Arbeitsgruppe Immunologie
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Charakterisierung
der immunmodulatorischen Wirkung des Neuromediators Substanz P
auf bovine Immunzellen
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Anja Sipka aus Karlsruhe
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. M. Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 18. November 2008
Gefördert durch die Firma Pfizer Animal Health durch Personal- und Sachmittel
Meinem Vater
Hanspeter Lamprecht gewidmet, und in liebevoller Erinnerung
an meine Mutter
Gamze Lamprecht-Sipka.
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1 Einleitung und Zielsetzung ... 13
2 Literaturübersicht... 15
2.1 Die neuroendokrine Regulation der Immunantwort... 15
2.1.1 Regulation durch das zentrale Nervensystem ... 16
2.1.2 Modulation durch das periphere Nervensystem ... 17
2.2 Das Neuropeptid Substanz P ... 20
2.2.1 Gene und Peptidsynthese ... 20
2.2.2 Abbau... 22
2.2.3 Rezeptoren ... 22
2.2.4 Verbreitung und Funktion... 24
2.3 Modulation von Zellfunktionen durch Substanz P... 26
2.3.1 Interaktion mit neutrophilen Granulozyten... 26
2.3.2 Beeinflussung von Monozyten und Makrophagen ... 29
2.3.3 Aktivierung von Thrombozyten... 30
2.3.4 Modulation von Lymphozyten... 31
2.4 Die Rolle von Substanz P bei entzündlichen Erkrankungen... 33
2.4.1 Infektiöse und nicht-infektiöse Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts... 33
2.4.2 Erkrankungen der Atemwege ... 34
2.4.3 Arthritis... 35
2.5 Die Bedeutung von Substanz P beim Rind ... 36
3 Geräte, Material und Methoden ... 38
3.1 Geräte ... 38
3.2 Material ... 39
3.2.1 Klinikbedarf ... 39
3.2.2 Laborbedarf... 40
3.2.3 Reagenzien... 41
3.2.4 Versuchstiere... 43
3.2.5 Mono- und polyklonale Antikörper ... 43
3.2.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen... 44
3.2.7 Plasmid für die Herstellung von Standardreihen ... 49
3.2.8 Primer... 50
3.3 Methoden... 51
3.3.1 Gewinnung einzelner Leukozytensubpopulationen des Blutes ... 51
3.3.2 Generierung von Makrophagen aus Blutmonozyten in vitro... 54
3.3.3 In-vitro-Stimulation von Monozyten und in vitro generierter Makrophagen... 55
3.3.4 Durchflusszytometrie... 56
3.3.5 Quantifizierung vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode... 57
3.3.6 In-vitro Proliferationsmessung... 58
3.3.7 Bestimmung der Apoptose neutrophiler Granulozyten ... 59
3.3.8 In-vitro-Migration neutrophiler Granulozyten... 61
3.3.9 Intrazelluläre Calciummessung... 64
3.3.10 Indirekte Membranimmunfluoreszenz (MIF) ... 66
3.3.11 Analyse der Thrombozyten-Granulozyten-Aggregation ... 67
3.3.12 Molekularbiologische Verfahren ... 68
3.3.13 Statistische Auswertung... 82
4 Ergebnisse... 84
4.1 Expression und Regulation des Substanz P-Rezeptors in vivo und in vitro... 84
4.1.1 Rezeptorexpression in vivo... 84
4.1.2 Rezeptorexpression in einzelnen Leukozyten-Subpopulationen in vitro... 87
4.2 Modulatorische Wirkung auf die Proliferation mononukleärer Zellen... 88
4.2.1 Einfluss von Substanz P auf die Vitalität und die Blastogenese lymphoider Zellen nach In-vitro-Stimulation ... 88
4.2.2 Einfluss von Substanz P auf die Proliferation von T- Zellsubpopulationen nach In-vitro-Stimulation ... 91
4.3 Die Substanz-P-vermittelte Modulation neutrophiler Granulozyten ... 92
4.3.1 Modulation des Calcium-Einstroms in neutrophile Granulozyten ... 92
4.3.2 Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten ... 96
4.3.3 Beeinflussung der In-vitro-Migration neutrophiler Granulozyten durch Substanz P ... 100
4.3.4 Aggregation von Thrombozyten und Granulozyten ... 103
4.4 Modulation von Monozyten und Makrophagen durch Substanz P ... 106
4.4.1 Regulation von Chemokinen und Zytokinen ... 106
4.4.2 Sezernierte Produkte von in-vitro-generierten Makrophagen... 113
5 Diskussion... 117
5.1 Expression und Regulation des Substanz-P-Rezeptors in vivo und in vitro.. 117
5.2 Modulatorischer Einfluss von Substanz P auf bovine Immunzellen... 121
5.2.1 Beeinflussung von Lymphozyten ... 121
5.3 Beeinflussung von Granulozyten ... 122
5.3.1 Beeinflussung von Monozyten und Makrophagen ... 128
5.4 Ausblick ... 132
6 Zusammenfassung ... 134
7 Summary... 137
8 Literaturverzeichnis ... 139
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
A Adenin
Abb. Abbildung
ACE Angiotensin converting enzyme Ala Alanin
AMP Adenosin-5´-monophosphat ANOVA analysis of variance
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Arg Arginin
Asp Asparagin ATP Adenosin-5′-triphosphat
BAL Bronchio-Alveoläre-Lavage Bcl-2 B-cell lymphoma 2 (anti-apoptotisches Protein) bp base pairs (Basenpaare)
bzw. beziehungsweise C Cytosin
C5a opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C5 Ca2+ ionisiertes Calcium
CCL β-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle in Folge („CC“) CD cluster of differentiation
cDNA complemetary DNA
CFU colony forming units
CGRP Calcitonin-gene related peptide
CNS central nervous system; zentrales Nervensystem
CO2 Kohlenstoffdioxid
ConA Concavalin A
CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin (unmethylierte DNA-Motive v.a. aus Bakterien) CRH Corticotropin-Releasing-Hormon
Ct cycle threshold
CXCL α-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle werden von beliebiger Aminosäure (X) getrennt
CXCL8 Interleukin-8 DAG Diacylglycerol DISC death inducing signalling complex DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates
dsDNA doppelsträngige DNA
E. coli Escherichia coli
EDTA ethylendiamine-tetraacetic acid (Ethylendiamintetraacetat) et al. et alii (lateinisch: und andere)
FACScan® fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät) FCCP Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazon FCM flow cytometer (Durchflusszytometer)
FCS fetal calf serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoresceinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm;
FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm;
FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm
fMLP N-Formyl-Methionyl-L-Leucyl-L-Phenylalanin for forward
FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® g Gramm
G Guanin
G-CSF granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor) ggf. gegebenenfalls
Gln Glutamin Gly Glycin
GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (Granulozyten-Makrophagen- Wachstumsfaktor)
h hora (lateinisch: Stunde)
H2O Wasser
HBSS Hanks Balanced Salt Solution His Histidin
HPA hypothalamic-pituitary-adrenal-axis; Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren- Achse
i.d.R. in der Regel
I0+ Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz ohne Serum
I10F+ Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem Kälberserum
IBD Inflammatory Bowel Disease
ICAM intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül) IFN Interferon
Ig Immunglobulin IL Interleukin
IP3 Inositoltriphosphat
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
JC-1 5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid
kB kilo Basen
kDA kilo Dalton
L Liter
LB lysogeny broth
Leu Leucin
LFA Leukocyte function-associated antigen
LMU Ludwig-Maximimilians-Universität LPS Lipopolysaccharid
µ mikro (x10-6)
µm Mikrometer
m milli (x10-3)
MACS magnetic associated cell sorting
mAK monoklonaler Antikörper
MdM monocyte derived macrophages Met Methionin
MHC major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz
Min. Minute(n) mm Millimeter MMP Mitochondrienmembranpotential
MNC mononuclear cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes) mol Mol
mRNA messenger RNA
mV Millivolt
MW molecular weight (Molekulargewicht)
n nano (x10-9)
n= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid
NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat-Wasserstoff NANC nicht-adrenerge, nicht-cholinerge Fasern des peripheren Nervensystems
NEP neutrale Endopeptidase
NFΚB nuclear factor-kappa B (Transkriptionsfaktor) NK Neurokinin
NKR Neurokininrezeptor NP Neuropeptid
PAF platelet activating factor
PAMP pathogen associated molecular pattern (Molekulare Muster von Erregern) PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PCR polymerase chain reaction PE Phycoerythrin
PGE2 Prostaglandin E2
PGF2α Prostaglandin F2α
Phe Phenylalanin PJ Propidiumjodid PMA Phorbol-12 Myristate-13 Acetat
PMN polymorphonuclear leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten)
PNS peripheres Nervensystem
PPT Preprotachykinin Pro Prolin
qrtPCR quantitative real time PCR
r Korrelationskoeffizient
RA rheumatoide Arthritis
rev reverse
ROS reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies) rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur S. aureus Staphylococcus aureus
s.u. siehe unten
SEA Staphylococcus aureus Enterotoxin A
SEM standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes)
SNS sympathisches Nervensystem
SP Substanz P
SPE Subtanz P Endopeptidase
SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® spp. subspecies (lateinisch: Unterarten)
T Thymin Tab. Tabelle TBE Tris Boric Acid EDTA-Puffer Thr Threonin
TLR toll-like-receptor (Toll-ähnlicher-Rezeptor) TNF tumor necrosis factor (Tumornekrosefaktor)
TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand TXA2 Thromboxan A2
Tyr Tyrosin
u.a. unter anderem
UV ultra violett
V Volt
v.a. vor allem
v/v Volumen pro Volumen
Val Valin
VCAM vascular cell adhesion molecule; vaskuläres Zelladhäsionsmolekül VIP vasoaktives intestinales Peptid
w/v Gewicht pro Volumen
x g multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)
Xaa variable Aminosäure
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung und Zielsetzung
In der peripartalen Periode kommt es bei Milchkühen häufig zu schweren Masitiden, die zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen in der Milchviehhaltung führen (SORDILLO u.
STREICHER 2002). Ursächlich für die erhöhte Infektionsanfälligkeit der Tiere ist eine Dysregulation der Immunantwort in der Phase um die Geburt (MALLARD et al. 1998;
WALLER 2000; PAAPE et al. 2002). Bedingt durch den peripartalen Anstieg von Stresshormonen wie Glukokortikoiden (SORDILLO u. STREICHER 2002) werden Immunzellen in ihrer Anzahl und Funktion, wie zum Beispiel die Adhärenz und Migration von neutrophilen Granulozyten, die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und die Ausdifferenzierung mononukleärer Zellen negativ beeinflusst (PREISLER et al. 2000). Seit einigen Jahren liegt der Forschungsschwerpunkt bei Milchkühen auf der Stärkung natürlicher Abwehrmechanismen während der peripartalen Phase der Immunschwäche. Dabei rücken vermehrt Therapieansätze in den Focus, die in die immunologischen Reaktionsabläufe eingreifen und diese modulieren, um so die Abwehr verschiedenster Krankheitserreger zu optimieren.
Bei der Regulation der Immunantwort spielen neben präformierten und induzierten Mediatoren von Immunzellen ebenfalls Neuromediatoren eine entscheidende Rolle. Von besonderem Interesse ist hierbei das Neuropeptid Substanz P, das sowohl von Zellen des Nervensystems als auch von Immunzellen produziert wird (O'CONNOR et al. 2004). Aus humanmedizinischen Studien ist bekannt, dass Substanz P vor allem pro-inflammatorisch auf Immunzellen wirkt, indem es unter anderem die Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen in Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen sowie die Rekrutierung und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten verstärkt (STERNER-KOCK et al. 1999; GUO et al. 2002; DIANZANI et al. 2003; BARDELLI et al. 2005). Eine Beteiligung von Substanz P an der Pathophysiologie von Asthma, Inflammatory Bowel Disease und rheumatoider Arthritis beim Menschen wird durch zahlreiche Studien belegt und der Einsatz von Substanz-P-Antagonisten für therapeutische Zwecke diskutiert (JACOBY et al. 2000;
LAVAGNO et al. 2001; KOON u. POTHOULAKIS 2006).
Der Einfluss von Substanz P auf bovine Immunzellen und die Beteiligung an Entzündungsreaktionen beim Rind ist noch weitgehend ungeklärt. Ziel dieser Arbeit war es mithilfe von In-vitro-Studien die Wirkung von Substanz P auf die Immunzellen des Rindes zu charakterisieren. Der Schwerpunkt lag dabei auf neutrophilen Granulozyten, die die Haupteffektorzellen der bovinen Mastitis darstellen (PAAPE et al. 2003), sowie auf Makrophagen, die als Sensorzellen die Anlockung und Regulation der Effektorzellen steuern.
Mittel- bis langfristig können die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über die immunmodulatorischen Eigenschaften von Substanz P für neue prophylaktische und therapeutische Konzepte in der bovinen Mastitis genutzt werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Die neuroendokrine Regulation der Immunantwort
Das physiologische Gleichgewicht des Körpers wird von drei miteinander vernetzten Systemen aufrechterhalten: dem Nervensystem, dem endokrinen System und dem Immunsystem (GOETZL u. SREEDHARAN 1992). Der Austausch von Informationen zwischen diesen drei Systemen wird durch die endokrine und parakrine Freisetzung von Hormonen, Neurotransmittern, Neuropeptiden und Zytokinen, sowie durch die gemeinsame Expression von Rezeptoren für diese Mediatoren ermöglicht (LAMBRECHT 2001). Das angeborene Immunsystem bildet durch die Erkennung von Pathogen-assoziierten Mustern (PAMPS) und die initiale, unspezifische, zelluläre und humorale Immunantwort die erste Abwehrfunktion gegen eindringende Pathogene. Die Freisetzung von Mediatoren des angeborenen Immunsystems führt zu einer raschen neuralen Aktivierung, die einerseits die lokale Immunantwort verstärkt, um Pathogene zu eliminieren, und andererseits systemische neuroendokrine Reaktionen auslöst, um die Immunantwort abzufangen und den Ruhezustand wieder herzustellen (COOK et al. 2004; BEUTLER 2005). Dieser Rückkopplungs- mechanismus führt zu einer Optimierung der Immunantwort. Eine Störung dieser Regelkreise kann zu übersteigerten Entzündungsreaktionen oder unkontrollierten Infektionen führen und somit schwerwiegende Krankheitsbilder auslösen (STERNBERG 2006). In Abb. 1 werden die Signalwege zwischen Nerven-, Endokrinem-, und Immunsystem schematisch dargestellt.
Abb. 1: Schematische Darstellung der neuroendokrinen Regulation des Immun- systems; aus STERNBERG (2006).
Dargestellt sind aktivierende (Pfeilspitze) und hemmende (Querstrich) Signale zwischen dem Immunsystem und dem zentralen Nervensystem (central nervous system, CNS) sowie dem peripheren Nervensystem (sympathisches Nervensystem (SNS), parasympathischen Nervensystem (Vagus nerve) und afferenten und efferenten Fasern des peripheren Nervensystems (PNS)).
2.1.1 Regulation durch das zentrale Nervensystem
Unter dem Begriff des zentralen Nervensystems werden die Neurone und Gliazellen von Gehirn und Rückenmark zusammengefasst.
Die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse (hypothalamic-pituitary-adrenal-axis, HPA) stellt durch die Ausschüttung von Glukokortikoiden den wichtigsten negativen Rückkopplungsmechanismus des zentralen Nervensystems in der Immunregulation dar.
Systemische pro-inflammatorische Stimuli, wie zum Beispiel bakterielles Lipopolysaccharid
(LPS), aber auch psychologische Stressoren führen zu einer Ausschüttung von Corticotropin- Releasing-Hormon (CRH) aus Zellen des paraventrikulären Nukleus des Hypothalamus.
Dadurch wird die Hypophyse zur Produktion von adrenokortikotropem Hormon angeregt, was schließlich zur Synthese von endogenen Glukokortikoiden in der Nebennierenrinde führt (WEBSTER et al. 2002). Glukokortikoide hemmen die Migration von Leukozyten, indem sie die Expression von Adhäsionsmolekülen (ICAM-1, E-Selektin und VCAM-1) sowie die Produktion von Chemokinen (CCL2, CXCL8) herunterregulieren (CRONSTEIN et al. 1992;
MIYAMASU et al. 1998; ATSUTA et al. 1999). Außerdem reduzieren Glukokortikoide die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1, IL-6 und TNF-α) durch eine Hemmung des nukleären Faktor κB (NFκB) (SCHEINMAN et al. 1995). Glukokortikoide hemmen somit die Migration von Immunzellen in entzündetes Gewebe, sowie die Aktivierung und Bildung von Zytokinen vor Ort, was zu einer Unterdrückung der Immunantwort führt.
2.1.2 Modulation durch das periphere Nervensystem
Das periphere Nervensystem setzt sich aus Nervenfasern und eingelagerten Ganglien des somatischen und des vegetativen Nervensystems zusammen. Funktionell lassen sich somatische Nerven in sensorische und motorische Fasern unterteilen. Das vegetative Nervensystem schließt neben sympathischen und parasympathischen Fasern auch nicht- adrenerge, nicht-cholinerge Fasern (NANC) mit ein. Die Neurotransmitter und die Neuropeptide des peripheren Nervensystems beeinflussen die Immunantwort in unterschiedlicher Weise.
Systemisch beeinflussen sympathische Nervenfasern die Immunantwort über die Ausschüttung von Adrenalin aus dem Nebennierenmark. Adrenalin führt über die Bindung an β-adrenerge Rezeptoren auf Immunzellen zu einer Verringerung der Anzahl zirkulierender Monozyten, B- und T-Zellen sowie natürlicher Killerzellen (JETSCHMANN et al. 1997). Auf regionaler Ebene moduliert der Sympathikus das Immunsystem über die Innervation lymphatischer Organe und Gewebe mit dem Transmitter Noradrenalin. Die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen während einer Immunantwort führt zu einer Stimulation des sympathischen Nervensystems, wodurch Noradrenalin in den lymphatischen Organen freigesetzt wird. Das Binden von Noradrenalin an β2-adrenerge Rezeptoren auf dendritischen
Zellen und Makrophagen führt zur vermehrten Bildung von zyklischem AMP und zur Aktivierung von Proteinkinase A. Dadurch wird in den Zellen über die Hemmung von NFκB die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen, wie IL-1, IL-6 und TNF-α gehemmt (VAN DER POLL et al. 1994; LE TULZO et al. 1997).
Das parasympathische Nervensystem moduliert die Immunantwort auf regionaler Ebene durch die afferenten und efferenten Fasern des Nervus Vagus. Die afferenten Fasern signalisieren durch Rezeptoren für IL-1 auf den Paraglia-Zellen der parasympatischen Ganglien eine Entzündungsreaktion in der Peripherie an das Gehirn (WATKINS u. MAIER 1999). Von den efferenten Fasern wird daraufhin Acetylcholin freigesetzt, das vor allem über nikotinerge Rezeptoren auf Makrophagen anti-inflammatorisch wirkt. Über die Hemmung von NFκB wird die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1, IL-6 und TNF), nicht jedoch die von anti-inflammatorischen Zytokinen (IL-10) in Makrophagen gehemmt (BOROVIKOVA et al. 2000; WANG et al. 2003).
Zusammengefasst werden sowohl Sympathikus als auch Parasympathikus von pro- inflammatorischen Zytokinen aktiviert und vermitteln einen negativen Rückkopplungs- mechanismus, der die Immunantwort hemmt und den Ruhezustand wieder herstellt.
Eine große Anzahl von Peptiden wird von Neuronen des vegetativen und somatischen Nervensystems gebildet. Diese Neuropeptide dienen vor allem in NANC-Fasern aber auch in cholinergen und sensorischen Fasern als Neurotransmitter, haben aber auch immunmodulatorische Aufgaben (WIDDICOMBE 1998; HOKFELT et al. 2000). Sensorische periphere Nerven, die an der Schmerz-, Druck- und Temperaturwahrnehmung beteiligt sind, regulieren die Entzündungsreaktion an ihrem Entstehungsort durch die Ausschüttung von Neuropeptiden, die im Allgemeinen pro-inflammatorische Wirkung haben. Die Stimulation dieser Fasern durch Mediatoren des angeborenen Immunsystems führt zur Ausprägung typischer Entzündungsmerkmale wie Vasodilatation, Ödembildung und Schmerz (STERNBERG 2006). Primäre und sekundäre lymphatische Organe werden von NANC Fasern innerviert, die durch die Ausschüttung von diversen Neuropeptiden mit T-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen interagieren (WEIHE et al. 1991; REUBI et al. 1998).
Zu den allgemein entzündungsfördernden Neuropeptiden gehören Substanz P (SP) und Calcitonin-gene related Peptide (CGRP), die unter anderem zu einer vestärkten Bildung von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α) und Chemokinen (CXCL8,
CCL2) führen (CUESTA et al. 2002; BARDELLI et al. 2005). Das vasoktive intestinale Peptid (VIP) gilt als anti-inflammatorisches Neuropeptid, da es die Produktion pro- inflammatorischer Zytokine und Chemokine hemmt. In Abb. 2 sind die Mediatoren des peripheren Nervensystems und ihre Wirkung auf Immunzellen schematisch dargestellt.
Abb. 2: Effekte des peripheren Nervensystems auf Immunzellen in lymphatischen Organen; aus STERNBERG (2006).
Dargestellt sind die stimulierenden (Pfeilspitze) und hemmenden (Querstrich) Effekte von Neurotransmittern (Acetylcholin, Noradrenalin) und Neuropeptiden (Substanz P, vasoaktives intestinales Peptid (VIP), Calcitonin gene-related peptide (CGRP), Corticotropin-releasing Hormon (CRH) und Neuropeptid Y) auf die Produktion pro-inflammatorischer Zytokine. Die Immunzellen besitzen Rezeptoren für die Neuromediatoren und exprimieren die Neuromediatoren teilweise selbst.
5HTT (5-hydroxytryptamin Transporter).
2.2 Das Neuropeptid Substanz P
Im Jahr 1931 beschrieben Von Euler und Gaddum erstmals einen aus dem Intestinaltrakt und dem Gehirn von Pferden isolierten Atropin-resistenten Faktor, der hypotensiv sowie stimulierend auf glatte Muskulatur wirkte. Es zeigte sich, dass die Wirkung des Extrakts auch nach Verdampfung erhalten blieb, und das entstandene Pulver wurde als Substanz P bezeichnet (HOKFELT et al. 2001). CHANG und LEEMAN (1970) gelang es erstmals, Substanz P aus Rinderhypothalamus zu isolieren und als Undekapeptid (Peptid aus 11 Aminosäuren) zu charakterisieren.
2.2.1 Gene und Peptidsynthese
Substanz P gehört zur Familie der Tachykinine, die ihren Namen aufgrund der Eigenschaft erhielt, schnelle Kontraktionen in glatter Muskulatur hervorzurufen (HOLZER u. HOLZER- PETSCHE 2001). Alle Tachykinine haben die gemeinsame C-terminale Sequenz Phe-Xaa- Gly-Leu-MetNH2 (Xaa = variable Aminosäure) (MAGGI 1997). Neben Substanz P sind Neurokinin A (NKA) und B (NKB) die bekanntesten Mitglieder der Tachykinin-Familie. Die N-terminal erweiterten Formen von NKA (Neuropeptid K und Neuropeptid γ) sind ebenfalls biologisch aktive Peptide. In neueren Studien konnten das beim Menschen und der Maus entdeckte Hemokinin-1 sowie die humanen Endokinine A-D ebenfalls der Tachykinin- Familie zugeordnet werden, obwohl sie im C-Terminus in einer Aminosäure von der klassischen Tachykinin-Sequenz abweichen (PENNEFATHER et al. 2004). In Tab. 1 sind die Aminosäuresequenzen der bei Säugetieren identifizierten Tachykinine dargestellt. Die Primärstruktur von SP, NKA und NKB scheint für alle Säugetier-Spezies identisch zu sein, wohingegen die Aminosäurensequenz von Hemokinin-1 in Ratte und Maus sich von dem humanen Peptid unterscheidet.
Tab. 1: Aminosäurensequenz der bei Säugetieren identifizierten Tachykinine; nach PENNEFATHER et al. (2004).
Spezies Name Sequenz
Säugetiere Substanz P Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH2
Säugetiere Neurokinin A His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-MetNH2 Säugetiere Neurokinin B Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-MetNH2
Ratte/Maus Hemokinin-1 Arg-Ser-Arg-Thr-Arg-Gln-Phe-Tyr-Gly-Leu-MethNH2
Mensch Hemokinin-1 Thr-Gly-Lys-Ala-Ser-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-MetNH2
Mensch Endokinin C Lys-Lys-Ala-Tyr-Gln-Leu-Glu-His-Thr-Phe-Gln-Gly-Leu-LeuNH2 Mensch Endokinin D Val-Gly-Ala-Tyr-Gln-Leu-Glu-His-Thr-Phe-Gln-Gly-Leu-LeuNH2
Die für Tachykinine spezifische Sequenz ist fett gedruckt. Die N-terminalen Erweiterungen von Neurokinin A (Neuropeptid K und γ) und humanem Hemokinin-1 (Endokinin A und B) sind nicht dargestellt.
Tachykinine werden aus Vorläuferproteinen, den so genannten Preprotachykininen synthetisiert, die von drei verschiedenen Genen kodiert werden. Das Preprotachykinin A (PPT-A) Gen kodiert bei Säugetieren für Substanz P, Neurokinin A, Neuropeptid K und γ (CARTER u. KRAUSE 1990). Eine Transkription von PPT-A führt zu einer vorläufigen mRNA, aus der nach unterschiedlichem „splicing“ vier verschiedene mRNA-Isoformen entstehen, die sich jeweils in der Kombination der Exons unterscheiden. Das Vorläuferpeptid von Substanz P wird aus allen mRNA-Isoformen synthetisiert, während die entsprechenden Exons für NKA nur in zwei, die für NPK und NPγ nur in einer Isoform enthalten sind (KRAUSE et al. 1987; HARMAR et al. 1990). Das PPT-B Gen kodiert nur für Neurokinin B (HOKFELT et al. 2001). Das humane Hemokinin-1 und die Endokinine A-D werden ebenfalls über verschiedene mRNA-Isoformen durch das PPT-C Gen kodiert (PAGE et al.
2003).
Die aus der reifen mRNA entstandenen Preprotachykinine sind große Polypeptide, die aus einem Signalpeptid, einer oder mehrerer Kopien des Neuropeptids und einem oder mehreren Platzhalter-Peptiden bestehen. Das am N-Terminus befindliche Signalpeptid erlaubt während der Synthese die Bindung und den Eintritt in das Endoplasmatische Retikulum und wird dann rasch abgespalten. Das so entstandene Propeptid wird zum Golgi-Apparat transportiert, wo
die Platzhalterpeptide entfernt werden und das aktive Neuropeptid in Vesikel verpackt wird (PENNEFATHER et al. 2004).
2.2.2 Abbau
Nach Freisetzung wird die physiologische Aktivität von Substanz P im Allgemeinen durch hydrolytische Spaltung terminiert. Es gibt mehrere unspezifische Enzyme, die zur Hydrolyse von Substanz P in der Lage sind, von denen Angiotensin converting enzyme (ACE) und neutrale Endopeptidase (NEP) jedoch die bedeutendsten sind (KATO et al. 1978; SKIDGEL et al. 1984; JOOS et al. 2000). NEP und ACE spalten die Peptidbindungen zwischen den Aminosäuren Gln-Phe, Phe-Phe und Gly-Leu, was bei Substanz P zu der Entstehung inaktiver Fragmente führt, denen das C-terminale Ende für die Rezeptorbindung fehlt (SKIDGEL et al.
1984; DI MARIA et al. 1998). Die Enzyme sind im Organismus weit verbreitet. NEP kommt in Niere, Lunge, bestimmten Gehrinregionen sowie Knochenmark und Lymphknoten vor Besonders gut ist die Hydrolyse von Substanz P durch NEP in den Atemwegen beschrieben.
Die Hemmung von NEP verstärkt die Effekte von exogen zugeführten Tachykininen, wie Bronchospasmus, Extravasation und Degranulation von Mastzellen in der Lunge (CHEUNG et al. 1992; ROQUES et al. 1993).
Aus menschlichem Gehirn und Rückenmark konnte auch eine für Substanz P spezifische Peptidase isoliert werden, die so genannte Substanz P Endopeptidase (SPE) (KARLSSON u.
NYBERG 1998). Die Autoren konnten zeigen, dass durch die Spaltung mit SPE Fragmente mit biologischer Aktivität entstanden. Daraus wurde von KARLSSON und NYBERG (1998) geschlossen, dass es sich nicht um ein inaktivierendes sondern ein konvertierendes Enzym handelt. Das aus der Spaltung entstehende N-terminale Fragment beeinflusst verschiedene Verhaltensmuster, wie zum Beispiel das Lernverhalten von Mäusen (HASENOHRL et al.
1990; LARSON u. SUN 1993).
2.2.3 Rezeptoren
Wie alle Tachykinine bindet Substanz P an eine bestimmte Rezeptorgruppe, die Neurokininrezeptoren (NKR). Es handelt sich hierbei um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren mit sieben Transmembran-Domänen, einem extrazellulären N-Terminus und einem
intrazellulären C-terminalen Teil (MAGGI et al. 1993). Zurzeit sind für Säugetiere drei verschiedene Neurokininrezeptoren beschrieben, NKR1, NKR2 und NKR3. Alle drei Rezeptoren werden von den klassischen Tachykininen Substanz P, Neurokinin A und Neurokinin B erkannt, es gibt jedoch unterschiedliche Affinitäten. Substanz P bindet mit höchster Affinität an NKR1. Die relative Affinität von NKR1 für Neurokinin A und Neurokinin B ist 100- und 500-fach geringer im Vergleich mit Substanz P, während NKR2 und NKR3 für Substanz P die geringste Affinität aufweisen (GERARD et al. 1991; REGOLI et al. 1994).
Die Bindung von Substanz P an den NKR1 führt zur Aktivierung von Phospholipase C, welche Phosphatidylinositolbiphosphat in Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) spaltet. Diese Second messenger stehen dann für die Mobilisation von Calcium aus intrazellulären Speichern (IP3) und für die Aktivierung der Proteinkinase C (DAG, Ca2+) zur Verfügung (O'CONNOR et al. 2004). Für den Haupt-Rezeptor von Substanz P existieren zwei Isoformen, die sich in der Länge des zytoplasmatischen C-Terminus um etwa 8 kDa unterscheiden, Substanz P jedoch mit derselben Affinität binden (KAGE et al. 1993). Zellen, die den verkürzten Rezeptor ausbilden, zeigen bereits bei geringeren Konzentrationen von Substanz P einen intrazellulären Calcium-Einstrom als Zellen, die den Rezeptor in voller Länge exprimieren. Auch in ihrer Deaktivierung unterscheiden sich die Isoformen. So wird der NKR1 in voller Länge nach Aktivierung schnell internalisiert und von Rezeptor-Kinasen gespalten, während der verkürzte Rezeptor nicht dieser Deaktivierung unterliegt (LI et al.
1997). Neuere Studien zeigen, dass die durch den voll ausgebildeten NKR1 ausgelöste Internalisierung zur Aktivierung von Enzymkaskaden führt, die ihrerseits Zellproliferation und anti-apoptotische Faktoren induzieren. Der verkürzte Rezeptor kann durch die fehlenden Abschnitte in der C-terminalen Sequenz diese Effekte nicht auslösen (DEFEA et al. 2000;
BOCKMANN et al. 2001).
Der NKR1 konnte im zentralen Nervensystem in Groß- und Kleinhirn sowie im Rückenmark nachgewiesen werden (CABERLOTTO et al. 2003). Auch im autonomen Nervensystem von Atmungsapparat, Gastrointestinaltrakt und Urogenitaltrakt ist der NKR1 exprimiert und an der Regulation der Organfunktionen beteiligt (QUARTARA u. MAGGI 1998). Die Expression von NKR1 ist auch für Immunzellen beschrieben. Der Rezeptor wird von humanen Blutmonozyten und aus Monozyten gewonnenen Makrophagen (Monocyte derived
Macrophages; MdM) sowie von humanen Alveolarmakrophagen exprimiert (HO et al. 1997;
BARDELLI et al. 2005). Auch in humanen Lymphozyten konnte die NKR1-mRNA nachgewiesen werden (LAI et al. 2005). Für das Rind konnte der NKR1 in Membranextrakten von Alveolarmakrophagen und Lutealzellen nachgewiesen werden (BRYLLA et al. 2005;
ROGERS et al. 2006).
2.2.4 Verbreitung und Funktion
Substanz P ist im zentralen und peripheren Nervensystem weit verbreitet. Im zentralen Nervensystem ist das Neuropeptid an der Steuerung von Verhaltensmustern und der Regulation von Überleben und Degeneration von Nervenzellen beteiligt (O'CONNOR et al.
2004). Im peripheren Nervensystem wird Substanz P in primären sensorischen Neuronen und intrinsischen Neuronen des Gastrointestinaltrakts, Respirationstrakts und Urogenitaltrakts gebildet und ist dort an der Regulation der Organfunktionen beteiligt (MAGGI 2000).
Außerdem wird Substanz P eine wichtige Rolle bei der Schmerz-Weiterleitung vom peripheren zum zentralen Nervensystem zugeschrieben (IVERSEN 1982). Substanz P wird jedoch auch von Zellen des Immunsystems, wie Makrophagen, Granulozyten, Lymphozyten und dendritischen Zellen produziert (BOST et al. 1992; KILLINGSWORTH et al. 1997). Im Folgenden wird der regulatorische Einfluss von Substanz P auf die Organfunktionen von Magen-Darm-Trakt und Respirationstrakt sowie die Rolle bei der Schmerz-Weiterleitung näher erläutert. Die immunmodulatorischen Funktionen von Substanz P auf zellulärer Ebene werden in Kapitel 2.3 beschrieben. Die Rolle von Substanz P bei pathologischen Prozessen wird in Kapitel 2.4 beschrieben.
Substanz P wird im Gastrointestinaltrakt hauptsächlich von enterischen, cholinergen Motoneuronen produziert und nimmt zusammen mit Neurokinin A die Funktion eines Ko- Transmitters ein (COSTA et al. 2000; FURNESS 2000; SCHEMANN et al. 2001). Die beiden Tachykinine sind dem Transmitter Acetylcholin untergeordnet und fördern als unterstützendes System die Motilität des Magen-Darm-Trakts (MAGGI 2000). Im Tierversuch konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung der Tachykinin-Rezeptoren NKR1 und NKR2 zu einer deutlichen Verminderung der Peristaltik in Dünn- und Dickdarm sowie im Ösophagus führt (BARTHO et al. 1999; TONINI et al. 2001). Auch der Elektrolyt- und Flüssigkeitshaushalt und die Sekretion von Verdauungsenzymen werden durch Substanz P
beeinflusst. Studien mit humanen und porcinen Systemen konnten zeigen, dass Substanz P an der Sekretion von Chlorid-Ionen im Kolon sowie an der Säureproduktion und Pepsinogen- Sekretion im Magen beteiligt ist (RIEGLER et al. 1999; SCHMIDT et al. 1999). Die vaskulären Effekte von Substanz P im Gastrointestinaltrakt sind variabel. Substanz P und NKA können sowohl Vasodilatation als auch Vasokonstriktion hervorrufen. Außerdem erhöht Substanz P bei inflammatorischen Prozessen über den NKR1 die Permeabililtät von Venolen in Magen-Darm-Trakt und Pankreas, die unter physiologischen Bedingungen durch die Anwesenheit von neutraler Endopeptidase niedrig gehalten wird (STURIALE et al. 1999;
MAA et al. 2000). Substanz P konnte auch in nicht neuronalen Zellen im Gastrointestinaltrakt, wie enteroendokrinen Zellen, eosinophilen Granulozyten und Makrophagen nachgewiesen werden (METWALI et al. 1994; CASTAGLIUOLO et al. 1997).
Im Respirationstrakt sind SP-haltige Nervenfasern in Epithelien, Drüsen, Blutgefäßen und glatter Muskulatur von Bronchien lokalisiert (BARNES et al. 1991). Substanz P reguliert in den Atemwegen vor allem neurogene Entzündungsprozesse. Eine Freisetzung von Substanz P und NKA aus Capsaicin-sensitiven sensorischen Nervenfasern führt zu Bronchokonstriktion, Plasma-Extravasation und Vasodilatation (O'CONNOR et al. 2004). Auslösende Faktoren können eine Reihe von Substanzen wie Allergene, Zigarettenrauch, Ozon aber auch bronchoaktive Substanzen wie Histamin, Prostaglandine und Leukotriene sein (MARTINS et al. 1991; BALUK et al. 1996; TAKEBAYASHI et al. 1998). Substanz P ist potenter in der Stimulation von Extravasation und Vasodilatation, während NKA der stärkere Bronchokonstriktor ist (SHELDRICK et al. 1995; VAN RENSEN et al. 2002). Tachykinine, im Besonderen Substanz P, lösen über den NKR1 eine Reihe von Reaktionen bei Leukozyten aus, die Entzündungsprozesse in der Lunge initiieren und verstärken (DEROSE et al. 1994;
NAKAGAWA et al. 1995).
Mitte der 70er Jahre wurde Substanz P in demyelinisierten Capsaicin-sensitiven Nervenfasern sowie in Spinalganglien und Neuronen des dorsalen Horn des Rückenmarks nachgewiesen, was die ersten strukturellen Hinweise auf eine Beteiligung an der Schmerz-Weiterleitung lieferte (ZUBRZYCKA u. JANECKA 2000). Das Neuropeptid wird in den Spinalganglien synthetisiert und von dort nach zentral in das dorsale Horn oder nach peripher in unmyelinisierte, Capsaicin-sensitive Nervenfasern transportiert, die größtenteils Nozizeptoren sind. Versuche mit Mäusen und Ratten haben gezeigt, dass eine Injektion von Substanz P zu
Schmerzäußerungen führt, während eine Behandlung mit einem Antagonist eine Analgesie hervorruft (YASHPAL u. HENRY 1983; ZUBRZYCKA et al. 1997). Die Gabe von Capsaicin führte bei Ratten zu einer Abnahme der Substanz P-Gehalte im Rückenmark einhergehend mit einer Erhöhung der Schmerzreiz-Schwelle (NAGY u. VAN DER KOOY 1983).
2.3 Modulation von Zellfunktionen durch Substanz P
2.3.1 Interaktion mit neutrophilen Granulozyten
Zu den vielfältigen Funktionen neutrophiler Granulozyten im Rahmen der Abwehr gehören die Adhärenz an Gefäßwände, das gerichtete Auswandern in entzündetes Gewebe und die dortige Aktivierung der Effektorfunktionen zur Eliminierung eingewanderter Mikroorganismen. Entzündungsmediatoren (u.a. CXCL8, Leukotrien B4, C5a) wirken chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten. Sie induzieren außerdem die Bildung von Selektinen (CD62P, CD62E) und Integrinen (LFA-1, Mac-1) sowie deren Liganden auf Endothelzellen und neutrophilen Granulozyten.
Es konnte gezeigt werden, dass Substanz P in einem breiten Konzentrationsbereich (1x10-16 mol/L bis 1x10-7 mol/L) die Adhäsion von humanen neutrophilen Granulozyten sowohl an Endothelzellen als auch an Epithelzellen steigert (DEROSE et al. 1994; TOMINAGA et al.
1999). Substanz P verstärkte dabei dosis- und zeitabhängig die Ausbildung von Adhäsionsmolekülen auf allen beteiligten Zelltypen, wobei sich eine glockenförmige Dosis- Wirkungs-Beziehung mit einem maximalen Effekt bei einer SP-Konzentration von 1x10-10 mol/L einstellte (DEROSE et al. 1994; DIANZANI et al. 2003). Auf humanen neutrophilen Granulozyten wird durch Substanz P vermehrt das β2-Integrin LFA-1 (CD11a/CD18) exprimiert, auf Endothelzellen werden ICAM-1 (CD54), der zugehörige Ligand für LFA-1 sowie die für das Anhaften von PMN zuständigen Selektine CD62P und CD62E verstärkt gebildet (SMITH et al. 1993; NAKAGAWA et al. 1995; DIANZANI et al. 2003). Die von Substanz P vermittelte Adhärenz an Lungenepithelzellen konnte durch Lipopolysaccharid (LPS) noch verstärkt werden und führte außerdem zu einer vermehrten Ausschüttung der pro-
inflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1β bei den neutrophilen Granulozyten (KUO et al.
2000).
Eine chemoattraktive Wirkung von Substanz P in mikromolaren Bereichen (1x10-6 bis 1x10-4 mol/L) wurde in mehreren Studien für neutrophile Granulozyten von Mensch und Ratte gezeigt (PERIANIN et al. 1989; IWAMOTO et al. 1990; FRANCO-PENTEADO et al. 2005).
PERIANIN et al. (1989) waren jedoch der Meinung, dass diese hohen Konzentrationen nicht die physiologischen Bedingungen widerspiegeln. Sie konnten in ihrer Studie zeigen, dass Substanz P in geringeren Konzentrationen (1x10-10 bis 1x10-6 mol/L) eine durch fMLP ausgelöste Migration von PMN verstärkt. In einer In-vivo-Studie konnten SMITH et al.
(1993) eine anhaltende Migration von humanen neutrophilen Granulozyten in der Haut nach intradermaler Injektion von Substanz P feststellen. In Gewebekulturen von Zahnpulpa führte eine Zugabe von Substanz P (1x10-10 bis 1x10-8 mol/L) zu einer signifikanten Erhöhung der CXCL8-Produktion (PATEL et al. 2003; PARK et al. 2004). SUN et al. (2007) konnten mittels Immunfluoreszenz zeigen, dass Substanz P (1x10-6 mol/L) die Expression des Chemokin-Rezeptors CXCR2 auf der Oberfläche von murinen neutrophilen Granulozyten verstärkt. Außerdem konnte in der Studie eine Verstärkung der CXCL2-induzierten Migration neutrophiler Granulozyten nach Inkubation mit Substanz P (1x10-6 mol/L) beobachtet werden.
Das Chemokin CXCL8, das Komplementspaltprodukt C5a aber auch bakterielle Produkte wie N-Formyl-Peptide führen über die Bindung an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zu einer Mobilisation von Calcium aus intrazellulären Speichern von PMN (BOULAY et al. 1990;
GERARD u. GERARD 1991; MURPHY u. TIFFANY 1991). Dieser Prozess stellt ein Schlüsselsignal für die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten dar (HALLETT u.
LLOYDS 1995). Die folgenden Phosphorylierungs-Kaskaden führen über die Aktivierung der NADPH-Oxidase zur Bildung von bakteriotoxischen und gewebsschädigenden reaktiven Sauerstoffspezies. Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass Substanz P die Aktivierung von neutrophilen Granulozyten und die nachfolgende Bildung von Sauerstoffradikalen beeinflusst. Ein Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration in humanen PMN wurde durch Substanz P in vergleichsweise hohen Konzentrationen (1x10-6 bis 1x10-3 mol/L) (SERRA et al. 1988; LLOYDS u. HALLETT 1993) aber auch in niedrigeren Konzentrationsbereichen (1x10-7 mol/L) (NOWAK et al. 1996) hervorgerufen. Dabei konnte sowohl das ganze Neuropeptid als auch das C-terminale Fragment von Substanz P (SP6-11)
einen Calcium-Einstrom auslösen (SERRA et al. 1988; IWAMOTO et al. 1990). Häufig wird ein so genannter „Priming-Effekt“ für die Aktivierung neutrophiler Granulozyten beschrieben. Eine Vorinkubation mit Substanz P verstärkte die Aktivierung von PMN durch experimentelle Stimuli (fMLP und PMA) (WOZNIAK et al. 1989; LLOYDS u. HALLETT 1993; STERNER-KOCK et al. 1999). DIANZANI et al. (2001) zeigten für humane PMN einen Priming-Effekt von Substanz P für den CXCL8-induzierten Calcium-Einstrom. Durch eine 3-minütige Vorinkubation mit Substanz P (3x10-6 mol/L) wurde der CXCL8-induzierte Calcium-Einstrom im Vergleich zur Kontrolle verdoppelt. Substanz P allein löste in derselben Konzentration in dieser Studie keinen Calcium-Einstrom aus.
Die Apoptose ist die häufigste Form des Zelltodes bei neutrophilen Granulozyten. Es handelt sich dabei um eine aktive Form des Zelltodes, bei der zelluläre Bestandteile und Metaboliten abgebaut werden ohne Entzündungsreaktionen hervorzurufen. Die Apoptose wird im Allgemeinen über zwei unterschiedliche Signaltransduktionswege reguliert, den extrinsischen und den intrinsischen Pfad. Beide Signalwege münden in der Aktivierung von Caspasen, einer Familie von Cystein-Proteasen, die typischerweise ihr Substrat nach einer Asparaginsäure spalten (HOLLÄNDER 2006; LUO u. LOISON 2008). Der extrinsische Signalweg wird über die Stimulation von so genannten Todesrezeptoren vermittelt, von denen vor allem CD95 (Fas) und der TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2 und 3 sowie deren Liganden für die Apoptose von neutrophilen Granulozyten am Bedeutendsten sind (LUO u.
LOISON 2008). Die Bindung der Liganden an die Todesrezeptoren führt über die Entstehung eines „Death Inducing Signalling Complex“ (DISC) zur Aktivierung der Caspasen, die wiederum verschiedene Enzyme aktivieren, welche die Fragmentierung der DNA und somit den Zelltod in Gang setzten (LILES et al. 1996; RENSHAW et al. 2000; KOGA et al. 2004).
Der intrinsische Pfad der Apoptose ist der wichtigste Mechanismus für das konstitutive Absterben von neutrophilen Granulozyten. Auslösender Faktor dieses Prozesses ist der Verlust des Mitochondrien-Membranpotentials. So genannte Bcl-2-Proteine lagern sich an die depolarisierten Mitochondrien an und erhöhen die Durchlässigkeit der Mitochondrien- membran, so dass pro-apoptotische Proteine (Cytochrom C, Smac, Omi) ins Zytosol gelangen, die ihrerseits die Caspase-Kaskade aktivieren (MAIANSKI et al. 2004a).
BÖCKMANN et al. (2001) konnte einen anti-apoptotischen Effekt von Substanz P (1x10-5 bis 1x10-4 mol/L) auf humane PMN zeigen. Ein NKR1-Rezeptorantagonist konnte diesen Effekt
hemmen, was die Autoren zu der Annahme führte, dass der NKR1-Rezeptor maßgeblich an der Übermittlung dieses Effekts beteiligt ist. Substanz P konnte in den untersuchten Konzentrationen außerdem die Aktivität von Caspase-3 hemmen. Dabei wurde sowohl die Prozessierung der inaktiven Pro-Caspase-3 als auch die Funktion der aktiven Caspase-3 durch Substanz P herabgesetzt. In einer anderen Studie konnte ein protektiver Effekt auf neutrophile Granulozyten durch das C-terminale Fragment von Substanz P (SP6-11) beobachtet werden (MACKINNON et al. 2002). Das SP-Fragment konnte den Anteil apoptotischer Zellen nach 20 Stunden Inkubation konzentrationsabhängig (1x10-6 bis 1x10-4mol/L) um bis zu 50%
reduzieren.
2.3.2 Beeinflussung von Monozyten und Makrophagen
Eine Verstärkung der Migration durch die direkte chemoattraktive Wirkung des C-terminalen Endes des Neuromediators wurde in verschiedenen Studien mit humanen Blut-Monozyten nachgewiesen (WIEDERMANN et al. 1989; SCHRATZBERGER et al. 1997). HOOD et al.
(2000) konnten zusätzlich zeigen, dass dieser Effekt durch den Substanz P-Rezeptor NKR1 vermittelt wird, da der Einsatz eines selektiven NKR1-Antagoisten die Chemotaxis aufheben konnte.
Nach Stimulation durch Lipopolysaccharid (LPS) sezernieren Monozyten und Makrophagen zahlreiche, vor allem pro-inflammatorische Zytokine, wie z.B. TNF-α, IL-1, IL-6 und IL-12, sowie zahlreiche Chemokine (CXCL1, 2, 3, 6 und 8, CCL1-5). Diese Mediatoren führen zur Eigenstimulation (IL-1α und IL-1β), zur Anlockung weiterer Makrophagen (CCL3 und CCL4) und anderer Leukozyten (CXCL1, 2, 3, 6 und 8), zur Aktivierung bestimmter Lymphozytensubpopulationen (IL-12) und auch zu systemischen Effekten wie z.B. Fieber (IL-1α und IL-1β, IL-6, TNF-α) (AKIRA u. KISHIMOTO 1996; JANEWAY 2005). Ein großer Teil der von Makrophagen initiierten Entzündungsreaktionen resultiert in der Anlockung und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten. So zeigen neutrophile Granulozyten eine gerichtete Migration zu den meisten der von stimulierten Makrophagen freigesetzten Chemokinen (CXCL1, 2, 3, 6 und 8, CCL1).
Eine Inkubation mit Substanz P (1x10-12 bis 1x10-6 mol/L) führte bei humanen Monozyten und Makrophagen zu einer gesteigerten Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1β, TNF-α und IL-6 (LAVAGNO et al. 2001; CUESTA et al. 2002; BARDELLI et al.
2005). In diesen Studien konnte Substanz P auch die Entstehung von reaktiven Sauerstoffspezies und den oxidativen Burst von Monozyten und Makrophagen verstärken.
BERMAN et al. (1996) konnten für Substanz P einen „Priming-Effekt“ auf murine Makrophagen zeigen. In ihrer Studie führte eine Vorinkubation mit Substanz P vor der Stimulation mit LPS zu einer stärkeren Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen (IL-1 und IL-6), als eine alleinige LPS-Stimulation. Auch die LPS-induzierte Sekretion von IL-12, einem Zytokin, das die Proliferation und Ausdifferenzierung von T-Zellen fördert, wird durch Substanz P verstärkt (KINCY-CAIN u. BOST 1997).
Bei Peritonealmakrophagen von Meerschweinchen und Mäusen konnte Substanz P die Produktion von Arachidonsäure-Metaboliten (Prostaglandin E2, Thromboxan B2) sowie die Phagozytoseleistung steigern (BAR-SHAVIT et al. 1980; MURRIS-ESPIN et al. 1995).
Außerdem konnte Substanz P die Induktion von anti-apoptotischen Faktoren, wie Bcl-2 und Stickstoffmonoxid, in murinen Peritonealmakrophagen fördern, und so die LPS-induzierte Apoptose verringern (KANG et al. 2001).
HO et al. (1997) konnten nachweisen, dass humane periphere Monozyten und aus menschlichem Speichel gewonnene Makrophagen neben dem NKR1 auch Substanz P selbst produzieren können. Diese Tatsachen führten die Autoren zu der Annahme, dass Makrophagen eine der hauptsächlichen Quellen für Substanz P bei entzündlichen Erkrankungen der Atemwege sind. Andere Studien wiesen eine Hochregulation der SP und NKR1 Expression in Monozyten und Makrophagen durch Endotoxin nach (BOST et al. 1992;
GERMONPRE et al. 1999).
2.3.3 Aktivierung von Thrombozyten
Unter physiologischen Bedingungen zirkulieren Thrombozyten als diskoide Partikel mit glatter Oberfläche in der Blutbahn (COOMBER et al. 2001). Im Rahmen von Entzündungsreaktionen werden lokal Thrombozyten-aktivierende Faktoren produziert, wie zum Beispiel der Plättchen aktivierende Faktor (PAF), Thrombin und Thromboxan A2
(TXA2). Diese Stoffe binden an G-protein-gekoppelte Rezeptoren, die zu einem Anstieg von intrazellulären Ca2+-Ionen und der Aktivierung von Proteinkinase C führen. Nach Aktivierung verändern die Thrombozyten ihre Form und setzen die Inhalte der α-Granula und der dichten Granula frei (HOLMSEN 1994). In Studien mit Kaninchen konnte festgestellt werden, dass
Substanz P eine Formveränderung von Thrombozyten induziert (GUDAT et al. 1981; SAVI et al. 1992). Dabei handelt es sich um einen kurzzeitigen, reversiblen Effekt, der durch den Einsatz von NKR1-Antagonisten aufgehoben werden konnte.
DAMONNEVILLE et al. (1990) beschrieben eine Erhöhung der zytotoxischen Aktivität humaner Thrombozyten gegenüber Larven von Schistosoma mansoni nach der Stimulation mit Substanz P. Bei eingesetzten Konzentrationen von 1x10-12 bis 1x10-6 mol/L erreichte SP einen maximalen Effekt bei 1x10-8 mol/L. In den Studien von GECSE et al. (1996; 1999) zeigte Substanz P einen Einfluss auf die Arachidonsäure-Freisetzung aus humanen Thrombozyten. Durch niedrige Dosen von Substanz P (1x10-12 mol/L) wird die Freisetzung von Thromboxan A2 und Prostaglandin F2α (PGF2α) gehemmt, während höhere Dosen (1x10-8 - 1x10-10 mol/L) die Produktion der beiden Arachidonsäure-Metaboliten förderten. Die Autoren betrachten ihre Ergebnisse in Zusammenhang mit denen von DAMONNEVILLE et al. (1990) als Hinweis darauf, dass Substanz P durch eine vermehrte Freisetzung von TXA2
die Zytotoxizität von Thrombozyten fördert.
In einer neueren Studie wird bei humanen Thrombozyten eine gesteigerte Aggregat-Bildung und eine Degranulation von α- und Dichten-Granula durch Substanz P in micromolaren Konzentrationen beschrieben (GRAHAM et al. 2004). Diese Effekte waren mit einer Mobilisation von Calcium aus intrazellulären Speichern verbunden. Außerdem konnte in der Studie die Expression der NKR1 mRNA in Megakaryozyten und die Anwesenheit des NKR1 auf humanen Thrombozyten nachgewiesen werden.
2.3.4 Modulation von Lymphozyten
Studien über die Migration von humanen Lymphozyten zeigten eine direkte chemotaktische Wirkung sowohl für T- als auch für B-Lymphozyten durch den C-terminalen Teil von Substanz P (SCHRATZBERGER et al. 1997). In neueren Untersuchungen konnte die chemotaktische Wirkung von Substanz P auf T-Lymphozyten weiter belegt, und über den Einsatz von NKR1-Antagonisten dem hauptsächlichen Rezeptor für SP zugeordnet werden (HOOD et al. 2000; GUO et al. 2002). GUO et al. (2002) konnten außerdem feststellen, dass Substanz P die Bildung von CCL4 in T-Lymphozyten auf mRNA-Ebene und auch die Sekretion des Chemokins signifikant steigerte. Das Chemokin wirkt vor allem auf Monozyten, Makrophagen und T-Zellen chemotaktisch. Die Autoren ordnen diesen Effekt
einer Aktivierung des NFκB zu, da Substanz P in den Versuchen zu einer erhöhten Tätigkeit der NFκB-aktivierenden Luciferase führte.
Über den Einfluss von Substanz P auf die Proliferation von T-Lymphozyten gibt es unterschiedliche Angaben. Indirekt moduliert Substanz P die Proliferation von T-Zellen durch die verstärkte IL-12-Produktion von Makrophagen (siehe 2.3.2). Auf direktem Wege wird Substanz P ein positiver Effekt auf die durch Mitogene, wie Concavalin A (ConA), induzierte Proliferation von Lymphozyten zugeschrieben (PAYAN et al. 1983; COVAS et al. 1994).
COVAS et al. (1994) berichten aber auch von einer Hemmung der Proliferation durch Substanz P bei immunsuppressiven Individuen. Andere Autoren konnten bei Versuchen mit einer humanen Lymphozyten-Zelllinie keinen Einfluss von Substanz P auf die Mitogen- induzierte Proliferation feststellen (ZHU et al. 1984; KRCO et al. 1986; ROBERTS et al.
1992). SCICCHITANO et al. (1987) untersuchten die Wirkung von Substanz P auf die Proliferation von Lymphozyten in Abhängigkeit der Zeit. Dabei konnte die Arbeitsgruppe feststellen, dass Substanz P innerhalb der ersten 24 Stunden hemmend auf die Proliferation wirkte und nach 48 Stunden keinen Effekt zeigte, was sich mit den Ergebnissen von KRCO et al. (1986) deckte. Nach 72 Stunden Inkubation konnte die Arbeitsgruppe eine proliferationsfördernde Wirkung von Substanz P feststellen. CALVO et al. (1992) konnten zeigen, dass Substanz P bei aktivierten humanen T-Zellen die Produktion von IL-2 verstärkt.
Dieses Zytokin fördert die Proliferation von T-Zellen. Der Effekt von Substanz P folgte einer glockenförmigen Dosis-Wirkungs-Beziehung und hatte sein Maximum bei 1x10-12 mol/L.
RAMESHWAR et al. (1993) konnten eine Steigerung der IL-2-Produktion durch Substanz P bei ruhenden murinen Lymphozyten und CD4-positiven T-Zellen beobachten. Dabei konnte der maximale Effekt von Substanz P in dem auch von CALVO et al. (1992) beschriebenen Konzentrationsbereich (1x10-12 mol/L) ermittelt werden.
2.4 Die Rolle von Substanz P bei entzündlichen Erkrankungen
2.4.1 Infektiöse und nicht-infektiöse Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts
Eine Beteiligung von Substanz P wird vor allem bei Infektionen mit Clostridium difficile und Salmonella spp., sowie bei der Pathogenese des Inflammatory-Bowel-Disease-Komplex diskutiert.
Ein wichtiger Mechanismus der durch Clostridium difficile ausgelösten Colitis ist die Freisetzung von Enterotoxin A und die damit verbundene Sekretion und Entzündung des Darms. Enterotoxin A vermittelt seine Wirkung durch die Aktivierung von intestinalen Neuronen und die Ausschüttung von Neuropeptiden, vor allem von Substanz P (KOON u.
POTHOULAKIS 2006). In Versuchen mit Ratten konnte die parenterale Gabe eines NKR1- Antagonisten alle durch Enterotoxin A ausgelösten inflammatorischen und sekretorischen Effekte hemmen (POTHOULAKIS et al. 1994; MANTYH et al. 1996). Eine Gabe von Enterotoxin A führte bei Ratten innerhalb von 30 Minuten zu einem vermehrten Gehalt von Substanz P in der Ileum-Mukosa und in Makrophagen der Lamina propria. Außerdem wurde die TNF-α-Produktion der Makrophagen gesteigert (CASTAGLIUOLO et al. 1997).
Eine Beteiligung von Substanz P an der Pathophysiologie von Salmonella-Infektionen wird ebenfalls diskutiert. Im Maus-Modell führte eine orale Infektion mit Salmonellen zu einer beachtlichen Hochregulation des NKR1 in Peyerschen Platten und mesenterialen Lymphknoten. Die Gabe eines Substanz P-Antagonisten vor der Infektion führte zu einer erhöhten Mortalität und einer verringerten mRNA-Expression von IL-12 und IFN-γ in intestinalen Makrophagen (KINCY-CAIN u. BOST 1996). Diese Ergebnisse ließen die Autoren vermuten, dass Substanz P ein wichtiger Faktor für die Bildung einer ausreichenden Immunantwort gegenüber Salmonella-Infektionen ist. Eine neuere Studie von WALTERS et al. (2005) zeigte jedoch eine erhöhte Resistenz von NKR1-defizienten Mäusen gegenüber Salmonella-Infektionen, die vermutlich auf eine erhöhte Produktion des anti- inflammatorischen Zytokins IL-10 zurückzuführen ist.
Der Krankheitskomplex Inflammatory Bowel Disease (IBD) schließt die Erkrankungen Morbus Crohn und ulzerative Colitis mit ein. Die Pathogenese von IBD beinhaltet prädisponierende genetische Faktoren sowie exogene und endogene Auslöser, die in einer
rezidivierenden und progressiven Entzündung des Darms münden (SHANAHAN 1993).
Obwohl die Ätiologie von IBD noch nicht hinreichend geklärt ist, wird angenommen, dass Substanz P und der NKR1 eine Rolle bei der Pathophysiologie des Krankheitskomlpexes spielen (KOON u. POTHOULAKIS 2006). Erhöhte Gehalte von Substanz P wurden in Rektum und Kolon von Patienten mit ulzerativer Colitis ermittelt und korrelierten mit den Krankheits-Schüben (MAZUMDAR u. DAS 1992; BERNSTEIN et al. 1993). Eine erhöhte Dichte von SP-haltigen Nervenfasern konnte bei Morbus-Crohn-Patienten in Kolon und in hypervaskulären Läsionen des Darms festgestellt werden (MAZUMDAR u. DAS 1992;
KIMURA et al. 1994). GOODE et al. (2000) untersuchten das Expressionsmuster des SP- Rezeptors in Kolon-Biopsien von gesunden und an IBD erkrankten Individuen. Generell war der Anteil NKR1-haltiger Zellen in den Bioptaten von IBD-Patienten erhöht. Bei Morbus- Crohn-Patienten konnte die Arbeitsgruppe eine erhöhte Expression des NKR1 im myenterischen Plexus ermitteln. Bei Patienten mit ulzerativer Colitis fiel eine verminderte Expression des Rezeptors in Kolon-Epithelzellen im Vergleich zu gesunden Individuen auf.
Die Autoren vermuten eine Herabregulation des Rezeptors aufgrund erhöhter Substanz-P- Sekretion bei ulzerativer Colitis.
2.4.2 Erkrankungen der Atemwege
Bei Asthma-Patienten konnten vermehrt Substanz-P-haltige Nervenfasern in der Submukosa von Bronchien sowie eine erhöhte Menge von Substanz P aus Lungengewebe und Bronchio- Alveolären-Lavagen (BAL) nachgewiesen werden (OLLERENSHAW et al. 1991; NIEBER et al. 1992; LILLY et al. 1995). Substanz P und Neurokinin A werden als potente Mitogene für glatte Muskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten beschrieben, und mit der Dickenzunahme der Atemwege bei Asthma in Verbindung gebracht (KUWANO et al.
1993; HARRISON et al. 1995; KIM et al. 1995). In den Epithelzellen des Respirationstrakts von Asthmatikern wurde eine erhöhte Expression von Substanz P und NKR1 gemessen (ADCOCK et al. 1993; CHU et al. 2000). Das in Speichel und Bronchialsekret von Asthmatikern erhöhte Zytokin IL-1β verursacht eine Hyperreagibilität der Atemwege (BORISH et al. 1992; BROIDE et al. 1992). In Studien von WU et al. (2002) konnte gezeigt werden, dass IL-1β zu einer vermehrten Freisetzung von Substanz P in Neuronen und glatter Muskulatur der Atemwege führt und dadurch die Hyperreagibilität vermittelt.
Eine Beteiligung von Substanz P an der Immunantwort bei Virus-Erkrankungen der Atemwege wird ebenfalls diskutiert. TRIPP et al. (2002) konnten eine verstärkte Expression des Substanz-P-Rezeptors auf CD4-positiven T-Zellen nach Infektion mit Para- influenzavirus 3 und Respiratorischem Synzytialvirus feststellen. In Tierversuchen führten Infektionen mit dem Respiratorischen Synzytialvirus zur verstärkten Expression von NKR1 in Lungengewebe von Ratten (KING et al. 2001). Die Behandlung von Meerschweinchen mit einem NKR1-Antagonisten bei Infektionen mit Parainfluenzaviren konnte die Einwanderung von Makrophagen in das Lungengewebe sowie die Hyperreagibilität der Bronchien hemmen (JACOBY et al. 2000).
Chronischer Raucherhusten wird mit einer vermehrten Synthese und Freisetzung von Substanz P in Neuronen der Lunge und oberen Atemwege in Verbindung gebracht (KWONG et al. 2001). Mehrere Studien belegen, dass eine Freisetzung von Substanz P durch Zigarettenrauch die Adhäsion von Leukozyten an der Tracheal-Schleimhaut induziert und die Aktivität der neutralen Endopeptidase herabsetzt (DUSSER et al. 1989; BALUK et al. 1996).
2.4.3 Arthritis
Eine Beteiligung von Substanz P an der Entstehung von rheumatoider Arthritis wird schon seit längerer Zeit diskutiert. Die rheumatoide Arthritis (RA) ist durch eine chronische Entzündung der Gelenke charakterisiert, die mit der Infiltration und Anhäufung von aktivierten Immunzellen, hauptsächlich T-Zellen, Monozyten, Makrophagen und Plasmazellen einhergeht. Durch die hauptsächlich von T-Zellen und Monozyten ausgeschütteten Zytokine kommt es zu einer fortschreitenden Zerstörung von Knorpel und Knochen (FELDMANN et al. 1996). LEVINE et al. (1984) ermittelten in Tierversuchen, dass Sprunggelenke, die zu schweren Arthritiden neigen, dichter mit Substanz-P-haltigen Nervenfasern innerviert waren als Kniegelenke, die in der Regel nur milde Arthritiden entwickeln. Außerdem führte eine Injektion von Substanz P in Kniegelenke von Ratten zu einer Verschlimmerung der Arthritis, während ein Antagonist diesen Effekt nicht auslösen konnte. Bei humanen Synoviozyten führte Substanz P zu Zell-Proliferation und zur Freisetzung von Prostaglandin E2 und Collagenase (LOTZ et al. 1987). Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis konnten außerdem erhöhte Gehalte des Neuropeptids in Gelenkflüssigkeit und Serum gemessen werden (MARSHALL et al. 1990; MENKES et al.
1993). Erhöhte Gehalte von Substanz P wurden auch in Kniegelenken von Kaninchen gemessen, denen die pro-inflammatorischen Zytokine IL-1β oder TNF-α injiziert wurden (O'BYRNE et al. 1990). KRAUSE et al. (1995) konnten feststellen, dass Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Arthritis den Substanz-P-Rezeptor NKR1 exprimieren, während er bei Synoviozyten von gesunden Individuen nicht ausgebildet wird. Bei Monozyten isoliert aus Patienten mit RA führte eine Stimulation mit Substanz P zu einer vermehrten Produktion von TNF-α im Vergleich zu Monozyten von gesunden Individuen (LAVAGNO et al. 2001).
Bei bakteriell ausgelösten Arthritiden konnte im Tiermodell gezeigt werden, dass eine Blockade des NKR1 die Eliminierung der Bakterien verschlechterte und zu stärkeren Läsionen im Gelenk führte (VERDRENGH u. TARKOWSKI 2008).
2.5 Die Bedeutung von Substanz P beim Rind
Bisher wurden nur wenige Studien durchgeführt, die sich mit der Bedeutung von Substanz P im bovinen Organismus beschäftigen. NISHI et al. (2000) untersuchten die Verteilung von Substanz-P-haltigen Nervenfasern im Respirationstrakt von Kälbern und adulten Rindern. Die Arbeitsgruppe konnte vom nasalen Bereich der Atemwege bis in die Lunge SP-haltige Nervenfasern detektieren, die bei Kälbern zahlreicher waren als bei adulten Tieren. SP-haltige Nervenfasern wurden hauptsächlich in Epithelien und in darunter gelegenem Bindegewebe sowie um Blutgefäße und in den Drüsen des gesamten Respirationstrakts gefunden. Sie waren jedoch in der glatten Muskulatur nur spärlich ausgeprägt. Auch in den myenterischen Ganglien des Pansens von Rindern, Schafen und Damwild konnte Substanz P nachgewiesen werden (MUNNICH et al. 2008).
Hinweise auf eine Beteilgung von Substanz P an der Schmerzübertragung bei Rindern gibt eine Studie von COETZEE et al. (2008). Die Arbeitsgruppe konnte bei frisch kastrierten Kälbern erhöhte Substanz-P-Gehalte im Serum messen, deren Höhe positiv mit der Stärke der Schmerz-Lautäußerung der Tiere korrelierte.
Auch in nicht neuronalen Zellen konnten Substanz P und sein Rezeptor beim Rind nachgewiesen werden. Die mRNA von Substanz P und dem NKR1 konnte in bovinen Lutealzellen und ovariellen Makrophagen gemessen werden (REIBIGER et al. 2001;
BRYLLA et al. 2005). Die Autoren vermuten eine Beteiligung von Substanz P an der Entwicklung des bovinen Gelbkörpers im frühen Stadium.
ROGERS et al. (2006) untersuchten den immunmodulatorischen Effekt von Substanz P auf bovine Alveolarmakrophagen. Die Arbeitsgruppe konnte den hauptsächlichen Substanz P- Rezeptor NKR1 auf diesen Zellen nachweisen. Eine Aktivierung boviner Alveolar- makrophagen mit Substanz P (1x10-9 mol/L) führte zu einer leichten Erhöhung der Phagozytose-Aktivität und zu einer vermehrten Produktion von TNF-α.
Zusammenfassend kann angenommen werden, dass Substanz P auch beim Rind von Zellen des peripheren Nervensystems gebildet wird und an der Regulation von Organfunktionen des Respirationstrakts und des Gastrointestinaletrakts sowie an der Schmerzweiterleitung beteiligt ist. Es gibt außerdem Hinweise auf ein immunmodulatorisches Potential von Substanz P.
3 Geräte, Material und Methoden
3.1 Geräte
Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, „Typ RO 50/14SMB Typ I“
(Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel) Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System
Typ SG-RS90-4 UF“ (Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel) Autoklav Typ GE406 (Getinge AB, Getinge/Schweden)
Biometra T-Gradient (biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen)
BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg)
Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 (Heraeus, Hanau)
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Wartewig (6.001.000), Göttingen) Centricon®– Filtrationssystem (Amicon, Beverly/MA, USA)
CO2-Flasche zur Sterilfiltration (Kohlensäurewerke Hannover, Hannover) Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel
pressure vessel“
(Alloy Products (XX670053) Wisconsin, USA)
Eismaschine Typ UBE 30-10 (Ziegra, Isernhagen) Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan®, mit
angeschlossener Computereinheit (Becton Dickinson, Heidelberg) Fluoreszenzmikroskop Eclipse 80 i mit
Phasenkontrasteinrichtung (Nikon GmbH, Düsseldorf) Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ (Heraeus, Hanau)
Heizblock Techne Dir-Block DB.3 (Thermo Dux, Wertheim)
Invertmikroskop (Zeiss, Oberkochen)
Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) (Einzelhandel) Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor,
Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor
(Heraeus Instruments, Osterode)
Laborfeinwaage „B6“ (Mettler, Zürich/Schweiz)
Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ (Knick, Berlin)
Laborwaage „BL310“ (Sartorius GmbH, Göttingen)
MACS®MultiStand Metallständer (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) Magnetrührer mit Heizplatte (Janke und Kunkel, Staufen)
Microcomputer Gelelktrophoresis power supply consort (Keutz Laborgeräte, Reiskirchen) MIDI MACSTM Separations-Einheit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) Mini-Sub® Cell GT Gelelektrophorese-Kammer (BioRad Laboratories GmbH, München)
