3 MATERIAL UND METHODEN
3.3 Statistische Auswertung
Die statistische Analyse bezüglich der embryonalen Entwicklungsraten wurde mit dem Chi-Quadrat-Test durchgeführt. Unterschiede in Patientenalter und Anzahl der punktierten Eizellen innerhalb der Zona pellucida-Studie wurden mit ANOVA (zweiseitiger t-Test) überprüft. Ebenso erfolgte die statistische Auswertung der Zonaparameter mit ANOVA (zweiseitiger t-Test). Unterschiede galten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von P < 0,05 als signifikant, P < 0,001 wurde als hochsignifikant definiert.
Abbildung 4: Untersuchungen an bovinen Oocyten. Schematische Darstellung der Parametererhebungen.
BCB-Färbung IVM IVM/IVF
immature Oocyten mature Oocyten Oocyten 21 h p.ins.
Gewinnung von bovinen COCs
Zona-Imaging
Zona-Imaging
Zona-Imaging
Parthenogenetische Aktivierung Ca2+-Messung
in vitro Kultivierung
Spindel-Imaging
Hoechst-Färbung
in vitro Kultivierung
4 Ergebnisse
4.2 Ergebnisse der Untersuchungen an humanen Oocyten
4.1.1 Polarisationsmikroskopische Analyse der meiotischen Spindel 4.1.1.1 Spindeldynamik im Verlauf der Maturation humaner Oocyten
In 3 von 9 polarisationsmikroskopisch untersuchten humanen Metaphase I-Oocyten konnte in Zeitrafferstudien die finale Maturation bis zum Metaphase II-Arrest dargestellt werden. Bei den übrigen Eizellen schnürte sich der Polkörper entweder gar nicht oder nicht in der fokussierten Ebene ab. Die Spindel zeigte sich als hochdynamischer Teil des Cytoskeletts:
Die Metaphase I-Spindel lagerte sich peripher (Abb. 5A) und nahm in ihrer Intensität bis zur Bildung des ersten Polkörpers zu (Abb. 5B). Für die Dauer von 75 bis 90 min bildeten die Mikrotubuli eine Verbindung zwischen Polkörper und Ooplasma (Spindelbrücke, Abb. 5C, 5D); anschließend war eine Dissoziation für die Dauer von 40 bis 60 min zu beobachten (Abb. 5E). 115 bis 150 min nach der Ausschleusung des ersten Polkörpers polymerisierten die Mikrotubuli zur zweiten meiotischen Spindel (Abb. 5F).
Abbildung 5: Spindeldynamik während der Meiose I (Eizelle ovoid geformt)
A B C
D E F
4.1.1.2 Spindeldynamik in humanen Metaphase II-Oocyten vor ICSI
493 mature Eizellen wurden im Rahmen des Standard-ICSI-Programms eines zweimaligen Imagings im Abstand von 2 h unterzogen, wobei beim ersten Imaging bereits 80,7 % der Oocyten eine Spindel aufwiesen. Nach 2 h konnte bei der Mehrzahl der Eizellen, die bei der ersten Untersuchung eine dissoziierte, also nicht sichtbare Spindel hatten, eine Spindel dargestellt werden (Tab. 1).
4.1.1.3 Ergebnisse nach ICSI in Abhängigkeit von der Spindeldynamik
16 bis 20 h nach der ICSI und einem zweimaligem Spindel-Imaging wurde die Befruchtung beurteilt (Tab. 2). Dabei gab es nur einen geringfügigen Unterschied in der Fertilisation zwischen der Gruppe, die bereits beim ersten Imaging eine Spindel aufwies, und jener Gruppe, die bis zur zweiten Untersuchung eine Spindel entwickelt hatte (78,3 % versus 78,2
%). Dagegen zeigten die Eizellen ohne Spindel eine signifikant schlechtere Fertilisationsrate (62,5 %, p < 0,025).
4.1.1.4 Auswirkung der Eizell-Aktivierung während der Spindelbrückenphase
15 humane Metaphase I-Oocyten wurden in vitro bis zur Spindelbrückenphase (Abb. 5C, 5D) nachmaturiert und mit Ca2+-Ionophor aktiviert. 10 von 15 Eizellen bildeten 16 bis 20 h nach Aktivierung 2 Vorkerne, jedoch keinen zweiten Polkörper.
Exemplarische Zeitrafferstudien im Anschluss an die artifizielle Aktivierung zeigten, dass aus der bestehenden Spindelbrücke die Spindel vollständig in den sich bildenden ersten Polkörper ausgeschleust wurde und dort dissoziierte (Abb. 6). Eine Assoziation von Mikrotubuli zur zweiten meiotischen Spindel unterblieb auch bei Langzeitbeobachtungen.
Nach Aktivierung durch ein Spermatozoon während der Routine-ICSI zum Zeitpunkt einer bestehenden Spindelbrücke zeigten 18 von 20 Eizellen eine anomale Fertilisation mit 3 Pronuclei und fehlendem zweiten Polkörper. 2 Oocyten bildeten einen zweiten Polkörper und 2 Vorkerne (Abb. 7).
Tabelle 1: Spindeldynamik in humanen Metaphase II-Eizellen vor ICSI 2. Imaging nach 2 h Metaphase II
(n = 493) 1. Imaging
darstellbare Spindel nicht darstellbare Spindel darstellbare
Tabelle 2: Fertilisationsrate von humanen Metaphase II-Eizellen nach ICSI in Abhängigkeit von der Spindelpräsenz
1. Imaging 2. Imaging nach 2 h Fertilisationsrate darstellbare
Spindel 398 darstellbare Spindel 396 78,3 % (310/396)a darstellbare Spindel 55 78,2 %
(43/55) nicht darstellbare
Spindel 95
nicht darstellbare Spindel 40 62,5 % (25/40)b
a:b p < 0,025
Abbildung 6: Spindeldissoziation im ersten Polkörper nach artifizieller Aktivierung einer humanen Oocyte in der Spindelbrückenphase
A B
C D
Abbildung 7: A. Humane Oocyte nach ICSI in der Spindelbrücken-Phase mit 3 Vorkernen B. Humane Oocyte nach ICSI in der Metaphase II mit sichtbarem zweitem Polkörper und 2 Vorkernen
4.1.2 Zona pellucida-Imaging humaner Oocyten
4.1.2.1 Prospektive Zona pellucida-Imaging-Studie
In die Studie wurden 1029 Metaphase II-Oocyten aus 135 Zyklen von 124 Patienten eingeschlossen. Nach den Kriterien Intensität und Homogenität erfolgte eine subjektive Einteilung in 2 Gruppen: Eizellen mit einer homogen-intensiven inneren Zona-Schicht wurden als „hoch doppelbrechend“ (HZB, high zona birefringence) bezeichnet, jene mit inhomogenen, schwach anisotropen Eigenschaften als „niedrig doppelbrechend“ (LZB, low zona birefringence) eingestuft (Abb. 8).
Abbildung 8: Humane Metaphase II-Oocyten. Zona pellucida hoch doppelbrechend (A), Zona pellucida niedrig doppelbrechend (B)
A B
B A
197 (19,1 %) der untersuchten Eizellen zeigten eine hohe Anisotropie, wobei in 44 Zyklen keine Eizellen dieser Klassifikation zu finden waren. Subtrahiert man diese Zyklen, so entspricht das einem Durchschnitt von 2,16 HZB-Eizellen pro Zyklus.
Die Fertilisationsrate der Studie lag bei 69,4 % (714/1029); zwischen HZB- und LZB-Eizellen gab es keine signifikanten Unterschiede. Jedoch unterscheiden sich beide Gruppen signifikant (p < 0,025) in der Embryonalenwicklung am Tag 3. Während 41,7 % (n = 57) der befruchteten Eizellen mit hoher Doppelbrechung sich zu Embryonen mit mindestens 8 Blastomeren und sehr guter Qualiät teilten, taten dies in der LZB-Gruppe nur 24,4 % (n = 119).
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse nach Transfer von 2 Embryonen, wobei – wenn möglich – bei der Selektion für den Embryotransfer befruchtete HZB-Eizellen bevorzugt wurden. Das Patientenalter zwischen den Gruppen war nicht signifikant unterschiedlich, doch war die Anzahl der punktierten Metaphase II-Eizellen in der Gruppe mit Transfer von 2 Embryonen aus Eizellen mit hoher Doppelbrechung signifikant höher. Konnte ein Transfer nur mit 2 Embryonen aus LZB-Eizellen vorgenommen werden, lag die klinische Schwangerschaftsrate bei 24,6 % und unterschied sich damit signifikant von den Schwangerschaftsraten aus Transfers, bei denen 2 Embryonen aus HZB-Eizellen bzw. aus je einer HZB- und LZB-Eizelle transferiert wurden (65,0 % bzw. 50,0 %). Entsprechende Unterschiede sind auch bei der Implantationsrate und Geburtenrate wiederzufinden. Mit einer Implantationsrate von 13,1
% und einer Geburtenrate von 20,0 % hatte die LZB/LZB-Gruppe die schlechtesten Ergebnisse. Die besten Implantations- und Geburtenraten mit 40,0 % bzw. 60,0 % resultierten aus Transfers von Embryonen, die sich aus fertilisierten Eizellen mit hoher Anisotropie entwickelten.
4.1.2.2 Zona pellucida-Imaging immaturer humaner Oocyten
Der über einen Algorithmus berechnete objektive Score von 54 immaturen Oocyten im GV- oder Metaphase I-Stadium wurde am Tag der Punktion erfasst. Nach einer 24-stündigen in vitro Kultivierung wiesen 48 Eizellen (88,9 %) eine Veränderung der doppelbrechenden Eigenschaften auf (Abb. 9). Die Mehrheit der Eizellen tendierte zu einem niedrigeren Score, jedoch konnten aufgrund des geringen Stichprobenumfangs keine signifikanten Unterschiede nachgewiesen werden.
Tabelle 3: Ergebnisse der prospektiven Zona pellucida-Imaging-Studie
Embryotransfer von HZB+HZB HZB+LZB LZB+LZB p
Anzahl ICSI-Zyklen 20 50 65
Implantationsrate 40,0 %a (16/40)
26,0 %b (26/100)
13,1 %c
(17/130) c:ab p < 0,025
Schwangerschaftsrate 65,0 %a (13/20)
Geburtenrate 60,0 %a
(12/20) HZB+HZB = Transfer von 2 Embryonen mit hoch doppelbrechender Zona pellucida, HZB+LZB = Transfer von einem Embryo mit hoch doppelbrechender und einem mit niedrig doppelbrechender Zona pellucida, LZB+LZB=
Transfer von 2 Embryonen mit niedrig doppelbrechender Zona pellucida
Abbildung 9: Veränderung des Scores von humanen immaturen Oocyten nach einer 24- stündigen Kultivierung
4.2 Ergebnisse der Untersuchungen an bovinen Oocyten
4.2.1 Einfluss des Meiosestadiums boviner Oocyten bei parthenogenetischer Aktivierung
4.2.1.1 Auswirkung der Maturationsdauer boviner Oocyten auf den Aktivierungs-erfolg
Insgesamt 218 Eizellen wurden nach 20,5 bis 24 h in vitro Maturation einzeln aktiviert. Die erhobenen Daten (Tab. 4) zeigen deutlich, dass eine verkürzte Maturation zu einer signifikant niedrigeren Teilungsrate sowie Blastozystenrate führte (34,2 % bzw. 7,6 %). Mit einer Teilungsrate von 72,1 % und einer Blastozystenrate von 29,5 % wies eine Maturationsdauer von 22,5 h die besten Resultate auf. Nach einer längeren Maturation war ein Abfall der Raten zu beobachten, der jedoch aufgrund des geringen Probenvolumens in der letzten Gruppe statistisch nicht signifikant war.
Tabelle 4: Teilungsrate und Blastozystenrate am Tag 9 nach parthenogenetischer Aktivierung boviner Oocyten in Abhängigkeit von der Maturationsdauer
Maturationsdauer 20,5 h 22,5 h 23,5 h 24 h
Teilungsrate 34,2 %a (27/79) 72,1 %b (44/61) 64,8 %c (35/54) 62,5 %d (15/24) Blastozysten d9 7,6 %e (6/79) 29,5 %f (18/61) 20,4 %g (11/54) 16,7 % (4/24)
a:bc p < 0,001; e:f p < 0,005; a:d p < 0,025; e:g p < 0,05
4.2.1.2 Ergebnisse nach Aktivierung in Abhängigkeit vom Maturationsstadium
In 4 Versuchen wurde das Maturationsstadium in vitro maturierter boviner Oocyten polarisationsmikroskopisch erfasst. 73,6 % der Eizellen befanden sich im Metaphase II-Stadium der Meiose, davon waren 64,1 % spindelpositiv (107/167). Insgesamt 227 Eizellen wurden anschließend einzeln artifiziell aktiviert und bis zum Tag 9 kultiviert. Die frühembryonale Entwicklung war zwischen Metaphase I- und Metaphase II-Eizellen signifikant unterschiedlich. Sowohl die Teilungsrate als auch die Blastozystenraten waren bei der Gruppe signifikant höher, bei der die Aktivierung zum physiologischen Zeitpunkt, also in
der Metaphase II, erfolgte (Abb. 10). Das höchste parthenogenetische Entwicklungspotential besaßen dabei die Oocyten, die neben einem Polkörper auch eine Spindel aufwiesen. Eine darstellbare Spindel im Metaphase I-Stadium führte dagegen nicht zu besseren Entwicklungsraten. 71,7 % (43/60) der Eizellen mit fehlendem Polkörper waren spindelpositiv (Tab. 5).
Abbildung 10: Teilungs- und Blastozystenraten nach parthenogenetischer Aktivierung boviner Metaphase I und Metaphase II-Eizellen
Tabelle 5: Teilungs- und Blastozystenraten nach parthenogenetischer Aktivierung boviner Oocyten unter Einbeziehung der Spindelkonfiguration
Maturationsstadium Anzahl (n = 227)
4.2.1.3 Hoechst-Färbung 20 h nach Aktivierung boviner Oocyten
Vor der parthenogenetischen Aktivierung wurden 132 in vitro maturierte Oocyten auf das Vorhandensein eines Polkörpers und einer Spindel überprüft. 75,8 % wurden auf diese Weise als Metaphase II-Eizellen eingestuft. Am Tag 1 befanden sich über 50 % der untersuchten Eizellen im Pronucleus-Stadium, 24 % hatten bereits die erste Teilung durchlaufen. 22 % waren in einem Meiose-Stadium arretiert (Abb.11).
In Tabelle 6 zeichnet sich eine Abhängigkeit von der Maturationsdauer ab. Bei verkürzter Maturation war die Zahl der Eizellen, die im Meiose-Stadium stagnierten, höher (33,3 % vs.
17,8 %). Entsprechend war der Prozentsatz der Eizellen, die sich geteilt hatten, niedriger (13,9
% vs. 28,1 %). Dieser Zusammenhang ließ sich jedoch nur zum Teil biometrisch absichern.
Zwischen Metaphase I- und Metaphase II-Stadium zum Aktivierungszeitpunkt gab es keine signifikanten Unterschiede, jedoch war nach 22-stündiger Maturation eine höherer Prozentsatz von Meiose-Stadien in der Metaphase I-Gruppe zu erkennen (25,9 % vs. 14,5 %).
Tabelle 7 differenziert die Oocyten detailliert nach der Spindeldarstellbarkeit. Auch in diesen Versuchen war zu erkennen, dass spindelpositive Metaphase II-Eizellen zu den besten Ergebnissen führten: Im Vergleich mit Metaphase II-Stadien ohne Spindel hatte diese Gruppe signifikant mehr Teilungsstadien (28,9 % vs. 8,3 %) und weniger Meiose-Stadien (18,4 % vs.
33,3 %), was jedoch nicht signifikant war. Die Spindelexistenz schien bei Eizellen ohne Polkörper für die Aktivierung keinen entscheidenden Einfluss zu besitzen, jedoch waren die Fallzahlen zu gering, um dies statistisch abzusichern.
Abbildung 11: DNA-Konfiguration 20 h nach Aktivierung boviner Oocyten. Meiose-Stadium (A), Vorkernstadium (B), 2-Zellstadium (C)
A B C
Tabelle 6: Ergebnisse der DNA-Färbung 20 h nach parthenogenetischer Aktivierung Vorkernstadium 48,4 %
(15/31) 56,5 %
(39/69) 54,0 % (54/100) Metaphase II 75,8 %
(100/132)
2-Zell-Stadium 12,9 %
(4/31) 29,0 %
(20/69) 24,0 % (54/100) Meiose-Stadium 0,0 %
(0/5)
25,9 % (7/27)
21,9 % (7/32) Vorkernstadium 80,0 %
(4/5) 48,2 %
(13/27) 53,1 % (17/32) Metaphase I 24,2 %
(32/132)
2-Zell-Stadium 20,0 % (1/5)
25,9 % (7/27)
25,0 % (8/32) Meiose-Stadium 33,3 %
(12/36)
17,7 % (17/96)
22,0 % (29/132) Vorkernstadium 52,8 %
(19/36) 54,2 %
4.2.1.4 Messung der initialen Ca2+-Freisetzung in bovinen Oocyten
Exemplarisch wurden an bovinen in vitro maturierten Eizellen im Metaphase I- und Metaphase II-Stadium [Ca2+]i-Messungen nach Zugabe von Ionomycin vorgenommen (Abb.
12). Unabhängig vom Meiosestadium reagierten die Eizellen mit einem sofortigen Anstieg der intrazellulären Konzentration freier Ca2+-Ionen. Wie bereits in der Literatur beschrieben (NAKADA u. MIZUMO 1998), produzierten die Oocyten nach Ionomycin-Zugabe einen einzelnen Peak und fielen dann auf ihr basales Niveau der [Ca2+]i zurück. Eizellen mit einem Polkörper hatten dabei initial eine höhere Amplitude der relativen Fluoreszenz-Intensität und damit eine stärkere Freisetzung von Ca2+-Ionen.
Tabelle 7: Ergebnisse der DNA-Färbung 20 h nach parthenogenetischer Aktivierung boviner Oocyten unter Einbeziehung der Spindelkonfiguration
Maturationsstadium Anzahl Oocyten 20 h nach Aktivierung
Meiose-Stadium 18,4 % (14/76) Vorkernstadium 52,6 % (40/76) Metaphase II
Spindel darstellbar
76,0 % (76/100)
2-Zell-Stadium 29,0 % (22/76)a Meiose-Stadium 33,3 % (8/24) Vorkernstadium 58,4 % (14,24) Metaphase II
Spindel nicht darstellbar
24,0 % (24/100)
2-Zell-Stadium 8,3 % (2/24)b Meiose-Stadium 26,3 % (5/19) Vorkernstadium 52,6 % (10/19) Metaphase I
Spindel darstellbar
59,4 % (19/32)
2-Zell-Stadium 21,1 % (4/19) Meiose-Stadium 15,4 % (2/13) Vorkernstadium 53,8 % (7/13) Metaphase I
Spindel nicht darstellbar
40,6 % (13/32)
2-Zell-Stadium 30,8 % (4/13)
a:b p < 0,05
Abbildung 12: Messung der Ca2+-Freisetzung nach Aktivierung mit Ionomycin (Pfeil) in 3 bovinen Oocyten im Metaphase I-Stadium. Die kleineren Schwankungen sind durch äußere Lichteinflüsse bedingt.
Metaphase I
4.2.2 Zona pellucida-Imaging boviner Oocyten
2142 polarisationsmikroskopische Zona pellucida-Messungen wurden im bovinen Modell mit dem objektiven Messmodul vorgenommen. Bereits bei den ersten Untersuchungen wurde zum einen deutlich, dass die innere Schicht der bovinen Zona sehr viel höhere doppelbrechende Eigenschaften besitzt als jene humaner Eizellen (Abb. 13). So liegt der Zona-Score deutlich im positiven Bereich. Zum anderen waren jedoch auch individuelle Unterschiede zu erkennen.
Abbildung 13: Bovine Oocyte nach in vitro Maturation. Hoffmann-Kontrast-Aufnahme (A), Polarisationsmikroskopisches Bild (B).
4.2.2.1 Zona pellucida-Imaging immaturer boviner Oocyten nach BCB-Färbung
Als qualitatives Unterscheidungsmerkmal für die Entwicklungskompetenz von Oocyten wurde zunächst eine BCB-Vitalfärbung in vorselektierten immaturen COCs vorgenommen und damit die G6PDH-Aktivität festgestellt. Auf diese Weise wurden 772 Oocyten (47,3 %) als BCB+ klassifiziert und mit guter Qualität bewertet; das Ooplasma von 859 Eizellen (52,7
%) war nicht oder nur schwach gefärbt. Diese wurden mit BCB- bezeichnet.
Bei 836 Oocyten wurde ein Zona-Imaging durchgeführt. Die zuvor als qualitativ gut bewerteten Eizellen unterschieden sich hochsignifikant in allen erhobenen Parametern von den schlechter klassifizierten. Die Mittelwerte der BCB-positiven Eizellen lagen unter denen der anderen Gruppe (Tab. 8).
A B
Tabelle 8: Zona-Imaging in immaturen bovinen Oocyten nach BCB-Färbung
Immature Oocyten Anzahl CV-Wert PV-Wert Score BCB + 406 21,67 ± 4,62a 41,59 ± 9,12c 33,09 ± 14,51e
BCB - 430 24,92 ± 4,94b 46,16 ± 9,30d 39,04 ± 14,70f
a:b p < 0,001; c:d p < 0,001; e:f p < 0,001
4.2.2.2 Zona pellucida-Imaging maturer boviner Oocyten
In Tabelle 9 sind die Zonaparameter von 446 bovinen Eizellen nach in vitro Maturation aufgeführt. Auffällig ist, dass die Durchschnittswerte der nicht bis zum Metaphase II-Arrest maturierten Eizellen höher sind als die, bei denen ein Polkörper nachgewiesen werden konnte.
Die Unterschiede erwiesen sich als statistisch hoch signifikant.
Tabelle 9: Zona-Imaging in maturen bovinen Oocyten
Mature Oocyten Anzahl CV-Wert PV-Wert Score
Metaphase II 75,6 % (337/446) 24,63 ± 6,73a 48,13 ± 13,44c 39,67 ± 18,04e Metaphase I 24,4 % (109/446) 28,99 ± 7,33b 56,52 ± 14,77d 51,80 ± 20,57f
a:b p < 0,001; c:d p < 0,001; e:f p < 0,001
4.2.2.3 Vergleich der parthenogenetischen Entwicklung nach Zona pellucida-Imaging 365 maturierte Eizellen wurden in 3 Versuchen artifiziell aktiviert und vor der in vitro Kultivierung einem Zona-Imaging unterzogen. Die Teilungsrate betrug 78,6 % (287/365); am Tag 7 waren 31,5 % (115/365) zu Blastozysten entwickelt. Diese Rate steigerte sich bis zum Tag 9 der Kultivierung auf 36,7 % (134/365). Ein Schlüpfen konnte bei 50 Eizellen beobachtet werden (13,7 % der aktivierten Eizellen bzw. 37,3 % der Blastozysten). Die parallel durchgeführte Kontrollen (n = 196), die ohne polarisationsmikroskopische Untersuchung und nicht im MiniWell-System kultiviert wurden, waren von diesen Ergebnissen nicht signifikant unterschiedlich. Nach künstlicher Aktivierung teilten sich 140 Eizellen der Kontrollgruppe (71,4 %). Am Tag 9 wurden 83 Blastozysten gezählt (42,3 %).
(x ± SD)
(x ± SD)
Davon waren 31 aus der Zona pellucida geschlüpft (15,8 % der aktivierten Kontrolleizellen bzw. 37,3 % der Kontroll-Blastozysten).
Der Vergleich des Zona-Imagings zwischen den Oocyten mit positiver parthenogenetischer Entwicklung und denen mit weniger großem Potential ist in Tabelle 10 wiedergegeben. Die oben beschriebenen Ergebnisse, dass die Zonaparameter bei den qualitativ überlegenen Oocyten niedriger angesiedelt sind, spiegeln sich tendenziell auch in diesem Versuch wider.
Tabelle 10: Vergleich der PV-, CV- und Scorewerte nach parthenogenetischer Aktivierung
Anzahl CV-Wert PV-Wert Score
geteilt 287 22,07 ± 4,16 42,33 ± 7,69 31,25 ± 9,91 Teilungsrate
d3 nicht geteilt 78 23,06 ± 5,05 43,87 ± 8,76 33,24 ± 11,86 Blastozyste 115 21,39 ± 3,94a 41,50 ± 7,42 30,51 ± 9,39 Blastozystenrate
d7 keine Blastozyste 172 22,53 ± 4,23b 42,88 ± 7,82 31,74 ± 10,21 geschlüpft 50 21,19 ± 4,08 41,04 ± 7,41 29,41 ± 8,75 Schlupfrate
d9 nicht geschlüpft 84 21,98 ± 4,09 42,51 ± 7,67 31,70 ± 9,69
a:b p < 0,025
4.2.2.4 Zona pellucida-Imaging 21 h p.ins. – Vergleich der frühembryonalen Entwicklung
Für den Vergleich der Zona pellucida-Eigenschaften in polarisiertem Licht im Hinblick auf die weitere embryonale Entwicklungsfähigkeit der Eizellen wurde das Imaging 21 h nach Zugabe der paternalen Gameten vorgenommen, da Eizellen ohne umgebenden Cumuluskomplex nicht physiologisch befruchtet werden können, eine Denudierung für die polarisationsmikroskopische Zona-Analyse aber unverzichtbar ist. Die Cumuluszellen bilden während der Fertilisation ein spermienselektierendes Mikromilieu für die Eizell-Spermien-Interaktion (ZHANG et al. 1995, TANGHE et al. 2002).
Die Teilungs- sowie Blastozystenraten von Versuch und Kontrollen sind in Tabelle 11 aufgeführt. Der Transport nach der in vitro Fertilisation vom kooperierenden Labor ins Hauptlabor bedingte eine niedrigere Teilungsrate sowie d9-Blastozystenrate. Mit einer
(x ± SD)
Teilungsrate von über 80 % und über 30 % entwickelten Blastozysten waren die IVF-Ergebnisse der Versuche vergleichbar mit denen der mittransportierten Kontrolloocyten.
Tabelle 11: Übersicht über Teilungs- und Blastozystenraten im Vergleich mit Kontrollen
Versuch Kontrolle
mit Transport
Der Vergleich der embryonalen Entwicklung am Tag 3 zeigte signifikante Unterschiede zwischen Eizellen, die sich zu Embryonen mit mindestens 2 Blastomeren entwickelten, und solchen, die ungeteilt arretierten. Dabei wiesen die später geteilten Eizellen die niedrigeren Durchschnittswerte aller Zonaparameter auf. Die Oocyten, die sich am Tag 7 der Kultivierung bis zum Blastozystenstadium gefurcht hatten, besaßen ebenso die hochsignifikant niedrigeren Zona-Mittelwerte verglichen mit den Eizellen, deren Entwicklung nicht so fortgeschritten war. Innerhalb dieser Gruppe hatte die Zona der Eizellen, die bereits am Tag 7 expandierte Blastozysten waren, signifikant niedrigere doppelbrechenden Eigenschaften als die Zona jener Eizellen, die noch nicht so weit entwickelt waren. Auch bis zum Tag 9 geschlüpfte Blastozysten gingen im Vergleich mit den nicht gehatchten aus Eizellen mit niedrigeren Zona-Mittelwerten hervor (Tab.12).
Insgesamt war die durchschnittliche Doppelbrechung der Zonae von Oocyten mit dem größeren embryonalen Entwicklungspotential signifikant niedriger.
(x ± SD)
Tabelle 12: Vergleich von PV-, CV- und Scorewerten und des embryonalen Entwicklungs-potentials
Anzahl CV-Wert PV-Wert Score
geteilt 334 25,28 ± 6,00 48,25 ± 12,11 38,71 ± 15,08 nicht geteilt 81 27,38 ± 6,89 51,79 ± 13,37 43,73 ± 16,87 Teilungsrate
d3
p p < 0,02 p < 0,05 p < 0,02
Blastozyste 108 23,72 ± 5,72 44,93 ± 11,09 34,38 ± 13,18 keine Blastozyste 226 26,03 ± 5,98 49,83 ± 12,26 40,77 ± 15,49 Blastozysten
rate d7
p p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001
expandiert 32 21,39 ± 3,80 40,75 ± 8,02 30,02 ± 10,16 nicht expaniert 76 24,69 ± 6,10 46,69 ± 11,72 36,21 ± 13,85 Expansion d7
p p < 0,002 p < 0,005 p < 0,02
geschlüpft 102 23,66 ± 5,67 44,28 ± 10,98 32,83 ± 13,45 nicht geschlüpft 94 25,79 ± 6,15 48,01 ± 11,81 37,51 ± 14,75 Schlupfrate
d9
p p < 0,02 p < 0,025 p 0,025
(x ± SD)
5 Diskussion
Die Beurteilung der Eizell-Qualität gewinnt sowohl in der humanen wie auch in der bovinen assistierten Reproduktionsmedizin als Beitrag zum besseren Verständnis der physiologischen Abläufe und zur weiteren Optimierung der Erfolgsraten immer mehr an Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob die polarisationsmikroskopische Darstellung des meiotischen Spindelapparats sowie der Zona pellucida ein geeignetes Verfahren zur Charakterisierung des Entwicklungspotentials von Eizellen ist.
5.1. Meiotische Spindel in humanen Oocyten
Aufgrund ihres Aufbaus aus Mikrotubuli ist die Spindel eine dynamische Struktur, die sich polarisationsmikroskopisch visualisieren lässt. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Untersuchungen keine spezielle Färbetechnik erfordern und daher nicht-invasiv und zellerhaltend erfolgen. Darüber hinaus ermöglichen Zeitrafferaufnahmen ein direktes Verfolgen dieser Dynamik. So zeigte sich in initialen zeitabhängigen Studien bei der Metaphase I-Spindel während der weiteren Maturation eine Intensitätszunahme der Anisotropie, wobei die Spindel zur Abschnürung des ersten Polkörpers eine Brücke zwischen Polkörper und Cytoplasma bildete. Vor der Entstehung der Metaphase II-Spindel war eine zwischenzeitliche Dissoziation zu beobachten.
Eine Verstärkung der Doppelbrechung konnte nach artifizieller Aktivierung bereits in murinen Metaphase II-Spindeln nachgewiesen werden (LIU et al. 2000b, NAVARRO et al.
2005). Vermutlich wird sie durch eine höhere Konzentration an Mikrotubuli, einhergehend mit einer noch geordneteren Ausrichtung, verursacht.
Die beobachtete Spindelbrücke zeigt eine noch nicht abgeschlossene Meiose I an, obwohl der erste Polkörper schon sichtbar ist. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist somit, dass nicht jede Eizelle, die lichtmikroskopisch aufgrund ihres abgeschnürten ersten Polkörpers als Metaphase II klassifiziert wird, sich auch tatsächlich in diesem Stadium befindet. In polarisiertem Licht lässt sich vielmehr nachweisen, dass sie noch die späte Telophase I durchlaufen kann und die Aktivierung durch ICSI zu einem unphysiologischen Zeitpunkt
erfolgen würde. Dieses Phänomen bestätigt Berichte von EICHENLAUB-RITTER (2002) und DE SANTIS et al. (2005).
Der weitere Verlauf der Langzeitbeobachtung zeigte, dass eine dissoziierte Spindel nicht unbedingt eine Dysfunktion impliziert, sondern während des Übergangs in die Meiose II auch physiologisch sein kann. Dies wird durch eine zweimalige Spindel-Untersuchung vor der ICSI mit einer größeren Fallzahl belegt. Mehr als die Hälfte der Eizellen, die bei der ersten Untersuchung spindel-negativ waren, wies bei der Wiederholung nach 2 h einen visualisierbaren Spindelapparat auf. Das bedeutet, dass eine einmalige polarisationsmikroskopische Analyse nicht ausreicht, um eine Eizelle als eindeutig spindel-negativ zu klassifizieren.
Im Einklang mit anderen Autoren (WANG et al. 2001b, COHEN et al. 2004, SHEN et al.
2006) korrelierte eine Spindelpräsenz mit einer signifikant höheren Fertilisationsrate im Vergleich zur Befruchtungsrate spindel-negativer Eizellen. Dabei spielte der Zeitpunkt der Darstellbarkeit (1. oder 2. Imaging) keine Rolle. Schon beim ersten Imaging konnte bei 80,7% der Oocyten eine Spindel dargestellt werden, beim zweiten Imaging betrug die Quote 91,4 %. Diese Zahlen stimmen mit anderen veröffentlichten Studien überein (DE SANTIS et al. 2005, SHEN et al. 2006, RAMA RAJU et al. 2007). Außerdem sind sie ein Zeichen dafür, dass die Rahmenbedingungen im Labor, die die Polymerisation von Mikrotubuli beispielsweise durch suboptimale Temperaturbedingungen negativ beeinflussen können, akzeptabel sind. Ebenso ist die durchschnittliche Fertilisationrate von 76,7 % nach ICSI vergleichbar mit den Daten aus dem deutschen IVF-Register (FELBERBAUM et al. 2007).
Da die Spindelbrücke zwischen Polkörper und Ooplasma nur in polarisiertem Licht erkennbar ist, jene Eizellen aber mit herkömmlichen lichtmikroskopischen Verfahren als matur diagnostiziert werden, ist dieses Meiose-Stadium kritisch zu betrachten.
Eine zu diesem unphysiologischen Zeitpunkt durchgeführte ICSI führte größtenteils zu einer anomalen Fertilisation mit fehlendem 2. Polkörper und Ausbildung von 3 Vorkernen. Analog zeigte die Mehrzahl der Eizellen nach artifizieller Aktivierung durch Ca2+-Ionophor ebenfalls
Eine zu diesem unphysiologischen Zeitpunkt durchgeführte ICSI führte größtenteils zu einer anomalen Fertilisation mit fehlendem 2. Polkörper und Ausbildung von 3 Vorkernen. Analog zeigte die Mehrzahl der Eizellen nach artifizieller Aktivierung durch Ca2+-Ionophor ebenfalls