Modulation von Makrophagen durch PGE 2

Wie in 2.4.1 beschrieben, ist die Makrophagenpopulation von ausserordentlicher Heterogenität geprägt. Der Nachweis unterschiedlicher Makrophagenpopulationen im Euter mittels Immunhistochemie bestätigt deren Plastizität und funktionelle Polarität. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, welches Differenzierungspotential von bovinen, in vitro generierten Monozyten ausgeht, bzw. mittels welches Zytokinspektrums sie ihrer Funktionalität Ausdruck verleihen. Überdies wurde untersucht, inwieweit sich die Anwesenheit von PGE2 als Immunmodulator auf den Differenzierungsprozess und den Phänotyp in vitro generierter Makrophagen auswirkt. Dieser Versuch diente der Simulation

inflammatorischer in vivo Bedingungen, indem in inflammatorisches Gewebe rekrutierte Monozyten im frühen Stadium ihres Differenzierungsprozesses zu Makrophagen Entzündungsmediatoren wie PGE2 begegnen. Ihre funktionelle Polarität spiegelt sich anhand ihres Zytokinexpressionsprofils wider und gibt Aufschluss über deren Phänotyp.

Zunächst sollte jedoch folgendes genannt werden: die unterschiedlichen Phänotypen von Makrophagen werden unter dem Aspekt der sie umgebenden Stimuli, wie z.B. IFN+LPS oder IL-4 und IL-13 geprägt (MANTOVANI et al. 2004). Zieht man nun Parallelen der in vitro generierten Makrophagen zu jenen, von Mantovani und anderen Arbeitsgruppen beschriebenen Zelltypen, so muss gesagt werden, dass in vitro eine frühere Prägung stattfindet und die Literatur nur bedingt auf die in vitro Versuche anwendbar scheint. So treffen die eingesetzten Stimuli der Differenzierung (hier PGE₂ und LPS) auf mehr oder minder naive Monozyten des peripheren Blutes, um dann unter deren Einfluss zu Makrophagen zu differenzieren. MANTOVANI et al. (2004) hingegen beschreiben bereits differenzierte, durch den Prozess der Reifung polarisierte Makrophagen, die verschiedenen Stimuli exponiert sind.

Dieser zeitliche Faktor der einwirkenden Stimuli ist, ebenso wie Zusammensetzung der Mikroumgebung und das Zusammenspiel anderer Mediatoren, vor der Interpretation der Ergebnisse von Bedeutung.

Sowohl Makrophagen, denen PGE2 am Ende des Differenzierungsprozesses zugegeben wurde, als auch solche, die unter PGE2 ausdifferenzierten, exprimierten in quantifizierbarem Maße mRNA von CXCL8. Dieses belegt die Einbindung von Makrophagen in die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten im inflammatorischen Geschehen. Die direkte Zugabe von PGE2 in der Konzentration von 1x10^-6 mol/l am Tag 7 der Differenzierung führte in Makrophagen zu einer signifikant stärkeren CXCL8 mRNA-Expression als in Makrophagen, denen kein PGE2 zugegeben wurde (Abb. 25). Dieses könnte bedeuten, dass PGE2 als proinflammatorisches Signal die Makrophagen zu einer vermehrten CXCL8 Sekretion stimuliert, um die Migration neutrophiler Granulozyten und auch T-Zellen in inflammatorisches Gewebe zu locken. PGE2High-MdM zeigten diese vermehrte Expression nicht. Es scheint sich hierbei also um einen kurzweiligen Effekt zu handeln, der nicht für längere Zeit induzierbar scheint. Erwähnenswert ist weiterhin die konstante Expression der CXCL8 mRNA nach Stimulation mit LPS (Abb. 25), die, im Vergleich zu anderen Zytokinen

durch PGE2 nicht beeinflusst wird. Jenes verdeutlicht die Sonderrolle des Chemokins CXCL8 und deren Wirkungen in der Rekrutierung weiterer Effektorzellen.

Die Expression von CCL5 ist ebenfalls vor dem Hintergrund der beiteren zellulären Chemotaxis (T-Zellen, NK-Zellen, Monozyten) zu werten. Anders als CXCL8 war es jedoch erst durch LPS-Stimulation in MdM, die in Abwesenheit von PGE2 ausdifferenzierten, nachweisbar (Abb. 25). War hingegen PGE2 als kontinuierlicher Reiz in der Differenzierungsphase vorhanden, wird CCL5 geringgradig basal exprimiert (Abb. 21). Diese Tatsache könnte die Rolle von PGE2 im Gewebe als entzündungsfördernder Mediator aufgreifen, der langfristig weiterhin Effektorzellen in das Gewebe rekrutiert. Auch war die Expression von CCL5 unter LPS Einfluss um ein Vielfaches höher als die basale Expression, so dass PGE₂ möglicherweise eine primende, „prä-inflammatorische“ Rolle der Zellrekrutierung zugeschrieben werden könnte. Weiterhin lag die CCL5-Expression nach Stimulation mit LPS in PGE₂-differenzierten MdM um eine Log-Stufe höher als jene, denen PGE₂ direkt am Ende der Differenzierung zugegeben wurde. Diese verbesserte Ansprechbarkeit auf LPS könnte ebenfalls mit den proinflammatorischen Eigenschaften des PGE2 in Zusammenhang stehen. Nennenswert ist jedoch weiterhin die PGE2-abhängige Hemmung der CCL5 Expression in den LPS-Ansätzen. Jener Effekt findet sich auch in der Literatur wieder (XU et al. 2008). Es scheint, als wäre PGE2 für eine primär vermittelte Ansprechbarkeit von CCL5 verantwortlich, wohingegen höhere Konzentrationen diesen Effekt wieder begrenzen können. Diese Beobachtung passt in die modulierende Rolle von Eicosanoiden, die gegen Ende einer Entzündung die Migration neutrophiler Granulozyten und anderer Effektorzellen ins Gewebe hemmen können (LAWRENCE et al. 2002; SERHAN et al. 2002). Vor dem physiologischen Hintergrund einer Entzündung reflektiert diese Tatsache das empfindliche Zusammenspiel einzelner Entzündungsmediatoren und ihrer Konzentrationen in deren Mikroumgebung.

IL-10 kommt bei der Differenzierung von Makrophagen eine Schlüsselrolle zu. So wird dessen Expression, zusammen mit IL-12 zur kategorischen M1/M2- Einteilung genutzt.

Klassisch aktivierte, proinflammatorische Makrophagen exprimieren wenig IL-10 und viel IL-12, „IL-10^Low, IL-12^High“ (MANTOVANI et al. 2004). Sowohl Makrophagen, die unter PGE2 ausdifferenzierten, als auch jene, die in Abwesenheit von PGE2 differenzierten, zeigten eine schwache, aber quantifizierbare Expression dieses Zytokins (Abb. 22 und Abb. 26), die

durch LPS verstärkt wurde (10⁴-10⁵ Anzahl Kopien). Es wird berichtet, dass IL-10 in Verbindung mit LPS in CD4+ Lymphozyten die CXCL13 Produktion und dessen Rezeptor CXCR5 stimuliert, die daraufhin in follikuläres Gewebe homen und so die Antikörper- produktion fördern. Auch die IL-10-abhängige IL-7-Produktion könnte hier aufgrund der Assoziation dieser Zytokine mit der Bildung sekundären, lymphatischen Gewebes von Bedeutung sein (MANTOVANI et al. 2004). Darüber hinaus wird IL-10-abhängig die Expression antiinflammatorischer Moleküle verstärkt (MOORE et al. 2001b). Des Weiteren ist IL-10 ein bedeutender Stimulus für NK-Zellen, sowie für zytotoxische T-Zellen (MOCELLIN et al. 2003). Die basale, wenn auch niedrige Expression von IL-10 in Abwesenheit von IL-12 deutet im Fall der in vitro generierten MdM auf einen eher regulatorischen Zelltyp hin. Interessant ist, dass nach LPS-Stimulation, PGE₂ zu einer statistisch signifikanten Abnahme der IL-10 Expression führte (Abb. 22 und Abb. 26). Es ist bekannt, dass PGE₂ zur Expression eines pro-toleranten Zytokinprofils in monozytären Zelllinien beiträgt, jedoch wird auch eine vermehrte IL-10 Expression durch LPS und PGE₂ beschrieben (STRASSMANN et al. 1994). In diesem Zusammenhang könnte das Zusammenwirken anderer, lokaler Zytokine für die PGE2-vermittelten Effekte ausschlaggebend sein. Eventuell agiert hier PGE2 auch im Sinne eines proinflammatorischen Mediators, der zu einem switch der Makrophagenpopulation in Richtung M1 beiträgt. Wie bereits in Abschnitt 2.5 beschrieben, ist PGE2 ein Entzündungsmodulator, der sich nicht eindeutig als pro-oder antiinflammatorisch einordnen lässt.

Wie Abb. 22 zeigt, wurden IL-1β und TNF-α in unstimulierten MdM nicht exprimiert, sind jedoch durch LPS deutlich induzierbar. Beide, als proinflammatorisch zu bezeichnende Zytokine zeigten unter PGE2 in hohen Konzentrationen eine statistisch signifikant verringerte Expression (Abb. 22). Diese hemmenden Effekte für IL-1β und TNF-α wurden beschrieben (HINZ et al. 2000). Dabei wird diskutiert, ob es sich, in Erwiderung auf von Makrophagen und dendritischen Zellen synthetisiertes PGE2, um einen autokrinen feedback Mechanismus handeln könnte (HARRIS et al. 2002). Dieses wäre auch im vorliegenden Versuch eine mögliche Erklärung der Zytokinhemmung, liegt doch im Medium in großen Mengen PGE2

vor. Erwähnenswert ist weiterhin, dass PGE2 keine Steigerung der mRNA von TNF-α und IL1-β induzieren konnte. Dieses spricht für hemmende, antiinflammatorische Eigenschaften des PGE₂, die an der Begrenzung der inflammatorischen Antwort beteiligt sind. In diesem

Zusammenhang kann auch noch einmal auf die PGE2 vermittelte Stimulation der Generierung antiinflammatorischer Lipoxine hingewiesen werden (SERHAN et al. 2008). In vivo könnte sich die Situation jedoch wiederum ganz anders darstellen: so wäre es z.B. möglich, dass erst in Assoziation zu anderen Zellen PGE2 die Inflammation verstärken kann und beispielsweise sezernierte Zytokine von Granulozyten als Zellen der ersten Stunde Makrophagen zur Synthese proinflammatorischer Zytokine veranlassen. Das Phänomen, dass in vitro generierte, bovine MdM keine basale Expression von IL-1β und TNF-α zeigten, ist jedoch ebenfalls diskussionswürdig. Fraglich ist, ob in vivo durch Zell- umgebende Einflüsse ein Auftreten solcher Phänotypen vorkommt. Während des Differenzierungsprozesses sind gewebsständige Makrophagen einer Vielzahl von Stimuli ausgesetzt, die zu ihrer Prägung beitragen. Im Hinblick auf den zeitlichen Faktor der Differenzierung muss noch einmal auf die eingangs erwähnte Abgrenzung zu Mantovani eingegangen werden. Es bleibt unklar, welche Faktoren vor dem eigentlich prägenden Stimulus auf eine Zelle einwirken. Möglicherweise liegt die Determinierung eines Makrophagenphänotyps bereits in der Subpopulation von Monozyten, der anschließend eventuell nur noch über einen Teil seiner ursprünglichen Plastizität verfügt.

Trotzdem unterstreicht die gute Ansprechbarkeit auf LPS die Potenz des Makrophagen per se als hocheffektive Zelle der Immunabwehr.

PPARγ ist für die Differenzierung von Makrophagen nicht zwingend erforderlich (MOORE et al. 2001a). Jedoch ist eine Beeinflussung des Differenzierungsprogramms von Makrophagen durch PPARγ möglich (KOMI u. LASSILA 2000; PIEMONTI et al. 2000). In humanen Makrophagen führte die Aktivierung von PPARγ zur Hemmung der IL-1β, IL-6 und TNF-α Expression (JIANG et al. 1998; SHU et al. 2000; MEIER et al. 2002). Auch YOUSSEF et al.

(2004) beschreiben eine Aktivierung von PPARγ in Verbindung mit antiinflammatorischen Effekten in vivo und postulieren eine regulatorische Funktion für PPARγ in der Induktionsphase einer Entzündung (YOUSSEF u. BADR 2004). Weiterhin findet ein PPARγ-abhängiges Priming von Monozyten in Richtung eines M2 Phänotyps statt (BOUHLEL et al.

2007). Dieses deckt sich mit dem hier vorliegenden Ergebnis der fehlenden LPS-Erwiderung:

Eine Stimulation mit LPS führte zu keiner vermehrten mRNA-Expression des Transkriptionsfaktors (Abb. 27). Jenes Phänomen der fehlenden Wirkung M1 assoziierter Stimuli beobachteten auch andere Arbeitsgruppen und beschreiben für IL-1β, TNF-α, IFNγ

und LPS keine, oder gar hemmende Effekte auf die PPARγ Expression (HUANG et al. 1999;

ZHOU et al. 2008).

Produkte des Arachidonsäurestoffwechsels, wie 15d-Prostaglandin J2, agieren als endogene PPARγ-Liganden (KLIEWER et al. 1997; KERSTEN u. WAHLI 2000). PPARγ Agonisten hemmen die vermehrte Expression inflammatorischer Gene in Makrophagen in Erwiderung auf TLR-Liganden (VAN GINDERACHTER et al. 2008). Es sollte geprüft werden, ob PGE2

als endogener PPARγ Ligand agieren könnte und dessen mRNA- Expression beeinflusst. Die Zugabe von PGE2 führte zu einer verringerten PPARγ–mRNA-Expression (Abb. 27). Dieses deutet daraufhin, dass PGE2 in bovinen MdM nicht als PPARγ-Agonist agiert. Die zu verzeichnende Hemmung der Expression geht konform mit Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen: auch berichten Kapoor et al. (2007) über eine Hemmung und verminderte Expression von PPARγ in Fibrobasten durch Zugabe von exogenem PGE₂. Wiederum führte die Abwesenheit von PGE₂ zu einer vermehrten PPARγ- Expression (KAPOOR et al. 2007).

Weiterhin führte die Abwesenheit des PGE₂ synthetisierenden Enzyms mPGES-1 zu erhöhten Nitirit Leveln (Nitrit als stabilies Produkt des NO-Stoffwechsels). Die Hemmung scheint cAMP unabhängig, über PI 3-Kinase und Akt-1 vermittelt zu werden (KAPOOR et al. 2006).

All jene Effekte deuten auf eine Beteiligung von PPARγ im antiinflammatorischen Geschehen hin. Inwieweit PPARγ direkt an der Ausprägung antiinflammatorischer Makrophagentypen beteiligt ist, erfordert jedoch weitere Untersuchungen.

Interessante Ergebnisse zeigten die Untersuchungen der mRNA-Expression von PTX3: In vitro generierte, bovine MdM exprimierten in unstimulierten Ansätzen kein PTX3. PGE2

hatte darauf keinen Einfluss. Die PTX3-Expression war jedoch durch LPS stark induzierbar (Abb. 27). Dieser Effekt der Induktion in Erwiderung auf proinflammatorische Stimuli findet sich auch in der Literatur wieder (ALLES et al. 1994; LEE et al. 1994; INTRONA et al.

1996). Differenzierten die MdM unter kontinuierlichem Einfluss von PGE2 aus, so führte PGE2 auch hier zu einer Hemmung der mRNA-Expression (Abb. 23). Wurde PGE2 am Ende der Differenzierung für 3 h zugegeben, hatte es keinen Einfluss auf die PTX3 mRNA-Expression. Dieses zeigt, dass PTX3 möglicherweise einer anderen Regulation unterliegt als andere Zytokine und Chemokine. Immerhin konnte auch bei IL-10 und CCL5 bereits nach 3 h eine Hemmung der Expression gezeigt werden, welches kurzzeitig vermittelte Effekte des PGE₂ belegt, die jedoch für PTX3 nicht zuzutreffen scheinen. Generell ist die Expression von

PTX3 mit dem Typ der M2 Makrophagen assoziiert. Genauergesagt hat es in der Spätphase der Entzündung in Verbindung mit einsetzender Wundheilung und Gewebeerneuerung seine Relevanz (MANTOVANI et al. 2004). Die Tatsache, dass PTX3 durch LPS induzierbar ist, wirft die Frage auf, inwieweit dessen Expression spezifisch für M2 Makrophagen sein kann.

Möglicherweise handelt es sich um eine Art „basale“ Expression des löslichen pattern-recognition-receptors, der per se von MdM exprimiert wird, jedoch funktionell nicht von allen Typen beansprucht wird. Hier muss auch erwähnt werden, dass die mRNA-Expression nicht unbedingt Rückschlüsse auf die tatsächlich synthetisierten Produkte geben kann. Jedoch lässt sich die gute Ansprechbarkeit auf LPS tendenziell als physiologische Reaktion werten: LPS signalisiert über TLR-4 und NF-κB die Präsenz bakterieller Stimuli und einer darauffolgenden möglichen Entzündungsreaktion. Im Zuge dessen ist die vermehrte Expression des PTX3 zur Zirkulation im Blut und Bindung von Komplement sowie zur Aufnahme apoptotischer Zellen und Zelldebris eine logische Konsequenz. Möglicherweise verschieben sich auch die Schwerpunkte der PTX3-Expression während einer Entzündung: so könnte zunächst in der Initialphase die Komplemenaktivierung nach Antigenbindung den hauptsächlichen Aspekt der PTX3-Funktion ausmachen, wohingegen in späteren Entzündungsphasen die Clearance apoptotischer Zellen und Wiederherstellung der normalen Gewebetextur die wichtigste Rolle spielen könnte. Jene Erwägungen zeigen jedoch auch die Grenzen der Methode der Messung der mRNA-Expressionsdaten auf: die funktionelle Aussage der Expression eines Moleküls, z.B. hinsichtlich zeitlicher und räumlicher Ausdehnung, kann nur im Kontext mit anderen Aspekten getroffen werden. In diesem Zusammenhang sollte noch einmal erwähnt werden, dass PTX3 als sezerniertes Produkt in der Milch experimentell infizierter Kühe vorkommt (LUTZOW et al. 2008a). Die Tatsache, dass PGE2 wiederum zu einer verringerten PTX3 mRNA- Expression führte, stellt jedoch die bereits beschriebenen antiinflammatorischen Eigenschaften des PGE2 in Frage. So wäre doch, vor dem Hintergrund der resolutionsfördernden Eigenschaften des PGE2, eine vermehrte, bzw. konstante Expression des PTX3 zu erwarten. Möglicherweise überwiegen hier jedoch die in erster Linie proinflammatorisch vermittelten Wirkungen der Prostaglandine und es wäre denkbar, dass sich erst in Verbindung mit weiteren M2 Stimuli, wie z.B. IL-4, die Polarisierung des PGE2 in Richtung Antiinflammation ändert.

Expression von CD163 und S100A8/A9 von in-vitro generierten MdM und PGE₂-MdM Ziel dieses Versuches war die phänotypische Charakterisierung des in vitro generierten Makrophagentyps. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob PGE2 in der Lage ist, eine bestimmte Subpopulation von Makrophagen zu induzieren. Beide in diesem Versuch detektierten Antigene, die für verschiedene Subpopulationen stehen, wurden bereits histologisch in Makrophagen in der Zitze nachgewiesen (4.2, 5.3).

Die hier generierten MdM exprimierten in An- und Abwesenheit von PGE2 sowohl CD163 (AM-3K) und S100A8/A9 (MAC387). Nimmt man die Summe aus stark und schwach positiven Zellen, so liegt diese bei MAC387 höher als bei AM-3K. Nimmt man die Summe aus AM-3K^High/Low und MAC387^High/Low so lässt sich daraus mit einiger Wahrscheinlichkeit schließen, dass es Zellen gibt, die gleichzeitig beide Antigene exprimieren. Dieses bedeutet einerseits, dass in vitro generierte Makrophagen bezogen auf diese beiden Antigene Mischpopulationen darstellen, und Zellen beide, jeweils eines der untersuchten, oder keines der untersuchten Antigene exprimieren können. Zum zweiten bedeudet dies, dass es möglich ist, in vitro MdM zu generieren, die physiologische Expressionsmuster der in vivo bestimmten Makrophagen zeigen.

Greift man auf die anfangs erwähnte Einteilung der beiden Antigene zurück (S100A8/A9 entspricht M1, CD163 entspricht M2), so scheint zumindest in vitro keine genaue Einteilung in M1 oder M2 möglich zu sein.

Bezieht man dieses Ergebnis auf die Situation in situ (Zitze), so stellt sich die Frage, ob auch dort möglicherweise Makrophagen vor Ort waren, die von beiden Antikörpern entweder nicht als solche erkannt wurden, oder ob es sich eventuell um eine Population handeln könnte, die in der Zitze nicht vorkommt. Möglicherweise hemmen Wirtsfaktoren im umgebenden Gewebe die Expression dieses Phänotyps und fördern die Expression anderer Makrophagentypen. In der Zellkultur hingegen ist zwar auch eine gegenseitige Interaktion der Makrophagen denkbar, jedoch fehlen Wirtsfaktoren, die in vivo vorhanden sind.

Auch hier konnten Unterschiede in der Expressionsintensität (MAC387/AM-3K^High/Low) festgestellt werden. In PGE2-MdM ließen sich deutlich weniger S100A8/A9 oder CD163-positive Zellen nachweisen als in MdM (4.3.1).

PGE2 scheint zudem die Expression der beiden Antigene S100A8A/9 und CD163 differenziell zu modulieren, da sich das Verhältnis der Expression von S100A8/A9

(MAC387) zu CD163 (AM-3K) in PGE2-MdM zu einem größeren MAC387^High/AM-3K^High -Verhältnis entwickelte (Abb. 24 H). Dieses kann als Beleg dafür angesehen werden, dass PGE2 die Expression funktions-relevanter Moleküle oder die Differenzierung funktionell unterschiedlicher Makrophagen mit steuert. Jedoch sind in vivo mit großer Wahrscheinlichkeit, andere, co-regulierende Faktoren am Differenzierungsgeschehen beteiligt. Die Ergebnisse dieser Detailstudie könnten dazu verwendet werden, um anhand des Expressionsverhaltens von S100A8/A9 und CD163 die differenzierende Rolle weiterer Wirtsfaktoren zu prüfen.

Die reduzierte Zahl an S100A8/9- und CD163-positiven PGE2-MdM, geht einher mit den Ergebnissen der quantitativen real-time PCR, indem PGE₂ auf mRNA-Ebene die Expression vieler Chemokine und Zytokine hemmte (Abb. 21, Abb. 22) und es somit keinen klaren Hinweis darauf gibt, ob PGE₂ die Differenzierung von Monozyten in Makrophagen eines bestimmten funktionellen Phänotyps (M1 oder M2) drängt. Zumindest scheint es nicht so zu sein, dass PGE₂-MdM sog. ‚inaktivierte‘ Makrophagen darstellen, da sie zumindest das Chemokin CXCL8 in unveränderter Form nach LPS-Stimulation exprimieren. Ebenso ist es eher unwahrscheinlich, dass die reduzierte Expression der klassischen Zytokine in PGE2 -MdM auf einer vermitteltelten Hemmung beruht, da bei Bildung von PPARγ-Liganden es zu einer Hochregulation der PTX3-Expression kommen müsste, die in PGE2 -MdM nach LPS-Stimulation nicht beobachtet werden konnte (Abb. 23).