Zelle statt. IL-1β, TNF-α und LPS förderten eine Sekretion von S100 Proteinen aus neutrophilen Granulozyten (RAMMES et al.
1997; KIDO et al. 2005) und murinen Makrophagen. Weiterhin band S100A8/A9 spezifisch an Endothelzellen, in denen sie eine inflammatorische Reaktion auslösen. Zusätzlich induzierten sie die Expression proinflammatorischer Zytokine sowie Adhäsionsmoleküle (VCAM-1 und ICAM-1). S100-Proteine wurden außerdem stark in lokal inflammatorischem Gewebe exprimiert (FOELL et al. 2007). Weiterhin ist eine IL-10 abhängige Geninduktion von S100A8/A9 in murinen Monozyten/Makrophagen möglich. Damit geht ein mögliches S100A8/A9 Induktionsprofil zu einem regulatorischen Makrophagentyp einher (PERERA et al. 2010). Hingegen wurde auch Calprotectin als inflammatorischer Marker im Gewebe (z.B.
Lunge) gefunden, dessen Expression mit frisch rekrutierten, Monozyten-ähnlichen Makrophagen (M1 Makrophagen) genannt wird (STRIZ u. TREBICHAVSKY 2004).
Antikörper AM-3K
Der Antikörper AM-3K erkennt das CD163-Molekül, ein Monozyten/Makrophagen restringiertes Membranprotein, welches zur Scavenger-Rezeptor Cystein-Superfamilie gehört (LAW et al. 1993; HOGGER et al. 1998; SCHAER et al. 2001). CD163 fungiert als ein Hämoglobin Scavenger Rezeptor, der im Blut zirkulierende Hämoglobin-Haptoglobin Komplexe bindet und beseitigt (KRISTIANSEN et al. 2001). Aufgrund dieser „reinigenden“
Funktion wurde CD163 positiven Makrophagen eine Bedeutung in der späten Entzündungsphase zugeschrieben (ZWADLO et al. 1987; TOPOLL et al. 1989). Für die Stimuli IL-6, IL-10 und Glucocorticoide wurde eine Induktion der CD163 Expression beschrieben (SULAHIAN et al. 2000; SCHAER et al. 2001), wohingegen durch IFNγ und LPS eine verringerte CD163 Expression beobachtet wurde (BUECHLER et al. 2000). Auch die Sekretion antiinflammatorischer Proteine von Makrophagen war mit CD163 assoziiert (HAMANN et al. 1995). Zunächst wurden mit Hilfe des AM-3K Antikörpers humane Gewebemakrophagen nachgewiesen (ZENG et al. 1996a), wobei später die breite Kreuzreaktivität dieses Antikörpers mit verschiedenen Tierspezies (u.a. Ratten, Schweine, Katzen, Rinder, Ziegen) erkannt wurde (ZENG et al. 1996a; YAMATE et al. 2000;
KAWASHIMA et al. 2004). Das immunhistochemische Detektionsmuster von AM-3K für tierisches Gewebe ist sehr ähnlich zu dem Detektionsmuster humanen Gewebes (ZENG et al.
1996a). Jedoch zeigte der Antikörper eine unterschiedlich starke Reaktivität in Abhängigkeit der verwendeten Makrophagen. So zeigten Makrophagen, die mit IL-10 stimuliert wurden, eine stark positive Reaktion auf AM-3K. Jene hingegen, die mit klassisch-aktivierenden Stimuli, wie z.B. IFNγ, stimuliert wurden, eine sehr schwach positive Reaktion. Das Detektionsmuster des Antikörpers zeigt somit in Richtung antiinflammatorisch polarisierter Makrophagen und ermöglicht daher eine präzisere Charakterisierung von Makrophagensubpopulationen als herkömmliche Makrophagen-spezifische Antikörper (KOMOHARA et al. 2006). Weiterhin war AM-3K immunhistochemisch negativ für Blutmonozyten und Populationen von dendritischen Zellen (ZENG et al. 1996b).
Weder Epithelzellen noch Blutmonozyten noch Populationen von dendritischen Zellen waren immunopositiv. Die Expression des von AM-3K erkannten CD163 erfolgte in Abhängigkeit des Differenzierungsstadiums der Makrophagen. Bei den AM-3K-positiv gefärbten Makrophagen soll es sich um Makrophagen im späten Differenzierungsstadium handeln. Des Weiteren waren die Bedingungen der Mikroumgebung der Makrophagen für die Expression von CD163 von entscheidender Bedeutung (YAMATE et al. 2000). Wurden unterschiedliche Makrophagen-Antikörper verwendet, berichten Forschergruppen von selektiv AM-3K positiv gefärbten Makrophagenpopulationen (IDE et al. 2001; KAWASHIMA et al. 2004;
KOMOHARA et al. 2008).
2.5 Prostaglandine
Prostaglandine sind eine Gruppe von Entzündungsmediatoren, die zusammen mit den Leukotrienen und den Thromboxanen als Eicosanoide bezeichnet werden. Sie werden aus Eicosatetraensäure (syn. Arachidonsäure) gebildet und sind an wichtigen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Arachidonsäure liegt in der Zelle nur in geringer Menge in freier Form vor, der größte Anteil ist Bestandteil der Membran-Phospholipide. Eine Freisetzung der Arachidonsäure erfolgt über das membrangebundene Enzym Phospholipase A2. Die Aktivierung dieses Enzyms erfolgt über inflammatorische, hormonelle oder immunogene Stimuli (MILLER 2006). Die freigesetzte Arachidonsäure ist Substrat und Ausgangspunkt für die Synthese von Prostaglandinen (Cyclooxygenase) und Leukotrienen (Lipoxygenase). Die Cyclooxygenase 1 (COX1) wird konstitutiv unter basalen Bedingungen von den meisten Zellen des Immunsystems exprimiert. Hohe Konzentrationen an COX1 wurden in Gefäßendothelzellen, Thrombozyten sowie in glatten Muskelzellen gefunden. Die basale Expression dieses Enzyms ist verantwortlich für die Synthese von Prostaglandinen zur Regulation homöostatischer Zellfunktionen in den meisten Organsystemen. Der fehlende Nachweis von COX2 in ruhenden Zellen sowie der Nachweis erhöhter COX2 Spiegel in inflammatorischem Gewebe führten zu der Vermutung, die COX2 sei ein primär unter inflammatorischen Stimuli induzierbares Enzym. Neuere Untersuchungen zeigten jedoch, dass auch die COX2 konstitutiv exprimiert wird und ein wichtiger Bestandteil der normalen Funktion von Organsystemen ist (MILLER 2006). Beide Cyclooxygenasen setzen die Arachidonsäure zunächst zu Prostaglandin G2 um, welches weiterhin zu PGH2 katalysiert wird. Die weitere Reaktion von PGH2 in die unterschiedlichen Prostglandinderivate (PGE2, PGD2 etc.) wird von zellulären Isomerasen und Synthasen katalysiert. Je nach Zelldifferenzierung und –enzymausstattung kommt es hier zu unterschiedlich hohen Konzentrationen der synthetisierten Prostaglandine. Unmittelbar nach der Synthese werden die Prostaglandine in die lokale Mikroumgebung der Zelle freigesetzt.
Prostaglandine wirken auf andere Zellen über die Bindung an spezifischen Zelloberflächen- Rezeptoren (G-Proteine). Man unterscheidet die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren anhand ihrer selektiven Bindung der Prostaglandinderivate sowie nach dem bindungsinduzierten Transduktionsweg, der nach Bindung des Liganden aktiviert wird (MCCULLOUGH et al.
2004). Die G-Protein-Zyklen wirken als Vermittler eines Effektorswitch zwischen
stimulierenden (Gs) und hemmenden (Gi) Signalwegen. Je nach Aktivierung eines stimulierenden oder hemmenden G-Proteins kommt es zur Aktivierung oder Hemmung einer Adenylatzyklase, die für die intrazelluläre Synthese von cyclischem AMP verantwortlich ist (MILLER 2006). Für PGE2 sind vier unterschiedliche Rezeptorsubtypen beschrieben: EP1, EP2, EP3, EP4 (HARIZI et al. 2003; MCCULLOUGH et al. 2004).
Bovine PGE2-Rezeptoren wurden mittels PGE2 Agonisten und Antagonisten in Chondrozytenkulturen funktionell charakterisiert. Sie weisen ähnliche pharmakologische Charakteristika des untersuchten Rezeptorsubtypes zu dem human PGE2-Rezeptor EP4 auf (DE BRUM-FERNANDES et al. 1996). Weiterhin ist PGE2 ein Faktor, der zur selektiven Differenzierung mononukleärer Zellen führt. Die in vitro Differenzierung dendritischer Zellen in Anwesenheit von PGE2 beeinflusste die IL-12/IL-23 Balance und förderte die Differenzierung von Th17-Zellen (KHAYRULLINA et al. 2008). Weiterhin hemmte es in dendritischen Zellen die Produktion der inflammatorischen Zytokine CCL3 und CCL4 (JING et al. 2003) und förderte die Produktion von endogenem IL-10, welches Zellfunktionen dendritischer Zellen abschwächt (HARIZI et al. 2002).
2.5.1 Antiinflammatorische Eigenschaften der Prostaglandine
Bisher ist wenig bekannt über die Mediatoren und Mechanismen, die eine Entzündung beenden. Es galt lange die Theorie, das Ende einer Entzündung sei ein passiver Prozess (SERHAN 2004), in dem eine Art „Verbrauch“ an Mediatoren den begrenzenden Faktor darstelle. Es käme zum „Auslaufen“ der Entzündung, welches eine Wiederherstellung physiologischer Zustände ermöglicht. LAWRENCE et al. (2002) jedoch zeigten, dass die Resolution einer Entzündung ein aktiver Prozess ist, der durch die Hemmung proinflammatorischer Gene, Zellbewegung, Apoptose, Phagozytose sowie durch Synthese antiinflammatorischer Mediatoren kontrolliert wird (LAWRENCE et al. 2002). Konkret beschreiben sie einen „switch“ der Prostaglandinsynthese von proinflammatorischen Prostaglandinen, wie hier erwähnt PGE2, hin zur Synthese antiinflammatorischer Prostaglandine gegen Ende einer Entzündung. In diesem Zuge synthetisiert die COX2 vornehmlich die antininflammatorischen Cyclopentenon-Prostaglandine wie 15d-PGJ2. Dieses wurde auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben (LEVY et al. 2001). PGE2
kommt in diesem Zusammenhang eine Doppelrolle zu: Es wird zunächst als klassisches
Prostaglandinderivat zu Beginn einer Entzündung synthetisiert und verstärkt so die klassischen Kennzeichen einer Entzündung (SERHAN 2004). Weiterhin aber induzierte es, zusammen mit PGD2, die Produktion von Schlüsselenzymen zur Synthese von Lipoxinen (LEVY et al. 2001), Resolvinen und Protectinen (SERHAN et al. 2000; SERHAN et al. 2002;
HONG et al. 2003). So stimulierten lokales PGE2 und PGD2 die Entwicklung von 15- Lipoxygenase-mRNA in Leukozyten zur Produktion von Lipoxinen (LEVY et al. 2001).
Diese endogenen, resolutionsfördernden Moleküle fördern das Abklingen der Entzündung durch Aktivierung spezifischer Mechanismen zur Herstellung der Homöostase. Zum Beispiel hemmten sie die Infiltration neutrophiler Granulozyten, förderten die Rekrutierung nicht- entzündlicher Monozyten und aktivierten die Phagozytose von Mikroorganismen und apoptotischen Zellen durch Makrophagen (CANNY et al. 2002; SERHAN et al. 2002;
CAMPBELL et al. 2007; SERHAN et al. 2007). Weiterhin konnten sowohl PGD2 als auch PGE2 durch Infiltration in Ansammlungen neutrophiler Granulozyten deren Phänotyp hin zu einem Resolutions-fördernden Phänotyp beeinflussen, genannt „lipid-mediator class switching“ (LEVY et al. 2001). Auch pharmakologisch verabreicht konnte PGE2, durch Stimulation von cAMP, antiinflammatorische Eigenschaften haben (KUNKEL et al. 1981).
Als resolutionsfördernder Mediator per se war PGE2 dennoch nicht zu bezeichnen (HASTURK et al. 2007), so förderte es doch nicht die antiinflammatorischen Eigenschaften von Makrophagen, wie z.B. Aufnahme und Beseitigung apoptotischer Zellen (SERHAN et al.
2008).
2.5.2 Prostaglandin E
2und dessen Wirkung auf Immunzellen
Für PGE2 sind zahlreiche Effekte auf Zellen des Immunsystems beschrieben. PGE2 hat zum einen potente, proinflammatorische Eigenschaften: Es induziert Vasodilatation und vestärkt die Histamin- und Bradykinin-bedingte, inflammatorische Ödematisierung (WILLIAMS 1979; TRANG 1980). Durch Herabsetzung der Schmerzgrenze in Erwiderung auf Histamine und Kinine ist PGE2 auch für die Schmerzauslösung verantwortlich (ZURIER u.
QUAGLIATA 1971) Zusätzlich förderte PGE2 die Synthese des inflammatorischen Zytokins IL-6 (ARONOFF et al. 2004). Andererseits hemmte PGE2 die Freisetzung lysosomaler Enzyme aus Granulozyten, Mastzelldegranulation und Thrombozytenaggregation (TRANG 1980). Auch SERHAN et al. (2008) klassifizierten PGE2 zusammen mit anderen Mediatoren
des Fettsäurestoffwechsels als antiinflammatorischen und entzündungsbegrenzenden Faktor.
Im Folgenden werden die Effekte von PGE2 auf unterschiedliche Zellen des Immunsystems näher betrachtet.
Monozyten und Makrophagen
PGE2 hatte einen ambivalenten Charakter auf die Aktivierung von Tumormakrophagen (RENZ et al. 1988). So wurde von einem PGE2-bedingten „Shut off“ der Aktivierung gesprochen (SCHULTZ et al. 1978; SCHULTZ et al. 1979), wobei als Ursache der hemmenden Effekte erhöhte cAMP Level in Makrophagen und anderen Leukozyten beschrieben wurden und PGE2 so eine Rolle als suppressives Molekül der Immunantwort zukommt (GOODWIN u. WEBB 1980; RENZ et al. 1988). In Verbindung mit PGE2 zeigte sich jedoch eine Stimulation der Tumor-assoziierten Zytotoxizität von Makrophagen (DRYSDALE u. SHIN 1981). Weiterhin konnte PGE2 in Abhängigkeit des bereits vorliegenden Aktivierungszustandes eines Makrophagen unterschiedliche Effekte vermitteln (SNIDER et al. 1982). Die exogene Zugabe von PGE2 auf LPS-stimulierte humane Makrophagen führte zu einer Hemmung der Sekretion von IL-1β, TNF-α, GM-CSF, IL-10 und CXCL8. Vermehrt sezerniert hingegen wurden TGF-β (FADOK et al. 1998). Außerdem zeigte sich eine Abnahme der Expression von CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4, IP10 und CCL5 in humanen, PGE2-stimulierten Makrophagen. Auch die Phagozytoseleistung muriner, PGE2- stimulierter Makrophagen, war, im Vergleich zu unstimulierten Makrophagen, signifikant herabgesetzt. Mit der PGE2-vermittelten Suppression der Phagozytose ging eine erhöhte intrazelluläre cAMP Bereitstellung unter Beteiligung des EP2 Rezeptors einher (ARONOFF et al. 2004). PGE2 und erhöhte cAMP Level waren weiterhin jene Faktoren, die zu einer pro- toleranten Polarisierung eines LPS-stimulierten Makrophagen beitrugen und zu einem typisch toleranten Zytokinprofil führten: IL-10 wurde stark exprimiert, während IL-12 jedoch nur in sehr geringem Maße exprimiert wurde (STRASSMANN et al. 1994; VAN DER POUW KRAAN et al. 1995). In Monozyten induzierte PGE in Kombination mit GM-CSF ebenfalls einen Phänotyp, der als pro-tolerant bezeichnet wird (GRANT et al. 2005) und Ähnlichkeiten zum Zytokinexpressionsprofil alternativ polarisierter Makrophagen aufwies (MANTOVANI et al. 2002). Des Weiteren förderte PGE2 die Chemokin-induzierte Migration in Monozyten (PANZER u. UGUCCIONI 2004).
Dendritische Zellen
Die Differenzierung dendritischer Zellen unter PGE2 führte zu der Expression eines proinflammatorischen Zytokinprofils: IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-23 sowie IL-6 wurden in PGE2 differenzierten dendritischen Zellen signifikant stärker exprimiert als in Zellen, die in Abwesenheit von PGE2 differenziert wurden (KHAYRULLINA et al. 2008). HARIZI et al.
(2003) verzeichneten eine verstärkte IL-10 Expression von PGE2 differenzierten Zellen.
KHAYRULLINA et al. (2008) beschrieben eine Verringerung der Expression von IL-6. In Erwiderung auf LPS zeigte sich, dass PGE2 die Zellen in Richtung einer starken, breitgefächerten, proinflammatorisch geprimten Zellantwort beeinflusst. Darüber hinaus zeigten unter PGE2 gereifte dendritische Zellen nach Stimulation mit spezifischen Antigenen vorwiegend eine Th17-Antwort. KHAYRULINNA et al. (2008) warfen auch die Frage auf, wo es in vivo zu einem „primenden Kontakt“ dendritischer Zellen durch PGE2 kommen könnte. Sie verweisen zum einen auf das Knochenmark aufgrund der PGE2-Syntheseleistung der dort ansässigen Zellen, wie mesenchymaler Stammzellen, Makrophagen und Präadipozyten im Stroma. Zusätzlich nennen sie die transendotheliale Migration dendritischer Zellen in Erwiderung auf inflammatorische Prozesse in benachbarte Gewebe als Möglichkeit, unter dem Einfluss von PGE2 zu reifen. Weiterhin spielte PGE2 als chemotaktisches Agens für migrierende dendritische Zellen eine Rolle: EP4-Rezeptor-defiziente Mäuse zeigen eine reduzierte Migration von dendritischen Zellen zu Lymphknoten (KABASHIMA et al. 2003).
Weiterhin führte die exogene Zugabe von PGE2 bei dendritischen Zellen zu einer Verringerung der MHCII Expression. Daran beteiligt waren die Rezeptoren EP2 und EP4.
Außerdem wurden gewebeabhängige Effekte für PGE2 auf dendritische Zellen beschrieben (HARIZI et al. 2003). In peripheren Geweben dominierten stimulierende Effekte, so förderte es die Aktivierung dendritischer Zellen und deren Migration (LUFT et al. 2002;
SCANDELLA et al. 2002). Waren dendritische Zellen jedoch bereits zu lymphatischen Organen migriert, traten hemmende Effekte des PGE2 in den Vordergrund, wie Migrationshemmung und verringerte Antigenpräsentation (HARIZI et al. 2001). Weiterhin wurden PGE2 modulatorische Eigenschaften hinsichtlich der Apoptose verschiedener Zelltypen zugeschrieben (BOWOLAKSONO et al. 2008; HOGGATT et al. 2009). In dendritischen Zellen, die für 72 h mit PGE2 inkubiert wurden, konnte, verglichen zu Zellen,
die in Abwesenheit von PGE2 inkubiert wurden, ein dosisabhängiger, signifikanter Anstieg überlebender Zellen gezeigt werden. Die Zugabe von PGE2 in Kombination mit LPS oder TNF-α zeigte hingegen keine signifikante Erhöhung der Überlebensrate Dendritischer Zellen (BARATELLI et al. 2005).
Weiterhin förderte die exogene Zugabe von PGE2, in Kombination mit TNF-α, IL-6 und IL- 1β, zu in vitro generierten dendritischen Zellen deren Reifung, Migrationsfähigkeit und immunstimulatorische Kompetenz (JONULEIT et al. 1997; RIESER et al. 1997). In dendritischen Zellen war PGE2 in der Lage, in Abwesenheit von LPS die IL-12-Produktion zu stimulieren. PGE2 allein galt jedoch als ein schwacher inflammatorischer Zellstimulus, der erst in Assoziation mit anderen Mediatoren (z.B. TNF-α) seine inflammatorische Potenz erreicht. In peripherem Gewebe residierende dendritische Zellen sind unreif. Zur Reifung zu einer immunkompetenten Zelle war ein Zusammenspiel verschiedener lokaler und systemischer Stimuli nötig (RIESER et al. 1997). Zusammenfassend zeigte sich PGE2 als ein wichiger Aktivator humaner dendritischer Zellen.
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Für die Untersuchungen wurden Tiere verschiedener Rassen und unterschiedlichen Alters eingesetzt. Im Folgenden sind die einzelnen Tiergruppen dargestellt, welche für die Untersuchungen ausgewählt wurden. Bei der Auswahl der Tiergruppen wurde auf Aspekte wie Parität, klinische Allgemeingesundheit und klinische Eutergesundheit innerhalb der Tiergruppen geachtet. Die Eutergesundheit wurde anhand der Zellzahl pro ml Milch und dem Nachweis euterpathogener Mikroorganismen (Vierfeldertafel der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft) definiert (KRÖMKER 2007).
Färsen (K1)
Es handelte sich bei den Kontrolltieren um zwei klinisch gesunde Färsen der Rasse Deutsch- Fleckvieh im Alter von 2 Jahren, die im Versuchsschlachthof Grub getötet wurden. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der Tötung noch nicht in Laktation, vorberichtlich Mastitis-frei und hatten zum Zeitpunkt der Tötung keinerlei Anzeichen einer klinischen Mastitis. Diese Tiergruppe wurde gewählt, um den Einfluss der Laktation auf die Leukozytenpopulation der Zitze gegenüber nicht laktierenden Tieren abgrenzen zu können.
Adulte, eutergesunde, laktierende Rinder (K2)
Die Tiere (n=7) stammten aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover (Holstein-Friesian), dem Veterinär-Anatomischen Institut der Universität Zürich (Holstein- Frisian), der Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilians-Universität München (Deutsch-Fleckvieh) sowie dem Schlachthof Buchloe (Deutsch-Braunvieh). Das Alter lag zwischen 2 und 5 Jahren. Alle Tiere waren zum Zeitpunkt der Probenentnahme in Laktation und hatten keinerlei Anzeichen einer klinischen oder subklinischen Mastitis. Die subklinische Mastitis war bestimmbar durch den Nachweis euterpathogener Mikroorganismen sowie durch Bestimmung des Zellgehalts pro ml Milch. Diese Gruppe diente der Makrophagen- Charakterisierung durch die Immunhistochemie und gilt neben den Färsen als Kontrollgruppe.
