und dem
Forschungsbereich Fortpflanzungsbiologie des Forschungsinstituts für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere, Dummerstorf
Untersuchungen zur zytoplasmatischen Reifung von Eizellen des Rindes:
Analyse der Regulation der Translation während der meiotischen Endreifung
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Fabiana de Andrade Melo Sterza aus Maringá, Brasilien
Hannover 2003
1.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. B. Meinecke 2.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. T. Leeb
Tag der mündlichen Prüfung: 03. Juni 2003
breve, comerás os seus frutos...
(Eclo 6, 19-20)
Wie ein Pflüger und Schnitter gehe auf die Weisheit zu, und warte auf ihren reichen Ertrag. „Du wirst in ihren Dienst Mühe brauchen, aber bald kannst du ihre Früchte genießen...“
(Jesus Sirach 6, 19-20)
Abkürzungsverzeichnis:
4E-BP1 eIF4E-Bindungsprotein 1 A I Anaphase I
aa Aminosäure
APC Anaphase-Promoting Complex/Cyclosom APS Ammoniumperoxodisulfat
ATP Adenosintriphosphat BLI Butyrolactone I BSA Bovine Serum Albumin
BVN Besamungsverein Neustadt a. d . Aisch CAK Cdk-activating Kinase
cAMP Zyklisches Adenosinmonophosphat Cdc2K Cell Division Cycle Kinase 2
Cdk1 Cyclin Dependent Kinase
CHAPS [(Cholamidopropyl)-dimethyllammonio]- propansulfonat
COK Cumulus-Oozyten-Komplex CPE Cytoplasmic Polyadenylation Element CPEB CPE-Bindungsprotein CSF Cytostatic Factor DMSO Dimethylsulfoxyd DTT DL-Dithiothreitol
ECL Enhanced Chemiluminescence ECS Estrus Cow Serum
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid eEF Eukaryotic Elongation Factor
eIF Eukaryotic Initiation Factor eRF Eukaryotic Releasing Factor ERK Extracellular Regulated Kinase
FSH Follikelstimulierendes Hormon GTP/GDP Guanosintriphosphat / Guanosindiphosphat GV Germinalvesikel
GVBD Germinal Vesicle Breakdown
hCG Human Chorionic Gonadotropin HRP Horseradish Peroxidase
I.E. Internationale Einheiten ICM Inner Cell Mass
IRES Internal Ribosome Entry Sites
IVF In-vitro-Fertilisation
IVM In-vitro-Maturation
IVP In-vitro-Produktion
kDA Kilodalton
LH Luteinisierendes Hormon LPS bacterial lipopolysaccharide MAP-Kinase;
MAPK
Mitogen Aktivated Protein Kinase MBP Myelin Basic Protein
MEK Mitogen Activated, ERK Activating Kinase M I Metaphase I
M II Metaphase II
miRNA micro RNAs
MISS MAPK-Interacting, Spindle Stabilizing Protein MOPS (3[N-Morpholino]propanesulfonic acid)
MPF Maturation Promoting Factor OA Okadinsäure p90rsk Ribosomal Protein S6 Kinase
PABP Poly(A)-Bindungsprotein
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAIP Poly(A)- Interacting Protein
PK Polkörper Poly-(A) Poly-Adenosine
PVDF Polyvinylidene Difluoride RNAi RNA interference
S Svedberg-Einheit SDS Sodium Dodecyl Sulfat Ser Serin siRNA Small interfering RNA
A-SH 2-Mercaptoethanol T I Telophase I
TBS Tris Buffered Saline TCM Tissue Culture Medium
TEMED NNN'N'-Tetramethylethylenediamine Thr Threonin
TNF Tumor Necrosis Factor TTBS Tween Tris Buffered Saline
Tween 20 Polyoxyethylenesorbitanmonolaurate UTR Untranslated Region
VSIEF Vertical Slab Gel Isoeletric Focusing
1- EINLEITUNG... 9
2- LITERATUR ... 11
2.1-ALLGEMEINE ÜBERSICHT ÜBER DIE ENTWICKLUNG VON EIZELLEN... 11
2.1.1- Wachstumsphase ... 11
- 2.1.1.1- Oogenese ... 11
- 2.1.1.2- Follikelentwicklung ... 11
- 2.1.1.3- Eizellentwicklung... 12
2.1.2-ENDREIFUNG... 13
- 2.1.2.1- Morphologische Änderungen ... 13
- 2.1.2.2- Biochemische Faktoren: die Proteinkinasen... 15
2.2- Regulation der Translation ... 20
2.2.1- Initiation, Elongation und Terminationsphase... 20
2.2.2- Zytoplasmatische Polyadenylierung und cap-Struktur... 23
3- MATERIAL UND METHODEN ... 26
3.1-GEWINNUNG DER EIERSTÖCKE... 26
3.2-ENTNAHME DER CUMULUS-OOZYTEN-KOMPLEXE (COK)... 26
3.2.1- Oozytenklassifizierung ... 26
3.3-IN-VITRO-REIFUNG... 27
3.3.1- Behandlungen... 29
3.4-IN-VITRO-FERTILISATION... 31
3.4.1- Aufbereitung der Spermien ... 31
3.4.2- In-vitro-Befruchtung ... 31
3.5-IN-VITRO-KULTIVIERUNG... 32
3.6- Beurteilung der Teilungs- und Entwicklungsstadien...32
3.7-ENTFERNUNG DES CUMULUS OOPHORUS UND PROBENVORBEREITUNG FÜR MORPHOLOGISCHE UND BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN... 34
3.7.1- Fixierung und Aceto-Orcein-Färbung der Eizellen... 34
3.8-BIOCHEMISCHE VERFAHREN... 35
3.8.1- Elektrophoresen... 35
3.8.2- Western-Blotting ... 36
3.8.3- Detektion der Proteine... .37
3.8.4- Färbungen der Membranen bzw. der Gele... 37
INHALTSVERZEICHNIS
3.8.5- Kinase-Assay... 37
3.8.6- Messung der Gesamtproteinsynthese... 38
3.8.7- Real Time-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)... 38
4- ERGEBNISSE... 39
4.1-CHARAKTERISIERUNG DES AUSGANGSMATERIALS... 39
4.1.1- Charakterisierung der In-vitro-Reifung ... 39
4.1.2- Charakterisierung des Ausgangsmaterials nach IVP... 41
4.2-CHARAKTERISIERUNG GRUNDLEGENDER BIOCHEMISCHER PROZESSE WÄHREND DER IVM ... 43
4.2.1- Kinaseaktivitäten während der IVM... 43
4.2.2- Translationsraten während der IVM ... 45
4.2.3- eIF4E-Phosphorylierung während der IVM... 48
4.3-ANALYSE DER AUSWIRKUNG DER CDC2- UND MAP-KINASE-INHIBITION AUF DIE EIF4E-PHOSPHORYLIERUNG ... 50
4.3.1- MAPK- und eIF4E-Phosphorylierung nach Behandlung mit Butyrolactone I... 50
4.3.2- MAPK- und eIF4E-Phosphorylierung nach Behandlung mit PD 098059... 52
4.4-NACHWEIS EINES SPEZIFISCHES REPRESSORS DER EIF4EWIRKUNG IN EIZELLEN... 57
4.5-NACHWEIS DER KOMPLEXBILDUNG VON EIF4E UND 4E-BP1 WÄHREND DER IN-VITRO- REIFUNG... 57
4.6-NACHWEIS DES PHOSPHORYLIERUNGSSTATUS VON 4E-BP1 WÄHREND DER IVM ... 59
4.7-UNTERSUCHUNGEN ZUR 4E-BP1-PHOSPHORYLIERUNG WÄHREND DER IVM... 61
5- DISKUSSION ... 64
5.1-DIE REGULATION DER TRANSLATION DURCH WIRKUNG VON EIF4E UND SEINES BINDUNGSPROTEINS 4E-BP1. ... 65
5.2-UNTERSUCHUNGEN ZU PHOSPHORYLIERUNGSWEGEN VON EIF4E UND 4E-BP1 ... 69
6- ZUSAMMENFASSUNG ... 76
7- SUMMARY... 78
8- RESUMO... 80
9- ANHANG... 82
10- LITERATURVERZEICHNIS ... 93
11- DANKSAGUNG ... 112
1- EINLEITUNG
In den zurückliegenden zwei Dekaden ist national und international das Verfahren der In-vitro-Produktion (IVP) zur Erzeugung von Rinderembryonen erarbeitet worden.
Heute werden diese In-vitro-Techniken zur Realisierung von Zuchtprogrammen eingesetzt, aber trotz aller Fortschritte ist die Methode auch noch Forschungsgegenstand. Der Grund dafür besteht vor allem darin, dass weltweit durch IVP einen Ausbeute an transfertauglichen Blastozysten von 30 – 40 % nicht übertroffen wird. Es wird vermutet, dass suboptimale Kultivierungsbedingungen maßgeblich für die begrenzten Erfolgsraten verantwortlich sind.
Darüber hinaus ist festzustellen, dass biologische Parameter, welche Entwicklungsvorgänge von Eizellen und Embryonen steuern, nur bruchstückhaft bekannt sind. Dies gilt vor allem für Prozesse der zytoplasmatischen Reifung.
Das Fortschreiten der Kernreifung kann mikroskopisch gut beurteilt werden.
Obwohl im Durchschnitt 90 % aller in vitro gereiften Eizellen die Metaphase II erreichen, ist die Ausbeute an transfertauglichen Blastozysten wesentlich geringer.
Dieser Sachverhalt führte zur Formulierung der Hypothese, dass eine asynchron verlaufende Kern- und Zytoplasmareifung während der In-vitro-Reifung (IVM), dafür verantwortlich ist. Daraus wurde die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit abgeleitet.
Diese besteht in der Untersuchung zytoplasmatischer Faktoren, die an der Regulation der Translation während der meiotischen Endreifung beteiligt sind.
Der biologische Hintergrund für derartige Untersuchungen sind Erkenntnisse, die belegen, dass die Genexpression während der Meiose, beim Übergang von der Prophase I zur Metaphase II, hauptsächlich auf dieser Ebene reguliert wird. Obwohl die Synthese neuer Proteine als eine grundlegende Voraussetzung für Reifungs- und Differenzierungsprozesse betrachtet wird, liegen bei Eizellen über die beteiligten Regulationsprozesse nur sehr geringe Erkenntnisse vor. Diese wurden hauptsächlich an Modellorganismen (Maus, Xenopus) erarbeitet und fehlen beim landwirt- schaftlichen Nutztier praktisch weitestgehend.
Es ist davon auszugehen, dass Erkenntnisse, welche detailliert molekulare Mechanismen der Regulation der Genexpression beschreiben, mittel- bis langfristig einen Beitrag zur Optimierung der IVP leisten können. Zu nennen ist hier die Etablierung mehrstufiger Reifungssysteme, durch deren Anwendung die Ausbeute an transfertauglichen Blastozysten erhöht werden könnte.
Konkret wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zum Auftreten, zur Wirkung und zur Funktion eines spezifischen Initiationsfaktors der Translation (eIF4E) und eines potentiellen Repressors (4E-BP1) durchgeführt. Da es sich bei beiden Faktoren um Phosphoproteine handelt, wurden weitergehende Analysen von Signalkaskaden durchgeführt, um beteiligte Phosphorylierungswege zu charakterisieren. Damit sollten Regulationsmechanismen der Genexpression untersucht werden, welche an der früher beschriebenen Stimulation der Proteinsynthese im Zeitraum des Germinal Vesicle Breakdown (GVBD), also in Abwesenheit von Transkriptionsprozessen, beteiligt sind.
2- LITERATUR
2.1- Allgemeine Übersicht über die Entwicklung von Eizellen 2.1.1- Wachstumsphase
2.1.1.1- Oogenese
Die Bildung von primordialen Keimzellen stellt den Beginn der Oogenese dar. In Rinderembryonen wurden primordiale Keimzellen erstmals am Tag 18 der Entwicklung festgestellt. Am Tag 110 befinden sich ca. 2,7 Mio. ursprüngliche Keimzellen in beiden Gonadenanlagen. Durch Apoptose nimmt die Keimzellmenge bis zur Geburt um mehr als 50 % und bis zur Pubertät um mehr als 90 % ab. Zu diesem Zeitpunkt sind in den Rinderovarien ca. 210.000 Eizellen vorhanden. Von diesen erreichen nicht mehr als 300 das ovulatorische Stadium (KANITZ et al., 2001).
2.1.1.2- Follikelentwicklung
In den Eierstöcken von Säugetieren reifen die Eizellen in Follikeln heran. Je nach Entwicklungsstufe unterscheidet man folgende Follikelklassen: Primordiale, primäre, sekundäre und tertiäre Follikel. HYTTEL et al. (1997, 1999) geben nachfolgende Maße für die Follikel und die in ihnen enthaltenen Oozyten an.
Primordiale Follikel: Die Follikelgröße beträgt 34,6 ± 3,7 m und die Eizellgröße 27,9 ± 3,3 m. Diese Oozyten werden von einem flachen, einschichtigen Follikelwandepithel umgeben.
Primäre Follikel: Die Größe dieser Follikel beträgt 46,1 ± 6,1 m und die Eizellgröße 31,6 ± 4,3 m. Die einlagige Granulosazellschicht, welche die Eizelle umgibt, bekommt eine kubische Form. Diese Zellen sind Nähr- und Stützzellen.
Sie versorgen die Oozyte mit kleinmolekularen Stoffen, die für ihre Syntheseleistungen benötigt werden. Zwischen Oozyte und Granulosazellen sind gap junctions nachweisbar.
Sekundäre Follikel: Die Follikelgröße beträgt 101,7 ± 41,8 m und die Eizellgröße 45,6 ± 14,0 m. Die Eizellen sind von zwei oder mehr Granulosazellschichten umgeben, welche sich im Laufe der Zeit vermehren und mehrlagige Zellschichten bilden. Die Verbindung zwischen Ei- und Granulosazellen erfolgt durch die gap junctions, wodurch ein Stoffaustausch bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 1,5 kDa ermöglicht wird.
Tertiäre Follikel: Die Follikelgröße ist 1 mm und die Eizellgröße 80 - 120 m.
Diese Follikeln besitzen ein Antrum. Die Eizelle wird von einer vollständigen Zona Pellucida umgeben und befindet sich jetzt im Cumulus oophorus.
Es wurde gezeigt, dass in vitro die Entwicklungskompetenz von Eizellen von der Größe der Follikel, aus denen diese gewonnen wurden abhängig, ist (CROZET, 1989; HELEIL et al., 2001). Eizellen aus Follikeln < als 2 mm sind nur eingeschränkt kompetent, in vitro die Meiose zu vollenden.
2.1.1.3- Eizellentwicklung
- Morphologische Veränderungen
Die Entwicklung von Eizellen kann in zwei Phasen unterteilt werden, die Wachstumsphase und die meiotische Endreifung. Die lange Phase des Eizellwachs- tums ist gekennzeichnet durch eine Größenzunahme der Oozyten von 20 - 30 Hm bis ca. 120 Hm bei voll ausgewachsenen Rindereizellen (HYTTEL et al., 1997;
KANITZ et al., 2001). Während dieser Phase nehmen Organellen, wie Mitochondrien, kortikale Granula und Golgi-Komplexe zu. Eine deutlich erkennbare Nukleolusstruktur ist ausgeprägt. HYTTEL et al. (1997) zeigten, dass Eizellen zwischen 100 und 120 Hm graduell die Fähigkeit erlangen, während der Reifung in vitro, die Metaphase II zu erreichen.
Oozyten, die ihre volle meiotische Kompetenz noch nicht erreicht haben, sind fähig, in vitro die Metaphase I zu erreichen. Nach erfolgter In-vitro-Fertilisation ist aber keine weitere Embryonalentwicklung möglich (PAVLOK et al., 1992, 1997).
Die voll ausgewachsenen Eizellen sind in der Prophase der ersten meiotischen Teilung im Diplotän-Stadium arretiert. Dieses Stadium wird auch als Germinal-
vesikel-Stadium (GV) bezeichnet. Diese Phase ist morphologisch durch einen prominenten Zellkern, einen deutlichen Nukleolus und das weitgehend diffus verteilte Chromatin gekennzeichnet.
- Biochemische Prozesse
Über biochemische Prozesse, die dieses Wachstum der Eizellen begleiten, ist bei Nutztieren relativ wenig bekannt.
Untersuchungen an wachsenden Eizellen der Maus zeigten hohe Trans- kriptionsraten und eine Akkumulation von Makromolekülen (RNAs und Proteine).
Dabei ist die Genexpression im Verlauf des Wachstums relativ konstant, d.h. es treten weder quantitativ noch qualitativ signifikante Unterschiede in der Proteinsyntheserate auf (PAYNTON und BACHVAROVA, 1994; MARELLO et al., 1992). Bei Oozyten der Maus wurde gefunden, dass nur ein Bruchteil der akkumulierten Ribosomen (ca. 15 %) und mRNAs an der Proteinsynthese beteiligt sind. Es ist also davon auszugehen, dass ein Großteil der Ribosomen, wie auch spezifische mRNAs und Proteine während dieser Entwicklungsphase in einer inaktiven Speicherform vorliegen (PAYNTON und BACHVAROVA, 1994) und erst in einer späteren Entwicklungsphase oder nach erfolgter Befruchtung aktiviert werden.
2.1.2- Endreifung
2.1.2.1 - Morphologische Änderungen
Der Übergang von der Prophase I zur Metaphase II wird als meiotische Endreifung bezeichnet. In vivo vollzieht sich der Übergang nach dem präovulatorischen LH- Peak. Wird die Eizelle aus dem Follikel entfernt, so beginnt dieser Prozess spontan (SIRARD und BLONDIN, 1996).
Die kurze Phase des Übergangs von der Prophase I zur Metaphase II ist durch eine dramatische Änderung der Genexpression gekennzeichnet.
Das zytologische Kennzeichen des Beginns der meiotischen Endreifung ist die Kondensation des Chromatins und die Auflösung der Kernhülle, der sogenannte
„Germinal Vesicle Breakdown“ (GVBD). Nach dem GVBD organisieren sich die Chromosomen weiter so, dass durch ihre Verlagerung in die Äquatorialplatte die Metaphase I erreicht wird. Anschließend, in der Anaphase I, trennen sich die
homologen Chromosomen voneinander, so dass in der Telophase I zwei Zellen mit einem haploiden Chromosomensatz entstehen. Schließlich wird die Metaphase II erreicht, in welcher das Zytoplasma asymmetrisch auf zwei Zellen verteilt ist. Eine Zelle ist der erste Polkörper (PK), eine rudimentäre Zelle, die im wesentlichen nur den zweiten Chromosomensatz enthält und bald zugrunde geht. Die andere Zelle ist eine sekundäre Oozyte, die nahezu das gesamte angehäufte Material (Ribosomen, mRNAs, Nährstoffe) in einem grossen Zytoplasmaraum enthält (NIEMANN und MEINECKE, 1993). In diesem Stadium wird die Meiose, bedingt durch die Aktivität eines cytostatischen Faktors (CSF), noch einmal arretiert (PAGE und ORR- WEAVER; 1997; SAGATA et al., 1989).
Die Dauer der meiotische Endreifung variiert bei den verschiedenen Tierarten.
Sie benötigt durchschnittlich 24 Stunden bei Rinder- und 32 - 34 Stunden bei Schweineizellen. Daten von Rindereizellen sind in der Tabelle 1 dargestellt (WEHREND und MEINECKE, 2001).
Die weitere Entwicklung der Eizellen erfolgt erst nach Befruchtung oder parthenogenetischer Aktivierung.
Cumuluszellen scheinen Einflüsse auf die Kinetik der Reifung zu haben.
Cumulusfreie Ratten- und Rindereizellen zeigten eine Beschleunigung des GVBDs (LINDNER et al.,1980; FISSORE et al., 1996). Andererseits wurde bei Mauseizellen kein oder nur ein geringer Effekt der Cumulus-Zellen auf die Reifung beobachtet (POLANSKI, 1997).
Tabelle 1 - Reifungszeit und durchschnittliche Dauer der Meiosestadien bei Rindereizellen (WEHREND und MEINECKE, 2001).
Meiosestadium Dauer
GV 8,5 Std.
Diakinese 1,2 Std.
M I 8,3 Std.
A I 1,6 Std.
T I 1,9 Std.
Meiosestadium Reifungszeit GV 0 – 4 Std.
Diakinese 6 – 14 Std.
M I 10 – 18 Std.
A I – T I 16 – 24 Std.
2.1.2.2- Biochemische Faktoren: Proteinkinasen
Die Wiederaufnahme der Meiose und damit der Beginn der meiotischen Endreifung wird durch umfangreichen Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsprozesse spezifischer Proteine gesteuert (RIME et al., 1989; MOOR und CROSBY, 1986;
ENDO et al., 1986; LOHKA et al., 1987; DOREE et al., 1983). Dabei kommt zwei Proteinkinasen oder Proteinkinasekaskaden eine besondere Bedeutung zu. Diese sind einerseits Kinasen aus der Familie der mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs oder ERKs, extrazellulär regulierte Kinasen) und andererseits der cyklinabhängigen Kinasen (cdks oder cdcs, cell division cycle). Die Bedeutung dieser Kinasen wird aus Versuchen, die zeigten, dass deren spezifische Inhibition, Eizellen während der IVM in Germinalvesikelstadium arretieren, deutlich (KUBELKA et al.
2000; TOMEK et al., 2002b).
Die beiden Formen von MAPK (eine Serin / Threoninkinase), ERK1 und ERK2 sind im GV-Stadium in nicht phosphorylierter Form nachweisbar. Die Phosphorylierung dieser Kinasen, welche mit deren Aktivierung korreliert, findet im Zeitraum des einsetzenden GVBD, beim Rind 6 - 10 Stunden nach Beginn der Reifung statt (KUBELKA et al., 2000; TOMEK et al., 2002b). Während des weiteren Reifungsverlaufs wurden stabile Aktivitäten der MAPK mit maximalen Werten in der Metaphase II gefunden (TOMEK et al., 2002b; TORNER et al., 2001). Die Aktivierung von ERK1 und ERK2 erfolgt über eine Proteinkinasekaskade welche extrazelluläre Signale auf Faktoren des Zellkerns und des Zytoplasmas überträgt und über Ras, Raf und MEK verläuft (KOSAKO et al., 1994). Bei Eizellen verschiedener Spezies (Xenopus – SAGATA et al., 1989; NEBREDA und HUNT, 1993; NEBREDA et al., 1993; CHAU und SHIBUYA., 1998; Maus –VERLHAC et al., 1996; 2000;
Seestern – TACHIBANA et al., 2000) wurde in diesem Zusammenhang eine weitere Kinase beschrieben, welche als c-Mos bezeichnet wird. c-Mos, eine 39 kDa Serin und Threonin Kinase, ist eine MAPKKK und ihre Aktivität wird über MEK auf MAPK übertragen. Die Substrate vom MAPK selbst sind vielfältig (SEGER und KREBS, 1995; CAMPBELL et al., 1995; MARAIS et al., 1993). Die am besten untersuchten Substrate sind in somatischen Zellen Transkriptionsfaktoren, wie z.B. Stat, c-Jun und TCF-Elk-1 (LI et al., 2002; SEGER und KREBS, 1995; MARAIS et al., 1993) und Kinasen ribosomaler Proteine (z.B. p90rsk – KALAB et al., 1996; GAVIN et al.,
1999). In Rindereizellen stehen detaillierte Untersuchungen in diesem Zusammen- hang noch aus.
In neuesten Untersuchungen an Eizellen der Maus wurde von LEFEBVRE et al.
(2002) ein weiteres MAPK-Substrat, genannt MISS (MAPK-interacting and spindle- stabilizing protein), identifiziert. Dieses Protein ist offensichtlich an der Stabilisierung des Spindelapparates in der Metaphase II beteiligt. Da MISS nur in der Metaphase II stabil ist, vermutet man, dass es auch eine wichtige Rolle bei der Arretierung der Eizellen in der Metaphase II spielt.
Cyclinabhängige Kinasen sind maßgeblich an der Regulation des Zellzyklus beteiligt. Während der Meiose kommt der cdc2 Kinase (cdc2K) eine besondere Bedeutung zu. Cdc2K (eine 34 kDa Serin / Threonin Proteinkinase) ist der katalytische Bestandteil des MPF (Maturation Promoting Factor oder auch M-Phase Promoting Factor). Die genannte Proteinkinase ist nur aktiv in Verbindung mit ihrer regulatorischen Untereinheit Cyclin B (Xenopus - NEBREDA und FERBY, 2000;
TAIEB et al.,1997; LI et al., 1995; GAUTIER und MALLER, 1991; Seestern - KISHIMOTO, 1999; PICARD und PEAUCELLIER, 1998; PICARD, 1991; Fisch - HIRAI et al., 1992).
Untersuchungen an verschiedenen Spezies (Maus - CHESNEL und EPPIG, 1995a; CHESNEL und EPPIG, 1995b; Xenopus - SADLER und MALLER, 1983; Rind - TOMEK et al., 2002b; MEINECKE et al., 2001; KUBELKA et al., 2000; Schwein - KUBELKA et al., 2002a, b) ergaben, dass im GV-Stadium nur eine sehr geringe, d.h.
als basal zu beschreibende MPF-Aktivität nachzuweisen ist. Speziell bei Säugetieren und Xenopus wurde gezeigt, dass cdc2K in dieser Phase vorhanden ist. Die Neusynthese von Cyclin B ist aber notwendig zur Bildung des aktiven Komplexes (TAIEB et al., 1997). Bis kurz vor Beginn des GVBD wird die Aktivität des MPF durch Phosphorylierung an den Aminosäuren Thr 14 und Tyr 15 der katalytischen Untereinheit unterdrückt. Diese inaktive Form des cdc2 / Cyclin B Komplexes wird als prä-MPF bezeichnet (TAIEB et al.,1997). Die Proteinkinasen Myt1 und Wee1 sind für diese inhibitorische Phosphorylierung verantwortlich (KANATSU-SHINOHARA et al., 2000; NIGG, 2001; COLEMAN und DUNPHY, 1994). Die Aktivierung des prä-MPF erfolgt durch die Unterdrückung der Myt1-Kinaseaktivität und Dephosphorylierung von cdc2K an den Aminosäuren Thr 14 und Tyr 15 durch Aktivierung der Phosphatase cdc25 (LINCOLN et al., 2002; NIGG, 2001; TAIEB et al., 1997).
Beim aktiven sowie beim inaktiven MPF ist die Aminosäure Thr 161 phosphoryliert (TAIEB et al., 1997; COLEMAN und DUNPHY, 1994). Diese Phosphorylierung wird von einer „cdk-activating kinase“ (CAK) katalysiert (KARAISKOU et al., 2001; MÄKELÄ et al., 1994; COLEMAN und DUNPHY, 1994).
Die Aktivierung des prä-MPF erfolgt in Eizellen von Säugetieren zeitgleich oder kurz vor Beginn des GVBD. Aber im Gegensatz zur MAPK-Aktivität, die stabile, hohe Werte bis zur Metaphase II zeigt, beobachtete man einen drastischen Rückgang der Aktivität des MPF beim Übergang von der Metaphase I zur Anaphase I (KUBIAK et al., 1992; VERLHAC et al., 1994; TORNER et al., 2001; KUBELKA et al., 2000;
2002b). Dieser Rückgang erfolgt durch Cyclindegradierung mittels eines ubiquitinabhängigen proteolytischen Systems. In somatischen Zellen, wie auch in Eizellen verschiedener Spezies, wurde ein 26S Proteinkomplex, genannt Proteasom identifiziert, der für diese Degradierung verantwortlich ist (COX et al., 2002;
REVERTE et al., 2001; JOSEFSBERG et al., 2000).
Bei fortschreitender Entwicklung werden in der Metaphase II erneut maximale MPF-Aktivitäten beobachtet (KUBELKA et al., 2000;.VERLHAC et al., 1994)
Verschiedene Studien legen den Schluss nahe, dass die Reaktivierung des MPF während des Übergangs von der Metaphase I zur Anaphase I für die Verhinderung der Neubildung der Kernhülle, wie auch für die Unterdrückung der DNA-Replikation (Maus –VERLHAC et al., 1994; Rind und Schwein – WEHREND und MEINECKE, 2001) verantwortlich ist. Die genauen Mechanismen dieser Phänomene sind noch weitgehend unbekannt.
Cdc2K kann als Histon-Kinase wirken und phosphoryliert Lamin (PETER et al., 1990). Das deutet darauf hin, dass cdc2K an der Desintegration der Kernhülle und damit am GVBD beteiligt ist (KUBELKA et al., 2000).
Nach vollständiger meiotischer Endreifung werden die Eizellen in der Metaphase II erneut arretiert.
- Cytostatic Factor (CSF)
Die Arretierung der Eizellen in der Metaphase II wird der Wirkung eines zytostatischen Faktors (CSF) zugeschrieben (MASUI und MARKERT, 1971; KUBIAK et al., 1993; CIEMERYCH und KUBIAK, 1999). Dessen Aktivität wurde als erstes bei Amphibienoozyten nachgewiesen (MASUI und MARKERT, 1971). Die Mikroinjektion
von Zytoplasma aus Eizellen, welche in der Metaphase II arretiert waren, in eine Blastomere zweizelliger Embryonen, inhibierte deren Mitose, während sich die andere Zelle weiter teilte. KUBIAK et al. (1993) haben ähnliche Ergebnisse bei Eizellen der Maus erhalten. Die Hauptwirkung des CSF scheint die Unterdrückung der Cyclindegradierung und damit die Aufrechterhaltung hoher MPF-Aktivitäten zu sein (HIRAO und EPPIG, 1999).
Die Aktivierung verschiedener Proteinkinasen ist Voraussetzung zur Erlangung der CSF Aktivität. Daran beteiligt sind MAPK (GROSS et al., 1999) und c-Mos (HASHIMOTO et al., 1994; SAGATA et al., 1989). Neuere Untersuchungen zeigten, dass die MAPK-abhängige CSF-Aktivierung, durch p90rsk, einem MAPK Substrat, vermittelt wird (GROSS et al., 1999; MALLER et al., 2001). Die konstitutive Expression von aktivierter p90rsk führte zu einer Inhibition der Zellteilung in Xenopusblastomeren. Zytologische Untersuchungen ergaben, dass sich diese Zellen in der M-Phase befanden und einen Spindelapparat aufwiesen, wie er charakteristisch für die meiotische Metaphase ist.
Die Befruchtung führt zu einer Erhöhung der zytoplasmatischen Ca2+- Konzentration. Dieses Phänomen fördert die Inaktivierung des CSF. REIMANN und JACKSON (2002) zeigten, dass dafür der „anaphase-promoting complex/cyclosome“
(APC), eine Ubiquitin-Ligase, welche die Cyclin-Degradierung steuert, verantwortlich ist. Im Gegensatz dazu unterdrückt ein spezifischer Inhibitor des APC-Aktivators, cdc20, das Absinken der MPF-Aktivität bei niedriger Ca2+-Konzentration in der Metaphase II. Der Emi 1 genannte Faktor ist unerlässlich für die Arretierung von unbefruchteten Eizellen in der Metaphase II und scheint ein wichtiger Mediator der CSF-Aktivität zu sein (REIMANN und JACKSON, 2002). NIXON et al. (2002) haben festgestellt, dass wiederholte Erhöhungen der Ca2+-Konzentration nötig sind, um längerfristig die Cyclin B-Degradierung zu fördern. Diese wird erst in der S-Phase des mitotischen Zellzyklus gestoppt.
Neben Änderungen im Proteinphosphorylierungsmuster werden während der meiotischen Endreifung auch Änderungen bei der Proteinsynthese und im RNA- Metabolismus festgestellt. Bei der Maus (SCHULTZ et al., 1978) wurde ein Rückgang der Gesamtproteinsyntheserate mit Erreichen der Metaphase II beschrieben. Neuere Untersuchungen an Rindereizellen zeigten maximale Werte der
Proteinsynthese während des GVBD. In der Prophase I und Metaphase II wurden hingegen nur basale Werte erreicht (TOMEK et al., 2002a).
Nach Abschluss der Prophase, wenn die Oozyte die maximale Kondensation ihrer Chromosomen aufweisen, verliert die Eizelle die Möglichkeit, neue mRNA zu transkribieren (TOMEK et al., 2002a), so dass ihre Zellfunktionen bis zum ersten Mitoseszyklus über bereits vorliegende, gespeicherte mRNA und / oder über postranslationale Modifikationen von vorhandenen Polypeptiden geregelt werden müssen. Dieser zellphysiologische Aspekt verdeutlicht die Dominanz der zytoplasmatischen Kontrolle während der finalen Oozytenreifungsphase (NIEMANN und MEINECKE, 1993, S. 89).
Neben dem Rückgang der Transkription im Verlauf der IVM wurde aber eine Akkumulation von polyadenylierter mRNA bei Rindereizellen beobachtet (TOMEK et.
al., 2002a). Genauere Untersuchungen legen den Schluss nahe, dass es sich dabei um zytoplasmatische Polyadenylierung bereits vorhandener zytoplasmatischer mRNA handelt. Im Gegensatz zu somatischen Zellen, wo eine Verlängerung der Poly(A)-Sequenz mit einer Aktivierung der betroffenen mRNA und damit mit einer Stimulierung der Translation korreliert (STUTZ et al., 1998; RICHTER, 1999), ist in Rindereizellen die akkumulierte, polyadenylierte mRNA in der Metaphase II translatorisch inaktiv (TOMEK et al., 2002a). Welche Mechanismen diesen Unterschied zwischen somatischen und germinativen Zellen begründen, ist unbekannt.
Die grundlegende Bedeutung zytoplasmatischer Polyadenylierungsprozesse für die meiotische Endreifung von Rindereizellen zeigten Experimente mit dem Polyadenylierungshemmer Cordycepin (KRISCHEK und MEINECKE, 2002). Die Autoren fanden, dass die Inhibition der Polyadenylierung die Chromatin- kondensation, wie auch den GVBD sowie die MPF- und MAPK Aktivierung inhibiert.
Dabei wurde ein Effekt in den ersten sechs und im weiteren Reifungsverlauf zwischen 9 und 12 Stunden beobachtet. Bei Erreichen der Metaphase II ist die polyadenylierte mRNA dann in translatorisch inaktiver Form gespeichert (TOMEK et al., 2002a). Dies deutet darauf hin, dass neben der zytoplasmatischen Polyadenylierung weitere Prozesse an der Regulation der Translation beteiligt sind.
Kandidatenmoleküle für diesen Regulationsprozess sind Initiationsfaktoren (eIFs) welche die Aktivität des Translationsapparates beeinflussen können, d.h. Faktoren welche die cap-abhängige Translation regulieren.
2.2 – Regulation der Translation
Die Synthese neuer Proteine ist ein hochgradig regulierter Prozess, der es Zellen erlaubt, auf eine Vielzahl von Stimuli, auch ohne De-novo-Transkription zu reagieren.
Die Regulation der Genexpression auf der Ebene der Translation ist bei Eizellen von zentraler Bedeutung, da diese Zellen große Mengen an mRNA in einer stabilen, aber translatorisch inaktiven Form speichern und Transkriptionsprozesse mit einsetzendem GVBD praktisch vollständig zum Erliegen kommen (CURTIS et al., 1995; TOMEK et al., 2002a). Die Genexpression während Reifungs- und Befruchtungsvorgängen sowie während früher Phasen der Embryonalentwicklung wird hauptsächlich auf dieser Ebene kontrolliert (DREYFUSS et al., 1996; DE VANTERY et al., 1997; RICHTER et al., 1999). Dabei kommt der cap-abhängigen Translation eine besondere Bedeutung zu. Die überwiegende Mehrheit der zellulären mRNAs (mit Ausnahme von mRNAs aus Mitochondrien) besitzen an ihrem 5´-Ende ein modifiziertes Guanosin (m7GpppN), die sogenannte cap-Struktur. Diese Struktur wird von spezifischen Faktoren erkannt, welche an Regulationsprozessen beteiligt sind. Im Folgenden werden die einzelnen Schritte der Translation kurz erläutert. Eine Auswahl der beteiligten Faktoren ist in der Tabelle 2 (S. 22) dargestellt.
Die Proteinbiosynthese wird in 3 Phasen unterteilt, welche die sogenannten Initiations-, Elongations- und Terminationsprozesse umfassen. Die Reaktionen bei jeder dieser Phasen werden von Proteinfaktoren reguliert (Initiationsfaktoren, eIFs;
Elongationsfaktoren, eEFs und Terminationsfaktoren), welche vorübergehend mit Ribosomen, mRNAs oder Aminoacyl-tRNAs interagieren. Dabei wird die Initiationsphase als limitierender Prozess bei der Neusynthese von Proteinen angesehen (HERSHEY, 1991; THACH, 1992; SONENBERG und GINGRAS, 1998).
Die biologische Aktivität von Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren wird durch Phosphorylierung oder Dephosphorylierung reguliert.
2.2.1- Initiations-, Elongations- und Terminations-Phase
Im ersten Schritt der Initiationsphase verbindet sich Met-tRNA mit den Initiationsfaktoren eIF2, eIF5 und GTP. Dieser Komplex interagiert mit eIF3 und der kleinen ribosomalen Untereinheit und bildet den 43S-Präinitiationskomplex. Unter Mithilfe von eIF4B bindet dieser Komplex nahe der eIF4F-cap-Struktur der mRNA.
Bei dieser Bindung kommt dem Initiationsfaktor eIF4F eine entscheidende Bedeutung zu. Er besteht aus drei Untereinheiten, dem eIF4E (ein cap- Bindungsprotein), dem eIF4A (eine RNA Helicase) und dem eIF4G, welcher die Integrität des Komplexes gewährleistet. Der eIF4F ist verantwortlich für die Auflösung von Sekundär- und Tertiärstrukturen am 5´-untranslatierten Ende (5´UTR) der mRNA. Seine Wirkung ist somit Voraussetzung für die Bindung des 43S- Präinitiationskomplexes an die mRNA. Der entstandene Komplex, bestehend aus dem 43S-Präinitiationskomplex, dem eIF4F, und der mRNA wird als 48S- Präinitiationskomplex bezeichnet.
Beim letzten Schritt im Verlauf der Initiation der Translation stimuliert eIF1 den
„Scanning“-Prozess der kleinen ribosomalen Untereinheit vom 5´-Ende nahe der cap-Struktur bis zum Initiationscodon AUG. Unter Mitwirkung von eIF5B bindet die große ribosomale Untereinheit und bildet den funktionellen Translationskomplex.
Die Elongation, d.h. die eigentliche Bildung der Polypeptidkette wird durch Elongationsfaktoren stimuliert (eEF1-3). Dieser Prozess beinhaltet die Bindung der Aminoacyl-tRNA an das Ribosom, die Katalyse der Peptidbindung durch eine Peptidyltransferase und die Translokation des Ribosoms. Diese Prozesse sind GTP abhängig. Pro Sekunde werden ca. 6 Peptidbindungen geknüpft (HERSHEY, 1991)
Bei Erreichen des Stopcodons fördert ein „releasing factor“ (eRF) die Termination der Translation. Das führt zur Freisetzung des Proteins.
Wie bereits erwähnt, besteht heute weitgehend Übereinstimmung in der Ansicht, dass die Initiation der Translation der limitierende Prozess der Proteinsynthese ist (HERSHEY, 1991; MINICH et al., 1994). In diesem Zusammenhang wird die Wirkung des cap-Bindungskomplexes eIF4F als begrenzend für die Gesamtprotein- syntheserate angesehen (THACH, 1992; PAIN, 1996; SONENBERG und GINGRAS, 1998).
Frühere Untersuchungen an somatischen Zellen zeigten, dass das cap- Bindungsprotein eIF4E nur in phosphorylierter Form in 48S Präinitiationskomplexen und Polysomenfraktionen zu finden ist (JOSHI-BARVE et al., 1990; TUAZON et al., 1990). Diese Ergebnisse führten zu der Vermutung, dass die Phosphorylierung dieses Initiationsfaktors an Ser 209 bedeutsam für dessen biologische Affinität ist.
Tabelle: 2 – Übersicht über Funktion und Eigenschaft ausgewählter Initiations-, Elogantions- und Terminationsfaktoren der Translation (HERSHEY, 1991; PAIN, 1996; PESTOVA et al., 2001).
Initiations- faktor
MW (kDa)
MW Untereinheiten (kDa)
Funktion
eIF1/eIF1A 13,5 / 19 Teil des 43S Präinitiationskomplexes, stimuliert scanning von cap zu Initiationscodon AUG eIF2 130 : 36; : 38; : 55 Rekrutierung tRNA; Bildung des 43S
Präinitiationskomplexes, GTP-abhängig eIF2B 272 : 26; : 39;
: 58; : 67; : 82
Katalyse des GDP-GTP Austausches an eIF2
eIF3 550 Bildung des 43S Präinitiationskomplexes
eIF4B 80 RNA-Helicase, wirkt zusammen mit der RNA-
Helicase eIF4A
eIF4F 295 4A:50; 4E:25; 4G:220 Cap Erkennung und Bindung, Auflösung von Sekundärstrukturen an 5’ UTR der mRNA, Stimulation der Bildung des 48S Präinitiations- komplexes, Bindung zu PABPs, begrenzend für Translationsraten
eIF5/eIF5B 150/49 Interaktion mit eIF1, eIF1A, eIF2, eIF3 des 48S Präinitiationskomplexe, Stimulierung der Bildung des 80S Initiationskomplexes
Elogantions- faktor
MW (kDa)
MW Untereinheiten (kDa)
Funktion
eEF-1 51 bindet aa-tRNA, GTPase
eEF-1 23 GTP:GDP Austausch an eEF-1
eEF-1 49 GTP:GDP Austausch an eEF-1
eEF-2 100 stimuliert Translokation des Ribosoms, GTPase Terminations-
faktor
MW (kDa)
Untereinheiten (kDa)
Funktion
eRF 54 erkennt Stop-Codons, stimuliert Peptidyl-tRNA
Trennung und Freisetzung den Proteine
Nach MINICH et al. (1994) wird die Affinität von eIF4E zur cap-Struktur durch Phosphorylierung erhöht und die Bildung des vollständigen Faktors eIF4F gefördert.
Somit ist die Phosphorylierung von eIF4E ein wichtiger Regulationsmechanismus der Initiation der Translation.
Die Wirkung von eIF4E kann durch spezifische Bindungsproteine unterdrückt werden (PAUSE et al., 1994; GINGRAS et al., 1999). Bisher sind in somatischen Zellen drei solche 4E-BPs beschrieben worden (4E-BP1, -BP2 und -BP3). Diese sind strukturell verwandt und binden in ihrer nicht phosphorylierten Form an eIF4E (PAUSE et al., 1994; GINGRAS et al., 1999). Dabei scheinen diese Bindungsproteine nicht die Bindung von eIF4E an die cap-Struktur zu unterbinden.
Vielmehr unterdrücken sie die Interaktion von eIF4E mit eIF4G und eIF4A und damit die Formation des funktionellen Komplexes eIF4F. Somit wird durch die Wirkung der 4E-BPs die Auflösung von Sekundärstrukturen und Tertiärstrukturen in der 5´UTR verhindert, so dass die kleine ribosomale Untereinheit nicht an die mRNA binden kann (GINGRAS et al., 1999). Ob derartige Repressoren von eIF4E oder eIF4F auch in Eizellen vorkommen, ist nicht bekannt.
Neben der beschriebenen cap-abhängigen Translation existiert in somatischen Zellen offensichtlich auch ein Initiationsmechanismus, welcher cap-unabhängig ist.
Ein derartiger Mechanismus wurde erstmals bei viralen mRNAs beschrieben (HONDA et al., 2000). Dort spalten virale Proteasen den zellulären Faktor eIF4G, verhindern damit die eIF4F-Bildung und schalten die zelluläre cap-abhängige Translation ab. Die Initiation der Translation viraler mRNAs erfolgt dann an spezifischen Sequenzen, den „Internal Ribosome Entry Sites“ (IRES). Neuerdings wurden solche IRES auch bei zellulären mRNAs gefunden (KIM und JANG, 2002;
FERNANDEZ et al., 2002; PYRONNET und SONENBERG, 2001). Dies trifft aber offensichtlich nur für mRNAs von wenigen Proteinen zu (z.B. Chaparone und einige Wachstumsfaktoren; PYRONNET und SONENBERG, 2001). Man muss davon ausgehen, das die Translationsinitiation der überwiegenden Mehrheit der mRNAs cap-abhängig ist. Über das Auftreten der cap-unabhängigen Translation bei Eizellen ist noch nichts bekannt.
2.2.2- Zytoplasmatische Polyadenylierung und cap-Struktur
Neben der 5´-cap-Struktur besitzen mit wenigen Ausnahmen (z.B. beta-Actin-, Histon-mRNA,GORLACH et al., 1989; SCHRODER et al., 1989) alle mRNAs am 3´- Ende eine Poly(A)-Sequenz (GEBAUER et al., 1994). Diese Poly(A)-Sequenz wird im Zellkern gebildet. Beim Transport ins Zytoplasma findet eine Verkürzung statt (GEBAUER et al., 1994). Die Poly(A)-Sequenz ist zusammen mit Poly(A)-
Bindungsproteinen (PABPs) offensichtlich für die Stabilität der mRNA verantwortlich, da mRNAs mit weniger als 30 Adenosinresten schnell abgebaut werden (RICHTER, 1999; WAKIYAMA et al., 2001).
Daneben existiert ein Mechanismus, durch den die Poly(A)-Sequenz im Zytoplasma verlängert wird. Dafür sind die Poly(A)-Polymerase und spezifische Sequenzen in der 3´-UTR verantwortlich. Dies sind neben dem nukleären Polyadenylierungssignal AAUAAA, sogenannte zytoplasmatische Polyadeny- lierungselemente (CPEs). Unter Verwendung von somatischen Zellen wurde gezeigt, dass die zytoplasmatische Polyadenylierung mit der Aktivierung der Translation der betroffenen mRNA korrelierte (STUTZ et al., 1998; RICHTER, 1999).
An CPEs binden spezifische Proteine, die stimulierend oder inhibierend auf die Translation wirken können. Stimulierend wirkt die Interaktion eines 62 kDa- Phosphoproteins (CPE-Bindungsproteins – CPEB; HAKE und RICHTER, 1994;
HAKE et al., 1998; MENDEZ et al., 2002). Diese Bindung förderte die Aktivität der Poly(A)-Polymerase und führt zu einer Verlängerung der Poly(A)-Sequenz (MENDEZ et al., 2000b).
Im Gegensatz dazu führte die Bindung eines Proteins, genannt Maskin, zu einer Inhibition der zytoplasmatischen Polyadenylierung und damit zur Reprimierung der betroffenen mRNA (CAO und RICHTER, 2002;. MENDEZ und RICHTER, 2001;
RICHTER, 1999)
Damit wird deutlich, dass Modifikationen und die Bindung von Faktoren am 3´- Ende der mRNA die Initiation der Translation am 5´-Ende beeinflussen. Dies setzt eine direkte Interaktion der beiden Enden der mRNA voraus. Verantwortlich hierfür sind nach neuesten Vorstellungen Poly(A)-Bindungsproteine (PABPs), welche mit eIF4G des cap-Bindungskomplexes eIF4F direkt oder über ein „Poly (A)-binding protein interacting protein“ (PAIP) interagieren (ROY et al., 2002). Untersuchungen von PREISS und HENTZE (1999), zeigten, dass eine synergetische Aktivierung der Translation auftritt, wenn sowohl cap-Struktur wie auch Poly(A)-Sequenz vorhanden waren. Die Autoren führen dies neben der Stimulation der Initiation durch den cap- Bindungskomplex eIF4F auf eine zusätzliche Förderung der Bindung des 43S Präinitiationskomplexes an die mRNA durch die beschriebene Interaktion von 5´- und 3´-Ende der mRNA zurück.
Man kann also vereinfacht von zwei unterschiedlichen Wirkungsspektren bei der Regulation der Translation ausgehen. Ein Wirkungsspektrum betrifft die biologische
Aktivität von spezifischen Initiationsfaktoren wie eIF4E oder eIF4F. Diese wirken eher global, indem sie die Gesamtaktivität des Translationsapparates beeinflussen. Auf der anderen Seite scheinen mRNA-Bindungsproteine spezifisch für unterschiedliche mRNAs zu sein. Diese Bindungsproteine stimulieren oder inhibieren die Translation bestimmter mRNAs durch Modifikation der Stabilität von Sekundärstrukturen am 5´- Ende oder durch Beeinflussung von Prozessen wie der zytoplasmatischen Polyadenylierung. Im Gegensatz zur global wirkenden Beeinflussung (d.h.
Phosphorylierung / Dephosphorylierung) von Initiationsfaktoren, ist dieser Mecha- nismus also eher als spezifisch anzusehen.
Ein weiterer spezifisch wirkender Mechanismus der Translationsregulation wurde kürzlich bei C. elegans beschrieben. Dieser umfasst die Funktion kleiner RNAs, die aus 21 - 25 Nukleotiden bestehen, welche durch die zytoplasmatische Endonuklease
„Dicer“ aus einem längeren Transkript mit charakteristischen „stem-loop“ Strukturen gebildet werden (PROVOST et al., 2002; ZHANG et al., 2002). Die dabei entstehenden micro RNAs (miRNAs) oder small interfering RNAs (siRNAs) sind nicht als „antisense-RNA“ aufzufassen, da sie nicht mit der codierenden Region einer gegebenen mRNA hybridisieren. Vielmehr bilden diese miRNAs Hybride mit der 3´- UTR der mRNA und führen dadurch zu Repression der Translation, indem sie möglicherweise Polyadenylierungsprozesse und damit die beschriebene Interaktion von 5´- und 3´-Ende der mRNA unterdrücken. Die Wirkung dieser miRNAs wird als
„RNA interference“ (RNAi) bezeichnet (LAGOS-QUINTANA et al., 2001, LEE und AMBROS et al., 2001). „Dicer“ wurde auch für höhere Eukaryoten, bis hin zum Menschen beschrieben (ZHANG et al., 2002). Ob dieser Mechanismus jedoch bei Prozessen der Eizellreifung eine entscheidende Rolle spielt, ist nicht bekannt.
3- MATERIAL UND METHODEN
3.1- Gewinnung der Eierstöcke
Für die Bearbeitung des Themas wurden die Oozyten aus Eierstöcken geschlachteter Kühe verwendet. Es handelte sich fast ausschließlich um Kühe und Jungrinder der Rasse Deutsches Fleckvieh. Die Eierstöcke wurden am Schlachthof Erlangen gewonnen.
Die Entnahme der Eierstöcke erfolgte unter hygienischen Bedingungen und nur Eierstöcke, die keine degenerativen Erscheinungen zeigten, wurden verwendet. Die Organe wurden in einen Thermogefäß mit 0,9 %iger NaCl-Lösung bei 20 - 25 °C gelagert und innerhalb von 3 Stunden in das Labor transportiert.
3.2- Entnahme der Cumulus-Oozyten-Komplexe (COK)
Die Eizellen wurden mittels der Slicing-Methode gewonnen. Hierbei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Oberfläche der Ovarien durch ein Mehrfachmesser aufgeschnitten wird. Die geschnittenen Eierstöcke wurden mit PBS-Lösung (34 ºC;
siehe Anhang 9.1.1) gespült. Die Spülflüssigkeit wurde anschließend gesiebt und filtriert. Die daraus resultierende Flüssigkeit wurde in eine gerasterte Petrischale übertragen. Unter dem Stereomikroskop (15-facher Vergrößerung, Nikon SMZ 800), wurden die COKs gesucht und in eine Petrischale (Durchmesser 30 mm) über- tragen, die mit modifizierter PBS-Lösung gefüllt war (Sammelschale). Die Oozyten wurden bei 45-facher Vergrößerung klassifiziert.
3.2.1- Oozytenklassifizierung
Die gewonnenen COKs wurden nach Beschaffenheit von Cumuluszellen und Eizellplasma klassifiziert. Als Grundlage der Qualitätsbeurteilung wurden die Kriterien von LEIBFRIED und FIRST (1979) übernommen.
Tabelle 3: Klassifizierungsschema für Cumulus-Oozyten-Complexe:
Klasse 1 Oozyten mit dunklem, homogenem Eizellplasma und einer kompakten, mindestens fünfflagigen Cumuluszellschicht
Klasse 2 Oozyten mit dunklem, homogenem Eizellplasma und einem kompakten, Cumulus, der stellenweise weniger als fünf Lagen aufweist
Klasse 3 Oozyten mit dunklem, homogenem Eizellplasma mit einem kompakten, mehrlagigen Cumulus mit leichter Zellexpansion
Klasse 4 Oozyten mit voll expandiertem Cumulus
Klasse 5 Oozyten mit dunklem oder degeneriertem Plasma, mit weniger als dreilagiger Cumuluszellschicht und nackte Oozyten
Für alle Untersuchungen wurden ausschließlich COKs der Klasse 1 und der Klasse 2 verwendet.
3.3- In-vitro-Reifung
Die gewonnenen Oozyten wurden dreimal im Grundmedium (TCM 199 + 3 mg / ml BSA bzw. 10 % Estrum Cow Serum - ECS) gewaschen, bevor sie in das Reifungsmedium überführt wurden. Zuerst wurden die Oozyten zweimal in Petrischalen umgesetzt, die mit Grundmedium (siehe Anhang, 9.1.2) gefüllt waren.
Der letzte Reinigungsschritt sowie die Reifung selbst, erfolgte in einer "4-Well- Multischale". In jede Vertiefung der Schale wurden 500 Ml des Grundmediums gegeben, und in Abhängigkeit vom Experiment wurden zusätzlich bestimmte Inhibitoren zugesetzt. Die Kulturen in der Reifungsschale wurden mit Mineralöl überschichtet. Das Reifungsmedium wurde am Morgen vor Durchführung der Experimente vorbereitet und im Brutschrank bei 39°C, 5% CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeit gelagert, um pH-Wert und Temperatur zu äquilibrieren.
Abb. 1: Klassifizierung der Cumulus-Oozyten-Komplexe nach LEIBFRIED und FIRST (1979).
Die Abbildungen zeigen Eizellen der Klassen 1 bis 5. Eine detaillierte Beschreibung dieser Klassifizierung befindet sich in die Tabelle 3.
COK der Klasse 1 COK der Klasse 2
COK der Klasse 3
COK der Klasse 4
COK der Klasse 5
Die Reifung erfolgte bei 39 °C, 5 % CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeit.
Abhängig vom Experiment erfolgte die Reifung über eine Dauer von 0 - 24 Stunden.
Das Grundmedium TCM 199 (Tissue culture medium Hepes Modification mit L- Glutamin und 25 mM Hepes) wurde alle 14 Tage vorbereitet, sterilfiltriert, auf pH 7,4 eingestellt und bei 6 °C gelagert.
Dem Grundmedium wurde vor der Verwendung mit 3 mg / ml Bovine Serum Albumin (BSA) bzw. 10 % ECS zugesetzt.
3.3.1- Behandlungen
Für die Analyse der Aktivierung der Mitogen-Aktivierten-Proteinkinase (MAPK) und der cyclinabhängigen Kinase (cdc2K) wurden folgende Inhibitoren verwendet:
Butyrolactone I (BLI), PD 098059 und Okadinsäure (OA).
Die verwendeten Konzentrationen der Stammlösungen, sowie die Endkonzentrationen und Behandlungszeiten, sind in der Tabelle 4 dargestellt.
- Okadinsäure (OA)
Okadinsäure ist ein spezifischer Inhibitor von der Proteinphosphatasen PP1 und PP2A (SMITH et al., 1998; COHEN, 1990). OA beschleunigt die Auflösung der Kernhülle (GVBD) sowie die Aktivierung von MAPK und cdc2K (JESSUS et al., 1991;
RIME et al., 1990; GORIS et al., 1989).
- Butyrolactone I (BLI)
BLI (C24H24O7) ist ein spezifischer Inhibitor von cdks. BLI wird aus Aspergillus gewonnen. Die inhibitorische Wirkung von BLI ist gegenüber cdc2K ca. 140 mal höher als gegen MAPK, Proteinkinase C, und c-AMP-abhängige Proteinkinasen (KITAGAWA et al., 1993).
BLI hemmt cdc2K durch Kompetition mit ATP. Dieser Inhibitor synchronisiert somatische Zellen beim Übergang von der G1- zur S-Phase bzw. von der G2- zur M- Phase des Zellzyklus (KITAGAWA et al., 1993; 1994; OKUYAMA et al., 1997).
MOTLIK et al. (1998) zeigten, dass eine Hemmung der Meiose mittels BLI von der Zusammensetzung des Reifungsmediums abhängig ist. Die besten Ergebnisse bei Rindereizellen wurden in TCM 199 mit BSA (3 mg/ml) und 100 MM BLI erreicht.
- PD 098059: 2-(2-Amino-3-metoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one
PD 098059 (C16H13NO3) ist ein spezifischer Inhibitor der MAPK-Signalkaskade (die verschiedenen Formen der MAPK werden auch als extrazellulär regulierte Kinasen, ERKs, bezeichnet). Die Wirkung von PD 098059 auf MAPK erfolgt in somatischen Zellen durch Inhibition der Phosphorylierung und Aktivierung der MAP-Kinase-Kinase (MAPKK), MEK (mitogen-aktivierte, ERK-aktivierende-Kinase). Der Inhibitor hat keine Wirkung auf bereits phosphorylierte MEK (DUDLEY et al., 1995; ALESSI et al.
(1995).
Über die Wirkung von PD 098059 bei Eizellen verschiedener Spezies liegen noch keine systematischen Untersuchungen vor.
Tabelle 4: Zusammenstellung der verwendeten Inhibitoren mit Konzentrationen und Behandlungszeiten
Inhibitor Stammlösung/Lösungsmittel Endkonzentration Behandlungszeit
BLI 50 mM im DMSO 100 MM 0 – 10 h; 0 – 24 h
PD 098059 50 mM im DMSO 50 - 150 MM 0 – 10 h; 0 – 24 h
OA 1 mM im Methanol 2,5 MM 5 h
Die Lagerung der Stammlösungen erfolgte für maximal drei Monate bei -20 °C.
Zu den Kontrollgruppen wurde die entsprechende Menge Lösungsmittel ohne Inhibitor zugesetzt.
Um eine vollständige Auflösung vom PD 098059 zu erreichen, wurde der pH- Wert des Mediums durch Begasung mit CO2 abgesenkt. Nach vollständiger Auflösung erfolgte eine Äquilibrierung des pH-Wertes im Brutschrank bei 39 °C, 5 % CO2und gesättigter Luftfeuchtigkeit. Die Äquilibrierung war nach dem Farbumschlag des Indikators im Medium von gelb nach rot erreicht.
3.4- In-vitro-Fertilisation
Für die Befruchtung wurden folgende Medien verwendet:
die modifizierte Tyrode-Laktat-Lösung (PARRISH et al., 1986; Sperm-Talp) für Spermienkapazitation und -aufbereitung und das modifizierte Tyrode-Laktat-Medium (BAVISTER und YANAGIMACHI, 1977; Fert-Talp) für die Befruchtung.
3.4.1- Aufbereitung der Spermien
Um die Spermien aufzubereiten wurde das "Swim-up" Verfahren (PARRISH et. al., 1986) verwendet.
Das Ziel dieser Methode besteht darin, die unbeweglichen von den beweglichen Spermien zu trennen. Die Trennung erfolgte durch den Übergang der beweglichen Spermien aus der unteren Schicht in das oben liegende Kapazitationsmedium.
Eine Samenportion (1 Paillette 15 x 106 Spermien in 0,25 ml) wurde für die Befruchtung von ca. 100 Eizellen genutzt. Zwei sterile Kryoröhrchen (1,8 ml) wurden jeweils mit 1,5 ml Kapazitationsmedium (siehe Anhang, 9.1.3) gefüllt und mit einer halben Samenportion unterschichtet. Anschließend wurden sie eine Stunde im Brutschrank inkubiert. Danach wurden aus jedem Kryoröhrchen 800 µl Spermiensuspension aus dem oberen Drittel in ein vorgewärmtes und beschriftetes Zentrifugenröhrchen überführt und für 10 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Der über dem Spermiensediment entstandene Überstand wurde abgenommen und verworfen.
Das Sediment wurde erneut in 1,5 ml Kapazitationsmedium resuspendiert und abermals bei 800 g zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wurden die Spermien in 40 µl Befruchtungsmedium resuspendiert (Spermasuspension).
3.4.2- In-vitro-Befruchtung
Die Koinkubation von Spermien und gereiften COKs erfolgte in Befruchtungstropfen (60 Ml). Nach 24 Stunden Reifungszeit wurden die COKs aus der Reifungsschale entnommen, unter Beibehaltung der Gruppen in je 200 Ml Befruchtungsmedium (siehe Anhang, 9.1.4) gewaschen und in die Befruchtungstropfen umgesetzt.
Von der vorbereiteten Spermasuspension wurde eine Menge zugegeben, die ca.
120 x 103Spermien pro Befruchtungstropfen ergab (ca. 2 x 106Spermien / ml).
Die Koinkubationszeit von Oozyten und Spermatozoen betrug zwischen 18 und 22 Stunden.
3.5- In-vitro-Kultivierung
Für die Kultivierung wurde Grundmedium mit BSA bzw. 10% "Estrus Cow Serum"
(ECS), je nach Versuchsansatz verwendet. Die Kultivierung erfolgte wie bei der Reifung in einer "4-Well-Multischale", mit 500 Ml Grundmedium pro Vertiefung. Die Kultivierungsschalen blieben mindestens 4 Stunden im Brutschank bevor sie genutzt wurden.
Nach Ablauf der Befruchtungszeit wurden die COKs aus den Befruchtungstropfen entnommen und unter Beibehaltung der Gruppen zweimal in 200 Ml Grundmedium gewaschen. Danach wurden die COKs direkt in die Kultivierungsschalen eingesetzt und 9 Tage bei 39 °C, 5% CO2, und maximale Luftfeuchtigkeit inkubiert. Der Tag an dem die Kultivierung begonnen wurde, wurde als Tag 1 bezeichnet. Am vierten und sechsten Tag wurden jeweils 200 Ml Grundmedium, das mit 25 % ECS versetzt war, zugegeben.
3.6- Beurteilung der Teilungs- und Entwicklungsstadien
Während der Kultivierung wurden die Teilungs- und Entwicklungsstadien wie folgt beurteilt:
Am dritten Tag der Kultivierung wurde die Teilungsrate (Anteil der Embryonen mit mindestens 2 Zellen) unter einem Stereomikroskop bei zwanzigfacher Vergrößerung bestimmt. Embryonen, die gleichmäßige Blastomeren aufweisen, wurden als geteilt eingestuft.
Abb. 2: Embryonen Klassifizierung nach LINDNER und WRIGHT (1983), dargestellt sind: A: Beginnende-, B: Expandierte-, C: Schlüpfende- und D: Geschlüpfte Blastozyste. Detaillierte Beschreibungen befinden sich im Text.
Am siebten und achten Tag der Kultivierung wurde die Blastozystenrate bestimmt. Die Blastozysten wurden folgendermaßen klassifiziert (LINDNER und WRIGHT, 1983):
A- Beginnende Blastozyste B- Expandierte Blastozyste
C- Schlüpfende Blastozyste D- Geschlüpfte Blastozyste
- Beginnende Blastozysten: Blastozysten, die eine deutliche Blastozoelbildung und eine glatte Abgrenzung zum perivitellinen Raum aufweisen
- Expandierte Blastozysten: Blastozysten, die eine Ausdünnung der Zona Pellucida zeigen, wobei der perivitelline Raum verschwunden ist, der gesamte Embryo ist vergrößert, die ICM (inner-cell-mass) und der Trophoblast sind deutlich voreinander abzugrenzen
- Schlüpfende Blastozysten: Diese haben teilweise die Zona Pellucida verlassen.
- Geschlüpfte Blastozysten: Diese haben die Zona Pellucida vollständig verlassen.
3.7.- Entfernung des Cumulus oophorus und Probenvorbereitung für morphologische und biochemische Untersuchungen
Der Cumulus oophorus wurde durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Pipette entfernt. Zuerst wurden die Cumulus-Oozyten-Komplexe in 400 µl Grundmedium gegeben und danach in 400 µl Hyaluronidaselösung (s. Anhang 9.1.9) für maximal zwei Minuten überführt. Um das Enzym zu inaktivieren und Proteine zu entfernen, wurden die Eizellen einmal mit dem Grundmedium gewaschen und weitere fünfmal mit PBS ohne BSA (PBS-) gewaschen. Anschließend wurden die Proben in 0,5 ml Reaktionsgefäße pipettiert. Für die Fixierung in Ethanol / Essig (3:1) wurden die Eizellen einmal in PBS- gewaschen .
Für die biochemische Analyse wurden die Eizellen direkt nach Entfernung des Cumulus verwendet oder bei -20 °C gelagert.
3.7.1- Fixierung und Aceto/Orcein-Färbung der Eizellen
Um das Entwicklungstadium zu analysieren wurden die Eizellen in einer Lösung aus Ethanol / Essig (3:1) fixiert, mittels Aceto-Orcein gefärbt und anschließend zytologisch beurteilt.
Ca. fünf Eizellen wurden unter einem Deckglas fixiert (zwei Deckgläser pro Objekträger). Über den Siliconstreifen wurde das Deckglas vorsichtig so platziert, dass die Strukturen leicht festgepresst wurden, ohne zu zerplatzen.
Für eine längere Lagerung der Objektträger wurden diese in Küvetten überführt und mit Fixierflüssigkeit gelagert, so dass das untere Deckglas in die Flüssigkeit eintauchte. Dadurch wurde das Austrocknen des Raumes zwischen Deckglas und
Objektträger verhindert. Die Küvetten wurden luftdicht verschlossen und bei 6 °C bis zur Färbung und Auswertung gelagert.
- Aceto-Orcein Färbung:
Orcein (2g) wurden in Essigsäure (ca. 90 ml) gelöst und bis kurz vor Erreichen des Siedepunkts erwärmt. Danach wurde die Flüssigkeit auf ca. 20° C abgekühlt, mit Essigsäure auf 100 ml aufgefüllt und filtriert. Das Filtrat wurde bei Raumtemperatur aufbewahrt. Vor jeder Benutzung wurde die Färbelösung erneut filtriert.
- Durchführung der Färbung:
Ein Tropfen der Farbstofflösung wurde am oberen Deckglasrand abgesetzt und mittels Filterpapierstreifen durch den Raum zwischen Deckglas und Objektträger gesaugt bis die Lösung den Zwischenraum ausfüllte. Die Farbstofflösung wurde fünf Minuten inkubiert. Danach wurde die Färbelösung mit 30 %iger Essigsäure verdrängt. Die Objektträger wurden bis zur Auswertung in einer feuchten Kammer gelagert.
Die Auswertung erfolgte bei vierzigfacher Vergrößerung. Die Entwicklungs- stadien wurden als Germinalvesikel-Stadium (GV), "Germinal Vesicle Breakdown"
(GVBD), Metaphase I (MI), Anaphase I (AI), Telophase I (TI) und Metaphase II (MII) klassifiziert (HOMA, 1988).
3.8- Biochemische Verfahren 3.8.1- Elektrophoresen
Zur Auftrennung von Proteinen oder Protein-Komplexen in Polyacrylamidgelen wurden die Methoden nach LAEMMLI (1970; SDS-PAGE), nach SCHÄGGER et al.
(1994; Native-PAGE) oder nach O'FARREL (1975; Isoeletrische Fokussierung, modifiziert nach GAVIN und SCHORDERET-SLATKINE, 1997) verwendet. Die entsprechenden Vorschriften dieser Methoden befinden sich im Anhang (Abschnitt 9.2).
3.8.2 - Western- Blotting
Nach der Elektrophorese (SDS-, Native PAGE oder VSIEF) wurden die Proteine vom Gel auf eine PVDF-Membran übertragen (TOWBIN et al., 1979).
Der Transfer erfolgte mittels eines "semidry" Elektroblotters, bei einem mA pro cm2Membranfläche für eine Stunde von der Anode zur Kathode.
Die Behandlung der Membran, die verwendeten "Blockingreagentien", die Antikörper sowie deren Konzentrationen sind in der Tabelle 5 dargestellt.
Zwischen der Inkubation mit dem ersten und zweiten Antikörper, sowie nach der Inkubation mit dem zweiten Antikörper wurde die Membran dreimal (je 20 Minuten) in TTBS (siehe Anhang, 9.2.4.2) gewaschen. Bei allen Reaktionen wurde die Membran konstant bewegt.
Tabelle 5: Membran-Behandlung und Antikörper für Western-Blotting:
MAP-Kinase eIF4E 4E-BP1 Akt 1
Block Reagenz 10 % Gelatine Lösung in TTBS
10 % Gelatine Lösung in TTBS
5 % Mager- milchpulver in TTBS
5 % Mager- milchpulver in TTBS
Blocking Zeit / Temperatur
Über Nacht / 4 °C 5 Std. / RT 2 Std. / RT 3 Std. / RT
1. Antikörper ERK1-polyklonal a eIF4E -
monoklonal c 4E-BP1 -
polyklonal e Akt 1/ P- Akt g polyklonal Verdünnung 1:3000 in TTBS
2 % Gelatine
1:5000 in TTBS 2 % Gelatine
1:1000 in TTBS 5 % Mager- milchpulver
1:1000 in TTBS mit 5 % BSA Zeit/
Temperatur 1,5 Std. / RT Über Nacht / 4 °C 3 Std. / RT Über Nacht / 4 °C
2. Antikörper Anti-rabbit bHRP* anti-mouse dHRP* Anti-rabbit f HRP*
Anti-rabbit hHRP*
Verdünnung 1:5000 in TTBS + 2 % Gelatine
1:10000 in TTBS 1:10000 in TTBS 5 % Magermilch- pulver
1:2000 in TTBS 5 % Magermilch- pulver
Zeit/
Temperatur
1 Std. / RT 3 Std. / RT 3 Std. / RT 1,5 Std. / RT
HRP* = horseradish peroxidase-linked antibody a;b,f,h - Fa. Santa Cruz
c - Fa. Transductions Labs d - Fa. Jackson Labs
e – Antigen kloniert nach VOHNIKOVÁ, unveröffentlichte Ergebnisse g - Fa. Cell Signaling
3.8.3- Detektion der Proteine
Die Antigen-Antikörper-Reaktion auf der Membran wurde durch Chemi- lumineszenzreaktion (ECL oder ECL-Plus, Amersham Pharmacia) auf Röntgenfilmen sichtbar gemacht.
3.8.4- Färbungen der Membranen bzw. der Gele
- Silberfärbung von PVDF-Membranen nach Proteintransfer
Die im Anhang (Abschnitt 9.2.5.1) dargestellten Komponenten wurden gemischt, für dreißig Minuten gerührt und anschließend wurde die Membran für zehn Minuten gefärbt. Danach wurde die Membran gründlich mit Wasser gewaschen und im Dunkeln getrocknet.
Die Lösung wurde vor der Verwendung frisch hergestellt.
- Coomassie Färbung von Gelen:
Die Gele wurden 30 - 60 Minuten unter ständigem Schütteln in Coomassie Brilliant
blue R 250 (Sigma) Lösung gefärbt. Danach wurden sie mit einer Lösung aus 10 %iger Essigsäure und 45 %igem Methanol entfärbt bis die gewünschte Intensität
erreicht war (siehe Anhang, 9.2.5.2).
3.8.5- Kinase-Assay:
Die Histon-H 1-Kinase- und MAP-Kinase-Aktivität wurden nach MOTLIK et al. (1996) analysiert. Zu den Eizelllysaten in PBS wurden 5 Ml des Puffers A zugegeben. Die Kinase-Reaktion wurde begonnen durch die Zugabe von 5 Ml des Puffers B unter Zusatz 500 MCi / ml [32 P]-[-ATP (10 mCi / ml). Die Reaktion erfolgte in 30 Minuten bei 30 °C und wurde gestoppt durch Zugabe von 10 Ml des zweifach konzentrierten SDS-PAGE Probenpuffers. Anschließend wurden die Proben bei 95 °C für drei Minuten denaturiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf 15 %igen Acrylamidgelen analysiert, anschließend wurde das Gel gefärbt, getrocknet und bei -80 °C über Nacht auf Röntgenfilm exponiert. Die Komponenten des Puffers A und B sind im Anhang (9.2.6) dargestellt.
3.8.6- Messung der Gesamtproteinsynthese
Um die Gesamtproteinsynthese zu messen, wurde 50 MCi 35S-Methionin (Amersham Pharmacia) zum Kulturmedium zu verschiedenen Zeitpunkten hinzugefügt. Die Inkubation der Oozyten erfolgte für 4 Stunden (0+4h, 6+4h,10+4h, 14+4h, 20+4h IVM). Danach wurden die Oozyten in hypotonischem Puffer lysiert und mit 1 M NaOH, welche 5 % H2O2enthielt, für 10 Min. bei 37°C behandelt.
Die Proteine wurden mit TCA (50 %, Endkonzentration 12,5 %) gefällt.
Unlösliches Material wurde auf Glasfiberfilter (Whatman GF/C; Sigma) gesammelt.
Die Filter waren getränkt mit 5 % TCA, welche 100 mM Na4P2O7 enthielt. Die Präzipitate auf dem Filter wurden gründlich mit 5 % TCA gewaschen (3x 20ml). Die Filter wurden getrocknet, mit 5 ml Szintillationscoktail versetzt und die Radioaktivität in einem Szintillationszähler gemessen.
3.8.7- Real Time Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)
Die c-mos-cDNA wurde durch RT-PCR erhalten. Die Konstruktion der Primer (20 bp- Länge) erfolgte anhand der veröffentlichten c-mos-cDNA-Sequenz (WOOD et al., 1984). Folgende Primer wurden verwendet: forward: 5’ tcg cta cct ccc tcg tga gc 3’
(20); reverse: 5’ ccc tcc aga gcc cag cct at 3’ (20)
Die Amplifikation der cDNA erfolgte unter folgenden Bedingungen:
Vortemperierung bei 50 °C für 30 Minuten, 35 Zyklen bei 94 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 40 Sekunden und 70 °C für 70 Sekunden.
Für die Quantifizierung wurde ein Real-Time-PCR-System (I-cycler, Bio-Rad) verwendet.
4- ERGEBNISSE
4.1- Charakterisierung des Ausgangsmaterials
Um das Ausgangsmaterial zu charakterisieren, wurden die Eizellen zunächst während der In-vitro-Reifung morphologisch untersucht und anschließend für In- vitro-Produktionstechniken verwendet, um Blastozystenraten zu bestimmen.
4.1.1- Charakterisierung der In-vitro-Reifung
Die Eizellen wurden über die Dauer von 0, 6, 10, 16, 20 bzw. 24 Stunden kultiviert.
Danach wurden sie fixiert, gefärbt und morphologisch sowie zytologisch beurteilt.
Repräsentative Ergebnisse sind in der Abbildung 3 dargestellt.
Abb. 3: Verschiedene Meiosestadien während der meiotischen Endreifung:
Die Eizellen wurden unterschiedlich lange gereift und anschließend untersucht.
A: Germinalvesikelstadium (GV), B: Germinalvesikel Breakdown (GVBD), C: Metaphase I (M I); D: Anaphase I (A I), E: Telophase I (T I), F: Metaphase II (M
II).
A B C
E F
D
Abb. 4: Anteil verschiedener Meiosestadien während der IVM. Pro Zeitpunkt wurden 20 Eizellen analysiert.
Die zytologische Analyse der Eizellen ergab, dass vor Beginn der Reifung die Mehrheit der Eizellen einen deutlich erkennbaren Zellkern besaß (Abb. 3A). Die Zellen befanden sich im Germinalvesikel-Stadium. Mit längerer Reifungsdauer kondensierte das Chromatin und die Kernhülle löste sich auf (GVBD-Stadium; Abb.
3B). Nach einer 10-stündigen IVM lagerten sich die Chromosomen in der Äquatorialplatte an. Dadurch wurde die Metaphase I erreicht (Abb. 3C). Über eine kurze Ana- und Telophase, in der die Chromatiden getrennt werden (Abb. 3D/E), wurde nach 24-stündiger IVM die Metaphase II, mit ausgeschleustem erstem Polkörper erreicht (Abb. 3F).
Die Ergebnisse der zytologischen Untersuchungen sind in Abbildung 4 graphisch dargestellt. Es wurden durchschnittlich 20 Eizellen pro Zeitpunkt untersucht. Anhand der Abbildung ist zu erkennen, dass die Oozyten sich vor der Reifung zu etwa 90 % im GV-Stadium befanden. Der GVBD begann etwa nach sechs Stunden IVM und dieses Meiosestadium war nach zehn Stunden der Reifung abgeschlossen. Nach 24-stündiger IVM erreichten etwa 90 % der Eizellen die Metaphase II.
Zeit 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 h 6 h 10 h 16 h 20 h 24 h
IVM
Meiose- Stadium
GV GVBD M I A I T I M II Degeneriert
Zeit
%
