SEA+Fraxini (0.15µg/mL)
5.3 Einfluss von Mistelpräparaten auf neutrophile Granulozyten
5.3.3 Fehlender Einfluss auf die Migration neutrophiler Granulozyten
Neutrophile Granulozyten sind die ersten Abwehrzellen, die im Falle einer adäquaten Stimulation durch ein entzündliches Geschehen in das Gewebe einwandern. Ein Einfluss von Mistelpräparaten auf das Migrationsvermögen von PMN könnte die Infektionsabwehr durch neutrophile Granulozyten beeinflussen. In den verschiedenen Untersuchungsansätze zur Beeinflussung des Migrationsvermögens von PMN durch Mistelinhaltsstoffe konnte jedoch allenfalls ein schwach signifikanter Einfluss auf die Zellen nachgewiesen werden (vgl. Kapitel 4.6). Die Tatsache, dass die PMN-Migrationsraten nur in sehr geringem Maße beeinflusst wurde in Ansätzen, in denen Mistelpräparat zum gewählten Chemotaktikum (rhCXCL8) in der unteren Kammer zugesetzt wurden, belegen zumindest, dass eine hemmende Interaktion mit dem in vivo wesentlichen Chemokin nicht stattfindet. Einzig in sehr hohen Konzentrationen kam es in dem Ansatz mit aufgereinigten PMN zu einer schwach signifikanten-, in dem Ansatz mit Leukozyten zu einer statistisch nicht relevanten Reduktion der Migrationsrate (vgl.
Abb. 25). Ansätze, in denen Mistelpräparat zu Leukozyten in der oberen Kammer zugesetzt wurden, blieben ebenfalls nahezu unbeeinflusst – neutrophile Granulozyten migrierten. Nur in dem Ansatz mit Gesamtleukozyten kam es zu einer schwach signifikanten Reduktion der Migrationsrate (vgl. Abb. 26). Dies lässt vordergründig den Schluss zu, dass Mistelpräparate keinen Einfluss auf die PMN-Chemotaxis besitzten, obwohl der Zelltod der monozytoiden und lymphozytären Zellen induziert wird (siehe Diskussion oben). Da zumindest Monozyten-Abkömmlinge eine Quelle des CXCL8 darstellen, könnten Mistelinhaltsstoffe durchaus in vivo zu einer Hemmung der Chemotaxis neutrophiler Granulozyten führen.
In der Literatur finden sich wenige und widersprüchliche Angaben über die Beeinflussung des Migrationsvermögens neutrophiler Granulozyten durch Mistelinhaltsstoffe. So beschrieb SCHMIDT (1989) eine Steigerung der Chemotaxis von Granulozyten nach Inkubation mit Mistelgesamtextrakt (Helixor®). Andere Untersuchungen kamen dagegen zu negativen Ergebnissen (WILDFEUER u.
MAYERHOFER 1994).
5.4 Ausblick
Mistelinhaltsstoffe beeinflussen im Wesentlichen bovine mononukleäre Zellen.
Dominiert zwar der zytotoxische Effekt höherer Konzentrationen, so können in niedrigen Dosen proliferationsmodulierende Effekte beobachtet werden.
Da ein Einsatz in der flankierenden Therapie neoplastischer Erkrankungen beim Rind eine eher untergeordnete Bedeutung besitzen dürfte, stellt sich die Frage eines möglichen Einsatzgebietes.
Die hier beobachteten Eigenschaften lassen diese Präparate durchaus als geeignete Modulatoren einer Immunantwort oder als adjuvante Zusatzstoffe im Rahmen von Impfungen erscheinen. Verschiedene Arbeitsgruppen haben sich mit dieser Fragestellung beschäftigt. Schon 1979 untersuchten BLOKSMA et al. die adjuvanten Eigenschaften der Mistelpräparation Iscador®. Sie fanden eine erhöhte Zellantwort in Mäusen auf eine intrakutane Immunisierung mit Schafs-Erythrozyten. Es kam zu einer schnelleren IgM-Bildung, gefolgt von einer Vermehrung der IgG- und IgA-sezernieren-den B-Zellen.
In weiteren Studien wurden Mistel-Lektine als potente Adjuvantien für die mukosale Immunisierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die intranasale Ko-applikation von Mistellektinen die Immunantwort auf Herpes simplex-Virusprotein gD2 oder Ovalbumin beeinflusst und zu höheren Titern an spezifischen Antikörpern in Seren und Sekreten führte. Alle drei Isoformen der Typ-2 Mistellektine von Viscum album L.
(ML I, ML II und ML III) erwiesen sich als effektive Adjuvantien bei intranasaler und oraler Applikation. ML I verstärkte die lokale und systemische Th-2-Antwort auf
Antigene mit einer gesteigerten antigenspezifische Proliferation und einer erhöhten IL-5-Produktion in der Milz und in zervikalen Lymphknoten. Bisher untersuchte Non-Typ-2-Lektine erwiesen sich als schlechte Antigene und Adjuvanzien bei intranasaler Applikation. (LAVELLE et al. 2000; LAVELLE et al. 2001). Auch bei der subkutanen Immunisierung erwiesen sich Mistellektine als adjuvant und die Immunantwort polarisierend (YOON 2001).
Um Miststelpräparate auf eventuelle immunstimulatorische oder immunmodulatorische Eigenschaften bei Rindern zu prüfen, wird vorgeschlagen Rinder mit einem Modellantigen mit und ohne Zusatz eines Mstelpräparates zu immunisieren. Antikörper gegen das Modellantigen sollten dann mittels ELISA nach IgG-Isotypen getrennt qualitativ und quantitativ analysiert werden.
6 Zusammenfassung
Angelika Fischer: Charakterisierung der immunmodulatorischen Wirkung von Mistelpräparaten auf Zellen des Immunsystems von Rindern
Mistelpräparate (Viscum album) besitzen immunmodulatorische Eigenschaften für humane und murine Zellen. Über die Wirkung von Mistelpräparaten auf bovine Immunzellen liegen noch keine Studien vor. In dieser Arbeit wurde daher der Einfluss von Mistelinhaltsstoffen auf Zellen des Immunsystems von Rindern geprüft. Die Beeinflussung von Absterbekinetik, Proliferationsverhalten und funktionellen Parametern boviner Leukozyten des peripheren Blutes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) und mononukleäre Zellen (MNC)) durch Mistelpräparate wurde untersucht. Zur Verfügung standen drei Mistelpräparate (ABNOBAviscum Mali-2, Fraxini-2 und Pini-2), die sich hinsichtlich ihres Gehaltes an Mistellektinen und Viscotoxinen unterscheiden.
Bindungsstudien zeigten, dass FITC-markierte Mistelinhaltsstoffe mit gleicher Affinität an PMN, lymphoide und monozytoide Zellen des peripheren Blutes banden.
Inhibitionsstudien mit spezifischen Zuckern belegten, dass in erster Linie Mistellektine für die Bindungsreaktionen an bovine Leukozyten verantwortlich waren.
Ein funktioneller Einfluss auf die PMN konnte nicht gezeigt werden. Die Sterberate dieser Zellen wurde in Anwesenheit der verschiedenen Mistelpräparate in unterschiedlichen Konzentrationen in Reinkulturen von PMN oder in Mischkulturen aus PMN und MNC untersucht. Keines der drei geprüften Mistelpräparate konnte nach 22 h Inkubationszeit einen beschleunigten PMN-Zelltod induzieren. Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) nach rezeptorunabhängiger Stimulation mit Phorbol-Myristat-Acetat wurde nur in sehr hohen Konzentrationen schwach signifikant beeinflusst; Eine Beeinflussung der Fc-Rezeptor-abhängigen Stimulation mit opsonisierten Bakterien wurde nicht beobachtet. Auch das Migrationsvermögen der PMN, geprüft mit einem quantitativen Transmigrationsverfahren, wurde kaum beeinflusst. Dies war unabhängig
davon, ob das Mistelpräparat zusammen mit Zellen oben, oder zusammen mit dem Chemokin (rhCXCL8) unten in der Transmigrationskammer eingesetzt wurde.
Die Mistelpräparate reduzierten dosisabhängig stark die Zahl vitaler boviner mononukleärer Zellen in vitro. Am potentesten erwiesen sich die Präparate V. Fraxini und V. Mali, welche schon in einer Konzentration von 0,15 µg/mL die Anzahl vitaler Zellen signifikant reduzierten. V. Pini bewirkte erst in einer Konzentration von 150 µg/mL einen signifikanten Zellverlust. Ob MNC in Reinkultur oder zusammen mit PMN inkubiert wurden, hatte bei V. Pini auf die mistelinduzierte MNC-Absterbekinetik keinen Einfluss, V. Fraxini und V. Mali wirkten in Kokulturen erst ab 1,5 µg/mL zelltoxisch. Der zytotoxische Effekt konnte durch lektinspezifische Zucker gehemmt werden. Die Zytotoxizität bei 1,5 µg/mL betraf signifikant CD14+ Monozyten und CD8+ T-Zellen. Weniger empfindlich erwiesen sich CD4+ T-Zellen und nonT/non-B-Zellen, die erst ab 5µg/mL signifkant verstärkt abstarben.
Die durchflusszytometrische, quantitative Analyse vitaler Zellen und Blasten nach in vitro Stimulation boviner MNC belegte zunächst keinen proliferationsfördernden Einfluss subapoptotischer Mistelpräparatkonzentrationen. Nach Analyse der Zellteilungsraten mit Hilfe Carboxy-Fluorescein-succimidyl-Ester-gefärberter MNC erwies sich eine V. Fraxini-Konzentration von 0,15 µg/mL als teilungsfördernd für Superantigen-, nicht jedoch für Mitogen (Concanavalin A)-stimulierte MNC. Dies deutet darauf hin, dass Mistellektine die T-Zellrezeptor-abhängige Stimulation modulieren können.
Das beobachtete Wirkungsspektrum der untersuchten Mistelpräparate für bovine PMN und MNC weist teilweise deutliche Unterschiede zu humanen und murinen Zellen auf.
Gemeinsam ist jedoch die subtile Beeinflussung der zellulären Aktivierung besonders in niedrigen Konzentrationsbereichen. Diese Eigenschaft lassen Mistelpräparate durchaus als geeignete Modulatoren einer Immunantwort oder als adjuvante Zusatzstoffe für Impfungen erscheinen, was bereits in murinen Modellen erfolgreich belegt wurde.
7 Summary
Angelika Fischer: Characterization of immunmodulatory effects of mistletoe products on bovine immune cells
Mistletoe preparations (Viscum album) have immunomodulatory properties for human and murine cells. Up to now, no studies have been performed with bovine immune cells.
Therfore this work focuses on such effects concerning three different mistletoe preparations (ABNOBAviscum Mali-2, Fraxini-2 und Pini-2) containing varying contents of mistletoe lectins and viscotoxins.
The investigations covered the induction of cellular death, cellular proliferation and other functional properties of bovine blood leukocytes (neutrophilic granulocytes, PMN, and mononuclear cells, MNC). Inhibition assays revealed that specific sugars compete with binding of mistletoe compounds, proving that mainly lectins account for the binding to bovine leukocytes. Labelling studies proved that mistletoe lectins bind with comparable affinity and strength to all bovine leukocyte subsets.
Mistletoe products reduced significantly the numbers of viable bovine mononuclear cells. The most potent appeared to be V. Fraxini and V. Mali, killing the cells significantly at 0.15 µg/mL, followed by V. Pini (effective concentration: 150 µg/mL).
Neither MNC monoculture nor in coculture with PMN had effects on the killing induced by V. Pini. In cocultures V.Fraxini and V. Mali revealed a cytotoxic effect at a concentration higher than 1.5 µg/mL. The cytotoxic effect could be inhibited significantly by mistletoe lectin-specific sugars. Cytotoxicity at 1.5 µg/mL affected significantly CD14+ monocytes and CD8+ T cells, and at higher concentrations (5µg/mL) also CD4+ T cells and nonT/non-B cells.
In contrast none of the mistletoe products showed cytotoxic effects on PMN whether they were cultured alone or in combination with MNC. In addition, the generation of reactive oxygen species after receptor independent stimulation with phorbol myristate acetate was only moderately reduced by high concentrations of mistletoe products. No effects were seen on the Fc receptor-dependent stimulation with opsonised bacteria. The in vitro transmigration towards recombinant human CXCL8 remained largely unaffected, whether mistletoe products were used in combination with cells in the upper chamber or with rhCXCL8 in the lower chamber.
Quantitative flow cytometric analysis did not reveal a proliferation-enhancing effect of subapoptotic mistletoe product concentrations for in vitro stimulated MNC. However, analysis of cellular division rates after carboxy-fluorescein-succimidyl-ester labelling revealed that a low V. Fraxini concentration (0.15 µg/mL) enhanced the cellular division rate for superantigen-, but not for mitogen-stimulated MNC. These still preliminary data are pointing towards a modulation of the T-cell receptor-mediated stimulation by mistletoe lectins.
The observed effects on MNC are in part comparable to published findings in humans, whereas the complete lack of PMN modulation seems to be unique for cattle. The differential modulation of activation, proliferation and apoptosis of cells of the adaptive immune response indicate that mistletoe products interfere with key structures in activating and sustaining immunological responses in cattle – eventually advantageous as novel adjuvant compounds in vaccines or as mediators of immune polarization as successfully proved in murine models.
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