3 MATERIAL UND METHODEN
5.5 Vergleichsmöglichkeiten zwischen humaner und boviner Zona pellucida
Ein unmittelbarer Vergleich zwischen humaner und boviner Zona pellucida in der vorliegenden Arbeit ist schwierig, da die humanen Eizellen nach Hyperstimulation in vivo maturiert gewonnen wurden, während die bovinen Oocyten aus dem heterogenen Pool von Schlachthofovarien stammen und in vitro maturiert wurden. Da aber auch in der humanen assistierten Reproduktion bei extrem hohen Scores eine schlechte embryonale Entwicklung beobachtet wurde (JELINKOVA et al. 2007), scheinen sowohl eine sehr konzentrierte Struktur der inneren Schicht (hoher Score) als auch eine sehr ungeordnete Struktur (niedriger Score) den Ursprung in einer suboptimalen cytoplasmatischen Maturation zu haben und daher Marker für ein schlechtes Entwicklungspotential zu sein.
Da die Zonaparameter beim Rind teilweise eine große Varianz innerhalb der Gruppen aufweisen und der Score-Algorithmus für humane Eizellen konzipiert wurde, ist es schwer möglich, konkret auf die Eizell-Qualität rückzuschließen. Es wäre hilfreich, den dem Score zugrunde liegenden Algorithmus rinderspezifisch zu optimieren.
Ob sich die in vitro Maturation tatsächlich nicht nur auf die Oberflächenstruktur der Zona pellucida auswirkt (FAMILIARI et al. 2006, MERTENS 2006), sondern auch auf die innere Schicht, sollte durch weitere Versuche abgeklärt werden. Ein Vergleich in vivo versus in vitro würde zudem in beiden Spezies die Aussagefähigkeit erheblich erhöhen.
Denkbar ist außerdem, dass unterschiedliche Stimulationsprotokolle während der Follikulogenese einen unterschiedlichen Einfluss auf die Qualität der Eizelle und damit auch auf die Zona pellucida ausüben. Möglicherweise können sowohl die Hormonsubstitutionen als auch die Kulturmedien in vitro mit Hilfe der polarisationsmikroskopischen Analyse der Zona pellucida weiter optimiert werden.
6 Zusammenfassung
Maria Köster
Polarisationsmikroskopische Untersuchungen zur Qualität humaner und boviner Eizellen
Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu prüfen, ob die polarisationsmikroskopische Analyse der meiotischen Spindel, deren Dysfunktion beispielsweise zu Aneuploidien führen kann, eine klinisch anwendbare Methode zur Bewertung der nukleären Reife und Eizell-Qualität ist.
Parallel dazu sollte in polarisiertem Licht die Zona pellucida als potentieller Marker der cytoplasmatischen Maturation und Integrität untersucht werden.
Dazu wurde zunächst in polarisationsmikroskopischen Zeitrafferstudien an humanen Eizellen die Spindeldynamik im Verlauf der Maturation dargestellt. Nach einer Zunahme der Doppelbrechung der Metaphase I-Spindel bis zur Formierung des ersten Polkörpers bildete der Spindelapparat eine Brücke zwischen Polkörper und Ooplasma. Danach dissoziierten die Mikrotubuli zwischenzeitlich und polymerisierten schließlich zur Metaphase II-Spindel.
Durch eine zweimalige Spindel-Untersuchung vor der intracytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) konnte belegt werden, dass 57,9 % der Eizellen, die bei der ersten Untersuchung spindel-negativ waren, nach 2 h eine Spindel aufwiesen. Insgesamt führte eine Spindelpräsenz zu einer signifikant besseren Fertilisationsrate. Eine nicht darstellbare Spindel ist jedoch ohne eine zweite Analyse nicht gleichzusetzen mit einer schlechteren Entwicklungskompetenz, da eine kurzzeitige Dissoziation während der Meiose physiologisch ist. Kritisch zu bewerten ist außerdem das Ergebnis, dass mit Ausbildung des ersten Polkörpers erst zeitlich versetzt die Maturation abgeschlossen wird, was mit konventioneller Lichtmikroskopie nicht erkennbar ist. Eigene Untersuchungen ergaben zudem, dass eine frühzeitige Eizell-Aktivierung während der Phase mit ausgebildeter Spindelbrücke in einer anomalen Fertilisation mit Ausbildung von einem überzähligen Vorkern ohne Abschnürung des zweiten Polkörpers resultiert.
Für die Analyse der Zona pellucida wurde eine prospektive Studie konzipiert, bei der an 1029 humanen Metaphase II-Oocyten vor der ICSI eine subjektive Einteilung nach den anisotropen
Eigenschaften der inneren Zonaschicht erfolgte. Nur 19,1 % der Eizellen zeigten eine homogen-intensive Anisotropie, jedoch konnte diese signifikant sowohl mit einer besseren embryonalen Entwicklung am Tag 3 als auch mit einer höheren Implantations-, Graviditäts- sowie Geburtenrate korreliert werden.
Weiterhin wurden bovine Eizellen in vitro maturiert und nach polarisationsmikroskopischer Ermittlung des Meiose-Stadiums artifiziell aktiviert. Die parthenogenetische Entwicklung wurde in einer ersten Versuchsreihe bis zum Tag 9 verfolgt; in einem zweiten Ansatz wurde sie nach 20 h beendet und eine DNA-Färbung durchgeführt. In einem dritten Versuch wurde die initiale intrazelluläre Ca2+-Freisetzung nach Zugabe von Ca2+-Ionophor gemessen. Nach einer verkürzten Maturation konnte eine signifikant niedrigere Teilungs- und Blastozystenrate beobachtet werden. Dies ist mit einer noch nicht beendeten Reifung zu erklären, da Metaphase I-Eizellen im Vergleich zu maturen Eizellen eine schlechtere parthenogenetische Entwicklung zeigten. Spindel-positive Metaphase II-Oocyten wiesen tendenziell das höchste Entwicklungspotential auf.
An 2142 bovinen Eizellen erfolgte in polarisiertem Licht eine objektive Beurteilung der inneren Zonaschicht. Dabei wurde eine Gruppe im immaturen Stadium untersucht, nachdem sie zuvor mittels einer Brilliant Cresyl Blau-Färbung qualitativ bewertet worden war. Eine weitere Gruppe wurde in vitro maturiert, hier erfolgte eine qualitative Einteilung durch das Maturationsstadium. Außerdem wurde eine artifizielle Aktivierung durchgeführt und die Teilungs- sowie Blastozystenrate als Qualtitätsmerkmal erfasst. In einer letzten Versuchsreihe erfolgte das Imaging nach IVF, so dass die frühembryonale Entwicklungsrate in Bezug zu den Zonaparametern gesetzt werden konnte. Insgesamt zeigte sich, dass im Vergleich mit humanen Eizellen die anisotropen Eigenschaften der bovinen Zona pellucida deutlich höher sind. Zentrale Aussage dieses Zona-Imagings ist, dass die qualitativ besseren Oocyten signifikant niedrigere mittlere Zonaparameter aufwiesen. Eizellen mit schlechterem Entwicklungspotential besaßen dagegen eine wesentlich konzentriertere und dickere innere Zonaschicht.
Insgesamt ist festzuhalten, dass die Polarisationsmikroskopie durch die Beurteilung der anisotropen Strukturen eine neue non-invasive Möglichkeit darstellt, um vitale Eizellen hinsichtlich ihrer Entwicklungskompetenz zu untersuchen. Ausdruck der abgeschlossenen nukleären Maturation und Eizell-Qualität ist dabei eine visualisierbare Metaphase II-Spindel.
Klinische Anwendungsmöglichkeiten bieten sich vorwiegend bei Problempatienten in der humanen assistierten Reproduktion zur Optimierung des Zeitpunktes für die Durchführung der ICSI sowie bei der Enukleation boviner Eizellen im Rahmen der Klonierung.
Insbesondere die optischen Eigenschaften der inneren Zona pellucida-Schicht haben sich als prognostisches Kriterium für das Entwicklungspotential als geeignet erwiesen. Dabei scheinen eine inhomogene, niedrige Anisotropie, gleichzusetzen mit einer wenig geordneten Textur, wie auch eine sehr hohe Anisotropie, die einer sehr dichten und kompakten Struktur entspringt, Marker qualitativ schlechter Eizellen zu sein. Die innere Schicht der Zona pellucida spiegelt somit die cytoplasmatische Integrität der Eizelle wider. Diese Methode ist nicht nur in der humanen Sterilitätsbehandlung einsetzbar, sondern kann außerdem bei der weiteren Verbesserung der in vitro Kultivierung und von Stimulationsprotokollen nützlich sein.
7 Summary
Maria Köster
Evaluation of human and bovine oocyte quality using polarized light microscopy
The objective of this study was to evaluate whether the analysis of the meiotic spindle with polarized light microscopy may serve as a clinically applicable method for the assessment of nuclear maturity and oocyte quality. Spindle dysfunction may result in aneuploidies.
Furthermore, the zona pellucida also was investigated in polarized light as a potential marker of cytoplasmic maturation and integrity.
In the initial phase spindle dynamics of human oocytes during maturation were observed using time-lapse video-imaging in polarized light. After an increase in birefringence in the metaphase I spindle until extrusion of the first polar body, the spindle formed a connecting strand between the polar body and ooplasm. In the interim then, microtubules dissociated, and finally polymerized to the metaphase II spindle. When spindle imaging was performed twice before intracytoplasmic sperm injection (ICSI), it was found that 57.9 % of oocytes that were spindle-negative at the first examination possessed a spindle after 2 h. Overall it was found that the presence of a spindle was associated with significantly higher fertilization rates.
However the absence of a spindle without performing a second analysis is not equated with inferior developmental competence, since a temporary dissociation during maturation is normal. The result that completion of maturation occurs only after formation of the first polar body should be viewed critically, as this cannot be detected with conventional light microscopy. Investigations performed as part of this study demonstrate that premature oocyte activation during the phase with a connective strand between oocyte and polar body results in abnormal fertilization with formation of a supernumerary pronucleus without extrusion of the second polar body.
In order to analyze the zona pellucida, a propective study was designed with 1029 human metaphase II oocytes before ICSI, which were subjectively classified according to anisotropic properties of the inner layer of the zona pellucida. Although only 19.1 % of the oocytes
demonstrated a uniformly intensive birefringence, these characterictics were correlated with significantly better embryonic development on day 3 as well as significantly higher implantation rates, conception rates and birth rates.
In the next phase of the present study, bovine oocytes were matured in vitro and were artificially activated after determination of meiotic stage using polarized light microscopy. In the first series of tests, parthenogenetic development was studied until day 9; in the second series, in vitro culture was terminated after 20 h and DNA-staining was performed. In the third test series, initial intracellular release of Ca2+ was measured after adding a Ca2+ -ionophore. Significantly lower cleavage and blastocyst rates were observed after a shortened maturation. This finding is a result of the incomplete maturation process due to the fact that metaphase I oocytes had poorer rates of parthenogenetic development compared to mature oocytes. Spindle-positive metaphase II oocytes tended to have the highest developmental potential.
The inner zona layer of 2142 bovine oocytes was objectively evaluated in polarized light. One group of immature oocytes was examined after qualitative assessment with brilliant cresyl blue staining. A second group was matured in vitro, and qualitative classified according to maturational status. Mature oocytes were additionally subjected to artificial activation, and cleavage and blastocyst rates were measured. In a final series of tests, zona imaging was performed after in vitro fertilization (IVF), in order to correlate early embryonic developmental rates to zona parameters. Overall the birefringence of the bovine zona pellucida was much higher in comparison with human oocytes. The decisive result of the zona imaging in this study is that higher quality oocytes had significantly lower average zona parameters. In contrast, oocytes with inferior developmental potential had a significantly more concentrated and thicker inner zona layer.
In conclusion, this study demonstrates that the evaluation of birefringent structures by polarization light microscopy shows potential as a new, non-invasive method to assess the developmental competence of vital oocytes. Visualization of the metaphase II spindle is a good indicator for nuclear maturity and oocyte quality. The clinical application of this research will likely be most significant in human assisted reproduction for certain patients for optimizing of ICSI timing as well as in enucleation of bovine oocytes for cloning. Especially the optical properties of the inner zona layer were shown to be a suitable indicator of
developmental potential. Inhomogeneous, low birefringence, which equated with a low ordered texture, as well as very high birefringence, which arises from a very dense and compact structure, appear to be markers of low quality oocytes. The inner layer of the zona pellucida is a reflection of the cytoplasmatic integrity of the oocyte. This method will not only be valuable for use in human sterility therapy, but also to improve in vitro culture and stimulation protocols.
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