4 Ergebnisse
4.2 Semiquantitative Analyse von Makrophagenpopulationen in der bovinen
laktierenden Rindern (K2)
Zur Darstellung von Makrophagen in der bovinen Zitze wurden histologische Paraffinschnitte von fünf adulten, laktierenden, eutergesunden Rindern (Gruppe K2) mittels zweier Makrophagen-spezifischer Antikörper (MAC387 und AM-3K) markiert und die Zahl und Verteilung der Zellen semiquantitativ ausgewertet.
Bei allen Tieren waren sowohl MAC387 als auch AM-3K positive Makrophagen in den beiden untersuchten Lokalisationen (Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne) jeweils subepithelial und perivaskulär nachweisbar.
Serienschnitte von Makrophagen, die direkt unterhalb des Epithels der Fürstenberg’schen Rosette lokalisiert sind, zeigt Abb. 15 A und B: Stark positve, im Zellkörper klar abgrenzbare Makrophagen sind in Abb. 15 A zu erkennen. Ausläufer von Epithelzellen in das subepitheliale Gewebe hinein waren ebenfalls schwach positiv für MAC387. Abbildung 15 B hingegen zeigt negative Epithelzellen sowie einige positive Makrophagen für AM-3K. Im Vergleich zu von MAC387 gefärbten Zellen waren die von AM-3K detektierten Zellen in deutlich geringerer Anzahl zu finden. Des Weiteren wurden von MAC387 Makrophagen angesprochen, die von AM-3K nicht als solche erkannt werden (Abb. 15 A und B, weiße Pfeile). Zudem ist eine Population, die von beiden Makrophagen-Antikörpern detektiert wurde (Schnittmenge) vorhanden (Abb. 15 A und B, schwarze Pfeile).
Hingegen zeigt die Abbildung 15 C-F, dass die Blutgefäße der Fürstenberg’schen Rosette in größerem Maße von AM-3K-positiven Makrophagen als von MAC387-positiven Makrophagen flankiert wurden.
MAC387-positive Makrophagen AM-3K-positive Makrophagen
A B
C D
E F
Abb. 15: Serienschnitte zum Vergleich MAC387 und AM-3K positiver Makrophagen in subepithelialer und perivaskulärer Lokalisation der Fürstenberg’schen Rosette.
A, B: Tier Nr.6, Viertel hinten links, subepitheliale Lokalisation; C-F: Tier Nr. 3, Viertel vorne links, perivaskuläre Lokalisation. Schwarze Pfeile: von beiden Antikörpern positiv detektierte Makrophagen, weiße Pfeile: nur von MAC387 positiv detektierte Makrophagen.
Die semiquantitative Auswertung der unterschiedlichen Makrophagensubtypen in der Fürstenberg’schen Rosette bestätigt, dass subepithelial häufiger MAC387 positive Makrophagen lokalisiert waren. (Mittelwerte MAC387 2,2; AM-3K 1,5). Alle untersuchten Tiere lagen in dieser Lokalisation im Zellwert für AM-3K positive Zellen unterhalb oder gleich des Wertes der für MAC387-positiven. Umgekehrt waren perivaskulär mehr AM-3K- als MAC387-positive Makrophagen zu finden (MAC387 1,7; AM-3K 2,7).
Tab. 13: Makrophagensubtypen in der Fürstenberg’schen Rosette.
subepithelial perivaskulär
Tier Nr.1 MAC387 AM-3K MAC387 AM-3K
3 2,5 1,0 1,0 3,0
6 2,5 1,5 1,0 2,5
7 2,0 1,0 2,5 3,0
8 2,0 2,0 2,0 2,5
9 2,0 2,0 2,0 2,5
Mittelwert ± STD 2,2 ± 0,1 1,5 ± 0,2 1,7 ± 0,3 2,7 ± 0,1
1Siehe Tab. 16, Mittelwerte und Standardabweichungen der semiquantitativ erfassten Anzahl von bovinen Makrophagen in der Fürstenberg’schen Rosette, Nachweis mittels Antikörper MAC387 und AM-3K. Relative Häufigkeiten wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3, 3.5).
In der Zitzenzisterne zeigten sich subepithelial ähnliche Verhältnisse wie in der Fürstenberg’schen Rosette: auch hier waren MAC387-positive Makrophagen gegenüber AM-3K-positiven Makrophagen meist vorherrschend (Abb. 16; Tab. 14). Nur Tier 8 widerspricht der Tendenz der Gruppe.
Im perivaskulären Gewebe fanden sich keine quantitativen Unterschiede hinsichtlich unterschiedlicher Makrophagensubtypen.
MAC387-positive Makrophagen AM-3K-positive Makrophagen
A B
C D
Abb. 16: Serienschnitte zum Vergleich MAC387 und AM-3K positiver Makrophagen in subepithelialer Lokalisation in der Zitzenzisterne.
A, B: Tier Nr. 3, Viertel hinten links; C, D: Tier Nr 3, Viertel hinten links.
Tab. 14: Makrophagensubtypen in der Zitzenzisterne.
subepithelial perivaskulär
Tier Nr.1 MAC387 AM-3K MAC387 AM-3K
3 3,0 1,5 2,5 2,5
6 2,0 1,5 2,0 2,0
7 1,0 1,0 2,0 2,0
8 1,0 1,5 2,0 2,5
9 1,0 1,0 1,5 1,5
Mittelwert ± STD 1,6 ± 0,4 1,3 ± 0,1 2,0 ± 0,1 2,1 ± 0,2
1Siehe Tab. 16, Mittelwerte und Standardabweichungen der semiquantitativ erfassten Anzahl von bovinen Makrophagen in der Zitzenzisterne, Nachweis mittels Antikörper MAC387 und AM-3K. Relative Häufigkeiten wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3, 3.5).
Morphologie MAC387-positiver Makrophagen
Die von den hier verwendeten Antikörpern detektierten Makrophagen wiesen morphologische Unterschiede auf. Aufnahmen von MAC387-positiven Makrophagen zeigen die Abbildungen 17 und 18. Es handelte sich bei MAC387 um eine zytoplasmatische Färbung, so dass Zytoplasmaausläufer und Zellkörper gut sichtbar waren. Die von MAC387 detektierten Zellen waren rund bis spindelförmig und ohne dendritische Zellausläufer. Der Zellkern war nierenförmig und von mäßig vakuolisiertem Zytoplasma umgeben. Gefäßassoziierte Makrophagen sind in Abb. 17 A-C zu sehen. Auch intravaskuläre Monozyten des peripheren Blutes wurden von MAC387 detektiert (Abb. 17, D, Pfeil). Im perivaskulären Gewebe ähnelte die abgerundete Form der MAC387-positiven Makrophagen der runden, homogenen Morphologie von Monozyten.
A B
C D
Abb. 17: MAC387-positive, gefäßassoziierte Makrophagen in der Fürstenberg’schen Rosette.
A-D: Tier 3, Viertel hinten links, Pfeil: intravaskulär detektierte Monozyten.
A B
C D
Abb. 18: MAC387-positive, im peripheren Bindegewebe der Zitzenzisterne lokalisierte Makrophagen.
A-D: Tier Nr 3, Viertel hinten links
Morphologie AM-3K-positiver Makrophagen
Die von AM-3K detektierten Zellen waren im Vergleich zu den oben beschriebenen MAC387-positiven Makrophagen deutlich größer und vielgestaltiger. Nennenswert sind die langgestreckten, vom Zellkörper ausgehenden Zellfortsätze sowie ein zentral gelegener, runder Zellkern. Das Zytoplasma erschien fein granuliert und ohne Vakuolen. Die räumliche Einbettung und Plastizität von AM-3K-Makrophagen in ihrer Mikroumgebung wird in Abb.
19 deutlich.
Die Präsenz der Zellausläufer bestätigte sich bei Betrachtung eines mit AM-3K gefärbten Schnittes in geringer Vergrößerung (Abb. 20). Es wurden z.T. kleine, positive Zellbereiche im Anschnitt getroffen, die angeschnittene Zytoplasmaausläufer darstellen.
A B
C D
E F
Abb. 19: AM-3K-positive, im peripheren Bindegewebe der Zitzenzisterne lokalisierte Makrophagen.
A, C: Tier Nr. 3, Viertel vorne rechts; B, D: Tier Nr. 3, Viertel hinten links, E, F: Tier Nr. 6, Viertel hinten links.
Abb. 20: AM-3K-positive, perivaskuläre Makrophagen in der Fürstenberg’schen Rosette.
Tier Nr. 3, Viertel hinten links
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass anhand zweier Makrophagen-Antikörper unterschiedliche Phänotypen von Makrophagen mit spezifischen Verteilungsmustern sowie unterschiedlicher Morphologie in der bovinen Zitze detektiert werden konnten. Aufgrund der besonderen Prominenz dieses Zelltypes in der Zitze und im inflammatorischen Geschehen wurden Makrophagen als Zelltyp für weitere in vitro Untersuchungen ausgewählt.