Expression und Regulation des Substanz P-Rezeptors in vivo und in vitro

Von den drei bekannten Tachykinin-Rezeptoren bindet Substanz P mit höchster Affinität an den Neurokinin-Rezeptor 1 (NKR1). Die Neurokinin-Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, deren Genregulation im Allgemeinen mit einer geringen Menge mRNA-Transkripten in der Zelle verbunden sind (O'CONNOR et al. 2004).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation des NKR1 als hauptsächlicher Rezeptor für Substanz P mittels quantitativer real time PCR (qrtPCR) bestimmt. Die In-vivo-Regulation wurde in Eutergewebe gesunder oder mit E. coli bzw. S. aureus infizierter Kühe untersucht. Eine Expression und Regulation des SP-Rezeptors in Immunzellen wurde anhand in-vitro-generierter Leukozyten-Subpopulationen überprüft.

4.1.1 Rezeptorexpression in vivo

Zur Überprüfung der In-vivo-Expression des NKR1 wurde Eutergewebe aus zwei verschiedenen, zeitlich und räumlich getrennt durchgeführten Mastitismodellen retrospektiv untersucht.

Das erste Tiermodell wurde an der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover nach PETZL (2005) durchgeführt, die Gewebeproben wurden am Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) Dummerstorf analysiert. Dabei wurden klinisch gesunde, laktierende Kühen sequentiell mit E. coli (500 CFU) oder S. aureus (10000 CFU) infiziert. Nach 24 Stunden wurden die Tiere geschlachtet und aus den vier Vierteln Gewebeproben entnommen, die entweder über 24 h, 12 h oder 6 h infiziert waren oder aus dem mit Kochsalzlösung behandelten Placeboviertel stammten. Bei den mit E. coli infizierten Tieren lag die Anzahl der Kopien für den NKR1 bei allen drei Infektionszeiten und im Placeboviertel im selben Bereich um etwa 50 Kopien in 75 ng Gesamt-RNA (Abb. 12).

Die mit S. aureus infizierten Tiere zeigten dagegen eine um mehr als das zehnfach höhere

Expression des NKR1, die sich ebenfalls nicht innerhalb der verschiedenen Infektionszeiten und von der des Placeboviertels unterschied (Abb. 12).

50

Anzahl Kopien in 75ng Gesamt-RNA

Abb. 12: Expression des Substanz-P-Rezeptors (NKR1) nach sequentieller Infektion von Eutervierteln mit E. coli und S. aureus.

Dargestellt ist die mRNA-Expression von NKR1 (Anzahl Kopien in 75 ng Gesamt-RNA, Mittelwerte ± SEM) in Eutergewebe sequentiell mit E.coli (500 CFU intramammär) oder S. aureus (10000 CFU intramammär) infizierter Tiere. Die einzelnen Viertel waren jeweils über 24 h (vorne rechts), 12 h (hinten rechts) oder 6 h (hinten links) infiziert oder als Placeboviertel (0 h) mit NaCl behandelt. Die Anzahl der Tiere betrug für E. coli 0 h und 24 h n=4, 6 h und 12 h n=2, für S. aureus 0 h und 12 h n=7, 6 h und 24 h n=3.

Das zweite Mastitismodell wurde nach MEYER (2008) an der Klinik für Wiederkäuer der LMU München durchgeführt, die Proben wurden am Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere (FBN) Dummerstorf analysiert. Dabei wurde Eutergewebe von gesunden laktierenden Kühen (Goldstandard) und von Kühen, die experimentell entweder für 6 oder für 24 Stunden mit E. coli (500 CFU) infizierten wurden, gewonnen. Durch das angewandte Modell konnten systemische Effekte auf unbehandelte und mit einem Placebo (physiologische Kochsalzlösung, NaCl) behandelte Euterviertel untersucht werden.

Im Eutergewebe gesunder Tiere konnte der NKR1 mit einer Basisexpression von 2797 ± 293 Kopien in 75 ng Gesamt-RNA nachgewiesen werden (Abb. 13). Bei den infizierten Tieren lag die Expression von NKR1 nach 6 Stunden auf einem ähnlichen Niveau wie bei gesunden Tieren. Auch in den Placebo- und Kontroll-Vierteln konnte keine Veränderung der Expression im Vergleich zum infizierten Viertel oder zu gesunden Tieren festgestellt werden.

Nach 24-stündiger Infektion mit E. coli kam es zu einer hoch signifikanten Reduktion der NKR1-Expression in den infizierten Vierteln um etwa den Faktor 10. Auch im Gewebe der Placebo- und Kontroll-Viertel kam es nach 24 Stunden zu einer hoch signifikanten Reduktion der Expression in derselben Größenordung wie in den infizierten Vierteln (Abb. 13).

E. coli Kontrolle

Anzahl Kopien in 75ng Gesamt-RNA

** ** **

Placebo

Goldstandard Infiziertes Viertel

Kontrollviertel Placeboviertel 500

1000 1500 2000 2500 3000 3500

nicht infiziert 6 h infiziert 24 h infiziert

Abb. 13: Expression des Substanz P-Rezeptors (NKR1) in Eutergewebe gesunder und mit E. coli infizierter Kühe.

Dargestellt ist die mRNA-Expression von NKR1 (Anzahl Kopien in 75 ng mRNA, Mittelwerte ± SEM) in Eutergewebe nicht-infizierter, gesunder Kühe (‚Goldstandard‘, n=6) und über 6 h oder 24 h infizierter (E. coli, 500 CFU intra-mammär) Kühe (n=5) mit je einem infizierten Viertel, einem Placebo-Viertel (NaCl intra-mammär) und zwei unbehandelten Kontroll-Vierteln. Angegebene Signifikanzen beziehen sich auf den Goldstandard-Wert (**: p≤0,01).

4.1.2 Rezeptorexpression in einzelnen Leukozyten-Subpopulationen in vitro

Zur Prüfung der Rezeptor-Regulation in unterschiedlichen Leukozyten-Subpopulationen wurden aus bovinen Blutleukozyten reine PMN, Lymphozyten (CD14-negative Zellen nach MAC-Separation), Monozyten (CD14-positiveZellen nach MAC-Separation) und MdM generiert. Die vier verschiedenen Subpopulationen wurden mittels qrtPCR auf ihre Basis-Expression von NKR1 überprüft (3.3.12.3). Für Monozyten und MdM wurde außerdem noch die Rezeptor-Regulation nach Stimulation mit LPS überprüft.

Alle vier untersuchten Leukozytensubpopulationen exprimierten die mRNA des Rezeptors in unstimuliertem Zustand. In Monozyten und MdM war der Rezeptor ungefähr um den Faktor 10 schwächer exprimiert als in Lymphozyten und Granulozyten (Tab. 8).

Nach dreistündiger Stimulation von Monozyten und MdM mit LPS (1 µg/mL) konnte keine Expressionsmodulation des NKR1 festgestellt werden (Abb. 14).

Tab. 8: Expression des Substanz P Rezeptors (NKR1) in unstimulierten Leukozytensubpopulationen.

Zelltyp mRNA-Kopien¹

Lymphozyten² 3055 ± 913

Granulozyten 1994 ± 92

Monozyten³ 281 ± 37

Makrophagen⁴ 381 ± 49

1) in 50 ng Gesamt-RNA Mittelwert ± SEM: Lymphozyten und Granulozyten n=3 Tiere; Monozyten und Makrophagen n=6 Tiere; 2) negative Zellen nach MAC-Separation (s.3.3.1); 3) CD14-positive Zellen nach MAC-Separation; 4) aus Blutmonozyten generierte Makrophagen.

Anzahl Kopien in 50 ng Gesamt-RNA

Monozyten

Monozyten+LPS

MdM

MdM + LPS 0

100 200 300 400 500 600 700 800

Abb. 14: Expression des NKR1 in Monozyten und Makrophagen (MdM) in unsti-mulierten Zellen und nach LPS-Stimulation.

Dargestellt ist die mRNA-Expression (in 50 ng Gesamt-RNA) des NKR1 in Monozyten und MdM in unstimuliertem Zustand und nach 3 Stunden Stimulation mit LPS (1 µg/mL). Die Box Plots enthalten Daten von 6 Tieren.

4.2 Modulatorische Wirkung auf die Proliferation mononukleärer