4 Ergebnisse
4.3 Analyse der Makrophagendifferenzierung in vitro
4.3.1 PGE 2 –vermittelte Effekte während der Differenzierung boviner
Monozyten wurden über 7 Tage in konstanter Anwesenheit von PGE2 in niedriger (PGE2Low, 1x10-12 mol/l), mittlerer (PGE2Med, 1x10-9 mol/l,) und hoher (PGE2High, 1x10-6 mol/l) Konzentration in Makrophagen ausdifferenziert (PGE2Low-MdM, PGE2Med-MdM, PGE2High -MdM). Zellen, die nicht unter dem Einfluss von PGE2 ausdifferenzierten (MdM) wurden als Referenzzellen eingesetzt. Nach Abschluss der Ausdifferenzierung wurden die Zellen am Tag 7 über 3 Stunden mit LPS (5 µg/ml) stimuliert. Es wurden ausgewählte Chemokine, Zytokine sowie der Transkriptionsfaktor PPARγ und der lösliche Pattern-recognition-receptor PTX3 gemessen.
Chemokine
CCL5 wird unter anderem von T-Zellen zur aktiven Chemotaxis weiterer mononukleärer Zellen in inflammatorisches Gewebe gebildet. Zur näheren Charakterisierung des chemotaktischen Potentials der hier generierten MdM wurde es, zusammen mit dem ebenfalls chemotaktisch bedeutsamen CCL20, für die Messung ausgewählt. CXCL8 ist das klassische Chemokin, welches die Migration neutrophiler Granulozyten in inflammatorisches Gewebe
veranlasst. Neutrophile Granulozyten sind als erste einwandernde Zellpopulation durch ihre antimikrobiellen Effekte wesentlich an der Erregerabwehr beteiligt.
CXCL8 und CCL5 wurden von unstimulierten MdM in geringem Maße exprimiert (102-103 Kopien/200 ng Gesamt-RNA, (Abb. 21 A, C). Die Differenzierung der MdM in Anwesenheit von PGE2 führte, unanbhängig von der PGE2-Konzentration, weder bei CXCL8 noch bei CCL5 zu einer statistisch signifikanten Änderung der mRNA-Expression (Abb. 21 A, C).
CCL20 wurde von den MdM nicht exprimert und unter dem Einfluss von PGE2 nicht induziert (Abb. 21, E). Somit konnte gezeigt werden, dass die Basis-mRNA-Expression der untersuchten Chemokine in Makrophagen durch die Ausdifferenzierung in Anwesenheit von PGE2 nicht moduliert wurde.
Eine LPS-Stimulation führte sowohl bei MdM als auch bei PGE2-MdM(Low, Med, High) zu einer statistisch signifikanten Hochregulation der CCL5 (3 Log-Stufen) und CXCL8 (1 Log-Stufe) -mRNA-Expression (Abb. 21). Ebenso drastisch wurde in beiden Zelltypen die CCL20 mRNA hochreguliert (Abb. 21). In PGE2Med und PGE2High-MdM führte die LPS Stimulation zu einer statistisch signifikanten Abnahme der CCL5- und CCL20-mRNA-Expression (Abb.
21, D, F). Interessanterweise blieb die CXCL8-mRNA-Expression nach LPS-Stimulation in allen PGE2-MdM-Zellpopulationen unbeeinflusst (Abb. 21, B).
A) Keine Stimulation B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
- -12 -9 -6
101 102 103 104 105
Anzahl Kopien
PGE2 (mol/l)
- -12 -9 -6
101 102 103 104 105
PGE2 (mol/l)
Abbildungsbeschriftung und Legende siehe nächste Seite
CXCL8
C) Keine Stimulation D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
E) Keine Stimulation F) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
- -12 -9 -6
Abb. 21: mRNA-Expression von CXCL8, CCL5 und CCL20 in MdM nach
Ausdifferenzierung unter PGE2 und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in Ab (-) oder Anwesenheit von PGE2 (1x10-12 mol/l, 1x10-9 mol/l und 1x10-6 mol/l) ausdifferenziert. Am Tag 7 erfolgte eine Stimulation mit LPS (5 µg/ml, 3 h, B, D, F). Die mRNA-Expression der Chemokine CXCL8 (A, B), CCL5 (C, D) und CCL20 (E, F) ist als mRNA-Kopienzahl/200 ng Gesamt-RNA angegeben.
Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p≤0,05).
CCL5
CCL20
Keine Basisexpression vorhanden
Zytokine
IL-10 wurde als Schlüsselzytokin von M2 Makrophagen und IL-12 als kennzeichnendes Zytokin von M1 Makrophagen analysiert. IL-1β und TNF-α gelten ebenso als assoziiert mit dem M1-Makrophagensubtyp.
Die Basis-Expression von IL-10 wurde in PGE2High-MdM signifikant herunterreguliert (Abb.
22, A). In unstimulierten MdM und PGE2Low,Med,High-MdM lag die Expression von IL-1β und TNF-α unterhalb der Nachweisgrenze (Abb. 22, C, E). Die Expression beider Zytokine wurde durch die Stimulation mit LPS induziert (Abb. 22, D, F). Bei LPS-stimulierten PGE2-MdM zeigte sich für IL-1β und TNF-α eine PGE2-dosisabhängige Abnahme der mRNA-Expression, die bei PGE2 High -MdM für beide Zytokine statistisch signifikant war.
In LPS-stimulierten PGE2High-MdM erwies sich die IL-10 mRNA-Expression im Vergleich zu LPS-stimulierten MdM und PGE2Med,Low-MdM als signifkant geringer (Abb. 22, B).
Die Expression von IL-12 lag in diesem Versuch sowohl in unstimulierten als auch in LPS-stimulierten MdM unterhalb der Nachweisgrenze.
A) Keine Stimulation B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
C) Keine Stimulation D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
- -12 -9 -6
Abbildungsbeschriftung und Legende siehe nächste Seite
IL-10
IL-1β
Keine Basisexpression vorhanden
E) Keine Stimulation F) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
G) Keine Stimulation H) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
- -12 -9 -6 Abb. 22: Expression von IL-10, IL-1β, TNF-α und IL-12 in MdM nach
Ausdifferenzierung unter PGE2 und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in Ab (-) oder Anwesenheit von PGE2 (1x10-12 mol/l, 1x10-9 mol/l und 1x10-6 mol/l) ausdifferenziert. Am Tag 7 erfolgte eine Stimulation mit LPS (5 µg/ml, 3 h, B, D, F, H). Die mRNA-Expression der Zytokine IL-10 (A, B), IL-1β (C, D), TNF-α (E, F) und IL-12 (G, H) ist als mRNA-Kopienzahl/200 ng Gesamt-RNA angegeben.
Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p≤0,05).
Peroxisome proliferator activated-receptor γ und Pentraxin 3
PPARγ ist als nukleärer Transkriptionsfaktor maßgeblich an der regulierten Expression pro- und antiinflammatorischer Gene beteiligt. Es sollte untersucht werden, ob bovine MdM PPARγ exprimieren, und ob eine Modulation der Expression von PPARγ durch PGE2
möglich ist.
PTX3 spielt als löslicher pattern-recognition receptor bei der Erkennung von PAMPs sowie apoptotischen Signalen und bei der Geweberegeneration im inflammatorischen Geschehen eine entscheidende Rolle. Des Weiteren kommt PTX3 als mögliches PPARγ-abhängig reguliertes Gen im Entzündungsgeschehen eine Bedeutung zu. Die Messung der PTX3 mRNA-Expression soll zur Aufklärung des funktionellen Phänotyps der MdM beitragen.
Die Basis-mRNA-Expression von PPARγ wurde in PGE2Med und PGE2High-MdM signifikant herunterreguliert (Abb. 23, A). PTX3 wurde weder von unstimulierten MdM noch von PGE2 -MdM exprimiert (Abb. 23, C).
Eine Stimulation mit LPS führte weder bei MdM noch in PGE2-MdM zu einer signifikant verstärkten PPARγ mRNA-Expression. Hingegen wurde die PPARγ mRNA-Expression nach LPS-Stimulation von PGE2High-MdM signifikant reduziert (Abb. 23, B). Eine Stimulation mit LPS führte zu einer starken Induktion der PTX3 mRNA-Expression. Auch hier waren in PGE2High-MdM signifikant weniger mRNA-Kopien zu verzeichnen als in den anderen Ansätzen (Abb. 23, D).
A) Keine Stimulation B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
C) Keine Stimulation D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
- -12 -9 -6
Abb. 23: Expression von PPARγ und PTX3 in MdM nach Ausdifferenzierung unter PGE2 und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in Ab (-) oder Anwesenheit von PGE2 (1x10-12 mol/l, 1x10-9 mol/l und 1x10-6 mol/l) ausdifferenziert. Am Tag 7 erfolgte eine Stimulation mit LPS (5 µg/ml, 3 h, B, D). Die mRNA-Expression des Transkriptionsfaktors PPARγ (A, B), und PTX3 (C, D) ist als mRNA-Kopienzahl/200 ng Gesamt-RNA angegeben. Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p≤0,05).
PTX3 PPARγ
Keine Basisexpression vorhanden
Expression von S100A8/A9 und CD163 in MdM und PGE2-MdM
Um die Effekte des PGE2 auf die Differenzierung von MdM nicht nur auf mRNA-Ebene, sondern auch auf Produktebene zu überprüfen, wurde eine Immunfluoreszenz mittels der beiden Antikörper MAC387 und AM-3K an den in vitro generierten MdM durchgeführt. Ziel des Versuchs war außerdem zu untersuchen, ob PGE2 in der Lage ist, eine spezielle Subpopulation von Makrophagen zu induzieren, die sich in der Expression oben genannter Antigene unterscheiden. Dafür wurde bovinen MdM von Kulturbeginn an PGE2 (1x10-9 mol/l) zugegeben. Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob die in vitro-generierten MdM funktionelle Parallelen durch Expression derselben Antigene zu denen in der Zitze nachgewiesenen Makrophagen aufweisen.
Fast alle MdM exprimierten die Antigene S100A8/A9 sowie CD163. Die Intensität der Expression pro Zelle unterschied sich, so dass für jedes Antigen zwischen ExpressionHigh und ExpressionLow (Anteilswerte der Expression des Gesamtansatzes) differenziert wurde. Die semiquantitative Auswertung ist in Abb. 24 G dargestellt.
Nicht alle Makrophagen waren jeweils für CD163 und AM-3K positiv (Abb. 24 A, B).
S100A8/A9 wurde in MdM und PGE2-MdM stärker exprimiert als CD163 (Summe positiver MdM für MAC387: 167; Summe positiver Zellen für AM-3K: 76, Abb. 24 G). MdM zeigten im Vergleich zu PGE2-MdM für beide Antigene den größeren Anteil an positiven Zellen.
Dabei überwog bei beiden Antigenen der Anteil schwach positiver Zellen gegenüber den stark positiven Zellen (z.B. MAC387Low: 139 von 200, MAC387High: 28 von 200, Abb. 24 G).
PGE2 führte zu einer deutlichen Reduktion der Zahl positiver Zellen (von 167 MAC387-positiven Zellen auf 45 positive Zellen und von 76 AM-3K-MAC387-positiven auf 31 positive Zellen, Abb. 24 G). Weiterhin verschob sich unter PGE2-Einfluss der Anteil stark positiver Zellen in Richtung S100A8/A9, während es sich unter den schwach positiven Zellen umgekehrt verhielt (Abb. 24 H).
A B
C D
E F
G) MAC387- und AM-3K-Immunfluoreszenz-positive MdM und PGE2-MdM
MAC387Low MAC387High AM-3KLow AM-3KHigh
MdM 139 28 61 15
PGE2-MdM 34 11 28 3
H) Verhältnis stark- und schwach-positiver Zellen unter MdM und PGE2-MdM.
MAC387High/AM-3KHigh MAC387Low/AM-3KLow
MdM 1,9 2,3
PGE2-MdM 3,7 1,2
Abb. 24: Immunfluoreszenzanalyse der CD163- und S100A8/A9-Expression boviner, in vitro gereifter Makrophagen.
Monozyten wurden über 7 Tage in vitro zu Makrophagen ausdifferenziert (MdM). Parallelen Ansätzen wurde während der Ausdifferenzierung 1x10-9 mol/l PGE2 zugesetzt (PGE2-MdM).
Die Zellen wurden fixiert (3.7) und mit einem Antikörper gegen S100A8/A9 (A, B) oder CD163 (C, D) markiert (indirekte Immunfluoreszenz unter Einsatz eines ALEXA Fluo 488 markierten Sekundärantikörpers). Zur Darstellung der Kerne (blau) wurden Zellen mit dem HOECHST-33342 inkubiert. Subjektiv konnten stark (A, C) und schwach positve (B, D) Zellen identifiziert werden (Pfeile). Nach Zugabe eines irrelevanten Antikörpers (Maus-IgG, E) oder PBS anstelle eines Primärantikörpers (F) erschienen die Zellen Fluoreszenz-negativ.
Von 200 Zellen wurde für jeden Antikörper die Zahl stark und schwach positiver Zellen erfasst (G) und daraus die Verhältnisse zwischen MAC387- und AM-3K-positiven Zellen bestimmt (H).