Die die Oocyte und den präimplantativen Embryo umgebende extrazelluläre Matrix wird aufgrund ihrer lichtmikroskopischen Transparenz Zona pellucida (ZP) genannt. Sie ist nicht nur während der Spermien-Eizell-Interaktion von unverzichtbarer Bedeutung, sondern bietet bis zum Schlupf einen biomechanischen Schutz (WASSARMAN 1987, YANAGIMACHI 1994).
2.6.1 Morphologie und Genese der Zona pellucida
Mit Beginn des Eizellwachstums werden Zona pellucida-Proteine ohne Beteiligung der Granulosazellen synthetisiert (EPIFANO et al. 1995). Die humane wie auch die bovine Zona pellucida sind zu einem geringeren Grad auch eine Syntheseleistung der umgebenden Follikelzellen (GROOTENHUIS et al. 1996, SINOWATZ et al. 2001). Während bei der Maus 3 codierende Gene für 3 ZP-Proteine (mZP1, mZP2, mZP3) identifiziert wurden, wird die Zona bei Mensch und Rind von 4 ZP-Proteinen (Mensch: hZP1, hZP2, hZP3, hZP4 / Rind:
bZP1, bZP2, bZP3-α, bZP3-β, bZP4) und entsprechend 4 codierenden Genen gebildet (WASSARMAN 1988, LEFIEVRE et al. 2004, TOPPER et al. 1997). Innerhalb des Tiereichs weisen die Gensequenzen hohe Homologien auf (HARRIS et al. 1994); als Modell wurde insbesondere die murine Zona intensiv untersucht. Aus glykolisierten ZP2 und ZP3 formieren sich Dimere, die extrazellulär zu langen Ketten assoziieren und quer durch ZP1 vernetzt sind.
So wird speziesübergreifend eine dreidimensionale Glycoproteinschicht gebildet, die von Granulosazellfortsätzen zur interzellulären Kommunikation durchsetzt ist (GREVE u.
WASSARMAN 1985, GREEN 1997). Beim Mensch ist die Zona ca. 20 µm dick, beim Rind etwa 12 µm (PELLETIER et al. 2004, NAKAGAWA et al. 1991).
Elektronenmikroskopisch stellt sich bei Mensch und Maus die innere Oberfläche fein und glatt dar, während die äußere Oberfläche bei maturen Eizellen als poröses, großmaschiges Netzwerk charakterisiert wird (PHILIPS u. SHALGI 1985, FAMILIARI et al. 1989). Die Oberfläche immaturer wie auch atretischer Oocyten wird dagegen als engmaschig und homogen beschrieben (FAMILIARI et al. 1989). Auch die Modifikation post fertilisationem spiegelt sich in Untersuchungen an der Maus in der Ultrastruktur durch ein Abnehmen der retikulären Struktur wider (JACKOWSKI u. DUMONT 1979). Eine lockere, poröse Oberflächenstruktur scheint für die Interaktion mit den Spermatozoen vorteilhaft zu sein (FAMILIARI et al. 2006). Eine Arbeitsgruppe begründete die unterschiedlichen Ergebnisse mit Fixationsartefakten (MAGERKURTH et al. 1999). Dieses Phänomen konnte jedoch nach Wiederholung der Experimente mit verschiedenen Aufbereitungstechniken von anderen Autoren nahezu ausgeschlossen werden (FAMILIARI et al. 2006).
Gleiche Veränderungen an der Oberflächentextur wurden von VANROOSE et al. (2000) in bovinen immaturen, in vitro maturierten Eizellen und in vitro produzierten Zygoten gefunden.
SUZUKI et al. (1994) und MERTENS (2006) beschreiben dagegen die bovine Zona
pellucida-Oberfläche von immaturen Eizellen als weitmaschig und porös. Ein Vergleich in vivo versus in vitro zeigt beträchtliche Diversitäten bei maturierten Eizellen und Zygoten. In vitro maturierte Oocyten und in vitro produzierte Zygoten zeigen deutlich weniger Poren und eine glattere Struktur, was auf suboptimale Kultivierungsbedingungen hindeutet. Die porenarme Architektur könnte Folge einer wenig ausgeprägten Penetration bzw. vorzeitigen Retraktion und damit eines unzureichenden Kontaktes der Granulosazellfortsätze unter in vitro Bedingungen sein. Ein Einfluss der Fertilisation konnte von MERTENS (2006) nicht bestätigt werden. SUZUKI et al. (2000) zeigten in einer Untersuchung eine ultrastrukturelle Veränderung der Oberfläche boviner in vitro maturierter Eizellen nach parthenogenetischer Aktivierung mit Ca2+-Ionophor und DMAP oder Cycloheximid. Dabei war die beobachtete Abnahme der porösen Struktur reversibel.
Im Verlauf der Passage durch den Eileiter werden verschiedene Moleküle in die Zona eingelagert (HERRLER et al. 1999). Trotzdem nimmt die Zonadicke während der embryonalen Entwicklung bis zum Schlupf ab (MONTAG et al. 1999a, PELLETIER et al.
2004, KILANI et al. 2006).
2.6.2 Funktion der Zona pellucida
Die Rolle der Zona pellucida bei der Befruchtung und frühembryonalen Entwicklung ist wesentlich und vielfältig. Phylogenetisch betrachtet sind die extraembryonalen Hüllen sehr alte Strukturen. Traditionell wird postuliert, dass heterologe Spermatozoen nicht an die Zona binden und penetrieren können (HERRLER et al. 1999, YANAGIMACHI 1994, TOPPER et al. 1997, WASSERMAN et al. 1999).
Während ihrer Passage durch den weiblichen Genitaltrakt durchlaufen die Spermien die Kapazitation, die sie zur Bindung an die Zona pellucida und Akrosomenreaktion befähigt.
Primärer Bindungsort an der Zona ist ein Rezeptor, der beim Rind als das Glycoprotein bZP3-α definiert ist, beim Mensch hZP3. Diese Rezeptorenbindung induziert die Akrosomenreaktion, bei der der enzymatische Inhalt des Akrosoms freigesetzt wird, so dass die Zona penetriert werden kann. Anschließend kann das Spermatozoon mit der Ooplasmamembran fusionieren. Dabei fungiert ZP2 als sekundärer Rezeptor für das akrosomenreagierte Spermium (TOPPER et al. 1997, BLEIL u. WASSARMAN 1981, WASSARMAN 1987 u. 1988). Im weiteren Wechselspiel zwischen männlichem und
weiblichem Gamet entsteht ein Polyspermieblock, der durch die sogenannte Zonareaktion möglich wird. Diese Reaktion wurzelt in der exocytotischen Ausschleusung der während der Maturation akkumulierten Corticalgranula, die über den perivitellinen Spalt die Zonaarchitektur modifizieren. Dabei werden die Glycoproteine ZP2 und ZP3 zu ZP2f bzw.
ZP3f konvertiert. Die genaue molekulare Basis dieser Reaktionen ist Gegenstand aktueller Forschung (YANAGIMACHI 1994, WASSARMAN et al. 1999, NARA et al. 2006).
In der weiteren präimplantativen Entwicklung unterbindet die Zona pellucida eine mögliche Disaggregation des zunächst nur lockeren Blastomeren-Zellverbands durch die Ovidukt- bzw.
Uterusmotilität und erleichtert den Transport des Embryos an seinen Implantationsort. So wird auch eine vorzeitige Adhäsion an das maternale Epithel verhindert. Eine weitere Funktion kommt ihr als eine Art Mailbox in der embryomaternalen Kommunikation zu (WASSARMAN et al. 1999, HERRLER 1999).
2.6.3 Zona hardening
Polyspermie stellt bei Insekten-, Reptilien- und Vogelarten durchaus ein physiologisches Phänomen dar (REMANE et al. 1985). Bei Mammaliae wird im Verlauf der Befruchtungskaskade jedoch die Penetration von mehr als einem Spermatozoon durch die Zonareaktion vereitelt (YANAGIMACHI 1994). Dieser Effekt wird in der Literatur auch als Zona hardening bezeichnet, da die Modifikation der Zonaproteine mit einer erhöhten Resistenz gegen proteolytische Enzyme, wie z.B. Chymotrypsin, einhergeht (HOODBHOY u.
TALBOT 1994, DE FELICI u. SIRACUSA 1982).
Zona hardening kann auch spontan bei gealterten Eizellen auftreten und wurde sowohl beim Menschen (COHEN et al. 1992) als auch beim Rind beschrieben (KATSKA et al. 1989). Eine weitere Form des Zona hardenings wird als Folge von suboptimalen Kultivierungsbedingungen in vitro diskutiert, wodurch der für die Implantation essentiellen Schlupf der Blastozyste beeinträchtigt wird. Untersuchungen an murinen Eizellen zeigten, dass Follikelflüssigkeit, Cumulus- und Granulosazellen, Serum sowie Fetuin, eine Hauptkomponente des fetalen Kälberserums, eine derartige Veränderung der Zonastruktur verhindern können (DE FELICI u. SIRACUSA 1982, SCHRÖDER et al. 1990). Beim Rind scheinen insbesondere der Zusatz von fetalem Kälberserum sowie ein Cumulus-intakter COC dem Zona hardening entgegenzuwirken (LANDIM-ALVARENGA et al. 2002, KATSKA et
al. 1989). Zonaveränderungen einhergehend mit niedrigeren Schlupfraten sind auch in Zusammenhang mit Kryokonservierung bei Maus, Mensch und Rind dargestellt worden (MATSON et al. 1997, TUCKER et al. 1991, VATJA et al. 1997). In der humanen assistierten Reproduktion scheinen außerdem die kontrollierte hormonelle Hyperstimulation sowie patientenspezifische Parameter zu einer Zonaverhärtung zu führen (LORET DE MOLA et al. 1997, MONTAG et al. 1999b, 2000). Eine Schlupfhilfe ist durch das Assisted Hatching vor dem Embryotransfer bei Mensch und Rind möglich geworden (COHEN et al. 1992, MONTAG et al. 1999b, SCHMOLL et al. 2003, RÜTHER 2005).
2.6.4 Polarisationsmikroskopische Untersuchungen
Auf der Suche nach einer Untersuchungsmöglichkeit ohne vorherige Fixierung nutzten KEEFE et al. 1997 die Polarisationsmikroskopie und bestätigten an Hamster-Eizellen eine auch elektronenmikrokopisch und histochemisch diskutierte Schichtung der Zona (KAUFMANN et al. 1989). Polarisationsmikroskopisch kann diese Schichtung aufgrund der unterschiedlichen optischen Eigenschaften nachgewiesen werden. Dabei stellt sich die Zona als eine dreischichtige Struktur von Zonafilamenten dar. Während die schmale mittlere Lamina keine Anisotropie aufweist, sind sowohl die innere als auch die äußere Schicht doppelbrechend. Da die innerste Schicht die stärkste Anisotropie besitzt, sind im vorgestellten Modell die Filamente dort radiär angeordnet, während sie in der äußeren Zone tangential gruppiert sind (Abb. 1).
Die Ergebnisse konnten von PELLETIER et al. (2004) auf die humane ZP übertragen werden.
Der Vergleich zwischen immaturen und maturen Eizellen zeigte keine signifikanten Unterschiede; jedoch gab es eine Korrelation zwischen Zonadicke und Zonadichte und damit der Stärke der anisotropen Eigenschaften. KILANI et al. (2006) wiesen nach, dass mit zunehmender Kultivierungsdauer eine zunehmende Dichte – gleichzusetzen mit zunehmender Anisotropie – auftritt, was gleichzeitig im Rahmen der fortschreitenden Embryonal-entwicklung mit abnehmender Zonadicke einhergeht.
In einer retrospektiven Studie beobachteten SHEN et al. (2005), dass eine hohe Anisotropie der inneren Zonaschicht besonders bei Eizellen zu finden ist, bei denen der Embryotransfer zu einer Gravidität führt. In einer weiteren retrospektiven Evaluation wurde ein Zusammenhang
zwischen der Doppelbrechung der inneren Zonaschicht mit der embryonalen Blastozystenentwicklung hergestellt (RAMA RAJU et al. 2007).
Abbildung 1: Schematische Struktur der Zona pellucida (nach KEEFE et al. 1997)