Aus dem Institut für Reproduktionsbiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
der Abteilung für Gynäkologische Endokrinologie und Reproduktionsmedizin der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
___________________________________________________________________
Polarisationsmikroskopische Untersuchungen zur Qualität humaner und boviner Eizellen
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Maria Köster
aus Kleve
Hannover 2008
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Burkhard Meinecke
PD Dr. Markus Montag
1. Gutachter: Prof. Dr. Burkhard Meinecke 2. Gutachter: PD Dr. Christine Wrenzycki
Tag der mündlichen Prüfung: 19. Mai 2008
Für meine Eltern
und Geschwister
Mit der Zeit wird aus Gras Milch.
(Sprichwort)
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG...1
2 LITERATURÜBERSICHT...3
2.1 Oogenese...3
2.2. Maturation und ihre Regulation...4
2.2.1 Nukleäre Maturation...5
2.2.2 Cytoplasmatische Maturation...6
2.3. Aktivierung...7
2.3.1 Physiologische Aktivierung...7
2.3.2 Artifizielle Aktivierung...8
2.4 Frühembryonale Entwicklung...10
2.5 Meiotische Spindel...12
2.5.1 Physiologische Grundlagen...12
2.5.2 Bedeutung der Spindelpräsenz...13
2.5.3 Lokalisation der Spindel in der maturen Eizelle...14
2.5.4 Spindelmorphometrie...14
2.5.5 Einfluss der in vitro Maturation...15
2.5.6 Polarisationsmikroskopische Studien über die bovine Spindel...15
2.6 Zona pellucida...15
2.6.1 Morphologie und Genese der Zona pellucida...16
2.6.2 Funktion der Zona pellucida...17
2.6.3 Zona hardening...18
2.6.4 Polarisationsmikroskopische Untersuchungen...19
2.7 Evaluation der Eizell-Qualität...20
2.7.1 Follikel...21
2.7.2 Cumulus-Oocyten-Komplex...21
2.7.3 Morphologie der Eizelle...21
2.7.4 Polkörperdiagnostik...22
2.8 Das Rind (Bos taurus) als Tiermodell...23
3 MATERIAL UND METHODEN...24
3.1 Untersuchungen an humanen Oocyten...24
3.1.1 Gewinnung und Präparation der in vivo maturierten Oocyten...24
3.1.2 Polarisationsmikroskopische Spindel- und Zona pellucida-Analyse...25
3.1.3 Gewinnung und Präparation der paternalen Gameten...26
3.1.4 Intracytoplasmatische Spermieninjektion...26
3.1.5 Vorkernbeurteilung und in vitro Kultivierung...27
3.1.6 Embryotransfer und Graviditätsermittlung...27
3.1.7 Untersuchung der Spindeldynamik in Metaphase II-Eizellen...28
3.1.8 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie...28
3.1.9 Versuche mit therapeutisch nicht verwendbaren Oocyten...29
3.1.9.1 Zeitrafferstudie von Metaphase I-Eizellen...29
3.1.9.2 Parthenogenetische Aktivierung...29
3.1.9.3 Zona pellucida-Imaging bei immaturen Oocyten...30
3.2 Untersuchungen an bovinen Oocyten...31
3.2.1 Gewinnung der bovinen immaturen Cumulus-Oocyten-Komplexe...31
3.2.2 In vitro Maturation...31
3.2.3 Polarisationsmikroskopische Ermittlung des Maturationsstatus und Zonaparameter...32
3.2.4 Parthenogenetische Aktivierung...32
3.2.4.1 Einzelaktivierung nach Spindel- und Zona-Imaging...32
3.2.4.2 Gruppenaktivierung vor Zona-Imaging...33
3.2.5 In vitro Kultivierung im MiniWell-System...33
3.2.6 Beurteilung der DNA-Konfiguration mit Hoechst 33342...34
3.2.7 Fluoreszenzoptischer Nachweis der initialen [Ca2+]i-Freisetzung...34
3.2.8 Brilliant Cresyl Blue-Färbung immaturer Oocyten...35
3.2.9 In vitro Fertilisation...…...36
3.3 Statistische Auswertung...37
4 ERGEBNISSE...38
4.1 Ergebnisse der Untersuchungen an humanen Oocyten...38
4.1.1 Polarisationsmikroskopische Analyse der meiotischen Spindel...38
4.1.1.1 Spindeldynamik im Verlauf der Maturation humaner Oocyten...38
4.1.1.2 Spindeldynamik in humanen Metaphase II-Oocyten vor ICSI...39
4.1.1.3 Ergebnisse nach ICSI in Abhängigkeit von der Spindeldynamik...39
4.1.1.4 Auswirkung der Eizell-Aktivierung während der Spindelbrückenphase...39
4.1.2 Zona pellucida-Imaging humaner Oocyten...41
4.1.2.1 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie...41
4.1.2.2 Zona pellucida-Imaging immaturer humaner Oocyten...42
4.2 Ergebnisse der Untersuchungen an bovinen Oocyten...44
4.2.1 Einfluss des Meiosestadiums boviner Oocyten bei parthenogenetischer Aktivierung...44
4.2.1.1 Auswirkung der Maturationsdauer boviner Oocyten auf den Aktivierungserfolg....44
4.2.1.2 Ergebnisse nach Aktivierung in Abhängigkeit vom Maturationsstadium...44
4.2.1.3 Hoechst-Färbung 20 h nach Aktivierung boviner Oocyten...46
4.2.1.4 Messung der initialen Ca2+-Freisetzung in bovinen Oocyten...47
4.2.2 Zona pellucida-Imaging boviner Oocyten...49
4.2.2.1 Zona pellucida-Imaging immaturer boviner Oocyten nach BCB-Färbung...49
4.2.2.2 Zona pellucida-Imaging maturer boviner Oocyten...50
4.2.2.3 Vergleich der parthenogenetischen Entwicklung nach Zona pellucida-Imaging...50
4.2.2.4 Zona pellucida-Imaging 21 h p.ins. – Vergleich der frühembryonalen Entwicklung...51
5 DISKUSSION...54
5.1 Meiotische Spindel in humanen Oocyten...54
5.2 Zona pellucida in humanen Oocyten...57
5.3 Maturationsstatus als Qualitätsmerkmal der bovinen Eizelle...58
5.4 Zona pellucida in bovinen Oocyten...62
5.5 Vergleichsmöglichkeiten zwischen humaner und boviner Zona pellucida...65
6 ZUSAMMENFASSUNG...67
7 SUMMARY...70
8 LITERATURVERZEICHNIS...73
9 ANHANG...97
9.1 Material...97
9.1.1 Reagenzien...97
9.1.2 Zusammengesetzte Reagenzien...98
9.1.3 Verbrauchsmaterialien...99
9.1.4 Geräte...100
9.1.5 Software...100
9.2 Abbildungsverzeichnis...101
9.3 Tabellenverzeichnis...102
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
Abs. Absorption
AM Acetomethylester
ART Assisted Reproductive Technology BCB Brilliant Cresyl Blue
BSA Bovines Serumalbumin
c centi
°C Grad Celsius
Ca Calcium
cAMP Cyclisches AdenosinMonoPhosphat Cai intrazelluläres Calcium
cdc2 Cell-Division-Cycle-Gene 2
COC Cumulus-Oocyten-Komplex
CR1aa Kulturmedium nach Charles Rosenkrans
cRNA complementary RNA
CSF Cytostatic Factor
d Tag
dd bidestilliert
DMAP 6-Dimethylaminopurin
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
D-PBS Dulbecco’s Phosphate buffered Saline
Emis. Emission
FSH Follikel stimulierendes Hormon g Gramm
GnRH Gonadotropin Releasing Hormon
G6PDH Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase
GV GerminalVesikel
GVBD GerminalVesicle BreakDown h Stunde
hCG humanes Choriongonadotropin
HEPES N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N’-[Ethansulfonsäure]
hMG humanes Menopausalgonadotropin ICSI Intracytoplasmatische Spermieninjektion IE Internationale Einheit
IU International Unit
IP3 Inositol-1,4,5-Trisphosphat IVM In vitro Maturation
IVF In vitro Fertilisation IVP In vitro Produktion l Liter
LH Luteinisierendes Hormon
M Molar
m Meter
m milli
min Minuten
µ micro
MAP Mitogen Aktivated Protein MPF Maturation Promoting Factor
mRNA messenger RNA
MTOC Mikrotubulusorganisationszentrum p pico
p Probabilität (Irrtumswahrscheinlichkeit) PLCζ Phospholipase C zeta
p.ins. post inseminationem
p.ov. post ovulationem
PVP Polyvinylpyrrolidon
RNA Ribonukleinsäure
s Sekunde
SD Standardabweichung
Tab. Tabelle
TCM Tissue Culture Medium
vs. versus
WHO World Health Organization x Mittelwert
ZP Zona pellucida
1 Einleitung
Der maternale wie auch der paternale Gamet sind hochdifferenzierte Zellen und Ursprung eines jeden Individuums. Im Gegensatz zur kontinuierlichen Spermiogenese ist der Gametenpool im Ovar jedoch von Geburt an limitiert. Bereits Anfang des 20. Jahrhunderts wurde die besondere Bedeutung der Eizelle für die frühembryonale Entwicklung erkannt und postuliert, dass die Embryogenese schon während der Oogenese beginnt. Um erfolgreich von einem Spermatozoon befruchtet zu werden, muss die Oocyte vorher einen komplexen Reifungsprozess durchlaufen. Dabei wird einerseits die Meiose eingeleitet und der diploide Chromosomensatz reduziert, was auch als nukleäre Maturation definiert wird. Parallel dazu findet andererseits die cytoplasmatische Maturation statt, die sich in einer Vielzahl von molekularen und strukturellen Veränderungen im und um das Ooplasma widerspiegelt.
Können die Maturationsvorgänge nicht koordiniert ablaufen, kann die Eizelle nicht physiologisch auf das Spermatozoon reagieren.
Nachdem 1978 mit der Geburt von Louise Brown die extrakorporale Fertilisation Realität wurde, hat sich die Reproduktionsmedizin stetig weiter entwickelt. Doch obwohl mit Etablierung der intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) die assistierte Reproduktion zusätzlich revolutioniert wurde (PALERMO et al. 1992), liegt die durchschnittliche klinische Schwangerschaftsrate in Deutschland bei etwa 28 % und die letztendlich entscheidende Baby- take-home-Rate bei ca. 18 % (FELBERBAUM et al. 2007). Um dies weiter zu optimieren, liegt ein Schwerpunkt der Forschung auf der Suche nach objektiven Beurteilungskriterien der Eizell-Qualität. Ein prognostischer Marker zur Identifizierung der Eizelle mit dem höchsten Entwicklungspotential könnte idealerweise zur Geburt eines Kindes nach Transfer nur eines Embryos führen, was zudem die Mehrlingsproblematik egalisieren würde.
Auch in der Veterinärmedizin gewinnen seit der Geburt des ersten in vitro produzierten Kalbes im Jahr 1982 die biotechnologischen Verfahren immer mehr an Bedeutung. Die in vitro Produktion boviner Embryonen ermöglicht durch die verstärkte Nutzung genetisch bedeutender weiblicher Tiere einen schnelleren züchterischen Fortschritt und ist Ausgangspunkt für weitere Biotechniken sowie Basisforschung. Die durchschnittlich erreichte Blastozystenrate von 25 bis 40 % könnte durch eine effiziente Selektion der qualitativ guten Eizellen mit Hilfe eines prognostischen Kriteriums weiter optimiert werden.
Die Polarisationsmikroskopie ermöglicht die non-invasive Darstellung von hoch geordneten und damit optisch anisotropen Molekülverbänden. Durch eine weiter entwickelte Technologie ist in den letzten Jahren die klinische Anwendung in der assistierten Reproduktion möglich geworden.
Visualisierbar in polarisiertem Licht ist die meiotische Spindel der Eizelle (Hamster, Maus, Mensch, Rind: LIU et al. 2000a), essentiell für die korrekte Chromosomensegregation und zusammen mit einem abgeschnürten ersten Polkörper morphologisches Zeichen der maturen Eizelle. In der Literatur wird sie überwiegend mit einer höheren Fertilisations- und Entwicklungsrate assoziiert (Mensch: WANG et al. 2001a). Trotzdem wird die qualitative und prognostische Bedeutung hinsichtlich des Entwicklungspotentials diskutiert. Ein Grund für widersprüchliche Ergebnisse könnte in der statischen Erfassung dieser dynamischen Struktur liegen.
Licht- und polarisationsmikroskopisch darstellbar ist die extrazelluläre Zona pellucida, eine Syntheseleistung des Cytoplasmas der heranreifenden Eizelle (Hamster: KEEFE et al. 1997, Mensch: PELLETIER et al. 2004). In polarisiertem Licht ist ihre konzentrische Schichtung erkennbar. In zwei retrospektiven humanmedizinischen Studien wurden die doppelbrechenden Eigenschaften der inneren Zonaschicht mit Blastozystenrate und Gravidität korreliert (RAMA RAJU et al. 2007, SHEN et al. 2005). Somit könnte die polarisations- mikroskopische Analyse der Zona pellucida eine klinisch anwendbare Möglichkeit zur Beurteilung der Eizell-Qualität sein.
Ziel dieser Arbeit war es zum einen, die meiotische Spindel humaner und boviner Eizellen als qualitativen Marker der nukleären Maturation zu untersuchen. Dazu wurde polarisationsmikroskopisch die Spindeldynamik analysiert und die Auswirkung der Eizell- Aktivierung in Abhängigkeit vom Meiose-Stadium beobachtet. Zum anderen sollte geprüft werden, ob die humane und bovine Zona pellucida durch eine Beurteilung in polarisiertem Licht ein Kriterium für die cytoplasmatische Maturation und damit Eizell-Qualität ist. Hierfür wurde eine prospektive Studie an humanen Oocyten durchgeführt. Außerdem wurde die bovine Zona pellucida in unterschiedlichen Stadien der Maturation objektiv beurteilt und mit der frühembryonalen Entwicklung nach in vitro Fertilisation (IVF) sowie nach parthenogenetischer Aktivierung in Relation gesetzt.
2 Literaturübersicht
2.1 Oogenese
Die Oogenese beschreibt die Entstehung von haploiden Oocyten aus diploiden Urkeimzellen und gliedert sich in eine Periode der mitotischen Vermehrung und eine Phase der meiotischen Differenzierung (PSCHYREMBEL 1994, LÜLLMANN-RAUCH 2003).
Die Entwicklung beginnt bereits während den ersten Furchungsteilungen durch die Bildung des „germinativen Plasmas“ in einigen Blastomeren, aus dem die Urkeimzellen hervorgehen (PICTON u. GOSDEN 1995). Diese Primordialkeimzellen, die sich durch ihre Morphologie (Größe, große Nucleus/Cytoplasma-Relation) sowie einen hohen Gehalt an alkalischer Phosphatase und Glykogen von den kleineren somatischen Zellen unterscheiden, sind bei Mammaliae zunächst extragonadal im Dottersackentoderm lokalisiert (LEICHTHAMMER et al. 1990). Vorwiegend durch amöboide Bewegung wandern sie in die Gonadenanlage ein – beim menschlichen Embryo bis zum Ende der 4. Woche (SCHNORR u. KRESSIN 2006).
Dort erfolgen im Cortex neben der Differenzierung zu Oogonien weitere mitotische Teilungen. Noch pränatal treten die Oogonien in die Prophase der ersten meiotischen Teilung ein und werden dann als primäre Oocyten definiert, die mitotisch inaktiv sind. Damit ist die Gesamtzellzahl an weiblichen Keimzellen festgelegt; sie wird beim Mensch im 5. Monat der Gravidität mit einem Maximum von ca. 7 Millionen angegeben (LÜLLMANN-RAUCH 2003). Bis zur Geburt hat sich diese Zahl durch kontrollierten Zelluntergang bereits auf etwa eine Million vermindert (BAKER 1982, HIMELSTEIN-BRAW et al. 1976). Die primären Oocyten arretieren über Jahre im Diplotän-Stadium der Prophase I (Germinalvesikel- Stadium), bis die präovulaturische Follikelreifung durch postpuberale hormonelle Einflüsse einsetzt. Während dieses Diktyotäns sind die Eizellen bei Mensch und Rind etwa 30 bis 50 µm groß und von einschichtigen flachen Epithelzellen sowie einer Basalmembran umgeben.
Diese funktionelle Einheit wird als Primordialfollikel bezeichnet. Während der reproduktiven Lebensphase wird jeweils ein Teil der Primordialfollikel für die weitere Follikulogenese rekrutiert. Das einschichtige Follikelepithel wird kubisch bis hochprismatisch (Primärfollikel), schließlich mehrschichtig (Sekundärfollikel) und bildet Liquor follicularis (Tertiärfollikel; BUCHER u. WARTENBERG 1989). Die Eizelle selbst zeichnet sich durch
eine sehr hohe Syntheseleistung und einen regen Metabolismus aus. Morphologisch zeigt sie eine mehr als 100-fache Volumenzunahme. In dieser Phase wird außerdem die extrazelluläre Zona pellucida gebildet (WASSARMAN u. ALBERTINI 1994, ERICKSON 1986, GOUGEON 1996). Im ovulationsfähigen Graafschen Follikel wird durch die präovulatorische LH-Freisetzung (Luteinisierendes Hormon) die Meiose I fortgesetzt; dabei entsteht durch ungleiche Cytokinese die sekundäre Oozyte mit einem haploiden Chromosomensatz und der erste Polkörper (TSAFRIRI et al. 1982). Es folgt der Beginn der zweiten meiotischen Teilung, die im Metaphase II-Stadium arretiert. Die Ovulation erfolgt, und die Eizelle mit umgebenden Cumuluszellen (Cumulus-Oocyten-Komplex, COC) gelangt in die Tuba uterina (SCHNORR u. KRESSIN 2006). Physiologisch wird die Eizelle erst durch ein penetrierendes Spermatozoon aktiviert, was den Abschluss der Meiose II mit Abschnürung des zweiten Polkörpers initiiert (THIBAULT et al. 1987). Bei den monoparen Spezies Rind und Mensch gelangt in der Regel nur ein Follikel pro Zyklus zur Ovulation, die anderen verfallen der Atresie (BYSKOV 1978).
2.2 Maturation und ihre Regulation
Die Zeitspanne von der Aufhebung des 1. meiotischen Arrests mit beginnender Auflösung der Kernmembran (GVBD, Germinal Vesicle Breakdown) bis zum 2. Arrest wird als Maturation definiert. Während dieser Phase finden sowohl die nukleären als auch die finalen cytoplasmatischen Reifungsprozesse statt, die die Eizelle zur Fertilisation und der weiteren embryonalen Entwicklung befähigen (CARROLL et al. 1996, TROUNSON et al. 2001, SIRARD et al. 2006).
Es ist inzwischen allgemein anerkannt, dass ein hoher intrazellulärer cAMP-Spiegel den primären Arrest aufrechterhält (CONTI et al. 2002). Hingegen sind die fein aufeinander abgestimmten regulativen Mechanismen der Maturation seit Jahren zentraler Schwerpunkt der Forschung (FULKA et al. 1998, TROUNSON et al. 2001, MEHLMANN 2005). Es scheint, dass hier der zentrale Regulationsweg im Tierreich im Verlauf der Evolution konserviert wurde, jedoch existieren diverse speziesspezifische Unterschiede in den komplexen molekulären Kaskaden (FULKA et al. 1998, SIRARD et al. 2006).
2.2.1 Nukleäre Maturation
In vivo wird die Wiederaufnahme der Meiose durch den präovulatorischen LH-Peak ausgelöst. Über LH-Rezeptoren findet eine Signaltransduktion statt, die zur Phosphorylierung von Connexin43-Proteinen führt. Dadurch wird die Kommunikation zwischen Oocyte und Cumuluszellen über die Gap Junctions mehr und mehr reduziert (GRANOT u. DEKEL 1994, 2002). Der intrazelluläre cAMP-Level sinkt. Dies bedingt die Aktivierung des Maturation Promoting Factor (MPF). Der MPF ist ein Serin-Threonin-Kinase-Heterodimer und wurde bereits vor 37 Jahren identifiziert (MASUI u. MAKERT 1971). Eine Untereinheit bildet die enzymatische Komponente (p34cdc2), eine die regulatorische (Cyclin B). Die Aktivierung erfolgt neben der Assoziation über eine Dephosphorylierung von p34cdc2 und einer Phosphorylierung von Cyclin B (GAUTIER et al. 1990, CLARKE u. KARSENTI 1991).
Über weitere Zwischenschritte initiiert der MPF den GVBD, die Kondensation des Chromatins und die progressive Organisation von Mikrotubuli zu einer bipolaren Spindel (MURRAY u. HUNT 1993). Außerdem wird die Transkription durch Inhibition der RNA- Polymerase II minimiert (CISEK u. GORDEN 1989). Beim Übergang in die Telophase I wird die MPF-Aktivität durch proteolytischen Abbau von Cyclin B und Dissoziation der Untereinheiten kurzzeitig drastisch reduziert (CHOI et al. 1991, WINSTON 1997). Dies wird durch einen Kontrollmechanismus bewirkt, der in der Literatur „Spindle assembly checkpoint“ genannt wird (FULKA et al. 1998, BRUNET u. MARO 2005). Durch Enzyminhibierung wird die Cyclin B-Degradation verhindert, bis die Chromosomen korrekt in der Metaphase-Position und über die Kinetochore mit Spindelfasern assoziiert sind. Dann folgt die Aufhebung der Inhibierung und so die Degradation von Cyclin B, was die Abschnürung des ersten Polkörpers möglich macht (LEDAN et al. 2001, HERBERT et al.
2003). Anschließend steigt die MPF-Aktivität durch die Synthese von Cyclin B wieder. Für die Beibehaltung des hohen Niveaus von aktivem MPF spielt beim 2. Arrest das Proto- Onkogen c-mos eine Rolle. Es kodiert eine Serin-Threonin-Protein-Kinase, die Cyclin B phosphoryliert und die Mitogen-activated Protein Kinase (MAP-Kinase) aktiviert. Außerdem wird ihr eine positive Interaktion mit dem CSF (Cytostatic factor) zugeschrieben, so dass sie über mehrere Effekte zum Arrest beiträgt (ROY et al.1990, 1996). Der CSF ist ebenfalls ein Faktor, der den MPF während des Arrestes stabilisiert (TROUNSON et al. 2001). Die MAP- Kinase-Aktivität nimmt langsamer zu als die MPF-Aktivität. Es ist eine Serin-Threonin-
Kinase, die primär extrazellulär über eine Proteinkinase-Kaskade reguliert wird. Ihr kommt verstärkend zum MPF eine Rolle bei der Assozitation der Spindel und der Mikrotubuli- Dynamik sowie der Kondensation der Chromosomen zu (VERLHAC et al. 1993, DEDIEU et al. 1996). So verbleibt die Eizelle post ovulationem (p.ov.) bis zu ihrer Aktivierung im Metaphase II-Arrest.
In vitro fehlt der initiale Stimulus von LH, jedoch wurde schon 1935 nachgewiesen, dass Eizellen spontan den Arrest überwinden können (PINCUS u. ENZMANN 1935). Bei der Spezies Rind haben Eizellen mit einem Eizell-Durchmesser ab 100 µm aus antralen Follikeln die Fähigkeit, die Maturation in vitro zu vollenden. Präantrale Follikel besitzen diese Fähigkeit nicht (FAIR et al. 1995). Es wird postuliert, dass das Follikelmilieu einen inhibitorischen Einfluss ausübt, bis neben den nukleären auch die cytoplasmatischen Veränderungen so weit abgeschlossen sind, dass die Eizelle bereit für die Befruchtung und die Entstehung eines neuen Individuums ist (RICHARD u. SIRARD 1996, RODRIGUEZ u.
FARIN 2004).
2.2.2 Cytoplasmatische Maturation
Die vorbereitenden Ereignisse im Ooplasma sind ebenso bedeutend wie die korrekte Reduktion des Chromosomensatzes während der Meiose. Viele der Reaktionen sind jedoch lichtmikroskopisch nicht zu erkennen (SIRARD et al. 2006).
Durch eine hohe Transkription findet eine Akkumulation von RNA, insbesondere mRNA statt. Mit Aufhebung des 1. Arrests wird die RNA-Synthese durch die steigende Aktivität des MPF blockiert. Die Regulation der Translation findet vorwiegend über die Länge der Polyadenylierung statt. So wird kontrolliert ein Pool diverser Proteine hergestellt. Es findet eine Umorganisation der Zellorganellen statt; die Zahl der Mitochondrien steigt, Cortical- Granula werden gebildet. Ca2+-Speicher werden im endoplasmatischen Retikulum angelegt und gegen Ende der Maturation peripher in die Cortikalregion umgelagert, parallel dazu findet eine Konzentraion von membranständigen Inositol-1,4,5-Trisphosphat-Rezeptoren (IP3- Rezeptoren) statt (SHIRAISHI et al. 1995). Zusätzlich zum zellinternen Metabolismus gibt es einen Austausch mit den somatischen Zellen des Follikels (WASSERMANN u. ALBERTINI 1994, FAIR et al. 1995, RICHARD u. SIRARD 1996).
Durch die Gesamtheit dieser Prozesse wird so die Basis nicht nur für die Aktivierung der Eizelle, sondern auch für die spätere embryonale Genom-Aktivierung und Entwicklung gelegt (SIRARD et al. 2006).
2.3 Aktivierung
2.3.1 Physiologische Aktivierung
In vivo findet die Befruchtung durch ein Spermatozoon in der Eileiterampulle statt. Dieses wird durch die Kapazitation befähigt, an einen Rezeptor der Zona pellucida zu binden und durch die anschließende Akrosomenreaktion in den perivitellinen Spalt vorzudringen. Mit der Anlagerung an das Oolemm und der Fusion der Zellmembranen im postakrosomalen Bereich gelangt zum einen der paternale haploide Chromosomensatz in die Eizelle (YANAGIMACHI 1994), zum anderen induziert eine spermienspezifische Isoform der Phospholipase C (PLCζ) die Aktivierung der arretierten Eizelle.
Die PLCζ katalysiert die Hydrolyse eines Phospholipids, bei der IP3 produziert wird.
(SAUNDERS et al. 2002). IP3 bindet an IP3-Rezeptoren, was zu einer Ca2+-Freisetzung aus den intrazellulären Ca2+-Speichern führt. Über positive Feedbackmechanismen wird die Reaktion verstärkt, so dass es zu Ca2+-Oszillationen kommt, die beim Rind bis zur Einleitung des mitotischen Zellzyklus’ anhalten (NAKADA et al. 1995). Diese Ca2+-Oszillationen steuern über Enzymaktivierungskaskaden die Aufhebung des Metaphase II-Arrests. Die MPF- Aktivität sinkt, die zweite meiotische Reifeteilung wird vollendet. Die Exocytose der Cortikal-Granula bewirkt innerhalb von Minuten eine Modifikation der Zona pellucida, was zum Polyspermie-Block führt (ABBOTT u. DULCIBELLA 2001, BLEIL u. WASSARMAN 1981). Das paternale Chromatin dekondensiert; Protamine werden durch maternale Histone ersetzt. Paternaler und maternaler Vorkern formieren sich. Mit ihrer Verschmelzung entsteht die Zygote und der Beginn der embryonalen Entwicklung (SCHULTZ u. KOPF 1995).
Analog zur Maturation sind auch die zellulären und molekularen Ereignisse im Verlauf der Eizell-Aktivierung noch nicht völlig entschlüsselt; beim Rind scheint im Vergleich zur Maus die MAP-Kinase eine wichtigere Funktion auszuüben (MALCUIT et al. 2006, LEE et al.
2006).
2.3.2 Artifizielle Aktivierung
In vitro kann eine parthenogenetische Aktivierung, d.h. eine Eientwicklung ohne Beteiligung eines Spermiums (REMANE et al. 1985), durch physikalische oder chemische Stimuli ausgelöst werden (YANAGIMACHI 1994). Im Rahmen moderner Reproduktionstechniken (ICSI, Klonierung) hat die künstliche Aktivierung von Eizellen in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen.
In der Humanmedizin werden Ca2+-Ionophore eingesetzt, die Ca2+-Ionen über die Zellkompartimente hinweg durch Lipidmembranen transportieren, so dass es zu einer Ionen- Umverteilung kommt und die intrazelluläre Ca2+-Konzentration steigt. Obwohl Ca2+- Ionophore keine Ca2+-Oszillationen hervorrufen, reicht der initiale Ca2+-Anstieg im Ooplasma, um die Aktivierungsereignisse auszulösen (OZIL u. SWANN 1995, STEINHARDT et al. 1974, SCHULTZ u. KOPF 1995, NAKADA u. MIZUMO 1998, WINSTON et al. 1991). Laborinterne Daten (MONTAG et al. 2005) und Einzelfall- Veröffentlichungen (ELDAR-GEVA et al. 2003, HEINDRYCKX et al. 2005) zeigen, dass Ca2+-Ionophore nach ICSI bereits erfolgreich bei Patienten mit schlechten Befruchtungsraten eingesetzt werden.
Bei der Spezies Rind wurde eine Vielfalt an Methoden getestet, um die Parthenogenese nach artifizieller Aktivierung zu optimieren. Mit physikalischen Stimuli in Form von elektrischen Pulsen kann eine Aktivierung boviner Eizellen induziert werden, jedoch ist die weitere parthenogenetische Entwicklung nicht zufriedenstellend (KONO et al. 1989). Eine Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Spiegels gelingt darüber hinaus auf chemischem Weg mit dem Einsatz von Ethanol (NAGAI et al. 1987), Strontium (WANG et al. 2007), Ca2+-Ionophore (SHI et al. 1993) oder auch das spezifischere Ionomycin (RHO et al. 1998). Dabei wirkt Ethanol über eine verstärkte Bildung von IP3, Strontium induziert multiple Ca2+-Wellen über eine intrazelluläre Ca2+-Freisetzung, vermutlich gekoppelt mit Ca2+-Verlagerungen innerhalb der Eizell-Kompartimente (ALBERIO et al. 2001). Eine vergleichende Untersuchung von WANG et al. (2007) zeigt allerdings, dass mit Blastozystenraten von etwa 5 % diese Form der parthenogenetischen Aktivierung zu ineffizient ist. Ein weiterer Ansatzpunkt bietet sich über eine unspezifische Hemmung der Proteinsynthese durch Cycloheximid (SHI et al. 1993).
Durch die fehlende Neusynthese von Cyclin B wird der Plasmaspiegel von aktivem MPF gesenkt und damit der Metaphase II-Arrest aufgehoben. Gute Ergebnisse werden dabei in
kombinierten Aktivierungsprotokollen mit Ethanol unter Zugabe von Cytochalasin B, das die Extrusion des zweiten Polkörpers verhindert, erzielt (PRESICCE u. YANG 1994, WANG et al. 2007). Etabliert hat sich außerdem eine Kombination aus Ca2+-Ionophor und 6- Dimethylaminopurin (DMAP, RHO et al. 1998, WANG et al. 2007). DMAP ist ein Serin- Threonin-Proteinkinase-Inhibitor (RIME et al. 1989). Als Mediumzusatz im GV-Stadium wird der GVBD durch Hemmung der MPF- und MAP-Kinase-Aktivierung reversibel verhindert. Die artifizielle Verlängerung der Prämaturationsphase soll der Eizelle in vitro mehr Zeit geben, cytoplasmatische Reifungsprozesse abzuschließen (LIU et al. 1998, ANDERIESZ et al. 2000a). Allerdings ist hier zu beachten, dass die Inkubation in DMAP direkt nach Ca2+-Ionophor-Gabe zu einer Aktivierung ohne Abschnürung des zweiten Polkörpers führt, d.h. beide Schwester-Chromatiden verbleiben im parthenogenetischen Embryo (SZÖLLÖSI et al. 1993, SUSCO-PARRISH et al. 1994). Nachteilig an Cycloheximid wie auch zu einem geringeren Grad an DMAP ist ihre unspezifische Inhibierung, so dass die Entwicklung durch weitere inaktive Enzyme negativ beeinflusst werden kann (ALBERIO et al. 2001). Um diese unerwünschte Nebeneffekte zu verhindern, werden selektivere Proteinkinase-Inhibitoren wie Butyrolacton I und Purinanaloga (Bohemin, Roscovitin) eingesetzt (ALBERIO et al. 2000 u. 2001).
Die entwickelten Aktivierungsprotokolle finden ihre Anwendung beim Rind insbesondere beim somatischen Kerntransfer. Zum einen werden hier parthenogenetisch aktivierte Oocyten als Kontrollgruppe genutzt, zum anderen müssen die rekonstruierten Kerntransferkomplexe für eine weitere Entwicklung artifiziell aktiviert werden. Insgesamt hat sich gezeigt, dass eine zeitlich versetzte Aktivierung nach der elektrisch eingeleiteten Fusion bessere Entwicklungsraten bewirkt (LIU et al. 2001). Erfolgreich eingesetzt werden dabei kombinierte Verfahren von Ca2+-Ionophor bzw. Ionomycin mit DMAP (CIBELLI et al. 1998, WELLS et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001b, VAJTA et al. 2003) sowie Ethanol mit Cycloheximid/Cytochalasin B (ZAKHARTCHENKO et al. 1999, BRÜGGERHOFF et al.
2002). GALLI et al. (2002) verglichen beide Methoden und konnten dabei keine signifikanten Unterschiede nachweisen. Ebenso konnte mit den spezifischeren Proteinkinase-Inhibitoren (Butyrolacton I, Bohemin) keine Verbesserung hinsichtlich Trächtigkeits- sowie Überlebensrate erreicht werden (ALBERIO et al. 2001). Ein neuer Ansatz mit einer Kombination von Ionomycin und Strontium wurde von YAMAZAKI et al. (2005)
veröffentlicht. Über eine erfolgreiche Aktivierung im Rahmen des somatischen Kerntransfers wurde zudem nach Injektion eines porcinen Spermienfaktors in bovine Oocyten berichtet, obwohl die Effizienz gering war (KNOTT et al. 2002). Da auch bei humanen Oocyten nach Injektion von humaner PLCζ cRNA eine parthenogenetische Entwicklung beobachtet werden konnte, könnte dies ein vielversprechender Ansatz sein, um sich der physiologischen Aktivierungskaskade anzunähern (ROGERS et al. 2004).
2.4 Frühembryonale Entwicklung
Mit der Syngamie beginnt die embryonale Entwicklung. Bei Mammaliae erfolgt die Furchung total adäqual, allerdings nicht immer synchron. Da der Embryo zunächst nicht an Größe zunimmt, werden die Blastomeren zunehmend kleiner. Dadurch nähert sich die bei Zygoten niedrige Relation zwischen Nucleus und Cytoplasma an das Verhältnis in somatischen Zellen an.
Bovine Embryonen durchlaufen nach etwa 2 Tagen die erste Furchung, nach etwa 4 Tagen wird das 8-Zell-Stadium erreicht. Nach 5 bis 6 Tagen gelangt der Embryo über den Eileiteristhmus in das ipsilaterale Cornu uteri. Aus den weiteren Zellteilungen geht dabei die Morula hervor, die zunächst ein Zellkonglomerat mit unregelmäßiger Oberfläche darstellt.
Während der Kompaktierung flachen die äußeren Blastomeren ab; interzelluläre Tight junctions werden gebildet. Die Differenzierung in zwei Zellpopulationen setzt ein. Aus den innen lokalisierten Zellen, der sogenannten Inneren Zellmasse (ICM), entwickelt sich der größte Teil zum eigentlichen Embryo. Die äußeren Zellen werden als Trophektoderm bezeichnet, aus denen später das Fruchthüllenepithel hervorgeht. Über Ionengradienten erfolgt ein Influx von Flüssigkeit und damit die Bildung des Blastocoels. Das Blastozystenstadium wird nach 7 bis 8 Tagen erreicht. Nach einer vorangehenden Expansion schlüpft die Blastozyste im mittleren Uterushornabschnitt etwa am neunten Tag der Gravidität aus der Zona pellucida (Hatching), wobei die kugelige Form zunächst beibehalten wird. An Tag 13 beginnt der Embryo zu elongieren und an Tag 18/19 sich zu implantieren. Bis zum 22. Tag der Trächtigkeit ist das Wachstum so weit fortgeschritten, dass die elongierte Blastozyste als langes, fadenförmiges Gebilde auch das nicht gravide Uterushorn ganz ausfüllt. Der
embryomaternale Dialog, essentiell für die Aufrechterhaltung der Gravidität, setzt dagegen schon zu einem früheren Zeitpunkt ein (SCHNORR u. KRESSIN 2006, VAN SOOM u. DE KRUIF 1996, MICHEL 1995, RÜSSE 1998).
Die menschliche präimplantative Entwicklung ist etwas schneller als die des Rindes. So gelangt der Embryo in vivo ca. 4 Tage p.ov. in den Uterus. Der Embryotransfer beim Mensch findet in Deutschland überwiegend am Tag 3 statt, wenn in der Regel das 8-Zell-Stadium erreicht ist. Da in manchen Ländern die Selektion an Embryonen legal ist, wird dort am Tag 5 im Blastozystenstadium transferiert. Dies ist allerdings aufgrund der längeren in vitro Kultivierung nicht unumstritten. Der humane Embryo schlüpft implantationsnah bereits am Tag 5 bis 6 aus der Zona pellucida, die Einnistung ist Ende der zweiten Schwangerschaftswoche abgeschlossen (LÜTJEN-DRECOLL 1996, LÜLLMANN-RAUCH 2003, MONTAG u. VAN DER VEN 2002a).
Speziesübergreifend ist die frühembryonale Entwicklung ein komplexer Prozess, der durch die fein choreographierte Expression der relevanten Gene reguliert wird. Dabei zeigt sich die Bedeutung der cytoplasmatischen Maturation, da bis zur Aktivierung des embryonalen Genoms die akkumulierten maternalen mRNAs und Proteine unerlässlich sind (TELFORD et al. 1990, WRENZYCKI et al. 2007, MINAMI et al. 2007). Auch das Vorhandensein paternaler mRNA wurde nachgewiesen (OSTERMEIER et al. 2004). Die Phase des Übergangs von der maternalen auf die embryonale Expression (maternal-embryonic transition) wird beim Menschen im 4- bis 8-Zell-Stadium beschrieben (BRAUDE et al. 1988).
Bei der genauer untersuchten bovinen Spezies erfolgt die Hauptaktivierung (major activation) im 8- bis 16-Zell-Stadium (TELFORD et al. 1990), wobei schon in der Zygote eine erste
„kleine“ Aktivierung (minor activation) beobachtet werden kann (MEMILI u. FIRST 2000).
Insbesondere im Hinblick auf die Tatsache, dass die Bedingungen im Verlauf der in vitro Kultivierung grundlegenden Einfluss auf das embryonale Expressionsmuster haben, bedarf es für das weitere Verständnis und Verbesserung der Biotechniken noch weiterer Forschung (NIEMANN u. WRENZYCKI 2000, LONERGAN et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2004).
2.5 Meiotische Spindel
2.5.1 Physiologische Grundlagen
Die meiotische Spindel ist wie jene der Mitose aus Mikrotubuli aufgebaut. Diese sind Polymere aus Tubulin, das seinerseits ein Dimer aus einer α- und β-Tubulin-Untereinheit darstellt. Durch eine helikale Anordnung entsteht eine röhrenartige Struktur. Initiationsorte des Mikrotubuluswachstums sind die Mikrotubulusorganisationszentren (MTOCs), wobei die Polymerisation der Tubulineinheiten ein energiefordernder Prozess ist. Astral von den MTOCs ausgehend herrscht an den exponierten Enden spontan eine rege Dissoziation oder Assoziation, bis durch ein chromosomales Kinetochor eine Stabilität erzeugt wird. Durch diese dynamische Instabilität kann die Spindel einerseits ihre Funktion, die korrekte Trennung der Chromosomen bzw. Chromatiden, ausüben; andererseits ist sie so anfällig gegenüber Temperatur und pH-Veränderungen (STRYER 1990, WANG et al. 2001c, AMAN u. PARKS 1994). Auch ein mangelnder Energiemetabolismus kann eine Polymerisierung der Mikrotubuli verhindern (ZENG et al. 2007). Eine Spindeldysfunktion kann zu anomalen Chromosomensegregationen und damit Aneuploidien führen (EICHENLAUB-RITTER 2002, WANG u. KEEFE 2002).
Die Struktur der Spindel wird als bipolar und symmetrisch beschrieben, jedoch existieren auch Formen, die sich fassartig mit flachen Spindelpolen darstellen und bei der Maus vermehrt bei in vitro maturierten Eizellen auftreten. Sowohl die humane als auch die bovine Spindel sind kleiner als die der Maus. Die flachen Pole werden durch die vermehrte Anzahl von MTOCs in der meiotischen Spindel erklärt (SANFINS et al. 2003, KIM et al. 2000, EICHENLAUB-RITTER 2002). Postovulatorisch nicht fertilisierte Eizellen zeigen im Laufe der Zeit durch degenerative Prozesse abnorme oder dissoziierte Spindeln (LIU et al. 2000a, SUN et al. 2004).
1975 zeigten SATO et al., dass die meiotische Spindel aufgrund ihrer optischen Anisotropie in polarisiertem Licht darstellbar ist. Die weiter entwickelte Technologie der Polarisationsmikroskopie ermöglicht inzwischen nicht nur die non-invasive Untersuchung in vitalen Eizellen, sondern auch die Einsetzbarkeit in der Routine der assistierten Reproduktion.
Die Spindel kann durch die neuen Technologien nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ
erfasst werden. Dabei ist die Stärke der Doppelbrechung direkt proportional zur Mikrotubuli- Dichte und kann metrisch in Nanometern berechnet werden (OLDENBOURG et al. 1998).
2.5.2 Bedeutung der Spindelpräsenz
Die Metaphase II-Spindel spiegelt gemeinsam mit dem ersten Polkörper die nukleäre Maturation wider. Zahlreiche Studien untersuchten, ob eine darstellbare Spindel zum Zeitpunkt der ICSI positiv mit der Befruchtungsrate korreliert. Durchschnittlich lag der Prozentsatz von spindel-positiven Eizellen zwischen 70 und 80 % und mit einer Ausnahme (MOON et al. 2003) wurde ein Zusammenhang zwischen Spindelpräsenz und Fertilisationsrate festgestellt (WANG et al. 2001a u. 2001b, RIENZI et al. 2003, COHEN et al. 2004, GASSNER et al. 2004, SHEN et al. 2006, RAMA RAJU et al. 2007, MADASCHI et al. 2007).
Bezogen auf die spätere Embryoqualität am Tag 3 fanden einige Arbeitsgruppen eine positive Korrelation mit einer sichtbaren Metaphase II-Spindel (WANG et al. 2001a, COOKE et al.
2003, MOON et al. 2003, MADASCHI et al. 2007), die jedoch von anderen Studien nicht belegt werden konnte (RIENZI et al. 2003, COHEN et al. 2004). RAMA RAJU et al. (2007) wiesen bei visualisierbaren Spindeln eine höhere Blastozystenrate am Tag 5 nach.
Die Aussagekraft der Spindelpräsenz auf die spätere Graviditätsrate ist umstrittener. Es wurde eine Studie veröffentlicht, die sie als prognostischen Marker beschreibt (MADASCHI et al.
2007), während hingegen zwei Veröffentlichungen keinen Zusammenhang sehen konnten (GASSNER et al. 2004, CHAMAYOU et al. 2006).
Eine Abhängigkeit vom Patientenalter konnte mit der Spindelpräsenz nicht korreliert werden (WANG et al. 2001a). Konfokalmikroskopische Untersuchungen (BATTAGLIA et al. 1996) haben jedoch einen Zusammenhang sowohl zwischen abnormer Spindel als auch zwischen abnormen Chromosomenanordnungen und zunehmendem Patientenalter ergeben.
2.5.3 Lokalisation der Spindel in der maturen Eizelle
Bei bisherigen Untersuchungen zur Spindellokalisation (RIENZI et al. 2003, COOKE et al.
2003) wurde außerdem deutlich, dass man lichtmikroskopisch nicht unbedingt von der Lage des ersten Polkörpers auf die der Spindel rückschließen kann. Damit kann bei der konventionellen ICSI eine mechanische Schädigung der Spindel nicht ausgeschlossen werden.
Bei einer Abweichung von mehr als 90° wurde eine niedrigere Fertilisationsrate beobachet (RIENZI et al. 2003). COOKE et al. (2003) konnten im Vergleich zwischen konventioneller ICSI und ICSI unter Berücksichtigung der Spindelposition eine bessere Embryoqualität feststellen, jedoch keinen Zusammenhang mit der Befruchtungsrate herstellen. Die Ergebnisse anderer Autoren zeigen, dass bei Spindel-schonender ICSI die Stärke der Abweichung keine Rolle spielt (MOON et al. 2003) bzw. die Durchführung einer Spindelposition-kontrollierten ICSI nicht zu besseren Befruchtungsraten und Embryoqualität führt (WOODWARD et al.
2008). Insgesamt ist die Bedeutung der Abweichung noch umstritten. Eine mögliche Erklärung ist die perivitelline Verlagerung des Polkörpers durch die mechanische Manipulation während des Denudierungspozesses (RIENZI et al. 2003).
2.5.4 Spindelmorphometrie
Die Aussagekraft der quantitativen Messungen der Spindellichtbrechung wird kontrovers diskutiert.
Es gibt Studien, die einen positiven Zusammenhang zwischen Doppelbrechungsintensität und Pronucleus-Score, Zellzahl der Tag 3-Embryonen sowie Blastozystenrate beschreiben (SHEN et al. 2006, TRIMARCHI et al. 2004, RAMA RAJU et. al. 2007). Andere Autoren sehen eine negative Korrelation zum Patientenalter, jedoch sind die Fallzahlen gering (DE SANTIS et al.
2005, SHEN et al. 2006). LIU et al. (2000b) und NAVARRO et al. (2005) konnten an murinen Eizellen nach Aktivierung eine Intensitätszunahme der Doppelbrechung beobachten.
Für vergleichbare Messungen scheinen die Technik sowie der Zeitpunkt der Messung essentiell (DE SANTIS et al. 2005).
2.5.5 Einfluss der in vitro Maturation
Die in vitro Maturation (IVM) ist verglichen mit den biotechnologischen Verfahren beim Rind in der humanen assistierten Reproduktion noch nicht ausgereift. Die Aneuploidie-Rate ist bei in vitro maturierten Eizellen hoch, was auf Störungen im Verlauf der Maturation durch suboptimale Kultivierungsbedingungen hindeutet (LI et al. 2006). Es gibt Hinweise auf einen möglichen Zusammenhang mit einer unzureichenden oder anomalen Spindelbildung, da nach Hyperstimulation gewonnene, immature humane Eizellen im Anschluss an eine 3- bis 48- stündigen in vitro Maturation mit etwa 50 % seltener eine Spindelpräsenz in der Metaphase II zeigen (RIENZI et al. 2003, ZENG et al. 2007). Genauere Studien gibt es im murinen System, wo deutliche Unterschiede in der Spindelorganisation existieren (SANFINS et al. 2003).
Analog zu der Bedeutung der Spindelpräsenz in der konventionellen ICSI wiesen PAES et al.
(2007) bei humanen in vitro maturierten Oocyten einen Zusammenhang zwischen visualisierbarer Metaphase II-Spindel und Befruchtungsrate nach.
2.5.6 Polarisationsmikroskopische Studien über die bovine Spindel
LIU et al. (2000a) zeigten in ihrer grundlegenden Veröffentlichung zum Einsatz der Polarisationsmikroskopie bei der Enukleation von Eizellen auch die Aufnahme einer bovinen Eizelle. Sie konnten zeigen, dass eine Metaphase II-Spindel auch beim Rind trotz des hohen Lipidgehalts der bovinen Oocyte auf diese Weise darstellbar ist. Weiterführende polarisationsmikroskopische Studien sind in der Literatur nicht zu finden.
2.6
Zona pellucidaDie die Oocyte und den präimplantativen Embryo umgebende extrazelluläre Matrix wird aufgrund ihrer lichtmikroskopischen Transparenz Zona pellucida (ZP) genannt. Sie ist nicht nur während der Spermien-Eizell-Interaktion von unverzichtbarer Bedeutung, sondern bietet bis zum Schlupf einen biomechanischen Schutz (WASSARMAN 1987, YANAGIMACHI 1994).
2.6.1 Morphologie und Genese der Zona pellucida
Mit Beginn des Eizellwachstums werden Zona pellucida-Proteine ohne Beteiligung der Granulosazellen synthetisiert (EPIFANO et al. 1995). Die humane wie auch die bovine Zona pellucida sind zu einem geringeren Grad auch eine Syntheseleistung der umgebenden Follikelzellen (GROOTENHUIS et al. 1996, SINOWATZ et al. 2001). Während bei der Maus 3 codierende Gene für 3 ZP-Proteine (mZP1, mZP2, mZP3) identifiziert wurden, wird die Zona bei Mensch und Rind von 4 ZP-Proteinen (Mensch: hZP1, hZP2, hZP3, hZP4 / Rind:
bZP1, bZP2, bZP3-α, bZP3-β, bZP4) und entsprechend 4 codierenden Genen gebildet (WASSARMAN 1988, LEFIEVRE et al. 2004, TOPPER et al. 1997). Innerhalb des Tiereichs weisen die Gensequenzen hohe Homologien auf (HARRIS et al. 1994); als Modell wurde insbesondere die murine Zona intensiv untersucht. Aus glykolisierten ZP2 und ZP3 formieren sich Dimere, die extrazellulär zu langen Ketten assoziieren und quer durch ZP1 vernetzt sind.
So wird speziesübergreifend eine dreidimensionale Glycoproteinschicht gebildet, die von Granulosazellfortsätzen zur interzellulären Kommunikation durchsetzt ist (GREVE u.
WASSARMAN 1985, GREEN 1997). Beim Mensch ist die Zona ca. 20 µm dick, beim Rind etwa 12 µm (PELLETIER et al. 2004, NAKAGAWA et al. 1991).
Elektronenmikroskopisch stellt sich bei Mensch und Maus die innere Oberfläche fein und glatt dar, während die äußere Oberfläche bei maturen Eizellen als poröses, großmaschiges Netzwerk charakterisiert wird (PHILIPS u. SHALGI 1985, FAMILIARI et al. 1989). Die Oberfläche immaturer wie auch atretischer Oocyten wird dagegen als engmaschig und homogen beschrieben (FAMILIARI et al. 1989). Auch die Modifikation post fertilisationem spiegelt sich in Untersuchungen an der Maus in der Ultrastruktur durch ein Abnehmen der retikulären Struktur wider (JACKOWSKI u. DUMONT 1979). Eine lockere, poröse Oberflächenstruktur scheint für die Interaktion mit den Spermatozoen vorteilhaft zu sein (FAMILIARI et al. 2006). Eine Arbeitsgruppe begründete die unterschiedlichen Ergebnisse mit Fixationsartefakten (MAGERKURTH et al. 1999). Dieses Phänomen konnte jedoch nach Wiederholung der Experimente mit verschiedenen Aufbereitungstechniken von anderen Autoren nahezu ausgeschlossen werden (FAMILIARI et al. 2006).
Gleiche Veränderungen an der Oberflächentextur wurden von VANROOSE et al. (2000) in bovinen immaturen, in vitro maturierten Eizellen und in vitro produzierten Zygoten gefunden.
SUZUKI et al. (1994) und MERTENS (2006) beschreiben dagegen die bovine Zona
pellucida-Oberfläche von immaturen Eizellen als weitmaschig und porös. Ein Vergleich in vivo versus in vitro zeigt beträchtliche Diversitäten bei maturierten Eizellen und Zygoten. In vitro maturierte Oocyten und in vitro produzierte Zygoten zeigen deutlich weniger Poren und eine glattere Struktur, was auf suboptimale Kultivierungsbedingungen hindeutet. Die porenarme Architektur könnte Folge einer wenig ausgeprägten Penetration bzw. vorzeitigen Retraktion und damit eines unzureichenden Kontaktes der Granulosazellfortsätze unter in vitro Bedingungen sein. Ein Einfluss der Fertilisation konnte von MERTENS (2006) nicht bestätigt werden. SUZUKI et al. (2000) zeigten in einer Untersuchung eine ultrastrukturelle Veränderung der Oberfläche boviner in vitro maturierter Eizellen nach parthenogenetischer Aktivierung mit Ca2+-Ionophor und DMAP oder Cycloheximid. Dabei war die beobachtete Abnahme der porösen Struktur reversibel.
Im Verlauf der Passage durch den Eileiter werden verschiedene Moleküle in die Zona eingelagert (HERRLER et al. 1999). Trotzdem nimmt die Zonadicke während der embryonalen Entwicklung bis zum Schlupf ab (MONTAG et al. 1999a, PELLETIER et al.
2004, KILANI et al. 2006).
2.6.2 Funktion der Zona pellucida
Die Rolle der Zona pellucida bei der Befruchtung und frühembryonalen Entwicklung ist wesentlich und vielfältig. Phylogenetisch betrachtet sind die extraembryonalen Hüllen sehr alte Strukturen. Traditionell wird postuliert, dass heterologe Spermatozoen nicht an die Zona binden und penetrieren können (HERRLER et al. 1999, YANAGIMACHI 1994, TOPPER et al. 1997, WASSERMAN et al. 1999).
Während ihrer Passage durch den weiblichen Genitaltrakt durchlaufen die Spermien die Kapazitation, die sie zur Bindung an die Zona pellucida und Akrosomenreaktion befähigt.
Primärer Bindungsort an der Zona ist ein Rezeptor, der beim Rind als das Glycoprotein bZP3- α definiert ist, beim Mensch hZP3. Diese Rezeptorenbindung induziert die Akrosomenreaktion, bei der der enzymatische Inhalt des Akrosoms freigesetzt wird, so dass die Zona penetriert werden kann. Anschließend kann das Spermatozoon mit der Ooplasmamembran fusionieren. Dabei fungiert ZP2 als sekundärer Rezeptor für das akrosomenreagierte Spermium (TOPPER et al. 1997, BLEIL u. WASSARMAN 1981, WASSARMAN 1987 u. 1988). Im weiteren Wechselspiel zwischen männlichem und
weiblichem Gamet entsteht ein Polyspermieblock, der durch die sogenannte Zonareaktion möglich wird. Diese Reaktion wurzelt in der exocytotischen Ausschleusung der während der Maturation akkumulierten Corticalgranula, die über den perivitellinen Spalt die Zonaarchitektur modifizieren. Dabei werden die Glycoproteine ZP2 und ZP3 zu ZP2f bzw.
ZP3f konvertiert. Die genaue molekulare Basis dieser Reaktionen ist Gegenstand aktueller Forschung (YANAGIMACHI 1994, WASSARMAN et al. 1999, NARA et al. 2006).
In der weiteren präimplantativen Entwicklung unterbindet die Zona pellucida eine mögliche Disaggregation des zunächst nur lockeren Blastomeren-Zellverbands durch die Ovidukt- bzw.
Uterusmotilität und erleichtert den Transport des Embryos an seinen Implantationsort. So wird auch eine vorzeitige Adhäsion an das maternale Epithel verhindert. Eine weitere Funktion kommt ihr als eine Art Mailbox in der embryomaternalen Kommunikation zu (WASSARMAN et al. 1999, HERRLER 1999).
2.6.3 Zona hardening
Polyspermie stellt bei Insekten-, Reptilien- und Vogelarten durchaus ein physiologisches Phänomen dar (REMANE et al. 1985). Bei Mammaliae wird im Verlauf der Befruchtungskaskade jedoch die Penetration von mehr als einem Spermatozoon durch die Zonareaktion vereitelt (YANAGIMACHI 1994). Dieser Effekt wird in der Literatur auch als Zona hardening bezeichnet, da die Modifikation der Zonaproteine mit einer erhöhten Resistenz gegen proteolytische Enzyme, wie z.B. Chymotrypsin, einhergeht (HOODBHOY u.
TALBOT 1994, DE FELICI u. SIRACUSA 1982).
Zona hardening kann auch spontan bei gealterten Eizellen auftreten und wurde sowohl beim Menschen (COHEN et al. 1992) als auch beim Rind beschrieben (KATSKA et al. 1989). Eine weitere Form des Zona hardenings wird als Folge von suboptimalen Kultivierungsbedingungen in vitro diskutiert, wodurch der für die Implantation essentiellen Schlupf der Blastozyste beeinträchtigt wird. Untersuchungen an murinen Eizellen zeigten, dass Follikelflüssigkeit, Cumulus- und Granulosazellen, Serum sowie Fetuin, eine Hauptkomponente des fetalen Kälberserums, eine derartige Veränderung der Zonastruktur verhindern können (DE FELICI u. SIRACUSA 1982, SCHRÖDER et al. 1990). Beim Rind scheinen insbesondere der Zusatz von fetalem Kälberserum sowie ein Cumulus-intakter COC dem Zona hardening entgegenzuwirken (LANDIM-ALVARENGA et al. 2002, KATSKA et
al. 1989). Zonaveränderungen einhergehend mit niedrigeren Schlupfraten sind auch in Zusammenhang mit Kryokonservierung bei Maus, Mensch und Rind dargestellt worden (MATSON et al. 1997, TUCKER et al. 1991, VATJA et al. 1997). In der humanen assistierten Reproduktion scheinen außerdem die kontrollierte hormonelle Hyperstimulation sowie patientenspezifische Parameter zu einer Zonaverhärtung zu führen (LORET DE MOLA et al. 1997, MONTAG et al. 1999b, 2000). Eine Schlupfhilfe ist durch das Assisted Hatching vor dem Embryotransfer bei Mensch und Rind möglich geworden (COHEN et al. 1992, MONTAG et al. 1999b, SCHMOLL et al. 2003, RÜTHER 2005).
2.6.4 Polarisationsmikroskopische Untersuchungen
Auf der Suche nach einer Untersuchungsmöglichkeit ohne vorherige Fixierung nutzten KEEFE et al. 1997 die Polarisationsmikroskopie und bestätigten an Hamster-Eizellen eine auch elektronenmikrokopisch und histochemisch diskutierte Schichtung der Zona (KAUFMANN et al. 1989). Polarisationsmikroskopisch kann diese Schichtung aufgrund der unterschiedlichen optischen Eigenschaften nachgewiesen werden. Dabei stellt sich die Zona als eine dreischichtige Struktur von Zonafilamenten dar. Während die schmale mittlere Lamina keine Anisotropie aufweist, sind sowohl die innere als auch die äußere Schicht doppelbrechend. Da die innerste Schicht die stärkste Anisotropie besitzt, sind im vorgestellten Modell die Filamente dort radiär angeordnet, während sie in der äußeren Zone tangential gruppiert sind (Abb. 1).
Die Ergebnisse konnten von PELLETIER et al. (2004) auf die humane ZP übertragen werden.
Der Vergleich zwischen immaturen und maturen Eizellen zeigte keine signifikanten Unterschiede; jedoch gab es eine Korrelation zwischen Zonadicke und Zonadichte und damit der Stärke der anisotropen Eigenschaften. KILANI et al. (2006) wiesen nach, dass mit zunehmender Kultivierungsdauer eine zunehmende Dichte – gleichzusetzen mit zunehmender Anisotropie – auftritt, was gleichzeitig im Rahmen der fortschreitenden Embryonal- entwicklung mit abnehmender Zonadicke einhergeht.
In einer retrospektiven Studie beobachteten SHEN et al. (2005), dass eine hohe Anisotropie der inneren Zonaschicht besonders bei Eizellen zu finden ist, bei denen der Embryotransfer zu einer Gravidität führt. In einer weiteren retrospektiven Evaluation wurde ein Zusammenhang
zwischen der Doppelbrechung der inneren Zonaschicht mit der embryonalen Blastozystenentwicklung hergestellt (RAMA RAJU et al. 2007).
Abbildung 1: Schematische Struktur der Zona pellucida (nach KEEFE et al. 1997)
2.7 Evaluation der Eizell-Qualität
Sowohl für die klinische Anwendung in der Sterilitätsbehandlung als auch zur Effizienzsteigerung der bovinen in vitro Produktion sind non-invasive Kriterien der Eizell- Qualität enorm wichtig. Die beschriebenen traditionellen Methoden werden in der Literatur kontrovers diskutiert. Sie sind ein Ansatzpunkt zur Identifizierung der Eizellen mit dem höchsten Entwicklungspotential, scheinen jedoch nicht aussagekräftig genug zu sein (EBNER 2006, WANG u. SUN 2007). Die Beurteilung der embryonalen Qualität humaner Furchungsstadien hat in Deutschland nur beobachtenden Charakter, da aufgrund der Gesetzgebung keine Selektion erfolgen darf.
Äußere Schicht mit tangentialen Mikrofilamenten
Mittlere Schicht, optisch isotrop
Innere Schicht mit radiären Mikrofilamenten
Oolemm
2.7.1 Follikel
Die Follikelgröße gibt erste Rückschlüsse auf das Entwicklungspotential der Oocyte. Nach ovarieller Hyperstimulation haben humane Eizellen aus Follikeln mit einem Durchmesser von 15 bis 23 mm die höchste Entwicklungskompetenz. Kleinere Follikel sind aufgrund ihrer unzureichenden Entwicklung trotz Hormonsubstitution ein Hinweis auf anatomische oder metabolische Defekte (SMITZ et al. 2001). Für die in vitro Maturation von bovinen Eizellen werden entsprechend der follikulogenetischen Entwicklung Follikel von 2 bis 8 mm punktiert (FAIR et al. 1995).
Es gibt Ansätze, das Entwicklungspotential von Eizellen durch biochemische Nachweise in der Follikelflüssigkeit zu bestimmen, jedoch sind die Methoden für den praktischen Einsatz noch zu aufwendig (MENDOZA et al. 2002, WANG u. SUN 2007).
2.7.2 Cumulus-Oocyten-Komplex
Die Morphologie des COCs hat eine Aussagekraft über den Maturationsstatus der Eizelle und wird zur Selektion in der bovinen IVP eingesetzt, da eine Beurteilung der Oocyte selbst durch die umschließenden Cumuluszellen nicht exakt möglich ist. Für eine genaue Charakterisierung der Eizell-Qualität sind die morphologischen Kriterien bislang unzureichend (VAN SOOM u. DE KRUIF 1996). Durch die Evaluierung eines Schlüsselenzyms der wachsenden Eizelle mittels einer Vitalfärbung (Brilliant Cresyl Blue(BCB)-Färbung) ist es möglich, selektiv den Anteil an entwicklungskompetenten Oocyten für die in vitro Maturation zu erhöhen (ALM et al. 2005).
In der humanen assistierten Reproduktion werden aufgrund der begrenzten Anzahl alle maturen Eizellen aus den gewonnenen COCs verwendet.
2.7.3 Morphologie der Eizelle
Per definitionem sollte eine humane Oocyte bester Qualität ein klares, moderat granuliertes Ooplasma ohne Einschlüsse, umgeben von einer gleichmäßigen Zona pellucida, aufweisen.
Punktierte und denudierte Eizellen zeigen jedoch eine enorme Variabilität. Mehr als die Hälfte aller gewonnenen Eizellen haben eine oder mehrere morphologische Auffälligkeiten
(EBNER 2006). In der Literatur findet man widersprüchliche Aussagen über die Bedeutung dieser Dysmorphismen hinsichtlich der Entwicklungskompetenz.
Einige Autoren berichteten von einer positiven Korrelation zwischen einem intaktem ersten Polkörper und dem Entwicklungspotential der Eizelle (EBNER et al. 2000). In mehreren neueren Studien wurde dies widerlegt, so dass das Erscheinungsbild des ersten Polkörpers nicht prognostisch genutzt werden kann (DE SANTIS et al. 2005, VERLINSKY et al. 2003).
Manche Arbeitsgruppen belegen mit hohen Fallzahlen, dass weder cytoplasmatische (Granulation, Einschlüsse, Farbe) noch extrazytoplasmatische (irreguläre Form, perivitelliner Debris, Zona pellucida-Homogenität) Dysmorphismen die Fertilitätsrate, Embryonalentwicklung und Implantationsrate beeinflussen (DE SUTTER et al. 1996, BALABAN et al. 1998, CHAMAYOU et al. 2006, TEN et al. 2007). Trotzdem sollten insbesondere die cytoplasmatischen Defekte kritisch betrachtet werden. Extensive Zentralgranulierung scheint ebenso wie eine ausgeprägte Vakuolisierung die Eizell-Qualität negativ zu beeinflussen (KAHRAMAN et at. 2000, DE SUTTER et al. 1996). EBNER (2006) berichtete von einem positiven Zusammenhang zwischen Viskosität und Qualität der Oocyte.
Problematisch ist hier aber die Tatsache, dass die cytoplasmatische Konsistenz nur während der invasiven ICSI bestimmt werden kann und eine Objektivierung schwierig ist.
Im Gegensatz zur Vorkern- sowie Embryonenbeurteilung (MONTAG et al. 2001, STEER et al. 1992) konnte bislang kein vergleichbarer, auf die Morphologie basierender Oocyten-Score etabliert werden; die lichtmikroskopisch erkennbaren Anomalien stellen negative Selektionskriterien dar.
2.7.4 Polkörperdiagnostik
Die Polkörperbiopsie hat sich in den letzten Jahren zur Aneuploidiediagnostik bewährt.
Obwohl bei der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) nicht alle Chromosomen parallel untersucht werden können, kann ein hoher Prozentsatz von genetisch abnormen Eizellen identifiziert werden (VERLINSKY et al. 2003). Eine innovative Möglichkeit zur genetischen Diagnostik ist die Comparative Genomische Hybridisierung (CGH), bei der die Untersuchung aller Chromosomen erfolgt (FRAGOULI et al. 2006). Diese Technik ist allerdings bislang nur in der Forschung erprobt (LANDWEHR et al. 2007). Da sie sehr arbeitsaufwendig ist, ist sie nicht mit dem engen gesetzlich vorgegebenen Zeitfenster in Deutschland zu vereinen.
Um sowohl den ersten als auch den zweiten Polkörper biopsieren zu können, kann die Entnahme nur nach der ICSI erfolgen. Die Beurteilung der Eizelle hinsichtlich ihrer chromosomalen Integrität kann also erst zu einem späteren Zeitpunkt vorgenommen werden.
2.8 Das Rind (Bos taurus) als Tiermodell
Aufgrund ethischer Aspekte können und sollen nicht alle Untersuchungen an humanen Eizellen vorgenommen werden. Auf der Suche nach geeigneten Tiermodellen für die Humanmedizin scheint das bovine Modell in mancher Hinsicht vorteilhaft zu sein (CHANSON et al. 2001, MENEZO 2003).
Das Rind ist polyoestrisch und asaisonal; die Geschwindigkeit der frühembryonalen Entwicklung ähnelt der des Menschen. Die Eizellgröße ist vergleichbar, und im Gegensatz zur Maus wird das Centrosom paternal vererbt (SATHANANTHAN et al. 1999, MENEZO 2003). Bekannt ist außerdem, dass die Größe der meiotischen Spindel zwischen Mensch und Rind eine größere Ähnlichkeit aufweist. Andere Autoren führen eine größere Übereinstimmung im Bereich der Genomaktivierung, intermediärem Metabolismus und Interaktionen mit dem Kulturmedium an (ANDERIESZ et al. 2000b, NEUBER u. POWERS 2000, MENEZO 2003, WRENZYCKI et al. 2001a).
Obwohl beispielsweise die Maus (Mus musculus) ein klassisches Labortier ist und als Modell viele Vorteile bietet, sind in den letzten Jahren kritische Meinungen im Bereich der reproduktionsmedizinischen Forschung geäußert worden. Vor dem Hintergrund der bedeutenden intensiven Forschungsarbeit an bovinen Embryonen wird bei vielen Fragestellungen wird nun zunehmend der Rinderembryo als Modell für den humanen Embryo angesehen (NEUBER u. POWERS 2000, CHANSON et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001a, MENEZO 2003).
3 Material und Methoden
Genaue Angaben über die Zusammensetzung und Herkunft der verwendeten Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräte sind im Anhang (siehe 9.1) aufgeführt.
3.1 Untersuchungen an humanen Oocyten
Die Untersuchungen an humanen Eizellen wurden im Rahmen des IVF-Programms der Universitätsfrauenklinik Bonn durchgeführt. Für polarisationsmikroskopische Langzeitbeobachtungen sowie Experimente mit parthenogenetischer Aktivierung wurden unter Berücksichtigung des Embryonenschutzgesetzes therapeutisch nicht nutzbare Oocyten verwendet. Ein Ethikvotum für Untersuchungen an unreifen Eizellen liegt vor. Über die durchgeführten Versuche ist eine Übersicht auf Seite 30 (Abb. 3) dargestellt.
3.1.1 Gewinnung und Präparation der in vivo maturierten Oocyten
Im Unterschied zu den geläufigen Superovulationsprotokollen in der Veterinärmedizin werden in der Humanmedizin zusätzlich Präparate verabreicht, die eine Hypophysensuppression induzieren. Dies erfolgt mittels einer Down-Regulation durch GnRH-Agonisten oder durch GnRH-Antagonisten.
Zur hormonellen ovariellen Hyperstimulation wurden Patienten mit patientenspezifisch angepassten Standardprotokollen behandelt. Im am häufigsten verwendeten langen Protokoll („long protocoll“) begann die Applikation von GnRH-Agonisten (Triptorelin / Decapeptyl®, Nafarelin / Synarela®, Leuprorelin / Enantone®, Dosierung: 0,1 mg/d) im Vorzyklus ca. am 20. bis 22. Zyklustag und wurde bis zur Ovulationsauslösung beibehalten. Bei einer Hypophysensuppression durch GnRH-Antagonisten (Cetrorelix / Cetrotide®, Ganirelix / Orgalutran®, Dosierung: 0,25 mg/d) wurden die Präparate eingesetzt, wenn der Leitfollikel einen Durchmesser von 13 mm erreicht hatte. Dies war meist ab dem 5. bis 6. Stimulationstag der Fall.
Zur kontrollierten ovariellen Hyperstimulation wurde rekombinantes FSH (Follikel stimulierendes Hormon: Gonal F®, Puregon®) oder hMG (humanes Menopausalgonadotropin:
Menogon HP®) ab dem zweiten Zyklustag in einer Anfangsdosierung von etwa 150 IE appliziert. Auch Kombinationen der Präparate kamen vielfach zum Einsatz. Die Dosierung variierte individuell zwischen 75 und 375 IE. Durch transvaginale Sonographie wurde die ovarielle Response, d.h. das Follikelwachstum, kontrolliert, parallel dazu wurde der Estradiol- sowie LH-Spiegel im Serum als weiterer Marker bestimmt. Die tägliche Dosierung der Gonadotropine wurde jeweils angepasst. An der Universitätsfrauenklinik Bonn durchgeführte Standard-Stimulationsprotokolle sowie Verlaufskontrollen sind in MONTAG et al. (1997) beschrieben.
Erreichte der Leitfollikel einen Durchmesser von 18 bis 20 mm oder der Estradiol-Spiegel im Serum einen Wert von 100 pg/ml pro 14 mm-Follikel, wurde die Ovulation mit hCG (humanes Choriongonadotropin: Predalon®, Ovitrelle®, Dosis: 10.000 IE) ausgelöst.
Die transvaginale Punktion der Follikel wurde 34 bis 36 h nach Ovulationsinduktion unter operativen Bedingungen und sonographischer Kontrolle durchgeführt (GEMBRUCH et al.
1988, VAN DER VEN et al. 1988). Das aspirierte Follikelpunktat wurde in Petrischalen (Ø 10 cm) gegeben und stereomikroskopisch durchsucht, die COCs in Gamete Medium® gespült und in vorbereiteten 4-Well-Schalen mit je 400 µl äquilibriertem Fertilization Medium® überführt. Nach einer Inkubation von 2 h wurden die Eizellen in Hyaluronidase (80 IU/ml, Cook) enzymatisch und mechanisch durch Pipettieren mit Denudierungspipetten (Ø 170 µm, Ø 140 µm, Ø 130 µm) frei präpariert. Danach erfolgte ein dreimaliges Waschen in Cleavage Medium®. Bis zur polarisationsmikroskopischen Untersuchung und Ermittlung des Maturationsstatus verblieben die Oocyten bei einer Temperatur von 37 °C und 6 % CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre in Cleavage Medium® unter Mineralöl (Cook) im Inkubator. Das Mineralöl wurde zum Schutz gegen osmotischen Stress durch Verdunstung, schnellen pH-Veränderungen und als Temperatur-Puffer verwendet.
3.1.2 Polarisationsmikroskopische Spindel- und Zona pellucida-Analyse
Die Polarisationsmikroskopie erlaubt die non-invasive Visualisierung von Objekten, die in der herkömmlichen Lichtmikroskopie zu wenig Kontrast aufweisen, aber aufgrund ihrer molekular hoch geordneten Struktur doppelbrechende Eigenschaften besitzen.
Hierfür wurde ein Inversmikroskop (Nikon) mit einer optischen Polarisationseinheit, bestehend aus einem Grünfilter, einem zirkularen Polarisator und einem steuerbaren
Flüssigkristall-Analysator, aufgerüstet. Dadurch wird vor dem zu untersuchenden Objekt zirkulär polarisiertes Licht erzeugt, was den unverzichtbaren Vorteil hat, dass im Gegensatz zu konventionellen linear polarisierenden Filtern eine Unabhängigkeit von der Orientierung der Strukturen erreicht wird. Hinter dem Objekt befindet sich der Flüssigkristall, mit dem das zirkulär polarisierte Licht synchron gefiltert wird. Die erzeugten Bilder wurden von einer hochauflösenden USB2-Kamera aufgenommen und durch die OCTAX polarAIDETM- Bildverarbeitungssoftware ausgewertet und visualisiert. Das System verfügte zusätzlich über eine Autokalibrierungsfunktion. Zudem wurde das Mikroskop mit einem beheizbarem Objektträgertisch ausgestattet. Um eine Konstanthaltung der Temperatur zu gewährleisten, erfolgten alle labortechnischen Manipulationen mit den Gameten bzw. Embryonen auf beheizten Arbeitsflächen (37 °C). Da Kunststoff mit polarisiertem Licht interagiert, wurden für die polarisationsmikroskopische Analysen stets Glasbodenschalen verwendet.
Für das Imaging in polarisiertem Licht wurden die denudierten Eizellen in 4 µl Mikrotropfen mit Cleavage Medium® unter Mineralöl vereinzelt. Jede Eizelle wurde fotografiert und ihre Daten erfasst. Von diesem Punkt an erfolgte die weitere Kultivierung rückverfolgbar in Einzeltropfen.
3.1.3 Gewinnung und Präparation der paternalen Gameten
Die Gewinnung erfolgte orthograd durch Masturbation nach einer Karenz von 3 bis 5 Tagen.
Nach 30 minütiger Liquifizierung wurde ein Spermiogramm nach WHO-Richtlinien (WHO- Laborhandbuch 1999) erstellt und das Ejakulat mit einem Mini-Swim Up in Fertilization Medium® aufbereitet. Details sind in MONTAG et al. (1997) aufgeführt.
3.1.4 Intracytoplasmatische Spermieninjektion
Die ICSI wurde an einem Inversmikroskop (Leica) mit zwei identischen Mikromanipulatoren (Narishige) nach einem modifizierten Standardprotokoll von PALERMO et al. (1995) durchgeführt (MONTAG et al. 1997). Dabei wurde die Eizelle mit einer Haltekapillare in Cleavage Medium® so fixiert, dass der Polkörper sich wahlweise in der 6- oder 12 Uhr- Position befand. Ein morphologisch möglichst unauffälliges und vitales Spermatozoon wurde nach mechanischer Immobilisierung mit einer Injektionskapillare in PVP auf der 3 Uhr-
Position injiziert (Abb. 2). Nach der Injektion wurden die Oocyten in Einzelkultur für 16 bis 20 h in je 50 µl mit Mineralöl überschichteten Cleavage Medium®-Tropfen unter Kultivierungsbedingungen inkubiert. Nicht ausreichend maturierte Oocyten, d.h. Eizellen ohne Polkörper, wurden von der Behandlung ausgeschlossen.
Abbildung 2: Intracytoplasmatische Spermieninjektion. Das zu injizierende Spermatozoon ist durch einen Pfeil markiert.
3.1.5 Vorkernbeurteilung und in vitro Kultivierung
Nach 16 bis 20 h wurden die Eizellen unter einem Inversmikroskop lichtmikroskopisch mit Hoffmann-Kontrast begutachtet. Die Formation von 2 Pronuclei und 2 Polkörpern galt als physiologisch fertilisiert. Bei mehr als 2 befruchteten Eizellen wurde für den späteren Embryotransfer eine Selektion anhand des Zona-Imagings getroffen. Sekundäres Kriterium war die Vorkern-Morphologie (MONTAG et al. 2001). Die Weiterkultivierung der zum Transfer bestimmten Eizellen im Vorkernstadium erfolgte einzeln in mit Mineralöl überschichteten 50 µl Tropfen mit Cleavage Medium® in Petrischalen (Ø 6 cm). Alle 24 h wurde die Entwicklung der Embryonen morphologisch beurteilt und dokumentiert.
3.1.6 Embryotransfer und Graviditätsermittlung
Der Embryotransfer wurde am Tag 2 oder 3 nach der Punktion durchgeführt. Dazu wurden die Embryonen 2 h vor dem Transfer in eine CenterWell-Schale mit 750 µl äquilibriertem
Blastocyst Medium® ohne Ölüberschichtung verbracht. Mit einem Flüssigkeitsvolumen von 50 µl wurden die Embryonen mittels eines Embryotransfer-Katheters transcervical in das Cavum uteri abgesetzt. Die genaue Technik ist in MONTAG et al. (2002b) beschrieben. Um einem durch die Therapie mit GnRH-Analoga induzierten Lutealphasendefizit entgegenzuwirken, erfolgte ab dem ersten Tag nach der Ovulationsinduktion eine intravaginale Applikation von Progesteron. Eine klinische Schwangerschaft wurde 14 Tage nach der Follikelpunktion über einen positiven β-hCG-Spiegel im Serum ermittelt und nach weiteren 2 Wochen sonographisch durch darstellbare Fruchthöhlen bestätigt (MONTAG et al. 1997). Anschließend erfolgte die Kontrolle durch einen niedergelassenen Gynäkologen.
Geburt bzw. Abort wurde von den Patienten selbst übermittelt.
Die klinische Schwangerschaftsrate wurde definiert als Anzahl der klinischen Schwangerschaften bezogen auf die Gesamtanzahl der Embryotransfers. Über die Anzahl der sonographisch darstellbaren Fruchthöhlen in Relation zu der Gesamtanzahl der transferierten Embryonen wurde die Implantationsrate errechnet.
3.1.7 Untersuchung der Spindeldynamik in Metaphase II-Eizellen
Nach einer Ruhephase von 30 bis 40 min im Inkubator wurde an den denudierten Eizellen ein erstes polarisationsmikroskopisches Spindel-Imaging durchgeführt. Jede Oocyte wurde mit Hilfe einer Injektionskapillare an der mikromanipulatorischen Einheit (Eppendorf) vorsichtig gedreht und gewendet, bis ein Polkörper und/oder ein Spindelapparat sichtbar wurde oder ein solches Vorhandensein sicher ausgeschlossen werden konnte. Nach einer weiteren Phase im Inkubator für 2 h wurde die Untersuchung auf die gleiche Weise wiederholt. Lediglich die Daten der Eizellen, die bereits bei der ersten Analyse einen Polkörper aufwiesen, wurden erfasst. Im Anschluss wurde bei allen maturen Eizellen die ICSI vorgenommen.
3.1.8 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie
Zwischen September 2005 und September 2006 wurden alle ICSI-Zyklen mit einem Transfer von 2 Embryonen in die Studie aufgenommen. Die Rückübertragung von 2 Embryonen entspricht dem deutschen Standard. Der Transfer von 3 Embryonen wird nur bei prognostisch schlechter Situation (mütterliches Alter >35 Jahre und mehrere erfolglose Vorversuche) und
