Eine Stimulation mononukleärer Zellen mit Stimulatoren bakterieller Herkunft (Superantigen, CpG-Motive, LPS etc.) führt zur Freisetzung löslicher Mediatoren, die zu einem beschleunigten Absterben neutrophiler Granulozyten in vitro führt (HENDRICKS 1998; SCHUBERTH et al. 2000). Dieses Phänomen erlaubt indirekte Aussagen darüber, ob MNC bioaktive, lösliche Faktoren freisetzten, welche die Überlebensrate der PMN negativ beeinflussen. Es sollte geprüft werden, ob die Mistelpräparate die Freisetzung der löslichen Mediatoren und damit die Absterbekinetik der neutrophilen Granulozyten beeinflussen.
Hierfür wurden MNC und PMN (1:1) für 24h in vitro mit SEA (Staphylokokken Superantigen A, vgl. S. 43) stimuliert. Parallelansätze enthielten die 3 geprüften Mistelpräparate in unterschiedlichen Konzentrationen. Anschließend wurden vitale neutrophile Granulozyten durchflusszytometrisch quantifiziert. Diese Versuche wurden exemplarisch mit Zellen zweier Tiere durchgeführt.
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Abb. 11: Einfluss von Mistelpräparaten auf das superantigeninduzierte, beschleunigte Absterben neutrophiler Granulozyten von zwei Tieren. Dargestellt sind Zahlen vitaler neutrophiler Granulozyten nach 24 h Kultur in vitro. Der Anstieg der Anzahl vitaler PMN in den höheren Konzentrationen von V. Fraxini und V. Mali ist auf die Reduktion der Anzahl vitaler MNC und den dadurch verringerten Einfluss auf die Vitalität der PMN zurückzuführen (Mittelwerte ± s von Triplikaten). Darstellung eines exemplarischen Versuches ohne statistische Analyse.
Das Superantigen SEA führte bei den zwei untersuchten Tieren in einer individuellen Art und Weise zu einer Reduktion der Zahl vitaler PMN nach 24 h (vgl. Abb. 11, Tier 1, Tier 2, schwarze und weiße Balken). Während V. Pini dieses beschleunigte Sterben nicht zu beeinflussen vermochte, wurde es durch V. Mali und V. Fraxini ab 15 µg/mL Presssaft, durch die Reduktion der Anzahl vitaler MNC (Daten nicht gezeigt) und die dadurch verminderte Freisetzung löslicher, die Vitalität der PMN negativ beeinflussender Mediatoren, vollständig aufgehoben.
4.3 Bindung von markierten Mistelinhaltsstoffen an Immunzellen des Rindes
Die erhobenen Daten zeigten, dass PMN funktionell und morphologisch durch die Mistelpräparate weitestgehend unbeeinflusst blieben. Unklar blieb, ob Mistelproteine oder Inhaltsstoffe anderer Substanzklassen nicht an diesen Zelltyp binden, oder ob eine hypothetische Bindung keinen Effekt bewirkt. Umgekehrt könnte die beobachtete drastische apoptotische Wirkung für Monozyten/Makrophagen darauf beruhen, dass wirksame Inhaltsstoffe besonders stark an entsprechende Rezeptoren der Zelloberfläche binden.
Um die Frage der Bindung näher zu beleuchten, wurden Mistelinhaltsstoffe (exemplarisch aus V. Fraxini) mit Fluorescein Isothiocyanat (FITC) markiert (siehe 3.3.10) und eine Membranfluoreszenz mit Gesamtleukozyten des Blutes durchgeführt.
Dies erfolgte im Vergleich mit kommerziell erhältlichen Einzellektinen. (siehe 3.3.11)
V. Fraxini
RCA
ConA
VVA
Fluoreszenzintensität
1:1000 1:100 1:10
0.1µg/mL 1µg/mL 10µg/mL
Si d e Scat ter
Gr
Mz Ly
Abb. 12: Konzentrationsabhängige Bindungsprofile von FITC-markierten V. Fraxini-Inhaltsstoffen und definierten FITC-markierten Lektinen.
Dotplots durchflusszytometrisch erfasster, markierter, boviner Leukozyten nach Gate auf morphologisch identifizierbare und vitale Zellen. RCA: Rizinus Communis Agglutinin; ConA:
Concanavalin A; VVA: Vicia Villosa Lectin. Mz: Monozyten; Ly: lymphoide Zellen; Gr:
Granulozyten. Exemplarischer Versuch mit Zellen eines Tieres.
FITC-markierte Inhaltsstoffe von Misteln banden an alle leukozytären Zellen des peripheren Blutes (neutrophile und eosinophile Granulozyten, lymphoide Zellen, Monozyten) mit vergleichbarer Bindungsstärke (vgl. Abb. 12). Pro Verdünnungsstufe der markierten Inhaltsstoffe (Faktor 10) nahm die Fluoreszenzintensität der Zellen ebenfalls um den Faktor 10 ab, wobei sich an der relativen Bindungsstärke zwischen MNC und PMN nichts änderte. Dies deutet darauf hin, dass die Mistelinhaltsstoffe etwa mit gleicher Affinität oder Avidität an die Hauptzellpopulationen boviner Leukozyten binden.
Von den drei kommerziell erhältlichen, FITC-markierten Lektinen wies Con A ein den Mistelproteinen ähnliches Bindungsverhalten auf: Das Lektin band mit gleicher Bindungsstärke an PMN und MNC. Ebenso war die Beziehung zwischen Verdünnung und relativer Bindungsstärke linear. Letzteres galt ebenso für die beiden Lektine RCA und VVA. Diese banden jedoch stärker an Granulozyten und Monozyten (RCA) oder nahezu selektiv an neutrophile Granulozyten (VVA), während die Bindung an lymphoide Zellen am schwächsten war. Das konzentrationsabhängige Bindungs-verhalten, und der Vergleich mit definierten Lektinen könnten darauf hin deutet, dass von den FITC-markierten Mistelproteinen im Wesentlichen Lektine an bovine Zellen banden und dass jede bovine Zellsubpopulation (lymphoide Zellen, Monozyten und Granulozyten) Rezeptoren (Zuckermotive) für diese Lektine auf der Zelloberfläche besitzt.
Eine weitere Bestätigung für die hauptsächliche Bindung von Lektinen an die verschiedenen Zellsubpopulationen wurde durch eine Koinkubation der FITC-markierten Mistelinhaltsstoffe mit den blockierenden Zuckern erbracht (vgl. 4.1.1). Die Bindung an die Zellen ließ sich durch die blockierenden Zucker hemmen. Dazu wurden bovine Leukozyten für 30 Minuten mit den verschiedenen Zuckern vorinkubiert und dann zusammen mit den markierten Mistelinhaltsstoffen für weitere 30 Minuten inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde die Veränderung der Fluoreszenzintensität in FL-1, als Maß für die Bindungsstärke, durchflusszytometrisch bestimmt. In der Auswertung wurden durch das Setzen entsprechender Regionen die vitalen neutrophilen Granulozyten und die vitalen lymphoiden Zellen identifiziert (siehe Abb. 13) und die
Veränderung der Fluoreszenzintensität im Histogramm getrennt für die beiden Subpopulationen dargestellt (siehe Abb. 14).
Propidiumjodid (FL-3)
Abb. 13: Identifizierung von Granulozyten und lymphoiden Zellen aus bovinen Gesamtleukozyten (linkes Bild) und Identifizierung von vitalen, Propidiumjodid-negativen Zellen (rechtes Bild) durch das Setzen entsprechender Gates im Dotplot.
Bei den vitalen neutrophilen Granulozyten ließ sich die mittlere Fluoreszenzintensität der Bindung der FITC-markierten Mistelinhaltsstoffe durch die beiden blockierenden Zucker Galactose (Gal) und der Mischung aus Galactose und N-Acetyl-D-Galactosamin (Gal/NacGal) um den Faktor zehn reduzieren. Auch der eingesetzte irrelevante Kontrollzucker Glucose (Glu) reduzierte die Fluoreszenzintensität, allerdings in deutlich geringerem Umfang als die blockierenden Zucker (siehe Abb. 14 A).
An den vitalen lymphoiden Zellen zeigten die markierten Mistelinhaltsstoffe ein vergleichbares Bindungsverhalten, wie an den vitalen neutrophilen Granulozyten.
Allerdings zeigte der Ansatz mit Glucose die gleiche Fluoreszenzintensität wie der Kontrollansatz ohne Zucker, bei dieser Zellsubpopulation reduzierte der Kontrollzucker die Bindungsstärke nicht (siehe Abb. 14 B).