Zona pellucida in bovinen Oocyten

Bislang existieren in der Literatur wenige Veröffentlichungen über die optischen Eigenschaften der Zona pellucida in polarisiertem Licht; diese sind auf die Spezies Hamster (KEEFE et al. 1997) und Mensch (PELLETIER et al. 2004) beschränkt. Nachdem in der

eigenen Arbeit übereinstimmend mit anderen Studien (SHEN et al. 2005, RAMA RAJU et al.

2007) die Doppelbrechung der inneren Zonaschicht als potentieller Marker des Entwicklungspotentials von Eizellen identifiziert wurde, erfolgte die Ausdehnung der Fragestellung auf das bovine Modell. Da durch eine sehr viel höhere Anisotropie eine subjektive Einteilung problematisch erschien, wurde die Auswertung mit den entwickelten objektiven Messparametern vorgenommen. Neben den Parametern CV (Dicke der innneren Zonaschicht) und PV (mittlere Peak-Intensität) wurde als ein zentraler Wert auch der Score einbezogen, ein Algorithmus, der auf den ermittelten Messwerten basiert. Ein positiver Score in humanen Metaphase II-Oocyten steht für eine gute Eizell-Qualität; allerdings wurden extrem hohe Score-Werte mit schlechterer Blastozystenrate korreliert (JELINKOVA et al.

2007).

Zunächst wurde zur qualitativen Differenzierung immaturer Eizellen eine BCB-Vitalfärbung durchgeführt. Dabei wurden 47,3 % als BCB+ und damit mit metabolisch guter Qualität klassifiziert. In einer anderen Arbeitsgruppe rangieren die BCB+ bei 57,9 bis 59,4 % (ALM et al. 2005, BHOJWANI et al. 2007), dies ist einerseits durch die hier strengere Selektion nur deutlich angefärbter Oocyten zu erklären, andererseits könnte bereits eine unterschiedliche Vorselektion der COCs ein Grund sein. Die polarisationsmikroskopische Analyse ergab hoch signifikante Unterschiede aller polarisationsmikroskopisch erfasster Zonaparameter.

Interessanterweise wies dabei die BCB+ Gruppe die niedrigeren Durchschnittswerte auf.

Hohe Zonawerte, gleichzusetzen mit einer dichteren und geordneteren Struktur der Mikrofilamente, scheinen in bovinen immaturen Eizellen ein schlechteres Entwicklungspotential zu bedeuten. Möglicherweise besitzen die Eizellen, deren Prämaturation noch nicht abgeschlossen ist, eine dichtere innere Zonaschicht, die eine Penetration von Spermatozoen auch zu einem späteren Zeitpunkt verhindert.

Auch beim Zona-Imaging maturer Eizellen waren statistisch hoch signifikante Unterschiede zwischen Oocyten mit und ohne Polkörper zu beobachten. Dabei hatten ausgereifte Eizellen niedrigere Zonaparameter als jene, die noch keinen ersten Polkörper ausgeschleust hatten.

Damit ist die Konstellation ähnlich den immaturen Oocyten, da auch nach Maturation die qualitativ höher einzuordnenden Metaphase II-Eizellen niedrigere Doppelbrechungs-intensitäten besitzen. Eine dickere, hoch anisotrope innere Schicht ist also vermehrt in Eizellen, die trotz in vitro Maturation nicht den Metaphase II-Arrest erreicht haben und so als

qualitativ schlechter beurteilt werden. Ursache könnte eine strukturelle Veränderung während der Entwicklung von Metaphase I zu Metaphase II sein, jedoch konnten PELLETIER et al.

(2004) in humanen Oocyten weder einen Unterschied in der Dicke noch in der Doppelbrechung zwischen immaturen und maturen Eizellen nachweisen. Der wahrscheinlichere Grund ist eine suboptimale Maturation, die zur Retardierung führt und sich auch in der inneren Zonaschicht widerspiegelt. Die in vitro Bedingungen können ebenfalls einen Einfluss im Sinne des sogenannten Zona hardening ausüben, der hier nicht überprüft werden konnte.

Um die frühembryonale Entwicklung beurteilen zu können, wurde in einem weiteren Versuch eine artifizielle Aktivierung durchgeführt. Auch hier hatten qualitativ bessere Eizellen, d.h.

die sich parthenogenetisch teilten und zu Blastozysten entwickelten, niedrigere Zonaparameter. Dies konnte jedoch überwiegend nicht biometrisch abgesichert werden. Ein Grund für die nicht so deutlich darstellbare Differenz könnte in der Art der Aktivierung liegen. Die membranpermeabilisierende Wirkung von Ca²⁺-Ionophor könnte unspezifischer wirken als die konventionelle IVF.

Um dies näher zu prüfen, wurde in einem letzten Versuchsansatz die Furchungs- sowie Blastozystenrate nach IVF als Qualitätsmerkmal untersucht. Das Ergebnis ist analog zu den vorher gewonnenen Erkenntnissen zu werten. Die qualitativ besseren Eizellen mit dem höheren Entwicklungspotential, ausgedrückt in ihrer Entwicklungsfähigkeit und Entwicklungsgeschwindigkeit zur Blastozyste sowie der Fähigkeit zu schlüpfen, hatten signifikant niedrigere durchschnittliche Zonaparameter.

In jedem dieser Analyseansätze ist das Ergebnis, dass bovine, qualitativ bessere Eizellen niedrigere Mittelwerte der Zonaparameter haben. Dabei ist sowohl die durchschnittliche Dicke der inneren Zonaschicht als auch die mittlere Peak-Intensität der Doppelbrechung niedriger. Insgesamt zeichnet sich die innere Lamina der bovinen Zona pellucida durch eine sehr hohe Anisotropie aus. Da es in der Literatur vorwiegend Studien gibt, die sich elektronenmikroskopisch nach Fixation mit der Oberflächenstruktur auseinandersetzen, ist es schwierig, für diese Ergebnisse eine fundierte Ätiologie zu finden. Naheliegend ist, dass durch eine sehr dichte Zona eine Fertilisation verhindert wird. Darüber hinaus ist es möglich, dass diese konzentrierte Textur über die ganze präimplantative Periode beibehalten wird und so das Hatchen des Embryos unmöglich wird. Ein Indiz dafür ist die Tatsache, dass Oocyten,

die bis zum Tag 9 erfolgreich geschlüpft sind, niedrigere Mittelwerte der Zonaparameter hatten als jene, die als Blastozyste arretierten. Polarisationmikroskopische Untersuchungen von Blastozysten würden hierzu eventuell weiteren Aufschluss geben. In der Literatur ist dieses Zona hardening, hervorgerufen durch suboptimale in vitro Kultivierungsbedingungen sowie Kryokonservierung, eingehend beschrieben (DE FELICI u. SIRACUSA 1982, MERTENS 2006) und Lösungsmöglichkeiten für ein erfolgreiches Schlüpfen mit nachfolgender Implantation sind durch das Assisted Hatching beim Mensch und beim Rind dargestellt worden (COHEN et al. 1992, MONTAG et al. 1999b, SCHMOLL et al. 2003, RÜTHER 2005). Da bereits in immaturen Oocyten qualitative Unterschiede nachweisbar waren, scheint die Basis dieser Eigenschaften der Zona pellucida bereits während der Follikulogenese gelegt zu werden. Die optischen Eigenschaften der inneren Zonaschicht spiegeln also die cytoplasmatische Integrität der Eizelle wider.

5.5 Vergleichsmöglichkeiten zwischen humaner und boviner Zona