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Charakterisierung der immunmodulatorischen Wirkung von Mistelpräparaten auf
Zellen des Immunsystems von Rindern
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Angelika Fischer
aus Braunschweig
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. W. Löscher
Tag der mündlichen Prüfung: 28. November 2006
Gefördert durch Personal- und Sachmittel der Firma PlantaVet, Bad Waldsee
Meinem Sohn Holger und
meinen Eltern
Sie wissen, weil sie zum Wissen bereit sind. ... Es ist nicht nötig zu wollen, es genügt, sich bereit zu halten.
(U. Eco)
1 Einleitung und Zielsetzung______________________________________ 11 2 Literaturübersicht_____________________________________________ 12
2.1 Die Mistel __________________________________________________________ 12 2.1.1 Vorkommen und Botanik der Mistel _____________________________ 12 2.1.2 Die Mistel als Arzneipflanze____________________________________ 13 2.1.3 Inhaltsstoffe der Mistel ________________________________________ 14 2.2 Immunmodulation durch Mistelpräparate und Mistelinhaltsstoffe ___________ 20
2.2.1 Beeinflussung von Monozyten/Makrophagen ______________________ 20 2.2.2 Funktionelle Beeinflussung von neutrophilen Granulozyten
(ROS/Phagozytose)___________________________________________ 21 2.2.3 Untersuchungen zur Beeinflussung der Zellproliferation______________ 23 2.2.4 Untersuchungen zur Beeinflussung der Apoptose ___________________ 23 2.2.5 Beeinflussung von natürlichen Killerzellen ________________________ 24 2.2.6 Zytokininduktion_____________________________________________ 26 2.2.7 Antikörperbildung gegen Mistelinhaltsstoffe _______________________ 28 2.2.8 Modulation der Immunantwort in vivo____________________________ 29 3 Material und Methoden ________________________________________ 32 3.1 Geräte _____________________________________________________________ 32
3.2 Materialien _________________________________________________________ 34 3.2.1 Laborbedarf_________________________________________________ 34 3.2.2 Klinikbedarf ________________________________________________ 35 3.2.3 Reagenzien _________________________________________________ 35 3.2.4 Verwendete Mistelpräparate ____________________________________ 37 3.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen______________________________ 37 3.2.6 Antikörper __________________________________________________ 39 3.2.7 Material für das Transmigrationsverfahren_________________________ 41
3.3 Methoden __________________________________________________________ 44 3.3.1 Durchflusszytometrie _________________________________________ 44 3.3.2 Separation und Gewinnung verschiedener Zellpopulationen aus
bovinem Blut________________________________________________ 46 3.3.3 Vitalitätsbestimmung von Zellen ________________________________ 48 3.3.4 Zellkultivierung in vitro _______________________________________ 49 3.3.5 Quantifizierung der Zahl vitaler Zellen mit Hilfe des
Durchflusszytometers (Referenzzellmethode) ______________________ 50 3.3.6 Proliferationsmessungen _______________________________________ 51 3.3.7 Indirekte Membranimmunfluoreszenz ____________________________ 53 3.3.8 Bestimmung reaktiver Sauerstoffmetaboliten_______________________ 56 3.3.9 Transmigration ______________________________________________ 58 3.3.10 Fluoreszenzmarkierung von Mistelinhaltsstoffen __________________ 61 3.3.11 Markierung von Zellen mit fluorochrommarkierten
Mistelinhaltstoffen und Lektinen ________________________________ 63 3.3.12 Statistische Verfahren________________________________________ 63 4 Ergebnisse ___________________________________________________ 65
4.1 Zeit- und dosisabhängige Absterberate (Apoptose/Nekrose) von
Zellsubpopulationen unter dem Einfluss von Mistelpräparaten______________ 65 4.1.1 Blockierung und Modulation der Wirkung der Mistel-inhaltsstoffe
durch Zucker ________________________________________________ 69 4.1.2 Einfluss der Kontaktzeit zwischen Mistelpräparaten und Zellen ________ 72 4.1.3 Prüfung der Apoptoseinduktion bei bestimmten Zellsubpopulationen____ 75 4.2 Modulatorische Wirkung auf das superantigeninduzierte, indirekte
beschleunigte Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro ________________ 79
4.3 Bindung von markierten Mistelinhaltsstoffen an Immunzellen des Rindes_____ 81
4.4 Modulatorische Wirkung auf die Proliferation mononukleärer Zellen ________ 86 4.4.1 Einfluss auf die Entwicklung von Zyten und Blasten_________________ 86
mononukleärer Zellen _________________________________________ 90 4.5 Modulation der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies von neutrophilen
Granulozyten durch Mistelinhaltsstoffe _________________________________ 99 4.5.1 Rezeptorunabhängige Stimulation mit einem Phorbolester ____________ 99 4.5.2 Rezeptorabhängige Bildung reaktiver Sauerstoffspezies _____________ 104 4.6 Beeinflussung des Migrationsvermögens neutrophiler Granulozyten ________ 105 5 Diskussion __________________________________________________ 109
5.1 Mistellektine binden an alle Leukozyten des peripheren Blutes _____________ 109
5.2 Einfluss von Mistelpräparaten auf mononukleäre Zellen __________________ 111 5.2.1 Mistelpräparate haben einen vitalitätsmindernden Effekt auf
mononukleäre Zellen_________________________________________ 111 5.2.2 Proliferationsbeeinflussung____________________________________ 114 5.3 Einfluss von Mistelpräparaten auf neutrophile Granulozyten ______________ 118
5.3.1 Fehlende vitalitätsmindernde Effekte ____________________________ 118 5.3.2 Fehlende Beeinflussung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies ______ 119 5.3.3 Fehlender Einfluss auf die Migration neutrophiler Granulozyten ______ 120 5.4 Ausblick __________________________________________________________ 121 6 Zusammenfassung____________________________________________ 123 7 Summary ___________________________________________________ 125 8 Literaturverzeichnis __________________________________________ 127
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) Abb. Abbildung
bspw. beispielsweise bzw. beziehungsweise
CD Cluster of Differentiation (System zur Bezeichnung zellulärer Differenzierungsantigene)
CFSE Carboxy-Fluorescein-Succimidyl-Ester CO2 Kohlenstoffdioxid
ConA Concanavalin A
CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin (unmethylierte DNA-Motive v.a. aus Bakterien) CXCL8 Interleukin-8
DHR 123 Dihydrhodamin 123
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. et alii (lateinisch: und andere)
FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)
Fc Fragment Cristalline (kristallisierbarer Antikörperteil, carboxy-terminales Fragment von Immunglobulinen nach Papain-Spaltung)
FCM Flow Cytometer (Durchflusszytometer) FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® g Gramm
G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor)
GM-CSF Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor (Granulozyten-Makrophagen- Wachstumsfaktor)
h hora (lateinisch: Stunde)
HSP Heat Shock Protein (Hitze-Schock Protein)
I10F+Strep Iscove-Zellkulturmedium mit L-Glutamin, Streptomycin und 10% FCS i.d.R in der Regel
i.m. intra muskulär i.p. intra peritoneal
IL Interleukin
iNOS induzierbare Stickstoffoxid Synthetase
kDa kilo Dalton
kg Kilogramm L Liter
LPS Lipopolysaccharid µ mikro (x 10-6)
m milli (x 10-3)
mAk monoklonale(r) Antikörper
MBL Mannose Binding Lectin (Mannose-bindendes Lektin)
MHC Major Histocompatibility Complex (Haupthistokompatibilitätskomplex) MIF Membranimmunfluoreszenz
Min. Minute(n)
MNC Mononuclear Cells (mononukleäre Zellen, hier: des Blutes, umfassen v.a.
Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen)
mRNA Messenger RNA
mU Milliunit
MW arithmetischer Mittelwert n nano (x 10-9)
n= bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid
NO Nitric Oxide (Stickstoffmonoxid) Nr. Nummer
P Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen PAMP Pathogen Associated Molecular Pattern (Molekulare Muster von Erregern) PBS Phosphate Buffered Saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PD Phosphodiester PE Phycoerythrin
Pellet Bodensatz; hier: durch Zentrifugation sedimentierte Zellen PJ Propidiumjodid
PMA Phorbol-Myristat-Acetat
PMN Polymorphonuclear Leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten) ROS Reactive Oxigen Species (Reaktive Sauerstoffspezies)
RT Raumtemperatur S Standardabweichung s.c. subkutan
sog. sogenannte(r)
spp. Spezies
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan® Std. Stunde
Tab. Tabelle
Th1, Th2 Bezeichnet den Phänotyp einer T-Helfer-Zelle 1 oder 2 TNF Tumor Necrosis Factor (Tumornekrosefaktor)
u.a. unter anderem
v.a. vor allem
well Vertiefung in einer Mikrotiterplatte V. Fraxini Abnobaviscum Fraxini-2
V. Mali Abnobaviscum Mali-2 V. Pini Abnobaviscum Pini-2
v/v Volumen pro Volumen vgl. vergleiche
w/v Gewicht pro Volumen
xg multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
1 Einleitung und Zielsetzung
Mistelinhaltsstoffe werden in der Humanmedizin zur begleitenden Behandlung von tumorösen Erkrankungen eingesetzt, ohne das ihre Wirksamkeit wissenschaftlich nachweisbar ist. Es existieren jedoch Erkenntnisse über Wirkungen der Inhaltsstoffe auf Zellen des Immunsystems und deren funktionelle Eigenschaften, welche diese Stoffe prinzipiell als geeignete, adjuvante Zusatzstoffe zu Vakzinen erscheinen lassen, da sie die Reaktionsweise von Immunzellen polarisieren können. Beim Rind wurden Mistelpräparate bisher weder in der Therapie noch in der Prophylaxe eingesetzt. Der Einsatz von Mistelpräparaten oder einzelnen Mistelinhaltsstoffen erfordert demnach die Erhebung grundsätzlicher und valider Daten zu ihrer Wirkungsweise auf bovine Immunzellen in vitro.
Es ist bekannt, dass die Zusammensetzung der Mistelinhaltsstoffe je nach Wirtsbaum unterschiedlich ist. Deshalb sollen in dieser Arbeit Mistelpräparate von drei unterschiedlichen Wirtsbäumen vergleichend untersucht werden.
Ziel der geplanten Arbeit ist die Charakterisierung der Wirkung von Mistelpräparaten und einzelner Komponenten auf Immunzellen und deren Funktion in vitro und die Erstellung eines Profils der Wirkung und Prüfung einer vom Individuum abhängigen Reaktionsweise. Im Einzelnen soll geprüft werden, ob Mistelpräparate die Vitalität oder die Sterberate bestimmter Zellsubpopulationen beeinflussen, ob funktionelle Eigenschaften von Leukozyten verändert werden und ob sie eine proliferationsmodulierende Potenz für lymphoide Zellen aufweisen.
Längerfristiges Ziel dieser Studien ist es, Mistelpräparate in der Prophylaxe (Adjuvanz bei Immunisierung) und der Therapie (Immunstimulanz) einzusetzen. Vorraussetzung hierfür ist die genaue Charakterisierung ihrer Wirkungsart auf bestimmte Zelltypen.
Wie Zellen des bovinen Immunsystems auf verschiedene Mistelpräparate funktionell reagieren ist noch nicht bekannt. Diese Arbeit soll hierfür einen Beitrag leisten, indem verschiedene Mistelpräparate auf ihre funktionsmodulierende Wirkung auf leukozytäre Subpopulationen boviner Zellen geprüft werden.
2 Literaturübersicht
2.1 Die Mistel
2.1.1 Vorkommen und Botanik der Mistel
Viscum album L. gehört in die Klasse der zweikeimblättrigen Bedecktsamer, in die Unterklasse der Rosidae und damit zur Familie der Viscaceae innerhalb der Ordnung der Santalales. Die Gattung Viscum selbst besteht aus etwa neunzig Arten, wovon ungefähr zwei Drittel in Afrika (südlich der Sahara) und Madagaskar, der Rest in Australien verbreitet ist. Viscum album L., die weißbeerige Mistel, ist besonders in den gemäßigten Zonen Mitteleuropas beheimatet. Ihre Verbreitung reicht von Südskandinavien bis Nordafrika, von Portugal bis Griechenland, von Kleinasien bis zum Kaukasus und weiter findet sie sich im Himalaja, in Indochina, China und Japan.
Die Mistel kommt auf verschiedenen Wirtsbäumen vor, sowohl auf Laubbäumen als auch auf Nadelbäumen. Die Zusammensetzung der Inhaltsstoffe der Mistel ist je nach Wirtsbaum unterschiedlich.
Nicht jeder Baum wird von den Mistelgewächsen als Wirt benutzt. Häufig findet man sie in Mitteleuropa auf Apfelbäumen und Pappeln, wie auch auf Kiefern und Tannen, dagegen äußerst selten auf Eichen und Ulmen. Einige Bäume, wie beispielsweise die Blutbuche oder der Buchsbaum, sind resistent gegenüber Mistelinfektionen (BECKER 1986)
Die Mistel ist als Halbparasit von der Wasser- und Mineralienversorgung durch den Wirt abhängig, kann aber selbständig Aminosäuren und Kohlenhydrate durch Photosynthese produzieren (epiphytischer Sprossparasitismus). Verbreitet wird die Mistel durch Vögel (Misteldrosseln), die die Mistelbeeren als Nahrung aufnehmen und als Kot wieder ausscheiden. Trifft eine Beere auf ihren Wirt, erfolgt nach der Keimung und Ausbildung der Haftscheibe, über die Wirt und Parasit engen Kontakt haben, die
Ausbildung des Senkers, der bis zum Xylem des Wirtes vordringt und somit der Mistel Zugang zu Wasser und Nährstoffen des Wirtes ermöglicht. Die Keimung der Mistel findet, wie bei allen anderen Pflanzen, im Frühjahr statt. Sie wächst zunächst negativ geotrop der Sonne entgegen. Von dem unverzweigten, mittelachsenbetonten Wachstum tritt die Mistel ab dem vierten bis fünften Lebensjahr in eine zweite Wachstumsphase ein, in der sie sich gabelförmig verzweigt und blüht. Die jungen, Blütenanlagen tragenden Sprosse führen nach ihrem zunächst negativ geotropen Wachstum Pendelbewegungen aus, die keine Beziehung zum Raum, zum Lichteinfall und zur Schwerkraft aufweisen. Sie ordnen sich dann in ihre endgültige Gestalt, der Kugelform, ein (LUTHER u. BECKER 1987). Die Blütenstände werden im Oktober ausgebildet und blühen zwischen Januar und März. Im Oktober des folgenden Jahres reift die Frucht und kann bis Mai am Busch bleiben. Die Mistel bildet sich im Sommer also vegetativ aus, während die Blüte- und Tragzeit der Früchte im Winter ist. Alle anderen Pflanzen haben demgegenüber einen entgegengesetzten jahreszeitlichen Entwicklungsablauf.
Vom Einsetzen der Blütendifferenzierung bis zur reifen Beere benötigt die Mistel als DNA-reichste Blütenpflanze siebzehn Monate, während beispielsweise die Rose nur fünf Monate braucht (LEROI 1987). Eine Ausnahme stellt der immergrüne Mistelbusch außerdem mit der Tatsache dar, dass er weder eine Wurzel noch eine Samenschale ausbildet. Die Mistel zeigt somit eine „embryonale“ Morphologie und verzögertes zeitliches Wachstum.
2.1.2 Die Mistel als Arzneipflanze
Die Verwendung der Mistel als Heilpflanze lässt sich bis zu Hippokrates in das Jahr 460-370 vor Christus verfolgen, der sie zur Behandlung gegen Milzsucht empfahl. In der Volksmedizin wird sie über die Jahrhunderte für die unterschiedlichsten Indikationen genannt (HAAS 1989). Gaulthier beschrieb zu Beginn des 20.
Jahrhunderts ihre blutdrucksenkenden Eigenschaften (FRANZ 1985). In der Therapie maligner Tumoren werden seit über 80 Jahren injizierbare Mistelextrakte angewendet (WEGMAN 1987). Die pharmakologische Wirkung der Mistel auf Mensch und Tier
der Mistelforschung und die therapeutische Anwendung der Mistel in den letzten Jahren rapide gewachsen. Mistelpräparate werden derzeit in der Tumortherapie als adjuvante Behandlungsform eingesetzt. Die Wirksamkeit einer Therapie mit Mistelextrakten ist jedoch umstritten, es ließ sich kein wissenschaftlich haltbarer Einfluss auf ein Tumorgeschehen nachweisen.
In verschiedenen in vitro Untersuchungen zeigten Mistelextrakte Eigenschaften, die auf immunstimulierende und zum Teil auch immunmodulatorische Wirkungen hinweisen.
Dazu gehört die Beeinflussung von Monozyten/Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und NK-Zellen, sowie die Stimulation oder Inhibition der Freisetzung verschiedener Zytokine (siehe unten).
2.1.3 Inhaltsstoffe der Mistel
2.1.3.1 Lektine
Lektine (lat.: legere = auswählen) sind Glykoproteine, die bestimmte Zucker hochspezifisch erkennen und binden, die aber gegenüber diesen Zuckern keine enzymatische Aktivität aufweisen. Der Lektingehalt der Misteln schwankt in Abhängigkeit vom Wirtsbaum, von der Jahreszeit und von der Kälte des Winters (BÜSSING u. SCHIETZEL 1999). Die Lektine der Mistel sind gegenwärtig die bekannteste und meist untersuchte Stoffklasse der Mistelinhaltsstoffe. Die ersten Beobachtungen über das Vorkommen von Lektinen in der Mistel wurden 1956 von Krüpe gemacht, der eine Agglutination menschlicher Erythrozyten durch wässrige Mistelextrakte beobachtete (FRANZ 1985). Seitdem haben umfangreiche Untersuchungen stattgefunden, um einerseits die chemische Struktur der Mistellektine, andererseits ihre biologische Aktivität aufzuklären. Man unterscheidet heute vier verschiedene Hauptgruppen von Mistellektinen, die entweder als Mistellektine (Abk.
ML), Viscum-album-Agglutinine (Abk. VAA) oder als Viscumin (LUTHER u.
BECKER 1987) mit römischen Ziffern I, II und III bezeichnet werden. Zusätzlich zu den genannten Lektinen wurde noch ein Chitin-bindendes Lektin entdeckt, das in der
Literatur als Visalb CBL zitiert wird (FRANZ et al. 2004). Die einzelnen Mistellektine werden durch ihre unterschiedliche Zuckeraffinität unterschieden (vgl. Tab. 1): ML-I bindet spezifisch die β-Galactose, ML-III das N-Acetyl-D-Galactosamin und ML-II kann beide Zuckerarten binden (DEBRAY et al. 1994; LEE et al. 1994). Von den vier identifizierten Lektinen kommt ML I am häufigsten vor. ML I ist das Hauptlektin der Laubbaummistel, während ML III bei der Kiefernmistel überwiegt.
Lektine liegen als Monomere vor, können sich jedoch auch als Dimere oder Trimere zusammenlagern. Die Monomere bestehen aus je zwei Ketten, einer zytotoxischen A- und einer zuckerbindenden B-Kette, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Die Aufgabe der A-Kette besteht in der enzymatischen Hemmung der Proteinsynthese. Sie kann zudem Lymphozyten zur Zytokinfreisetzung stimulieren. Die zuckerbindende B-Kette kann Makrophagen aktivieren (METZNER et al. 1985). Nur beide Ketten gemeinsam können zytotoxisch wirken: Die B-Kette bindet zunächst an die Zielzelle und ermöglicht sodann das Einschleusen der A-Kette (FRANZ 1986).
Von den einzelnen Lektinen existieren Isoformen, die durch unterschiedliche Glykosilierung und/oder veränderte Aminosäuresequenzen entstehen.
Tab. 1: Biochemische Eigenschaften der Mistellektine (PFÜLLER 2000)
Lektin Molekulargewicht [D] Zuckerspezifität Anzahl der Ketten
ML-I 115.000 D-Galactose 4 (Dimer)
ML-II 63.900 D-Galactose
N-Acetyl-D-Galactosamin 2
ML-III 61.600 N-Acetyl-D-Galactosamin 2
Viscalb CBLA 21.600 N-Acetyl-D-Glucosamin und Oligomere
2
rML 58.400 D-Galactose
N-Acetyl-D-Galactosamin
Obwohl Lektine insgesamt nur einen sehr geringen Anteil –ca.1%- der Mistelproteine ausmachen, ist ihre Zytotoxizität ein entscheidender Faktor der Wirksamkeit von Mistelpräparaten (SCHINK 1990; SCHLODDER 1990). Die Zytotoxizität der Mistellektine für Tumorzellen und andere Zellen ist lange bekannt und in vielen Details analysiert (STIRPE et al. 1982b). Sie tritt schon in sehr geringen Dosierungen (Picogrammbereich) auf (MÖCKEL et al. 1998) und ist abhängig von der jeweiligen Zelllinie und den Kulturbedingungen. Zwei zellbiologische Wirkprinzipien für die Zytotoxizität lassen sich identifizieren, zum einen die Hemmung der Proteinsynthese und zum anderen die Induktion von Apoptose (siehe 2.2.4). Für die Proteinsynthesehemmung wird folgendes Modell angenommen: Die B-Kette des Lektins bindet an einen D-Galactose- oder einen N-Acetyl-D-Galactosamim-Rezeptor auf der Zellmembran. Durch diese Bindung kommt es zu einer Internalisierung des Lektins in die Zelle, wo es zu einer Spaltung in A- und B-Kette kommt. Die Hemmung der Proteinsynthese beruht auf der RNA-N-Glycosidase-Aktivität der A-Kette, die durch die Spaltung der N-glykosidischen Bindung in der 28-rRNA auf ribosomaler Ebene eingreift (ENDO et al. 1988). Die A-Kette inhibiert so die Proteinbiosynthese irreversibel durch Spaltung der ribosomalen RNA. Wegen ihrer spezifischen Ribosomen-Inaktivierung zählt man die Mistellektine zu den Typ -2-Ribosomen- inaktivierenden Proteinen, wozu auch das bekannte toxische Ricin gehört (BARBIERI et al. 1993).
Das Gesamtmolekül von Mistellektin I wirkt stark zytotoxisch in der Zellkultur. In einer Konzentration von 5 ng/ml hemmt es stark das Wachstum menschlicher MOLT-4 Leukämiezellen. Für Hepatomzellen der Ratte (HTC) ist eine hundertfach höhere Konzentration nötig, um den gleichen Effekt zu erzielen. Es scheint, dass der zytotoxische Effekt der Lektine von der Fähigkeit der Zellen zur Bindung dieser Moleküle abhängt. Franz et al. haben schon 1982 darauf hingewiesen, dass die zytotoxische Potenz der Lektine zur Menge der Galactosyl-Reste auf der Zielzelle in Beziehung steht (FRANZ et al. 1982). Mistellektin I ist nicht nur zytotoxisch; es kann auch die Synthese- und Sekretionsleistung gewisser Zellen stimulieren. METZNER et al. (1985) haben gezeigt, dass Mistellektin I oder die B-Kette in niedrigen, nicht
zytotoxischen Konzentrationen, an Makrophagen bindet und so deren Sekretion von Zytokinen stimulieren können. Die A-Kette hat keinen Effekt auf die Makrophagen.
Hingegen stimuliert sie in sehr niedrigen Dosen die Proliferation von Lymphozyten.
2.1.3.2 Viscotoxine
Viscotoxine sind niedermolekulare, stark basische, amphiphile Polypeptide mit einem Molekulargewicht um 5 kD, 46-50 Aminosäuren und drei Disulfidbrücken und gehören zu den Thioninen. Sie weisen eine erstaunliche Hitzestabilität und eine große Resistenz gegenüber Proteasen wie Trypsin und Chymotrypsin auf, wahrscheinlich bedingt durch die Existenz von drei Sulfidbrücken in dem relativ kleinen Molekül (RIBEREAU- GAYON et al. 1986). Isoliert wurden sie erstmals von Winterfeld und Mitarbeitern (WINTERFELD u. BIJNEN 1948) als herzwirksame und blutdrucksenkende Substanz, und wurden später von SAMUELSSON u. PETTERSON (1970). eingehend untersucht Es werden sieben Isoformen von Viscotoxinen in der Mistel beschrieben: A1, A2, A3, B, B2, 1-PS und U-PS. Der Gehalt an Viscotoxinen und auch die einzelnen Fraktionen sind in der Mistel abhängig von Erntezeitpunkt und Wirtsbaum. Charakteristisch für die Viscotoxine ist ihr Reichtum an Lysin und Arginin. Durch ihre positive Ladung haben Viscotoxine einen stark basischen Charakter, der die Bindung an Nukleinsäuren ermöglicht. Ihre toxischen Wirkungen werden vermutlich durch Bindung der Thionine an Membranphospholipide und anschließende Porenbildung und Zellwandschädigung hervorgerufen. Viscotoxine wirken auch bei Tieren toxisch. Eine intraperitoneale Applikation von 0,8 mg/kg Viscotoxin A bei Mäusen tötet die Hälfte der Tiere. Bei Katzen reichen schon 0,1 mg/kg, um alle Tiere zu töten. In schwächeren Dosierungen rufen die Viscotoxine eine Hypotension, eine Bradykardie und eine negativ inotrope Wirkung auf den Herzmuskel hervor (BLOKSMA et al. 1979). Das Wachstum von menschlichen Tumorzellen in Zellkultur wird durch Konzentrationen von 1 μg/mL Viscotoxin um 50 % gehemmt. Hela-Zellen können schon durch eine Konzentration von 0,2 μg/mL Viscotoxin um 50 % gehemmt werden (FRANZ 1986, RIBEREAU-GAYON et al. 1986). Viscotoxine zeigten keine Zytotoxizität gegenüber Lymphozyten.
wiederholter Exposition anti-Viscotoxin-Antikörper (TONEVITSKY et al. 2001). Die Granulozyten-aktivierende Fähigkeit von Viscotoxinen haben STEIN et al. (1999c; und 1999d) detailliert untersucht und analysiert: Nach in vitro Kultivierung von Leukozyten mit Viscotoxinen (25 bzw. 250 µg/mL) erhöhte sich die phagozytische Aktivität und die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (oxidativer Burst) von Granulozyten signifikant, wobei in höheren Dosierungen teilweise auch zytotoxische Effekte zu beobachten waren.
2.1.3.3 Polysaccharide und Oligosaccharide
Polysaccharide sind hochmolekulare Zuckerpolymere, die aus Monosacchariden aufgebaut sind und an Proteine gebunden sein können. Poly- und Oligosaccharide der Mistel wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen untersucht (EDLUND et al. 2000;
LUTHER u. BECKER 1987). Eine eingehende Analyse stammt von Jordan aus dem Jahre 1986. Er fand in der wasserlöslichen Polysaccharidfraktion der Stängel und Blätter vor allem hochveresterte D-Galacturonane mit einem Molekulargewicht von 42 kD in esterfreier Form und in den Beeren vor allem Arabinogalactane (Molekulargewicht ca. 180-900 kD). (JORDAN u. WAGNER 1986). Diese Arabinogalactane können Mistellektin I binden und fungieren in der Pflanze und im Presssaft möglicherweise als Träger für die Lektine (EDLUND et al. 2000). Nachdem Wechselwirkungen zwischen den Polysacchariden und dem Mistellektin I beobachtet worden waren, wurde erwartet, dass sich diese im Hämagglutinationstest in einer Verminderung der Agglutination der Erythrozyten durch Mistellektin I auswirken würden. Dies wurde jedoch in keinem Fall beobachtet. Im Gegenteil, es trat im Vergleich zur Lösung mit reinem Lektin in den Mischungsansätzen eine leicht verstärkte Agglutination auf.
Nach der Injektion dieser Mistelextrakte wurde eine Granulozytose im peripheren Blut beobachtet (GOLDSCHMIDT 1966). In Tierversuchen schützten Mistel-Polysaccharide vor Strahlenschäden, sie verbesserten deutlich die Überlebenszeit von gammabestrahlten Mäusen (NARIMANOV et al. 1992). STEIN et al. (1999a) beobachteten, dass Polysaccharide aus der Mistel (Arabinogalaktane, 100 µg/mL) die
Proliferation von CD 4+ Lymphozyten deutlich stimulierten, nicht aber die von CD 8+ T-Zellen oder von B-Lymphozyten. Die Stimulation betraf vermutlich tendenziell Th1- Zellen, da auch die Freisetzung von IFN-γ deutlich gesteigert wurde ebenfalls die Freisetzung von IL-6, kaum aber die von TNF-α. Granulozytenfunktionen (Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und Phagozytose) wurden durch die Polysaccharide nicht beeinflusst.
Die Arbeitsgruppe um MUELLER u. ANDERER (1990) untersuchte Rhamnogalakturonane sowie eine niedermolekulare Oligosaccharidfraktion aus Mistelextrakten. Sie fanden für die Rhamnogalakturonane eine Erhöhung der Zytotoxizität von NK-Zellen durch Brückenbildung zwischen Zielzellen und Effektorzellen. Für die Oligosaccharidfraktion dagegen eine Stimulation von NK-Zellen und auch von Monozyten/Makrophagen durch die Freisetzung von Zytokinen..
2.1.3.4 Flavonoide
Flavonoide sind eine Stoffklasse, die ubiquitär im Pflanzenreich verbreitet ist. Viscum album enthält eine Reihe verschiedener Flavonoidderivate (BECKER u. EXNER 1980;
LORCH 1993). Sie liegen meist in glykosilierter Form vor. Unter den Aglyca findet man insbesondere Quercetin und verschiedene Quercetinmethylester, die in verschiedenen Zellkulturmodellen Apoptose induzieren und Radikalfänger- Eigenschaften zeigen, in vitro aber auch mutagen sind. Die antioxidativen, enzymhemmenden, entzündungshemmenden, antikarzinogenen, apoptoseinduzie- renden, antiproliferativen und NK-Zell-stimulierenden Eigenschaften der Flavonoiden werden seit Jahren diskutiert und erforscht. (KUO 1996; ROBAK u. GRYGLEWSKI 1996).
2.1.3.5 Alkaloide
Alkaloide (basische Pflanzeninhaltsstoffe, die Stickstoff enthalten) gehören zu den ältesten Drogen der Menschheit. Sie kommen vorwiegend in Pflanzen vor und dienen auch heute noch als Heilmittel und Anregungsmittel (Morphin, Atropin, Coffein,
werden, Alkaloide erwiesen sich als äußerst labil und schwer nachzuweisen.
Insbesondere das Vorliegen der pharmakologisch aktiven Form in der europäischen Mistel ist nicht geklärt. Es existieren einige Veröffentlichungen zu den Alkaloiden, jedoch sind die Aufzeichnungen äußerst dürftig (KHWAJA et al. 1980; KHWAJA et al.
1986).
2.1.3.6 Vesikel
Im Zuge der Kolloidoptimierung von Mistelpräparaten (bisher erst bei dem Präparat ABNOBAviscum durchgeführt) wurden Mistelpräparate so aufbereitet, dass die glykolipidhaltigen Membransysteme der Mistel möglichst in ihrer ursprünglichen Form als Vesikel erhalten bleiben. Die Vesikel bestehen vorwiegend aus chlorophyllhaltigen Membranbestandteilen mit galaktosehaltigen Glykolipiden. Sie erhalten erst während der Präparation ihre endgültige kugelige Form und sind ca. 50–350 nm groß (SCHEFFLER et al. 1993). Über die Vesikel liegen bisher wenige experimentelle Untersuchungen vor, sie scheinen aber immunstimulierende Wirkungen zu haben, (FISCHER et al. 1997) und eine deutliche in vitro Toxizität bei einer Vielzahl von Tumorzelllinien aufzuweisen (DOSER et al. 1989; JANSSEN et al. 1993).
2.2 Immunmodulation durch Mistelpräparate und Mistelinhaltsstoffe
2.2.1 Beeinflussung von Monozyten/Makrophagen
Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass Mistellektine bevorzugt an Monozyten/Makrophagen binden (GÖCKERITZ et al. 1996; KAYSER et al. 1992). Die Bindung führte zu einer Erhöhung des intrazellulären Kalziums (JOSHI u. GABIUS 1993) und zur Stimulation der Synthese und Freisetzung von Zytokinen (TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6) sowohl durch einzelne Lektine, als auch durch isolierte A- und B-Ketten (ELSÄSSER-BEILE et al. 2000; MÖCKEL et al. 1997). Wurden Makrophagen mit ML
I inkubiert, zeigte sich teils eine dosisabhängige Steigerung der Phagozytosefähigkeit In höheren Dosen wurde eine Hemmung dieser Funktion gezeigt (LUTHER u. BECKER 1987; LUTHER et al. 1986).
Im Tierversuch führte die Gabe eines Mistelpräparates oder eines isolierten Polysaccharids zu einem Anstieg der Phagozytoseaktivität von Makrophagen im Carbon-Clearance-Test (BLOKSMA et al. 1982). Auch JORDAN u. WAGNER (1986) konnten eine Steigerung der Phagozytosefähigkeit durch Gabe einer Polysaccharidfraktion nachweisen, allerdings nur vor Abtrennung der darin enthaltenen RNA-Fraktion. Nach der Abtrennung dieser Fraktion erwiesen sich die Polysaccharide als unwirksam, während die RNA-Fraktion immer noch hochwirksam war. Es wurde daher vermutet, dass die Steigerung der Phagozytosefähigkeit durch Mistel-RNA bedingt ist.
In verschiedenen Tierversuchen wurde die Aktivierung von Makrophagen und deren hemmende Wirkung auf die Metastasierung verschiedener Tumoren durch die Behandlung der Versuchstiere mit isolierten Mistellektinen oder Gesamtextrakten nachgewiesen (BEUTH et al. 1991, SCHAFFRATH et al. 2001, BRAUN et al. 2001).
Auch durch den Transfer von in vivo aktivierten Makrophagen von gesunden Mäusen in tumortragende Tiere konnte die Überlebenszeit der tumorerkrankten Mäuse verdoppelt werden. Mit nicht aktivierten Makrophagen konnte dieser Effekt nicht erzielt werden (KUTTAN 1993; KUTTAN u. KUTTAN 1992). Allerdings konnte ein mit N-methyl- N-nitrosourea chemisch induziertes Tumorwachstum in der Harnblase von Ratten durch die Gabe eines Galactosid-spezifischen Mistellektins nicht beeinflusst werden. Auch zeigte sich in dieser Studie kein Einfluss auf Makrophagen und andere Immunzellen.
(KUNZE et al. 1998).
2.2.2 Funktionelle Beeinflussung von neutrophilen Granulozyten (ROS/Phagozytose)
Mistelextrakte können Granulozyten in vitro direkt aktivieren. Interessanterweise erwiesen sich hierin insbesondere die ansonsten toxischen Viscotoxine als effektiv.
Phagozytose von Escherichia coli als auch den oxidativen Burst. Hierzu waren sämtliche Viscotoxine in der Lage, wie auch verschiedene Mistelgesamtextrakte, nicht aber isolierte Mistellektine. Elektronenmikroskopisch bestätigte sich die Phagozytosesteigerung durch Viscotoxine, indem die viscotoxinaktivierten, nicht aber unstimulierte Granulozyten, tote Zellen phagozytierten (STEIN et al. 1999c; STEIN et al. 1999d). Aber auch viscotoxinfreie Mistelextrakte konnten Granulozyten signifikant aktivieren (oxidativer Burst und Phagozytose), wofür weder Polysaccharide noch Mistellektine verantwortlich gemacht werden konnten. Wurden Granulozyten mit Mistelextrakten und Viscotoxinen koinkubiert, kam es zu einer additiven Verstärkung der Granulozytenaktivierung, was auf zwei verschiedene Wege der Granulozytenaktivierung hinwies: Zum einen scheinen Granulozyten durch andere Komponenten der Mistelinhaltsstoffe als Viscotoxin oder Mistellektin aktiviert zu werden, und ein anderer Aktivierungsweg scheint über den Ganzpflanzenextrakt und das Viscotoxin zu führen (STEIN et al. 1999b).
Im Gegensatz zu den Viscotoxinen ist die Bedeutung der Mistellektine für die Aktivierung der Granulozyten noch fraglich. Mistellektine binden zwar an Granulozyten, welchen Einfluss sie aber haben ist nicht geklärt. Verschiedene Arbeitsgruppen fanden eine leichte Steigerung der Phagozytoseaktivität von Granulozyten nach Inkubation mit isolierten Mistellektinen (PELLETIER et al. 2001;
STOIKA et al. 2001). BÜSSING et al. (1997) erreichte keine Steigerung, sondern eine leichte aber signifikante Verminderung der phagozytotischen Aktivität von Granulozyten sowie des E. coli-stimulierten oxidativen Burst nach Inkubation von Granulozyten mit wässrigem Mistelextrakt Viscum album Pini, mit einem geringen Gehalt an ML I. Auch in den Untersuchungen von STEIN et al. (1999c) konnten isolierte Mistellektine den oxidativen Burst und die Phagozytose in Granulozyten nicht steigern.
2.2.3 Untersuchungen zur Beeinflussung der Zellproliferation
Obwohl für viele pflanzliche Lektine eine proliferationsinduzierende Potenz für lymphoide Zellen beschrieben wird (z.B. für Concanavalin A oder für Pokeweed Mitogen), war diese bei Mistellektinen bisher nicht oder kaum festzustellen.
Es gibt dagegen umfangreiche Untersuchungen an verschiedenen Tumorzelllinien, die bestätigen, dass es nicht zu einer proliferationsfördernden Wirkung durch Mistelpräparate kommt. So untersuchten BÜSSING et al. (2005) bei 14 Tumorzelllinien die metabolische Aktivität der Zellen mittels MTT-Assay und Einbau des Thymidin- Analogons Bromdesoxyuridin nach 72h Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von isoliertem Mistellektin I und Mistelextrakt. Sie konnten bei keiner der untersuchten Zelllinien kongruente Befunde erheben, die für einen Proliferationsreiz durch ML I oder Mistelextrakt sprechen würden.
Auch KELTER u. FIEBIG (2005) untersuchten an 26 Tumorzelllinien die wachstumsbeeinflussenden Eigenschaften von drei wässrigen Mistelextrakten in verschiedenen Konzentrationen. Adhärent wachsende Zelllinien wurden anhand eines Propidiumjodid-Assays untersucht und in Suspension wachsende Kulturen mit dem Sulforohodamin B-Assay. Die Ergebnisse zeigten klar, dass in keiner der Zelllinien eine Wachstumsstimulation durch die drei getesteten Mistelextrakte zu beobachten war, insbesondere auch nicht im Niedrigdosisbereich.
2.2.4 Untersuchungen zur Beeinflussung der Apoptose
Mistelpräparate können Apoptose induzieren. Ihre Zytotoxizität ist zum Teil hierauf zurückzuführen. JANSSEN et al. (1993) analysierten die wachstumshemmende Wirkung von Mistelpräparaten und ML-I auf verschiedene Tumorzelllinien. Hierbei supprimierten sowohl die Mistelpräparate wie auch ML-I deutlich und dosisabhängig die Proliferation der Zellen; diese Wachstumshemmung war auf Apoptose zurückzuführen. Viele weitere Untersuchungen bestätigten die Induktion der Apoptose in Tumorzellen, Leukämiezellen wie auch Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten
durch Mistelextrakte oder isolierte Mistellektine. (BANTEL et al. 1999; BÜSSING u.
SCHIETZEL 1999; HOSTANSKA et al. 1996; VERVECKEN et al. 2000).
Die zellulären Mechanismen, über welche die Mistelinhaltsstoffe die Apoptose induzieren sind in vielen Details erforscht, letztendlich aber noch nicht geklärt. Die Mistellektine scheinen eine wichtige Rolle bei der Apoptoseinduktion zu spielen. Schon in niedrigen Konzentrationen triggern sie das Selbstmordprogramm der Zelle (MÖCKEL et al. 1997). Auch die Zytokininduktion spielt vermutlich eine Rolle (STEIN et al. 2000a; STEIN et al. 2000b; STEIN et al. 2000d). Eine Lektinbindung an Zellen führt innerhalb kürzester Zeit zu einem intrazellulären Anstieg von Kalzium (GÖCKERITZ 1994), im weiteren zu Veränderungen der Zellmembran, zum Anstieg reaktiver Sauerstoffmetaboliten, zur Herabregulation von p53 und blc-2, zur Expression mitochondrialer Apo-2.7-Moleküle und zur Translokation der Phosphatidylserine zur äußersten Schicht der Zellmembran; des weiteren zur Induktion von IL-4 , teilweise auch IL-6 und TNFβ und später zur Fragmentierung der DNA. Es gibt neuere Untersuchungen, die zeigen, dass Apoptose auch unabhängig von konventionellen Todesrezeptoren durch mitochondriale, rezeptorunabhängige Signalwege (Cytochrom c/
Apaf-1) induziert wird, und dass als wesentlicher Bestandteil des Signalweges die Caspase-Kaskade aktiviert wird (BANTEL et al. 1999; BÜSSING 2001). Auch eine Interaktion der Mistellektine mit der DNA wird als Ursache der Apoptose-Induktion diskutiert (BARBIERI et al. 1997). Mistellektine können wohl auch indirekt über die Erhöhung der Expression von Fas-Liganden in Lymphozyten Apoptose induzieren.
Damit werden Lymphozyten befähigt in Fas+-Zellen den programmierten Selbstmord einzuleiten (BÜSSING et al. 1999).
2.2.5 Beeinflussung von natürlichen Killerzellen
Mistelinhaltstoffe haben einen deutlichen Einfluss auf natürliche Killerzellen (NK- Zellen). Sie erhöhen die Zellbildungsrate im Knochenmark und deren Zytotoxizität.
Mistelaktivierte NK-Zellen können im Tierversuch antitumoral wirken.
So zeigte sich in einem Experiment an Mäusen, denen B16F10-Melanomzellen injiziert wurden, eine drastische Reduktion der Metastasierung, wenn sie vier Stunden nach der
Tumorzellinjektion in-vivo-aktivierte Milzzellen von gesunden, mistelbehandelten Mäusen injiziert bekamen. Zudem erhöhte sich ihre Überlebenszeit signifikant (ANTONY et al. 1997). In einem weiteren Versuch zeigte dieselbe Gruppe, dass auch in vitro mit Mistelpräparat aktivierte Milzzellen eine Metastasierung erheblich und signifikant reduzieren und die Überlebenszeit deutlich verlängern. Die Verabreichung normaler, nicht mistelaktivierter Milzzellen hatte dagegen keinen Effekt (ANTONY et al. 1999). Dass an dieser antimetastatischen und lebenszeitverlängernden Wirkung der mistelaktivierten Milzzellen vor allem die NK-Zellen beteiligt waren, zeigte ein weiteres, ähnliches Experiment: Wurden den Tieren nach der Gabe der mistelaktivierten Milzzellen NK-Zell-depletierende anti-Asialo-GM1-Antikörper verabreicht, oder waren die NK-Zellen schon in vitro aus den Milzzellkulturen entfernt worden, so zeigten sich keine antimetastatischen und lebenszeitverlängernden Effekte (ANTONY et al. 2000).
Die mistelvermittelte Aktivierung der NK-Zellen und deren Einfluss auf die Tumorhemmung wurde in einem weiteren Experiment mit Extrakt aus der koreanischen Mistel Viscum album coloratum demonstriert. Der Mistelextrakt wurde den Mäusen prophylaktisch zwei Tage vor der Tumorzellinjektion verabreicht. Die Metastasierung wurde auch hier signifikant verringert und die Lebenszeit verlängert. Die NK-Zell- Aktivität erhöhte sich nach der Mistelgabe signifikant für 1-3 Tage. Wurden aber die NK-Zellen gezielt durch anti-Asialo-GM1-Antikörper depeletiert, so wurde durch die Mistelinjektion auch keine Metastasehemmung mehr erreicht (YOON et al. 1998).
Auch einzelne Inhaltstoffe der Mistel beeinflussen die NK-Zellen in vitro. So führte das aus Misteln isolierte Polysaccharid Rhamnogalakturonan zu einer Steigerung der Zytotoxizität von NK-Zellen. Diese Steigerung führt über ein anderes Wirkprinzip als bei anderen biologic response modifiers, nämlich über eine spezifische Brückenbildung zwischen den Effektorzellen und den Tumorzellen. Es erwies sich sogar als potenter als IL-2 und IFN (HAMPRECHT et al. 1987; ZHU et al. 1993).
Auch Olligosacharide erhöhten die Zytotoxizität von CD56+ NK-Zellen, jedoch über einen anderen Weg als die Rhamnogalakturona, nämlich indirekt über die Freisetzung von Lymphokinen (KLETT u. ANDERER 1989; MUELLER u. ANDERER 1990).
Auch isolierte Viscotoxine führten in einer nicht zytotoxischen Konzentration zu einer deutlichen Steigerung der Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber verschiedenen Tumorzelllinien. Über welchen Mechanismus sie allerdings wirken konnte noch nicht aufgeklärt werden (TABIASCO et al. 2002).
Im Gegensatz zu den anderen Mistelinhaltsstoffen überwiegen bei den isolierten Mistellektinen die zytotoxischen Eigenschaften gegenüber einzelnen Lymphozyten- subpopulationen. So konnte bei einer Analyse der Lymphozytensubsets nach 72 Stunden Inkubation schon bei einer Mistellektinkonzentration von 1 ng/mL eine deutliche selektive Abnahme des NK-Zellanteils in der Zellkultur beobachtet werden.
Innerhalb der anderen T-Zell-Subsets traten dagegen keine wesentlichen Veränderungen auf. Ebenso veränderte sich nicht das Verhältnis zwischen T- und B-Zellen. Das präferenzielle Abtöten von NK-Zellen konnte vollständig durch Anti-Mistellektin- Serum unterdrückt werden. Die NK-Zellen scheinen eine besonders mistellektinsensible Population unter den lymphoiden Zellen zu sein (SCHINCK 2001).
2.2.6 Zytokininduktion
In einer Vielzahl von Experimenten ist die Fähigkeit von Mistelextrakten und einzelner Mistelinhaltsstoffe untersucht worden, in verschiedenen Zellen die Synthese und Freisetzung verschiedener Zytokine zu induzieren. Umfangreiche Untersuchungen liegen über die Zytokininduktion durch einzelne Mistellektine und auch durch isolierte A- und B- Ketten vor (ELSÄSSER-BEILE et al. 2000; JUNG et al. 1996; RIBEREAU- GAYON et al. 1996). So zeigten HAJTO et al. (1990), dass die Inkubation mononukleärer Zellen (PBMC) mit ML I bzw. isolierten B-Ketten zu einer Freisetzung von TNF-α, IL-6, IL-1β, nicht aber von IL-1α führt. Auch HOSTANSKA et al. (1995) untersuchten die Zytokin-Expression (mRNA) und –Freisetzung in mononukleären Zellen durch ML I. Sie fanden, dass die Expression von TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL- 10, IFN-γ und GM-CSF stimuliert wurde, nicht aber die von IL-2 und IL-5. Eine Erhöhung der Sekretion fanden sie für IL-6, IL-10 und TNF-α, nicht aber für IFN-γ.
Diese Ergebnisse lassen auf eine wesentliche Beteiligung von Monozyten schließen, an die ML I bevorzugt bindet.
Auch über die Zytokininduktion durch Mistelgesamtextrakte gibt es eine Vielzahl von Untersuchungen. vor allem aus der Arbeitsgruppe um Stein (STEIN et al. 1996; STEIN et al. 2000a; STEIN et al. 2000c). In einer umfangreichen Untersuchung mit einem Iscador® Pini-Präparat über die in vitro Reaktivität mononukleärer Zellen auf Mistelextrakte zeigten STEIN u. BERG (1997) eine teils drastische Freisetzung von IL- 6 und TNF-α und etwas geringer von GM-CSF. Deutlich seltener wurde IL-2, IL-4, IL- 5 und IFN-γ induziert. In einer weiteren Studie wurde der Einfluss von 12 verschiedenen Mistelpräparaten auf die Freisetzung von Zytokinen aus Leukozyten des peripheren Blutes untersucht und ergab für das lektinfreie V. Pini-Präparat eine Induktion von IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10 und TNF-α, nicht aber IFN-γ. Die anderen 11 untersuchten lektinhaltigen Mistelpräparate induzierten deutlich weniger Zytokine. Die Induktion bestimmter Zytokine oder Zytokinmuster korrelierte nicht mit dem Lektingehalt (ELSÄSSER-BEILE et al. 1998).
Die mistelinduzierte Zytokinproduktion in vivo wurde mehrheitlich bei Tumorpatienten untersucht (KOVACS 2000; KOVACS u. KUEHN 2002; STEIN et al. 1998). Dabei zeigte sich eine hohe individuelle Variabilität und Unterschiede in den induzierten Zytokinmustern zwischen den einzelnen Lektinen und in Abhängigkeit von den verschiedenen Inhaltsstoffen der unterschiedlichen Mistelpräparate. Trotz dieser hohen Variabilität zeigt sich in fast allen Untersuchungen ein deutlicher Anstieg der Freisetzung von IL-6 und TNF-α (STEIN 1995).
In einer klinischen Studie an gesunden Probanden mit verschiedenen Mistelpräparaten zeigte sich eine starke individuelle Varianz der mistelinduzierten Zytokinfreisetzung. Zu einer Freisetzung von IL-6 und TNF-α kam es jedoch bei allen Probanden und bei den verschiedenen Mistelpräparaten, allerdings in unterschiedlicher Höhe und zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Therapie. Bei anderen Zytokinveränderungen gab es keinen eindeutigen Trend (STEIN u. BERG 1998). Noch ausgeprägter waren die Variationen der Zytokinveränderungen und individuellen Unterschiede bei Tumorpatienten, bei denen eine Misteltherapie durchgeführt wurde, sodass kaum noch generelle Aussagen getroffen werden können (STEIN et al. 1998). Es kommt unter Misteleinfluss nicht notwendigerweise zu einer Steigerung der Zytokinexpression oder
–freisetzung, sondern eventuell auch zu einer Verminderung, sodass vermutet werden kann, dass eine Misteltherapie regulierend in das Zytokinnetzwerk als Teil des Immunsystems eingreift.
2.2.7 Antikörperbildung gegen Mistelinhaltsstoffe
Es gibt zur direkten Wirkung von Mistelpräparaten auf B-Zellen kaum Untersuchungen und Hinweise. Schon lange bekannt ist, dass Mistelantigene teils kräftige Immunogene sind und Antikörperbildung induzieren können (OLSNES et al. 1982; VESTER et al.
1968). Gut untersucht ist die Bildung von Mistellektin-Antikörpern, die bei fast allen Probanden und Patienten nach wenigen Wochen Misteltherapie nachzuweisen ist.
(KLEIN et al. 2002a; STEIN et al. 1997). So haben KLEIN et al. (2002a) in einer randomisierten, plazebokontrollierten Doppelblindstudie an gesunden Probanden die Bildung von Antikörpern gegen ML-1 und Viscotoxin untersucht. Es wurden zwei verschiedene Mistelpräparate (ein lektinreiches (IQ) und ein toxinreiches (IP)) über 12 Wochen zweimal wöchentlich in ansteigenden Dosen verabreicht. Vor Beginn der Behandlung hatte keiner der Probanden Antikörper gegen Mistelinhaltsstoffe. In der Kontrollgruppe konnte keine Antikörperentwickelung nachgewiesen werden. Gezeigt werden konnte, dass alle behandelten Probanden Antikörper gegen die Mistelinhaltsstoffe bildeten. Alle bildeten Antikörper vom IgG-Isotyp (vor allem IgG1 und IgG3) nur einige dagegen IgA und IgM. IgE Antikörper wurden nur von der Gruppe gebildet, die mit dem lektinreichen Präparat behandelt worden war.
In einer weiteren Studie von KLEIN et al. (2002b) wurde die Bildung von Antikörpern auf Mistelinhaltsstoffe von mistelbehandelten Tumorpatienten (ABNOBAviscum. Mali) untersucht. Innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 18 Wochen bildeten 92% der Patienten Antikörper gegen ein Viscotoxin und 96% gegen ein Mistellektin. Der hauptsächlich vertretene Isotyp war auch in dieser Studie IgG. Eine Beziehung zwischen der Entwicklung von Antikörpern gegen Viscotoxin und Lektin bestand nicht, sodass eine Kreuzreaktivität mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden konnte.
2.2.8 Modulation der Immunantwort in vivo
Mistelextrakte können als Adjuvans die Antikörperbildung gegen andere Antigene verstärken. So zeigten BLOKSMA et al. (1979) an Mäusen eine, im Vergleich zur Kontrolle, deutlich verstärkte Bildung von Antikörpern gegen Schafserythrozyten (SRBC), wenn diese zusammen mit Mistelextrakt intraperitoneal verabreicht wurden.
Auch bei einer Vakzinierung über die Schleimhaut zeigten isolierte Mistellektine ausgeprägte adjuvante Wirkung. Beim Vergleich eines herkömmlichen Adjuvans (Cholera toxin, CT) mit Lektin als Adjuvans zeigte sich kein signifikanter Unterschied in der adjuvanten Wirkung. Es wurden hohe Antikörpertiter sowohl gegen das eingesetzte Modellantigen (Herpes simplex virus glycoprotein D2) als auch gegen die verwendeten Adjuvantien induziert. Im Serum kam es zu einer signifikanten Erhöhung der IgG-Konzentration. Es zeigte sich eine Polarisation der IgG-Isotypen der CT- und lektinspezifischen Antikörper in Richtung IgG1. Auch die antigenspezifischen Antikörper zeigten hohe Titer von IgG1 und niedrigere Titer von IgG2a und IgG2b. In den Schleimhautsekreten erhöhte sich die Konzentration von IgA signifikant, sowohl gegen das Antigen, wenn es zusammen mit Mistellektinen intranasal appliziert wurde, als auch gegen das verwendete Mistellektin im Vergleich zu einer Immunisierung mit Antigen ohne Adjuvans (LAVELLE et al. 2002). Im gleichen Versuch wurde auch die antigenspezifische Milz-T-Zell–Proliferation gemessen und die Zytokinproduktion dieser Zellpopulation. In den Überständen wurde IL-5, nicht aber IFN-γ nachgewiesen.
Aus dem Fehlen von IFN-γ und der Dominanz der IgG1 Antikörper schloss diese Arbeitsgruppe auf eine selektive Induktion einer TH2-Typ Immunantwort.
Eine kräftige Steigerung der humoralen (wie auch der zellulären) Immunantwort auf ein Modellantigen (Keyhole limpet hemocyanine, KLH) war unter Adjuvansbehandlung mit Mistelextrakten oder –lektinen aus der koreanischen Mistel Viscum album coloratum zu beobachten. Schon nach zwei Wochen zeigte sich eine signifikante Erhöhung der antigenspezifischen Antikörpertiter und war über zwölf Wochen nachweisbar. Es erhöhten sich die Isotypen IgG1, IgG2a und IgG2b, nicht aber IgG3 und IgM. In einem Lymphozyteproliferationstest zeigten die Milzzellen von Mäusen,
Aufnahme im Vergleich zu nur mit KLH immunisierten Mäusen. Auch eine vermehrte Produktion von Zytokinen – IL-2, IFN-γ und IL-4 - durch spezifisch sensibilisierte Milzzellen war in den Zellkulturüberständen der mit Mistel und KLH zusammen behandelten Mäuse nachzuweisen (YOON et al. 2001).
Ob Mistellektine den Typ und die Richtung einer Immunantwort (mehr TH1 oder mehr TH2-domiert) beeinflussen können, wurde an hand der gebildeten Zytokine gefolgert.
TH1-Zytokine wie IL-2 und IFN-γ stimulieren bei der Maus die Bildung von Antikörpern des Typs IgG2a, während TH2-Zytokine wie IL-4 und IL-6 zur Bildung von IgG1 führen. So scheint das Mistelpräparat in diesem Versuch sowohl die TH-1 als auch die TH-2 Immunantwort auf KLH zu steigern. Die beteiligten Mechanismen sind nicht klar.
Um eine Beeinflussung der zellulären Immunantwort durch Mistelpräparate zu prüfen, wurde von der gleichen Arbeitsgruppe die Beeinflussbarkeit einer Hypersensibilitäts- reaktion vom verzögerten Typ untersucht. Dazu wurde Mäusen, die mit KLH mit und ohne Zusatz von Mistel immunisiert worden waren, 14 Wochen nach der ersten Immunisierung das Antigen in die Ballen der Hinterfüße injiziert und die Schwellung bis zum fünften Tag nach der Injektion gemessen. Die Mäuse, die mit KLH und Mistel zusammen immunisiert worden waren, zeigten einen signifikanten Anstieg der Hypersensibilitätsreaktion verglichen mit den Mäusen, die mit KLH alleine immunisiert worden waren. Hier zeigte sich, dass das Mistelpräparat als Immunadjuvans nicht nur die Fähigkeit des Antigens steigert, eine humorale Immunantwort zu induzieren, sondern auch diejenige, eine zelluläre Immunantwort zu verstärken.
Auch die Arbeitsgruppe um Bloksma untersuchte die zelluläre Immunantwort anhand der Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ. Mäuse wurden i.c. oder i.p. mit einer Mischung aus Mistelpräparat (Iscador®) und Antigen (SRBC) oder mit einer Mischung aus Kochsalzlösung und Antigen immunisiert. Die mit Mistel und Antigen immunisierten Mäuse zeigten fünf Tage nach der Immunisierung eine signifikant stärkere Fußschwellung nach einer s.c. Injektion von SRBC in den hinteren Fußballen als die mit Kochsalzlösung und Antigen immunisierte Mäuse. Auch nach einer s.c.
Immunisierung mit verschiedenen Konzentrationen von Iscador® (ohne Antigen)
zeigten die Mäuse fünf Tage später eine signifikant stärkere Fußschwellung nach einer s.c. Injektion von 10 mg/kg Iscador® als Mäuse, die nur mit NaCl immunisiert worden waren (BLOKSMA et al. 1979). Es zeigte sich demnach eine Korrelation zwischen adjuvanter Wirkung (verstärkte Reaktion auf i.f. Injektion des Antigens nach Immunisierung mit Mistelpräparat) und immunogener Wirkung (verstärkte Reaktion auf i.f. Injektion des Mistelpräparates nach vorhergehender Immunisierung mit Mistelpräparat) und es konnte ein kausaler Zusammenhang zwischen diesen beiden Phänomenen angenommen werden.
3 Material und Methoden
3.1 Geräte
10-Well-Transmigrationskammer 400 µL/285 µL
Fa. Cytogen (442000), Ober- Mörlen
Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr- Osmose Anlage, „Typ RO 50/14SMB TypI“
Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF“
Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel
Autoklav Typ GE406 Getinge AB, Getinge/Schweden
Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Heraeus, Hanau
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung Wartewig (6.001.000), Göttingen Centricon®– Filtrationssystem Amicon, Beverly/MA, USA
CO2-Flasche zur Sterilfiltration Kohlensäurewerke Hannover Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless
steel pressure vessel“
Alloy Products
(XX670053)Wisconsin, USA Eismaschine Typ UBE 30-10 Ziegra, Isernhagen
Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell
FACScan®, mit angeschlossener Computereinheit
Becton Dickinson, Heidelberg
Fluoreszenzmikroskop mit Ploemilluminator und Phasenkontrasteinrichtung
Zeiss (476250-9901), Oberkochen
Heißluftsterilisator „Typ ST5050“ Heraeus, Hanau
Invertmikroskop Zeiss, Oberkochen
Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C) Einzelhandel Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkel-
rotor, Hochgeschwindigkeitsaufsatz und Mikrotiterplattenrotor
Heraeus Instruments, Osterode
Laborfeinwaage „B6“ Mettler, Zürich/Schweiz Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Knick, Berlin
Laborwaage „BL310“ Sartorius GmbH, Göttingen
Magnetrührer mit Heizplatte Janke und Kunkel, Staufen
Photometer Eppendorf, Hamburg
Pinzette, gebogen, anatomisch Eickemeyer (170710), Tuttlingen Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µL) Brand (09U2539), Wertheim Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µL,
10-100 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL)
Gilson, Villers Le Bel/Frankreich
Pipettierhilfe „accu-jet®“ Brand (26404), Wertheim Plastikbox mit Gittereinsatz Einzelhandel
Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS) Heraeus-Christ. Osterode Reinwerkbank Laminair HL2448 Heraeus-Christ, Hanau Röhrchen-Schüttler „Typ Reamix“ ASID, Unterschleißheim Röhrchen-Schwenker „Typ Automix“ ASID, Unterschleißheim Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“ Dynatec, Zug/Schweiz Schlauchpumpe zum Absaugen von
Flüssigkeiten „Rumo100“
Heidolph (52100), Schwabach
Tischzentrifuge „Chemico“ mit Winkelmotor Wifug (10209), Bradford/England Tischzentrifuge „Hermle Z230M“ Hermle, Gosheim
Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ GFL, Hannover
Zählkammer nach Bürker Brand, Wertheim
Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Heraeus instruments, Osterode
3.2 Materialien
3.2.1 Laborbedarf
Combitips 1,25 mL Eppendorf (0030069.420), Hamburg
Combitips 2,5 mL Eppendorf (0030069.447), Hamburg
Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld Merck (612F1767), Darmstadt Eppendorf-Reaktionsgefäß 0,5 mL Sarstedt (72699), Nürnbrecht Eppendorf-Reaktionsgefäß 1,5 mL Greiner (616201), Frickenhausen Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung,
24 Vertiefungen
Corning (3524), Wiesbaden
Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, 96 Vertiefungen
Biochrom (P92960), Berlin
Flachboden-Zellkultur-Makroplatte mit Abdeckplatte, 4 Vertiefungen
Greiner (657160), Frickhausen
Pasteurpipetten, 22,5 mm aus Glas Brand (747720), Wertheim Petrischale (Durchmesser 94 mm) Greiner (633171), Frickenhausen Pipettenspitzen, gelb und blau Sarstedt (70/762002) (70/760002),
Frickenhausen Rundboden-Mikrotiterplatten mit
Abdeckung; steril, 96 Vertiefungen
Gechno Plastic Products TPP®, Trasadingen/Schweiz
Röhrchen, 15 mL, Polypropylen Greiner Corning (430791), New York, USA Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 mL Becton Dickinson (352008),
Heidelberg
Saugpipetten (10 mL) Sarstedt (86.1254.01), Nürnbrecht Transwell Membraneinsätze (permeabel)
3 µm Porengröße
Fa. Coster GmbH (3402) Bodenheim
Zentrifugenröhrchen, 50 mL aus Polypropylen (Falcons, steril)
Corning (430829), Wiesbaden
3.2.2 Klinikbedarf
Butterfly-Kanüle „Micro-FloTM“ 21G 0,8mm Fa. Industria Biomedica (AS2102), Mailand/Italien
Kanülen 1,80 x 40 mm, steril „TSK STERIJECT“ TSK-Supra, Tochigi/Japan Staukette nach Witte Eickemeyer (442015), Tuttlingen Vacutainer Brand Luer Adapters Becton Dickinson (367300),
Heidelberg
Vacutainer® Systems, Halter Fa. Becton Dickinson, Heidelberg Vacutainerröhrchen, 10 ml, EDTA-K2 (18 mg) Becton Dickinson (367525),
Heidelberg
3.2.3 Reagenzien
Acridin-Orange Sigma (A6014), Steinheim
Ammoniumchlorid (NH4Cl) Sigma (A4514), Taufkirchen Bicinchoninicacid (BCA)-Assay, Kit zur
Bestimmung der Proteinkonzentration
Perbio Science (23225), Bonn BupHTM Borate Buffer Pierce (28384) Rockford
Concanavalin A (ConA) Amersham Bioscience (17-0450- 01) Freiburg
D(+)-Glucose Sigma (G-8270) Steinheim
D(+)-Galactose Sigma (G-0625) Steinheim Ziegen-anti-Maus-Antikörper, IgG+M (H+L)
Fluoreszein (DTAF) konjugiert
Dianova (115-015-068), Hamburg Ziegen-anti-Maus-Antikörper IgG (H+L)
R-Phycoerythrin konjugiert Dianova (115-116-146), Hamburg Ethanol 641, absolut vergällt CG Chemikalien, Laatzen
Ethanol absolut Baker (8228), Deventer/Holland
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich (E87A51),
Steinheim
Ethylendiamine-Tetraacetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich (ED2SS), Steinheim
Fetales Kälberserum (FCS) Virus und Mykoplasmen getestet
Biochrom (S0 113/431B), Berlin
Fluoreszein Isothiocyanate (FITC) Sigma-Aldrich (F7250), Steinheim Fluorescein labeled Vicia Villosa Lektin (VVA) Vector Laboratories (FL-1231)
Burlington Fluorescein labeled Ricinus Communis
Agglutinin (RCA)
Vector Laboratories (FL-1081) Burlington
Fluorescein labeled Concanavalin A (Con A) Vector Laboratories (FL-1001) Burlington
IMDM (1x) Medium mit 25 mmol/l HEPES und L-Glutamin endotoxingetestet, steril
PAA Laboratories GmbH (E15- 819), Pasching, Austria
Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat Roth (8174.1), Karlsruhe Lipopolysaccharid von Escherichia coli
Serotyp O55:B5
Sigma-Aldrich (L-2637), Steinheim
Lymphozytenseparationsmedium® PAA Laboratories (J15-004), Linz/Österreich
2-Mercaptoethanol J. T. Baker (8683), Groß Gerau Natriumazid (NaN3), 10%ig Sigma-Aldrich (S-2002),
Steinheim
Natriumchlorid (NaCl) Roth (9265.2), Karlsruhe N-Acetyl-D-Galactosamine Sigma (A2795), Steinheim
Paraformaldehyd Sigma-Aldrich (P6148), Steinheim
Penicillin(-G)-Streptomycin Biochrom (A2213), Berlin PercollTM (spezifisches Gewicht: 1,130 g/ml) Pharmacia (17089101), Freiburg Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) Sigma-Aldrich (P-8139),
Steinheim Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
Dulbecco, ohne Ca++/Mg++ Biochrom (L18210), Berlin
Phycoerythrin (PE) Dianova (115015068), Hamburg
Propidiumjodid (PJ) Calbiochem (537059), Bad Soden Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA),
lyophilisiert
Sigma-Aldrich (S-9399), Steinheim)
Staphylokokken-Lösung, Pansorbin® Calbiochem (507858), Bad Soden
3.2.4 Verwendete Mistelpräparate
Da sich die Inhaltstoffe der Mistel je nach Wirtsbaum qualitativ und quantitativ stark unterscheiden, wurden Mistelpräparate von drei verschiedenen Wirtsbäumen untersucht.
Zur Verfügung standen ABNOBAviscum Fraxini-2, die Eschenmistel (310 B10), ABNOBAviscum Mali-2, die Apfelmistel (311 A17) und ABNOBAviscum Pini-2, die Kiefermistel (303 C35) der Firma ABNOBA Heilmittel GmbH Pforzheim. Im Gehalt der wichtigsten Inhaltstoffe unterscheiden sich die drei Präparate deutlich:
Tab. 2 Lektin- und Toxingehalte dreier Mistelpräparate.
Mistelart Lektingehalt (µg/mL)
Viscotoxingehalt (µg/mL)
V. Fraxini 15,1 146
V. Mali 8,5 82
V. Pini 0,3 2
3.2.5 Kulturmedien, Puffer und Lösungen
Zellkulturmedium I10Fstrep
Dem ISCOVE Grundmedium (mit 584 μg/mL L-Glutamin und 15 μg/mL Phenolrot) (siehe 3.2.3) wurden folgende Substanzen zugesetzt:
FCS 100 μl/mL
Streptomycin 10 µg/mL
Um Komplementaktivität auszuschließen und eventuell vorhandene Mykoplasmen abzutöten, wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, siehe 3.2.3) bei 56°C für eine Stunde im Wasserbad inkubiert. Die Lagerung von sterilen aliquoten Teilen erfolgte bei -20°C. Angesetzte Medien wurden nicht länger als zehn Tage im Kühlschrank aufbewahrt.
Lymphozytenseparationsmedium®
Lymphozytenseparationsmedium® (siehe 3.2.3) ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natriumdiatrizoat und einem hochmolekularen Zucker mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels Isopaque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/mL. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium®
unverdünnt verwendet.
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne EDTA
Die PBS-Trockensubstanz (siehe 3.2.3) wurde in Aqua tridest. gelöst. Die Bestandteile lagen in den folgenden Konzentrationen vor.
NaCl 8,0 g
KCl 1,24 g
Na2HPO4 0,2 g
KH2PO4 0,2 g
Aqua tridest. ad 1000 mL
Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS)
Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt (siehe oben) mit Aqua tridest. auf 1000 mL ergänzt.
Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen Paraformaldehyd 40 mg
PBS ad 1000 mL Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Acridinorange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung Acridinorange 250 mg
Ethidiumbromid 250 mg
PBS ad 100 mL
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Reinigungslösungen für die Durchflusszytometrie
Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit sterilfiltriertem Aqua tridest. (0,2 µm) und Natriumhypochlorit-Lösung (1% w/v) gespült.
Trägerflüssigkeit (Sheath fluid) für die Durchflusszytometrie
Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde sterilfiltriertes (0,2 µm) PBS mit 0,1 mg/mL NaN3 (Natriumazid) verwendet.
Propidiumjodid-Stammlösung
Die Propidiumjodid-Stammlösung (100 µg/mL Trägerflüssigkeit) wurde in aliquoten Teilen bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit entsprechende Teile der Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 4 µg/mL zu erreichen.
Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer) bovines Serumalbumin 5,0 g
NaN3 0,1 g
PBS ad 1000 mL
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
3.2.6 Antikörper
Monoklonale Antikörper (Primärantikörper)
Die eingesetzten monoklonalen Antikörper sind in Tab. 3 aufgeführt. Sie wurden zur Charakterisierung zellulärer Oberflächenstrukturen in der indirekten Membranimmunfluoreszenz und zur Herstellung von Referenzzellen für die absolute Zellzahlbestimmung eingesetzt.
Tab. 3: Monoklonale Antikörper mit Spezifität für bovine Zelloberflächenstrukturen Name Spezifität Isotyp Verdünnung1 Referenz
VPM65 boCD 14 Maus-IgG1 1:10 BERTHON u. HOPKINS
(1996)
CACT 83A boCD 4 Maus-IgM 1:5 NAESSENS u.
HOPKINS (1996) Bo 139 boMHC-Klasse-II Maus-IgG3 1:1 VON DER OSTEN
(1990)
CC63 boCD 8 Maus-IgG2a 1:10 HOWARD et al. (1991)
Bo 1 boMHC-Klasse-I Maus-IgG1 1:1 SCHUBERTH et al.
(1991)
1) Verdünnungen der Antikörper erfolgten in MIF-Puffer siehe S. 39
Nachweisantikörper (Fluorochrom-markierte Sekundärantikörper)
Als Sekundärantikörper für die indirekte Membranimmunfluoreszenz (siehe 3.3.7) dienten affinitätschromatographisch gereinigte, polyklonale Antikörperpräparationen:
Ziege-anti-Maus IgG und IgM (schwere und leichte Ketten) konjugiert mit Fluoreszeinisothiocyanat (Dianova Hamburg Nr. 115-015-068 siehe 3.2.3). Die eingesetzte Verdünnung betrug für den FITC konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörper in der Regel 1:100 (in MIF-Puffer, siehe 39). Zur Herstellung von Referenzzellen (siehe S. 50) wurde der Antikörper 1:40 verdünnt. Sollte bei einer Membranimmunfluoreszenz eine Fluoreszenz des Sekundärantikörpers im Fluoreszenzkanal 2 (FL 2) erreicht werden (für Mehrfachfluoreszenzanalysen), wurde ein Phycoerythrin (PE)-konjugierter Ziege-anti-Maus Antikörper (PE-conjugated-Affini-Pure-F(ab’)2-Fragment-Goat-anti- Mouse-IgG (H+L) Dianova Hamburg Nr. 115-116-146 siehe 3.2.3) eingesetzt (1:100 in MIF-Puffer). Die verwendeten Sekundärantikörper waren gegen Human-, Rinder- und Pferdeserumproteine absorbiert.
3.2.7 Material für das Transmigrationsverfahren
Percoll®
Bei Percoll® (siehe 3.2.3) handelt es sich um ein synthetisches Sol aus Polyvinyl- Pyrolidon-beschichteten Silikatpartikeln mit einem spezifischen Gewicht von 1,130 g/mL bei 20°C. Durch Zugabe von 0,9 g NaCl pro Liter Percoll® wurde die Isotonie erreicht (100%iges, isotones Percoll®).
Rekombinantes humanes Interleukin-8
Interleukin-8 (CXCL8) übt als Chemokin eine primär chemotaktische Wirkung auf neutrophile Granulozyten aus. Zum Einsatz kam rekombinantes humanes, lyophilisiertes Interleukin-8 (rhIL-8, 8,4 kDa, 72 Aminosäuren, siehe 3.2.3), das in PBS mit 0,1% BSA auf 1 µg/mL verdünnt und in aliquoten Teilen zu 1 mL bei –20°C eingefroren wurde. Vor Gebrauch wurde diese Lösung auf die benötigte Endkonzentration (0,1 µg/mL) mit PBS eingestellt.
