3 Geräte, Material und Methoden
5.4 Ausblick
Die vorliegende Arbeit sollte möglichst breit gefächert eine Charakterisierung der modulatorischen Wirkung von Substanz P auf bovine Immunzellen liefern. Zum überwiegenden Teil wurden die bearbeiteten Fragestellungen noch nicht beim Rind untersucht. Die zentralen Ergebnisse dieser Arbeit liegen in der Modulation boviner Granulozyten und Makrophagen. Substanz P ist in der Lage bovine PMN zu aktivieren. Eine Ausdifferenzierung von Makrophagen in Anwesenheit von Substanz P verstärkt die Bildung von Mediatoren, die zentral für die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten sind und deren Lebensspanne verlängern. Diese Ergebnisse legen einen maßgeblichen Einfluss von Substanz P bei der Ausbildung der Immunantwort während der initialen Phase einer Entzündung nahe.
Die Untersuchungen auf zellulärer Ebene zeigten eine individuell unterschiedliche Reaktionsbereitschaft von neutrophilen Granulozyten auf Substanz P. Weiterführende Studien sollten der wiederholt beobachteten Individualität zellulärer Reaktionen stärker Rechnung tragen und genauer prüfen, inwieweit eine In-vivo-Voraktivierung der Zellen bereits stattgefunden hat. Dies schließt eine breiter gefächerte Analyse möglicher Entzündungsmediatoren im Blut mit ein. Die Wirkung von Substanz P auf bovine Thrombozyten ist ein weiterer viel versprechender Aspekt des immunmodulatorischen Potentials von Substanz P, der in dieser Arbeit gegen Ende nur ansatzweise und exemplarisch untersucht werden konnte. Hier gilt es genauer zu analysieren, wie sich Art und Dauer der Thrombozytenaktivierung durch Substanz P von einer Aktivierung durch physiologische (Thrombin, ADP) und bakterielle Produkte (z.B. LPS) unterscheidet.
Neutrophile Granulozyten und Makrophagen stellen die Haupteffektorzellen zu Beginn der bovinen Mastitis dar. Die Fähigkeit von Substanz P, Anzahl und Funktion dieser Haupteffektorzellen zu modulieren, lässt das Neuropeptid als guten Kandidaten für einen therapeutischen oder prophylaktischen Behandlungsansatz erscheinen. In der Humanmedizin wird vermehrt der Einsatz von Substanz-P-Antagonisten diskutiert, um bei chronischen Entzündungen wie rheumatoider Arthritis und Inflammatory Bowel Disease die Immunantwort zu modulieren (LAVAGNO et al. 2001; KOON u. POTHOULAKIS 2006).
JACOBY et al. (2000) liefern einen Ansatz für einen möglichen therapeutischen Nutzen von SP-Antagonisten bei Viruserkrankungen des Respirationstrakts. BOOT et al. (2007) bewerten den Einsatz von SP-Antagonisten bei allergischem Asthma jedoch kritisch. Die Arbeitsgruppe
konnte bei multiplen Anwendungen eine verstärkte allergen-induzierte Reaktion der Atemwege beobachten. Die vorliegenden Ergebnisse aus den In-vivo-Versuchen am Mastitismodell legen sowohl therapeutische als auch prophylaktische Anwendungsmöglichkeiten für Substanz-P-Antagonisten nahe. Für die weitere Entwicklung therapeutischer oder prophylaktischer Konzepte beim Rind ist der Zusammenhang zwischen SP-Sekretion und Rezeptorregulation in der frühen Phase der E.-coli-Masitis ein entscheidender Punkt und sollte daher in weiterführenden Studien geklärt werden.
6 Zusammenfassung
Anja Sipka Charakterisierung der immunmodulatorischen Wirkung des Neuro-mediators Substanz P auf bovine Immunzellen
Eine Dysregulation der Immunantwort ist bei Milchkühen in der peripartalen Periode häufig die Ursache für schwerwiegende Mastitiden. Über den neuroendokrinen Regelkreis greifen Neuromediatoren in die Steuerung des Entzündungsgeschehens maßgeblich mit ein. Das Neuropeptid Substanz P wirkt modulatorisch auf humane und murine Immunzellen, und wird mit der Pathophysiologie verschiedener entzündlicher Erkrankungen beim Menschen in Verbindung gebracht. Die Auswirkungen von Substanz P auf das bovine Immunsystem sind bisher nur sehr wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Expression und Regulation des hauptsächlichen Substanz-P-Rezeptors NKR1 beim Rind sowie die Modulation boviner Immunzellen durch Substanz P untersucht.
Die Expression und Regulation des NKR1 wurde mittels quantitativer rt-PCR in Eutergewebeproben aus zwei konzeptionell unterschiedlichen Mastitismodellen analysiert.
Während die mRNA-Expression bei mit S. aureus infizierten Tieren unbeeinflusst auf dem Niveau nicht-infizierter Tiere blieb, konnte in beiden Tiermodellen bei den mit E. coli infizierten Tieren frühestens nach 24 Stunden eine systemische Herabregulation der mRNA-Expression um mehr als das 10-fache festgestellt werden. Somit konnte reproduzierbar eine Regulation des hauptsächlichen Substanz-P-Rezeptors während der initialen Phase einer akuten Mastitis in vivo demonstriert werden.
Die Expression des NKR1 konnte überdies in Lymphozyten-Subpopulationen, Granulozyten, Monozyten und in in-vitro-differenzierten Makrophagen (MdM) nachgewiesen werden. Eine 3-stündige Stimulation mit Lipopolysaccharid in vitro war nicht in der Lage das NKR1-Expressionsniveau in Monozyten und in MdM zu verändern. Dies stützt die aus den In-vivo-Modellen erhaltenen Ergebnisse, die ebenfalls keine Beeinflussung der Rezeptor-Regulation innerhalb der ersten 6 Stunden einer E.-coli-Mastitis zeigten.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der modulatorische Einfluss von Substanz P auf funktionelle Eigenschaften von Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und in vitro generierter Makrophagen untersucht.
Die Superantigen-induzierte Proliferation boviner Lymphozyten wurde durch Substanz P in einem breiten Konzentrationsbereich (1x10-8 - 1x10-12 mol/L) gehemmt. Dieser nach 6 Tagen In-vitro-Kultur auftretende Effekt ist vermutlich auf eine initiale Aktivierung monozytärer Zellen und eine darauf folgende Produktion proliferations-hemmender Mediatoren zurückzuführen.
Gemessen am intrazellulären Calcium-Einstrom konnte Substanz P (3x10-6 mol/L) bei der Hälfte der untersuchten Tiere neutrophile Granulozyten direkt aktivieren. Da die Zellen aller Tiere in gleichem Maße auf das Chemokin CXCL8 reagierten, lässt dies darauf schließen, dass individuelle Faktoren die Stimulierbarkeit durch Substanz P beeinflussen. Bei keinem der beiden Phänotypen konnte eine Vorinkubation mit Substanz P den nachfolgenden CXCL8-induzierten Calcium-Einstrom verstärken.
Substanz P hatte im Konzentrationsbereich von 1x10-8 - 1x10-12 mol/L keinen Einfluss auf die konstitutive Absterberate von neutrophilen Granulozyten (PMN). Auch das nach Stimulation mit LPS durch mononukleäre Zellen vermittelte, akzelerierte Sterben neutrophiler Granulozyten wurde in Anwesenheit von Substanz P nicht beeinflusst. Substanz P erwies sich überdies als nicht direkt chemotaktisch aktiv für bovine neutrophile Granulozyten. Allerdings wurde die CXCL8-induzierte Migration neutrophiler Granulozyten in Anwesenheit von Substanz P transient gehemmt. Hierfür könnte eine Aggregatbildung zwischen neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten verantwortlich sein, da fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden konnte, dass SP zur Aktivierung von Thrombozyten (gemessen an der P-Selektin-Expression) und deren Bindung an PMN führt. Ob dieses Phänomen auch in vivo zur Hemmung der Migration von neutrophilen Granulozyten beiträgt, sollte in weiterführenden Studien geklärt werden.
Die Anwesenheit von Substanz P (1x10-6-1x10-8mol/L) während der Monozyten-differenzierung erhöhte signifikant die Basisexpression von Chemokinen, die zentral für die Rekrutierung und Aktivierung von Granulozyten und Monozyten sind (CXCL8, CCL5), sowie die Expression von IL-1β, einem klassischen pro-inflammatorischen Zytokin.
Makrophagen, die in Anwesenheit von Substanz P kultiviert wurden, zeigten nach einer Stimulation mit LPS eine signifikant höhere Expression von CXCL8 und IL-1β, während in Monozyten unter SP-Einfluss nach LPS-Stimulation nur CCL5 signifikant herauf reguliert wurde. Kulturüberstände in vitro aktivierter MdM, die in Gegenwart von Substanz P
ausdifferenzierten wirkten chemotaktisch auf PMN und hemmten sowohl die Apoptose als auch die Nekrose von neutrophilen Granulozyten. Dies belegte indirekt die funktionelle Bedeutung des durch Substanz P veränderten Expressionsmusters auf mRNA-Ebene.
Insgesamt konnte eine hauptsächlich pro-inflammatorische Wirkung von Substanz P auf bovine Immunzellen gezeigt werden. Substanz P kann durch die Förderung der Aktivierung und der Rekrutierung neutrophiler Granulozyten sowie durch die Modulation des exprimierten Mediatorspektrums von Makrophagen einen Einfluss auf entscheidende Prozesse in der initialen Phase der Mastitis nehmen. Die Eigenschaften dieses Neuropeptids bieten somit potentielle Ansatzpunkte für prophylaktische oder therapeutische Konzepte zur Bekämpfung der bovinen Mastitis.
7 Summary
Anja Sipka: Charakterization of modulatory properties of the neuromediator substance P on cells of the bovine immune system
Dairy cows are particularly susceptible to severe mastits during the perparturient period which is associated with an impaired regulation of the immune response. Neuromediators have a decisive influence on inflammatory processes via the neuro-endocrine regulation circuit. The neuropeptide substance P modulates human and murine immune cells and is involved in the pathophysiology of several inflammatory diseases in human. Thus far the effects of substance P on cells of the bovine immune system are widely unknown. The aim of the present study was therefore to evaluate the expression and regulation of the main substance-P-receptor NKR1 in cattle as well as the modulatory properties of substance P on bovine immune cells.
Expression and regulation of the main substance-P-receptor NKR1 was analyzed by quantitative rtPCR in mammary gland tissue obtained from two distinct mastits models.
While mRNA-expression of S. aureus infected animals was on the same level as in healthy subjects, animals infected with E. coli showed a systemic, more than 10-fold decrease of mRNA-expression after 24 hours post infection in both models. This reproducibly demonstrates a regulation of the main substance-P-receptor during the initial phase of acute mastits in vivo.
Moreover the expression of NKR1 was detected in subsets of lymphocytes, granulocytes, monocytes and in-vitro-generated macrophages (MdM). Stimulation of monocytes and MdM with lipopolysaccahrid (LPS) for 3 hours did not alter the expression-level of NKR1, supporting similar findings obtained during the first 6 hours of E. coli mastitis from the in vivo model.
The second part of the study focused on the modulatory influence of substance P on the function of lymphocytes, granulocytes, monocytes and in-vitro-generated macrophages.
Superantigen-induced proliferation of bovine lymphocytes was inhibited in the presence of substance P in concentrations from 1x10-12 to 1x10-8 mol/L after 6 days of in-vitro-culture.
Underlying cause may be a substance P mediated activation of monocytes resulting in the production of mediators that inhibited the proliferation of lymphocytes.
In neutrophil granulocytes substance P (3x10-6 mol/L) was shown to directly activate the cells of 50% of the tested animals using the intracellular calcium-influx as read-out-system.
Stimulation of the cells with the chemokine CXCL8 resulted in a homogenous activation, indicating the possibility of individual differences in the response to substance P. The pre-incubation with substance P did not increase the CXCL8-induced calcium-influx in any of the two groups of responders.
In a concentration-range of 1x10-8-1x10-12 mol/L substance P showed no influence on constitutive cell death of PMN. Also the accelerated death of PMN, mediated by mononuclear cells after LPS-stimulation, was not altered by substance P. Moreover substance P showed no direct chemoattractant properties on neutrophil granulocytes. However CXCL8-induced migration of PMN was transiently inhibited in the presence of substance P. This effect is possibly due to the interaction of PMN with platelets; hence substance P caused the formation of cell-aggregates between activated platelets and PMN as demonstrated with fluorometric microscopy analyses. Further studies should be performed to clarify wether this phenomenon could also be responsible for reduced migration of neutrophil granulocytes in vivo.
In MdM generated in the presence of substance P (1x10-6-1x10-8 mol/L) mRNA-expression of chemokines, which are crucial for the attraction and activation of granulocytes and monocytes (CXCL8, CCL5) as well as the expression of IL-1β, a classically pro-inflammatory cytokine were significantly elevated. After stimulation with LPS, MdM generated in the presence of substance P showed an elevated expression of CXCL8 and IL-1β, while in SP-influenced monocytes only the expression of CCL5 was significantly up-regulated after LPS-stimulation.
In addition, supernatants of MdM culutered in the presence of substance P induced neutrophil migration and ihibited both necrosis and apoptosis of neutrophil granulocytes. Thus, it can be assumed that the modulation of the expression pattern of chemokines and cytokines by substance P has functional relevance for the attraction and activation of immune cells.
In general a pro-inflammatory influence of substance P on bovine immune cells could be demonstrated. Substance P may influence the initial phase of bovine mastitis by activation and recruitment of neutrophil granulocytes and modulation of resident macrophages. Thus, the properties of this neuropeptide provide potential starting points to develop new concepts for prophylaxis and therapy in bovine masitis.
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