Regulation von Chemokinen und Zytokinen

Monozyten

Bovine Monozyten wurden nach der MAC-Separation und einer 24stündigen Ruhephase mit SP (1x10^-6 mol/L, 1x10^-8 mol/L, 1x10^-10 mol/L und 1x10^-12 mol/L) inkubiert und über 3 Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. In der qRT-PCR wurde die Anzahl der mRNA-Kopien von verschiedenen Chemokinen und Zytokinen ermittelt (3.3.12.3). Außerdem wurden stimulierte und unstimulierte Ansätze zueinander ins Verhältnis gesetzt und so das Vielfache der Expression durch die LPS-Stimulation berechnet.

Bei Betrachtung der Chemokin-Regulation in den unstimulierten Ansätzen fällt eine relativ starke Streuung der Anzahl von Kopien durch die Inkubation mit Substanz P im Vergleich mit der Medium-Kontrolle auf (Abb. 25). Eine statistisch signifikante Hochregulation ergab sich für CCL5 bei der SP-Konzentration 1x10^-6 mol/L und für CXCL8 bei Substanz P 1x10^-8 mol/L (p≤0,05). Bei mit LPS stimulierten Ansätzen fand eine signifikante (p≤0,05) Hochregulation der Expression von CXCL1 und CCL5 um das 4- (CXCL1) bis 8-fache (CCL5) statt. Die Expression von CXCL8 wurde durch LPS nicht signifikant hochreguliert.

Im Vergleich zum nur mit LPS stimulierten Ansatz wurde durch eine Inkubation mit Substanz P (1x10^-8 mol/L) die Expression von CCL5 signifikant hochreguliert (p≤0,05). Die Expression von CXCL1 in LPS-stimulierten Monozyten wurde durch die Anwesenheit von SP (1x10^-8 mol/L, 1x10^-10 mol/L und 1x10^-12 mol/L) erhöht, die Unterschiede waren jedoch nicht statistisch signifikant. Ein Effekt von Substanz P auf die CXCL8-Expression nach

Auch bei den beiden untersuchten Zytokinen TNF-α und IL-1β wurde bei den mit SP inkubierten Monozyten eine starke Streuung der Kopienanzahl im Vergleich zur Medium-Kontrolle beobachtet (Abb. 26). Eine statistisch signifikante Beeinflussung der mRNA-Expression durch Substanz P konnte nicht gezeigt werden. Durch die Stimulation mit LPS wurde die Expression von IL-1β im Mittel um das 8-fache (8 ± 1), die von TNF-α um das 15-fache (15 ± 4) gesteigert. In beiden Fällen war die Hochreguation statistisch signifikant (p≤0,05). Bei einer zusätzlichen Inkubation der Monozyten mit Substanz P (1x10^-6 mol/L) wurde die Expression von IL-1β nur um das 4-fache (4 ± 1) gesteigert. Somit kommt es bei Monozyten durch die Inkubation mit Substanz P zu einer wenn auch nicht statistisch signifikanten so doch stärkeren Basisexpression von IL-1β, die durch eine Stimulation mit LPS in schwächerem Maße heraufreguliert als im Kontrollansatz.

CCL5

Abb. 25: Chemokin-Expression in Monozyten unter dem Einfluss von Substanz P und LPS.

Monozyten (n=6) wurden nach 24-stündiger Ruhephase mit SP (1x10^-6 mol/L (SP-6), 1x10^-8 mol/L (SP-8), 1x10^-10 mol/L (SP-10) und 1x10^-12 mol/L (SP-12)) inkubiert und über 3 Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Chemokine CCL5, CXCL1 und CXCL8 ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben (* p≤0,05).

TNF α

Abb. 26: Zytokin-Expression in Monozyten unter dem Einfluss von Substanz P und LPS.

Monozyten (n=6) wurden nach 24-stündiger Ruhephase mit SP (1x10^-6 mol/L (SP-6), 1x10^-8 mol/L (SP-8), 1x10^-10 mol/L (SP-10) und 1x10^-12 mol/L (SP-12)) inkubiert und über 3 Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Zytokine TNF-α und IL-1β ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben. Die Zytokinexpression wurde durch SP nicht signifikant beeinflusst.

Makrophagen

Aus Monozyten wurden in vitro über 7 Tage Makrophagen (MdM) generiert. Diese Ausdifferenzierung fand in Anwesenheit von Substanz P (1x10^-6 mol/L und 1x10^-8 mol/L) oder in Abwesenheit von Substanz P statt. Nach Abschluss der Ausdifferenzierung wurden die Zellen über 3 Stunden mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder als unstimulierte Kontrolle belassen. Wie bei den Monozyten wurden auch für die MdM die Anzahl der Kopien und das Vielfache der Expression nach Stimulation mit LPS berechnet.

Eine Ausdifferenzierung von MdM in Anwesenheit von Substanz P (1x10^-6 mol/L) führte zu einer Hochregulation der untersuchten Chemokine (Abb. 27). Im Vergleich zur Medium-Kontrolle war die Expression von CXCL1 nur schwach erhöht, für CCL5 und CXCL8 war die Steigerung deutlich und statistisch signifikant (p≤0,05). Auffällig war, dass die Anzahl der mRNA-Kopien weniger stark streuten als bei den Monozyten. Eine Stimulation mit LPS führte bei den MdM bei allen untersuchten Chemokinen zu einer statistisch sigifikanten Hochregulation der mRNA-Expression (p≤0,05). Eine Ausdifferenzierung unter Einfluss von Substanz P führte nach Stimulation mit LPS ebenso zu einer stärkeren Streuung der mRNA-Kopienanzahlen der Chemokine. Die Expression von CXCL8 nach LPS-Stimulation wurde durch die Ausdifferenzierung in Anwesenheit von SP (1x10^-6 mol/L und 1x10^-8 mol/L) signifikant erhöht im Vergleich zu LPS-Stimulierten MdM ohne SP-Ausdifferenzierung (Abb.

27) (p≤0,05). Betrachtet man die Expression von CCL5 nach Stimulation mit LPS in MdM, so wurde diese durch die Anwesenheit von Substanz P während der Ausdifferenzierung nicht erhöht im Vergleich zum Kontrollansatz. Es fiel jedoch auf, dass das Vielfache der Expression in den unter SP-ausdifferenzierten MdM deutlich geringer ausfiel als in den Kontrollansätzen. Die durch die Anwesenheit von SP erhöhte Basisexpression wurde durch die Stimulation mit LPS nicht im gleichen Maße verstärkt wie in den ohne SP-Einfluss ausdifferenzierten MdM.

Die Expression von TNF-α wurde durch eine Ausdifferenzierung mit Substanz P nicht signifikant beeinflusst. In LPS-stimulierten MdM konnte für beide Zytokine im Vergleich zu unstimulierten MdM eine siginifkant höhere mRNA-Expression gemessen werden (p≤0,05).

Bei IL-1β wurde durch Substanz P (1x10^-6 mol/L) sowohl bei stimulierten als auch bei unstimulierten MdM eine signifikante Steigerung der Expression gemessen (Abb. 28) (p≤0,05).

CCL5

Abb. 27: Chemokin-Expression in MdM nach Ausdifferenzierung unter Substanz P-Einfluss und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).

MdM (n=6) wurden nach Ausdifferenzierung über 7 Tage in Ab- und Anwesenheit von SP (1x10^-6 mol/L (SP-6) und 1x10^-8 mol/L (SP-8)) mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Chemokine CCL5, CXCL1 und CXCL8 ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben (* p≤0,05).

TNF-α

Abb. 28: Zytokin-Expression in MdM nach Ausdifferenzierung unter Sbstanz P-Einfluss und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).

MdM (n=6) wurden nach Ausdifferenzierung über 7 Tage in Ab- und Anwesenheit von SP (1x10^-6 mol/L (SP-6) und 1x10^-8 mol/L (SP-8)) mit LPS (1 µg/mL) stimuliert oder unstimuliert belassen. Die mRNA-Expression der Zytokine TNF-α und IL-1β ist in der Anzahl der Kopien in 50 ng Gesamt-RNA angegeben (* p≤0,05).