Experimentelle Untersuchungen zur Alterung porziner Eizellen in vitro

Tierärztliche Hochschule Hannover

Experimentelle Untersuchungen zur Alterung porziner Eizellen in vitro

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Anina Labudda

Marl

Hannover 2014

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Burkhard Meinecke Institut für Reproduktionsbiologie

Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves Physiologisches Institut

1. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. med. vet.Burkhard Meinecke

2. Gutachterin(nen)/Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Gerhard Breves

Tag der mündlichen Prüfung: 24.03.2014

Diese Arbeit entstand in Zusammenarbeit des Instituts für Reproduktionsbiologie mit dem virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen.

MEINEN ELTERN

Laufe nicht der Vergangenheit nach und verliere dich nicht in der Zukunft.

Die Vergangenheit ist nicht mehr.

Die Zukunft ist noch nicht gekommen.

Das Leben ist hier und jetzt.

Buddha

Inhalt

A Einleitung ... 7

B Literaturübersicht ... 8

1 Reifung der Oozyten ... 8

1.1 Kernreifung ... 8

1.1.1 Morphologische Aspekte ... 8

1.2 Zytoplasmatische Reifung ... 11

1.2.1 Metabolische Modifikationen ... 11

1.2.2 Biochemische Modifikationen ... 14

1.2.3 Strukturelle Modifikationen ... 16

1.3 Regulatoren des meiotischen Zellzyklus ... 17

1.3.1 M-phase promoting factor (MPF) ... 17

1.3.2 Mitogen-activated protein kinase (MAPK) ... 18

2 Alterung ... 22

2.1 Ovarielle Alterung ... 23

2.2 Oozytenalterung ... 24

2.2.1 Metabolische Modifikation während der Eizellalterung ... 26

2.2.2 Biochemische Modifikationen während der Eizellalterung ... 28

2.2.2.1 MPF ... 28

2.2.2.2 MAPK ... 28

2.2.2.3 Wiederherstellung des MPF- und MAPK-pools ... 29

2.2.2.4 Calcium (Ca²⁺) ... 29

3 Aktivierung der Eizelle ... 30

3.1 Physiologie ... 30

C Material und Methoden ... 32

1 In-vitro-Maturation ... 32

1.1 Allgemeine Maßnahmen... 32

1.2 Gewinnung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe ... 32

1.3 IVM der KOKs ... 33

2 Parthenogenetische Aktivierung ... 35

3 Ermittlung des Kernreifungsstadiums ... 37

3.1 Fixierung und Färbung der Oozyten ... 37

3.2 Beurteilung der Kernreifungs- und Teilungsstadien ... 37

4 Analyse der MAPK-Phosphorylierung ... 39

4.1 Lagerung und Vorbereitung der Oozyten ... 39

4.2 Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-Page) ... 39

4.3 Westernblot ... 40

4.4 Immundetektion und Chemilumineszenz ... 40

4.5 Auswertung der Chemilumineszenz ... 41

5 Statistische Auswertung ... 41

D Ergebnisse ... 42

1 Kernreifungsanalysen ... 42

2 Parthenogenetische Aktivierbarkeit ... 44

2.1 Einfluss von BSA und FKS auf die parthenogenetische Aktivierbarkeit ... 44

2.2 Parthenogenetische Aktvierbarkeit in vitro gealterter Oozyten ... 45

2 Phosphorylierung der MAPK ... 49

E Diskussion ... 52

F Ausblick ... 61

G Zusammenfassung ... 62

H Summary ... 64

I Literaturverzeichnis ... 66

Anhang ... 83

Abbildungsverzeichnis ... 83

Abkürzungsverzeichnis ... 85

Verwendete Chemikalien und Reagenzien ... 89

Rezeptverzeichnis ... 92

Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 96

Tabellen zum Ergebnisteil ... 98

Danksagung ... 101

A Einleitung

Bei Säugetieren existiert post ovulatorisch eine speziesspezifische Zeitspanne von nur wenigen Stunden, in der Eizellen befruchtungsfähig sind. Altern Oozyten über diese kritische Phase hinaus, so vermindert sich ihre Befruchtungs- und Entwicklungskompetenz (FISSORE et al. 2002). Aktuelle Besorgnisse bestehen vor allem in der Humanmedizin im Hinblick auf die Behandlung subfertiler Paare mit Kinderwusch. Hier werden neben den konventionellen Verfahren auch unreife ovarielle Eizellen endoskopisch gewonnen, in vitro maturiert und befruchtet, ehe nach einer weiteren Kultivierungsphase der Transfer in den Uterus erfolgt. Die Auswirkungen dieser assistierten Reproduktionstechnologien (ART) auf das sich entwickelnde Kind sind nicht ausreichend erforscht und werden teilweise widersprüchlich diskutiert (ANCKAERT et al. 2013).

Für die experimentelle Untersuchung des Alterungsprozesses der Oozyten eignet sich das Schwein in besonderer Weise als Modelltier. Sowohl die Zeitspanne, die die Eizelle für ihre Maturation benötigt, als auch die Frist, die zwischen der endogenen LH-Ausschüttung und der Ovulation liegt, ist bei Mensch (38-40 h) und Schwein (39-40 h) sehr ähnlich (EDWARDS 1966, HUNTER 2000). Zudem ist das Schwein auch unter Aspekten des Tierschutzes eine geeignete Spezies, da bei der Schlachtung Ovarien anfallen und die Experimente somit ohne zusätzliche Behandlungen oder Tötungen von Versuchstieren vorgenommen werden können.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand funktioneller und biochemischer Parameter die Auswirkungen einer experimentell induzierten Eizellalterung näher zu charakterisieren. Dazu wurde zunächst ein Alterungsmodell der Eizelle nach der In-vitro-Maturationsphase (IVM) etabliert. Als funktionelle Parameter dienten die morphologisch feststellbaren degenerativen Veränderungen des Ooplasmas und des Chromatins sowie die parthenogenetische Aktivierbarkeit. Als biochemischer Parameter wurde die Phosphorylierung der mitogen- activated protein kinase (MAPK) analysiert. Die experimentellen Studien sollten erste Hinweise auf charakteristische Alterungsvorgänge bei in vitro reifenden porzinen Eizellen aufzeigen.

B Literaturübersicht

1 Reifung der Oozyten

1.1 Kernreifung

1.1.1 Morphologische Aspekte

Germinalvesikelstadium

Die Kernreifung umfasst die Wiederaufnahme der Meiose im Diktyotänstadium und ihre Fortsetzung bis zur Metaphase II.

Noch vor der Geburt treten die Keimzellen in die Prophase I der Meiose ein und durchlaufen das Leptotän, Zygotän und Pachytän. Im darauffolgenden Diplotän (auch Diktyotän genannt) wird die Meiose arretiert und erst später mit Erlangen der Fortpflanzungsfähigkeit wird dieser Block aufgehoben (LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. 1987).

Während der Wachstumsphase nimmt nicht nur die Eizelle an Volumen zu, auch der Kern wird größer und aufgrund seines Erscheinungsbildes als Keimbläschen oder Germinalvesikel (GV) bezeichnet. Demzufolge wird das Stadium, in dem sich die Eizelle zu diesem Zeitpunkt befindet, Germinalvesikelstadium (GV-Stadium) genannt. Die Chromosomen liegen während des GV-Stadiums in Form von diffusen Bivalenten im Kernplasma vor (WASSARMAN und ALBERTINI 1994) und als Ausdruck einer intensiven RNA-Synthese ist mindestens ein Nukleolus ausgebildet (MOTLIK et al. 1984, CROZET 1989, WASSARMAN u.

ALBERTINI 1994).

Mit dem Abschluss der Wachstumsphase bildet sich in der Eizelle die Fähigkeit aus, die Meiose wieder aufzunehmen und das Diplotänstadium zu verlassen (meiotische Kompetenz).

Beim Schwein und den meisten anderen Spezies kompaktiert sich das Kernkörperchen mit dem Erreichen der meiotischen Kompetenz (MOTLIK u. FULKA 1986). DAGUET (1980) beobachtete, dass porzine Eizellen aus Follikeln mit einem Durchmesser von ≤ 2 mm gleichmäßiges, dekondensiertes Chromatin aufweisen, während Oozyten aus größeren Follikeln kondensiertes Chromatin an der Begrenzung des Kernkörperchens und verteilte Chromatincluster im Nukleoplasma besitzen.

Germinal vesicle breakdown (GVBD)

Im Anschluss an den gonadotropen Stimulus kommt es nach einer tierartspezifischen Latenzphase zur Auflösung des Nukleolus, zur Chromosomenkondensation, zum Abbau der Kernmembran und zum Aufbau des Spindelapparates. Der Abbau der Kernmembran wird als Germinal vesicle breakdown (GVBD) bezeichnet. MOTLIK u. FULKA (1976) haben den Prozess des GVBD an Schweineeizellen näher untersucht und ihn in folgende mikroskopisch differenzierbare Stadien eingeteilt:

GV I: Die Kernmembran und der Nukleolus sind deutlich zu erkennen. Um das Kern- körperchen befindet sich ein ring- oder hufeisenförmiger Bereich mit verdichtetem Chromatin.

GV II: Der Zellkern und das Kernkörperchen sind intakt. An der Kernmembran sind einige orceinpositive Strukturen (Chromozentren) zu erkennen.

GV III: Zellkern und Nukleolus sind erhalten. Das Chromatin stellt sich in Form schwach gefärbter Cluster und fädiger Strukturen dar.

GV IV: Der Zellkern ist intakt, aber das Kernkörperchen ist nicht mehr nachzuweisen.

Frühe Diakinese: Die Kernmembran ist nicht mehr zu erkennen. Die Bivalente befinden sich in der Region des ehemaligen Zellkerns.

Späte Diakinese: Die Chromosomen sind kondensiert und als individuelle Fragmente darstellbar.

Metaphase I

In der Metaphase I (MI) sind die maximal kondensierten Chromosomen paarweise in der Äquatorialebene des Spindelapparates angeordnet, die sich im weiteren Verlauf der Anaphase I (AI) trennen und zu den entgegengesetzten Spindelpolen gezogen werden.

Metaphase II

In der Telophase I (TI) liegen die beiden Chromosomengruppen getrennt voneinander vor und das erste Polkörperchen wird abgeschnürt. Der meiotische Zellzyklus der nun haploiden Eizelle wird in der Metaphase II (MII) erneut arretiert.

Die Kinetik der In-vitro-Kernreifung ist bei verschiedenen Spezies unterschiedlich. Eine Übersicht ist in Tabelle 1 dargestellt. Nach CHRISTMANN et al. (1994) befinden sich die meisten Eizellen des Schweins etwa 24 Stunden nach Kultivierungsbeginn in der Metaphase I, nach ca. 33 Stunden in der Anaphase I und nach etwa 46 Stunden in der Metaphase II.

Tabelle 1: Kinetik der Kernreifung in vitro bei verschiedenen Tierarten (WEHREND 1997)

MONTAG et al. (2006) beobachteten bei polarisationsmikroskopischen Untersuchungen an humanen Eizellen, dass die Sichtbarkeit des 1. Polkörpers nicht zwingend das Erreichen der MII kennzeichnet. Es kann noch für einige Stunden nach seiner Ausschleusung eine Spindelbrücke zwischen dem Polkörper und dem Zytoplasma der Eizelle beobachtet werden.

Die eigentliche MII-Spindel kann sich in manchen Fällen auch erst Stunden später bilden.

Tierart Metaphase I Anaphase I Telophase I Metaphase II Referenz

Schwein ab 24 h 32-34 h 36-48 h CHRISTMANN et

al. (1994) Rind 10-15 h 15-16 h 16-18 h 18-24 h SIRARD et al.

(1989)

Ziege 12-14 h 16-24 h PAWSHE et al.

(1994)

Maus ab 4 h ab 9 h ab 11 h 17 h DONAHUE (1968)

Pferd 16-24 h 24 – 72 h HINRICHS et al.

(1993)

1.2 Zytoplasmatische Reifung

Die zytoplasmatische Reifung umfasst alle metabolischen, biochemischen und strukturellen Modifikationen, die für den ungestörten Ablauf der Maturation, der Befruchtung und der frühembryonalen Entwicklung notwendig sind.

1.2.1 Metabolische Modifikationen

Auf Grund ihrer Bedeutung bei der Energieproduktion und beim Untergang einer Zelle stehen die Mitochondrien auch bei der Oozyte während der Tod- und Lebendentscheidungen im Zentrum der biochemischen Ereignisse (PEREZ et al. 2000, DANIAL u. KORSMEYER 2004). Die mitochondriale Aktivität scheint dabei von essentieller Bedeutung für die Spindelformation und Chromosomensegregation während der Meiose zu sein (EICHENLAUB-RITTER et al. 2004). Obwohl Eizellen im Vergleich zu anderen Zellen nur über kleine, morphologisch unreife Mitochondrien mit einem einfachen Innenaufbau und begrenzter Fähigkeit zur ATP-Synthese verfügen, ist ihre konstitutive Aktivität für den Erhalt und die frühe Embryonalentwicklung ausreichend (VAN BLERKOM et al. 2006;

DUMOLLARD et al. 2007).

Mittels einer Brilliantkresylblau-Färbung (BCB), konnten EGERSZEGI et al. (2010) bei porzinen Oozyten die Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Aktivität (G6PDH) der Mitochondrien untersuchen und daraus Rückschlüsse auf die Entwicklungsfähigkeit und den Chromatinstatus dieser Oozyten ziehen. Unreife Eizellen synthetisieren G6PDH (MANGIA u.

EPSTEIN 1975). Dieses Enzym spielt während der Wachstumsphase eine Rolle, um Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH) für die Redoxregulierung bereitzustellen. BCB wird durch die G6PDH-Aktivität farblos. Eizellen, die ihre Wachstumsphase abgeschlossen haben, zeigen eine verminderte Aktivität der G6PDH und deshalb nach einer BCB-Färbung ein blaues Zytoplasma, da sie nicht mehr in der Lage sind, diesen Farbstoff zu entfärben (ERICSSON et al. 1993).

EGERSZEGI et al. (2010) beobachteten in ihren Untersuchungen, dass zum Zeitpunkt 0 (unmittelbar nach der Gewinnung aus dem Follikel präpubertärer Schweine) in BCB gefärbten Eizellen (BCB⁺), das Chromatin überwiegend in diffuser und fibrillärer Form vorlag, während ein Drittel der farblosen Eizellen (BCB^-) kondensiertes Chromatin enthielt.

Auch hinsichtlich der IVM und In-vitro-Fertilisation (IVF) waren die BCB⁺-Eizellen den ungefärbten deutlich überlegen. Die respiratorische Aktivität der Mitochondrien von BCB⁺- Oozyten war zu Beginn der IVM signifikant höher als die von BCB^--Eizellen. Es wird angenommen, dass dieser Befund auf die höhere ATP Syntheserate der Eizelle vor der Reifung hindeutet.

EL SHOURBAGY et al. (2006) kamen zu dem Ergebnis, dass die Anzahl der Mitochondrien in Schweineeizellen großen Einfluss auf das Befruchtungsergebnis und die Embryonen- entwicklung ausübt. Da Mitochondrien während der frühen Zellteilungen nicht neugebildet werden, vermindert sich ihre Zahl in den Blastomeren früher Embryonen (bis zum Blastozystenstadium) mit jeder Teilung. Die Autoren gehen deshalb von der Annahme aus, dass nur große, ausgewachsene Eizellen, die über ausreichend Mitochondrien verfügen, sicherstellen, dass post fertilisationem genügend mtDNA-Kopien (mitochondriale DNA) vorhanden sind, um die Versorgung jeder Blastomere des Embryos zu gewährleisten.

Kleinere, noch nicht ausgewachsene Oozyten verfügen dagegen noch nicht über ausreichend Mitochondrien.

Zu vergleichbaren Ergebnissen kamen auch SPIKINGS et al. (2007), sie vermuten, dass sowohl der größte Teil der mtDNA-Replikation als auch die Expression der in diesem Zusammenhang wichtigen Transkriptions- und Replikationsfaktoren in den frühen Phasen der IVM von den Eizellen beendet wird. In einer jüngst erschienenen Studie an Schafeizellen (COTTERILL et al. 2013) konnten die Autoren belegen, dass sich die Mitochondrien während der Entwicklung vom Priomordial- (Oozytendurchmesser: ~ 30 μm) zum Graaf‘schen Follikel (Oozytendurchmesser ~ 120 μm) um mehr als den Faktor 1000 vermehren (Tab.2), während ihre Zahl und Aktivität im Verlaufe der IVM konstant blieb. Bei der in vitro gereiften Schweineeizelle im MII-Stadium variiert die durchschnittliche Mitochondrienzahl zwischen 236 392 und 425 886 (MAO et al., 2012). Dieser Größenbereich stimmt mit den Beobachtungen von EL SHOURBAGY et al. (2006) und SPIKINGS et al.

(2007) überein.

Tabelle 2: Anzahl der mtDNA-Kopien in Schaf- und Schweineeizellen aus unterschiedlichen Follikelentwicklungsstadien (COTTERILL et al. 2013^a, EL SHOURBAGY et al. 2006^b), 1 BCB⁺, ² BCB^- Eizellen,^c nach IVM

Schaf ^a

Follikelstadium Eizelldurchmesser (μm)

Anzahl der mtDNA- Kopien

Range

Primordial-

follikel 29,6 ± 1,0

605±205 74-1624

früher Primär-

follikel 40,5 + 1,2

779±256a 313–1974

Primär-

follikel 51,2 + 1,8

15 626±6637 170–57 594

Sekundär-

follikel 69,4 + 2,2

13 990±4351 3064–33 292

Präantraler

Follikel 96,6 + 1,3

71 133±14 437 23 151–131 881

Früher antraler

Follikel 118,4 + 1,4

543 632±240 415 4649–1 983 222 Graaf‘scher

Follikel 120,3 + 1,9

708 463±95 052 143 210–1 358 988 Schwein ^b

Graaf‘scher

Follikel 167 634,6 ± 20 740,4^c

Graaf‘scher

Follikel 185 004,7 ± 20 089,3^c

Graaf‘scher

Follikel¹ 222 446 ± 270 250^c

Graaf‘scher

Follikel² 115 352 ± 117052^c

1.2.2 Biochemische Modifikationen

Zu den biochemischen Modifikationen während der zytoplasmatischen Reifung gehören Veränderungen der mRNA- und der Proteinsynthese.

Transkription

Beim Schwein nimmt die RNA-Synthese der Eizellen in Follikeln mit einem Durchmesser von 2 mm im Vergleich zu kleineren Follikeln signifikant ab und erlischt vollständig in Follikeln, die ≥ 3 mm im Durchmesser sind. Für den Ablauf der Kernreifung selbst benötigt die Schweineeizelle keine Transkription (MEINECKE u. MEINECKE-TILLMANN 1993).

Da das Chromatin kondensiert, ist die DNA den Polymerasen für eine aktive Transkription nicht mehr zugängig. Während der fortschreitenden Reifung und nach der Befruchtung wird der größte Teil der gespeicherten und polyadenylierten RNA, ohne in den Translationsprozess eingeschleust worden zu sein, degradiert. Der genaue Mechanismus, der das Schicksal der maternalen mRNA während der Maturation und frühen Embryogenese steuert, ist bis heute ungeklärt (LI et al. 2010). Dabei liegt die Besonderheit in dem Phänomen begründet, dass die Eizell-mRNA drei Stoffwechselwegen folgen kann. Im Gegensatz zur mRNA in somatischen Zellen kann die maternale mRNA im inaktiven Zustand gespeichert, im aktiven Status translatiert und im nicht-translatierten Zustand degradiert werden. Dieses Merkmal erschwert und verhindert bisher die Erstellung und Analyse eines vollständigen Transkriptoms der reifenden Eizelle und des frühen Embryos (ROBERT 2010).

Die Translation der während der Oogenese synthetisierten und gespeicherten Transkripte erfolgt über die Polyadenylierung. Die ruhenden Transkripte tragen in ihrer 3'- untranslated region (3'-UTR) zwei hoch konservierte Sequenzen (AAUAAA), die die Polyadenylierung initiieren und als Adenylation control element (ACE, auch Cytoplasmic adenylation element, CPE: UUUUUAU) fungieren (EICHENLAUB-RITTER u. PESCHKE 2002).

Translation und post translationale Modifikation

Die Proteinsyntheserate der Schweineizelle sinkt bis zum Erreichen des MII-Stadiums auf etwa ein Fünftel des Ausgangswertes, den sie im GV-Stadium hatte (siehe Abb. 1).

Abb. 1: Proteinsyntheseaktivität der Schweineeizelle (TOMEK et al. 2002)

Für die Meiose werden neu synthetisierte Proteine benötigt, die u. a. den Wiedereintritt der Eizelle in die Meiose und die Aufrechterhaltung der MII gewährleisten. Drei Proteine, die in aktiver Form als Kinasen vorliegen, nehmen hierbei einen besonders hohen Stellenwert ein:

Der maturation- oder M-phase promoting factor (MPF), die mitogen-activated protein kinase (MAPK) und das Produkt des Protoonkogens c-mos (zelluläres Gegenstück des viralen Onkogens v-mos aus dem Monoley murine sarcoma virus, eine keimzellspezifische Proteinkinase, SCHMIDT et al. 2006). Die c-mos Kinase ist essenziell für die Aufrechterhaltung des MII-Stadiums in der reifen Eizelle. Zusammen mit der MAPK ist sie Bestandteil des cytostatic factors (CSF). Aktivitätsprofile dieser drei Enzyme (MPF, MAPK, c-mos) stellen ein wichtiges Kriterium der biochemischen Reifung der Oozyte dar.

Ein weiterer wichtiger biochemischer Parameter der zytoplasmatischen Reifung ist die endogene Generierung einer ausreichend hohen Glutathionkonzentration (GSH). Bei der Eizelle von Rind und Schwein konnte eindrucksvoll demonstriert werden, dass GSH für den Schutz der meiotischen Spindel gegen oxidativen Stress und für die Entwicklung des männlichen Vorkerns von herausragender Bedeutung ist (LUBERDA 2005, YOSHIDA 1993).

1.2.3 Strukturelle Modifikationen

Zu den auffälligsten strukturellen Modifikationen wärend der zytoplasmatischen Reifung gehört die Migration der kortikalen Granula (cortical granules, CG) in die unmittelbare Nähe des Oolemma.

Die CG enthält spezielle Enzyme und Glykoproteine, die nach der Penetration des Spermiums durch Exozytose in den perivitellinen Spalt freigesetzt werden und die Proteinstruktur der Zona pellucida verändern (Polyspermieblock). Die CG wird vom Golgi-Apparat und vom rauhen endoplasmatischen Retikulum bereitgestellt (GURAYA 1982), migriert zur Eizellperipherie und verteilt sich beim Schwein in einem 6–10 μm großen kortikalen Bereich unterhalb des Oolemma (WANG et al. 1997). In folgender Tabelle (Tab. 3) sind die Verteilungen von CG in porzinen Oozyten während der IVM aufgezeigt.

Tabelle 3: Verteilung der kortikalen Granula während der In-vitro-Reifung der Schweineeizelle (WANG et al. 1997)

Anzahl der kortikalen Granula pro 100 μm² Kortex IVM Dauer

(h)

Germinal Vesicle

Metaphase I Telophase I Metaphase II Degeneriert

0 33,8 ± 7,3 - - - -

26 33,5 ± 5,7^b 49,6 ± 9,6^c,A 45,3^c 53,2^c,A - 46 35,3 ± 5,1^b 45,3 ±4,5^c,AB - 45,7 ± 6,2^c,A - 46

ohne Kumulus- zellen

33,3 ± 1,0 37,8 ± 6,9^AB - 34,8 ± 7,5^B 33,0 ±12,3

72 - 36,0 ± 2,8^B - 34,9 ± 10,6^B 35,1 ± 8,2

b,c P≤ 0,005 innerhalb derselben Zeile, ^A,B P≤ 0,05 innerhalb derselben Spalte

Die Wanderung der CG unter das Oolemma ist 26 h nach IVM-Beginn (MI Stadium der Eizelle) vollendet. In der zweiten Hälfte der Kultivierungszeit (bis 46 h) transformiert sich die CG von einer hellen zu einer dunklen Form (WANG et al. 1997). Es ist bis heute unbekannt, ob die Anzahl der CG einen Grad der zytoplasmatischen Reife oder die unmittelbare Fähigkeit zur Blockierung der Polyspermie reflektiert (WANG et al. 1997).

1.3 Regulatoren des meiotischen Zellzyklus

1.3.1 M-phase promoting factor (MPF)

Durch Grundlagenforschung an Hefepilzen, Seeigel- und Froscheizellen, wurde die cyclin- dependent kinase 1 (Cdk 1, auch cell-division-cycle-Gen2 homolog) entdeckt (DORÉE und HUNT, 2002). Die am Thr¹⁴ und Tyr¹⁵ phosphorylierte und dadurch inaktivierte Cdk 1 (auch prä-MPF genannt, NURSE, 1990) bildet zusammen mit ihrer regulatorischen Untereinheit, dem Cyclin B1, ein Heterodimer (LABBÉ et al. 1989), das in der Interphase des Zellzyklus angereichert wird. Durch Dephosphorylierung der Thr¹⁴- und Tyr¹⁵-Reste und Phosphorylierung des Cyclin B1 wird die CDK1 aktiviert (LEE et al. 1992). Diese aktive Form wird als Maturation promoting factor (MPF, auch M-phase promoting factor) bezeichnet (MASUI u. MARKERT 1971).

Die inaktivierende Phosphorylierung der porzinen Cdk1 wird durch die Wee1B Kinase (SHIMAOKA et al. 2009) und die aktivierende Dephosphorylierung durch die Cdc25C Phosphatase (DAI et al. 2000) vollzogen. Bei der Wiederaufnahme der Meiose nach dem ovulationsauslösenden LH-Signal kommt es in der Oozyte gleichzeitig zu einer Dephosphorylierung der Cdk1 und zu einer vermehrten Assoziation der Cdk1 mit Cyclin B1.

Dies führt zu einer schrittweisen Zunahme der Cdk1-Aktiviät, die die Chromosomenkondensation und die Organisation der MI-Spindel unterstützt (POMERANTZ u. DEKEL 2012).

Während der GVBD und die Organisation der MI-Spindel eine Zunahme der Cdk1-Aktivität benötigen, hängt der Übergang von der MI zur AI von einer Inaktivierung der Cdk1 ab. Die Eizelle verlässt die M-Phase, indem sie das Cyclin B1 partiell proteosomal degradiert (über den ubiquinin proteasome pathway, UPP, HUO et al., 2004b) und dadurch die Cdk1-Aktivität drastisch reduziert (MURRAY et al. 1989). Im Gegensatz zur Mitose bleibt aber in der Eizelle ein Teil des Cyclin B1-pools erhalten, wird nach der Abschnürung des ersten Polkörpers reaktiviert und treibt die Oozyte in die MII (LEDAN et al. 2001).

Die Degradation mitotischer und meiotischer Proteine wird durch die E3 Ubiqutin-Ligase des Anaphase-promoting comlex/Cyclosome (APC/C) determiniert (SUDAKIN et al. 1995).

Während der ersten meiotischen Teilung vermittelt das Lysin 11 (K11) den proteosomalen Abbau (POMERANTZ et al. 2012). Die APC/C Aktivität wird über Aktivatoren und Inhibitoren geregelt, wobei der Bindungswechsel zwischen dem Koaktivator Cdc 20 (cell division cycle protein 20) und Cdh 1 (cell division cycle protein 20 homolog 1) die

Substratspezifität bestimmt (KRAFT et al. 2006). So ist z. B. der APC/C^{Cdh 1} während der Prometaphase I aktiv, hält dadurch die Cyclin B1-Konzentration niedrig und verhindert auf diese Art und Weise eine vorzeitige Aktivierung der Cdk 1 , die zu einer unzeitgemäßen Chromosomenkondensation führen würde (REIS et al. 2007). Mit dem Erreichen der MI wird das Cdh 1 gegen Cdc 20 ausgetauscht und der APC/C^{Cdc 20} markiert nun Cyclin B1 und Securin, und erlaubt so die Ausschleusung des ersten Polkörpers (niedrige Cdk1- und Securin- Konzentrationen. Securin inhibiert die Separase. Die Separase ihrerseits baut das Cohäsin, das die Homologen zusammenhält ab und erlaubt so die Trennung der homologen Chromosomen in der AI).

Bei der Schweineeizelle liegen bisher nur begrenzte Beobachtungen über den Wirkmechanismus des Protein-turnover vor. Die 20S-Untereinheit des Proteasoms akkumuliert im GV der porzinen Oozyte (HUO et al. 2004a). Diese Beobachtung und die weiteren experimentellen Befunde von HUO et al. (2004a) und YAMAMURO et al. (2008) belegen die Beteiligung der proteosomalen Degradierung von Zellzyklusproteinen in der Schweineeizelle sowohl bei der Aufrechterhaltung des GV als auch beim GVBD. Im weiteren Verlauf der Maturation konnten die Autoren (HUO et al. 2004a, YAMAMURO et al. 2008) durch Inhibitionsstudien demonstrieren, dass der proteosomale Proteinabbau beim MI-AI Übergang, der Polkörperausschleusung, beim Verlassen der MII, der Aktivierung und den frühembryonalen Furchungen eine Rolle spielt. Diese experimentellen Befunde deuten darauf hin, dass der gezielte Proteinabbau auch bei der Schweineeizelle integraler Bestandteil der meiotischen Zellzyklusregulation ist

1.3.2 Mitogen-activated protein kinase (MAPK)

Während der Wachstumsphase der Oozyte synthetisiert sie den vollständigen Besatz an MAPK-Molekülen, sodass sie lediglich über die aktivierende Phospho- und inaktivierende Dephosphorylierung das Aktivitätsniveau dieses Enzyms bestimmt (LIANG et al. 2007). Der MAPK-Signaltransduktionsweg besteht aus einer MAPK Kinase Kinase (MAP3K), einer MAP Kinase-ERK (extracellular signal-regulated) Kinase (MEK) und einer ERK Kinase. Die MAP Kinase-Familie gehört zu den Serin/Threonin spezifischen Proteinkinasen. Ihre

(ROBINSON und COBB, 1997; YE et al. 2003). In Eizellen operiert der MAPK- Signaltransduktionsweg während der Wiederaufnahme der Meiose unter der Regie von MOS, einer eizellspezifischen MAP3K, die MEK1/2 und ERK1/2 aktiviert (POMERANTZ u.

DEKEL 2012).

Bei der Schweineeizelle scheint der MOS-induzierte Signalweg jedoch über die Aktivierung des MPF zum GVBD zu führen (OHASHI et al. 2003, LIANG et al. 2007). Allerdings weisen bei dieser Tierart die meisten Resultate daraufhin, dass die MAPK erst nach dem GVBD, bei der Organisation der MI-Spindel größere Bedeutung erlangt. Diese Vermutung wird u. a.

durch die ERK1/2- Aktivitätskurve während der Eizellreifung belegt, die mit dem GVBD ansteigt und aufgrund der konstitutiven Phosphorylierung einen gleichbleibenden Aktivitätsspiegel bis zur MII aufweist (INOUE et al. 1995, YE et al. 2003). Erst nach der Befruchtung kommt es zur Inaktivierung (FAN u. SUN 2004).

Abb. 2: Verlauf der MAPK-Aktivität in der Schweineeizelle (mod. nach FAN u. SUN 2004).

GV: germinal vesicle, GVBD: germinal vesicle breakdown, M I: metaphase I, M II:

metaphase II, PN: pronucleus

Die MAPK-Aktivität steigt 18 Stunden nach dem Kultivierungsbeginn an, erreicht ein gleichbleibend hohes Niveau und sinkt erst 14 Stunden nach der Befruchtung korrespondierend zur Vorkernbildung ab (FAN u. SUN, 2004).

Bei der Maus und beim Schwein liegen Hinweise auf eine Beteiligung der MAPK bei der funktionellen Organisation der MI-Spindel vor (FAN u. SUN, 2004). Die MAPK kann immunhistologisch in der Mauseizelle an den Spindel-Mikrotubuli, besonders reichlich im Mikrotubulus-Organisationszentrum (MTOC) am Pol der Spindel und im Zytoplasma nachgewiesen werden. Bei der MI-Spindel in der porzinen Eizelle, die über keine MTOC verfügt (KIM et al. 1996), verteilt sich die MAPK während der Metaphase in der Spindel bis zu den Polen und mit dem Einsetzen der AI migriert sie zur Spindelmitte, wo sie auch während der TI verbleibt. Mit dem Erreichen der MII formt die MAPK eine ringähnliche Struktur und behält ihre Lokalisation zwischen der maternalen und der Polkörper- Chromatingruppe (LEE et al. 2000). Ihre genaue Funktion beim Spindelaufbau in der MI und ihr exakter molekularer Partner in dieser Funktion bleiben bis heute unbekannt.

Die MAPK spielt auch bei der Arretierung des meiotischen Zellzyklus in der MII eine wichtige Rolle, die allerdings beim Schwein auf molekularer Ebene noch nicht aufgeklärt ist.

Aus diesem Grund werden, wenn für das Schwein keine Daten vorliegen, die Reaktionsschritte an Hand experimenteller Daten von kleinen Versuchstieren (Frosch, Maus, Kaninchen) erläutert.

Das bedeutendste Substrat der MAPK ist die ribosomale S6 Proteinkinase (p90rsk oder MAPK-activated protein kinase-1), deren Aktivitätsprofil und Lokalisation in der porzinen Eizelle (FAN et al. 2003) parallel mit der MAPK verläuft. TATEMOTO und MUTO (2001) konnten durch die Hemmung der MAPK in porzinen MII-Eizellen bei etwa einem Viertel der Oozyten eine Vorkernbildung auslösen und so zeigen, dass der CSF (cytostatic factor, MASUI und MARKERT, 1971) auch beim Schwein über die Aktivität der MAPK aufrecht erhalten wird. Nachdem bereits 1993 HACCARD et al. demonstrieren konnten, dass der MOS-MEK-MAPK Weg zur Arretierung der Blastomerenteilung in der M-Phase führt (Frosch) und so die Zugehörigkeit dieser Kinasen zum CSF belegt wurde, erweiterten die Experimente von BHATT u. FERRELL (1999) sowie von GROSS et al. (1999) den Signalweg um die p90rsk (Frosch). Weiterführende Untersuchungen stellten dann klar, dass die p90rsk spezifisch den APC/C inhibiert und so die Cyclin B1-Degradierung blockiert. Das hat zur Folge, dass die MPF-Aktivität in der MII unverändert hoch bleibt und so das Fortschreiten des Zellzyklus verhindert wird. Das spezifische Verbindungsglied zwischen der p90rsk und dem APC/C wurde beim Frosch als Emi2 Protein (endogenous meiotic inhibitor 2, Emi2) identifiziert (SCHMIDT et al. 2006, TUNG et al. 2005). Die p90rsk phosporyliert das Emi2-Protein direkt, das daraufhin Phosphatase 2A-Moleküle (PP2A) rekrutiert, die das

dieser beiden Phosphorreste erlaubt jetzt eine unmittelbare Interaktion zwischen Emi2 und dem APC/C, der so inhibiert wird (siehe Abb. 3). Die durch die p90rsk induzierte PP2A Rekrutierung führt auch zur Dephosphorylierung eines Resteclusters am C-terminalen Ende des Emi2-Proteins mit der Folge, dass Emi2 stabilisiert und die Assoziation an den APC/C gefestigt wird. Beide Reaktionen zusammen inaktivieren den APC/C weitgehend, so dass kaum Cyclin B1 degradiert und die MPF-Aktivität hoch bleibt.

Da die Cyclin B1-Synthese im MII-Stadium kontinuierlich fortschreitet, droht bei einer vollständigen Hemmung der Cyclin B1-Degradierung eine Akkumulation. Hohe Cyclin B1- Spiegel in der Eizelle bergen jedoch die Gefahr in sich, dass die Aktivierung nach der Befruchtung fehlschlägt, weil die abrupte MPF-Inaktivierung ausbleibt. Der aktive MPF (Cdk1-Cyclin B1) ist jedoch in der Lage die C-terminalen Reste (T545, T551) zu phosphorylieren und so die Interaktion zwischen Emi2 und dem APC/C zu vermindern, woraufhin die abdissoziierten APC/C-Einheiten mit der Degradierung von Cyclin B1 beginnen und die drohende Akkumulation während des langen MII-Arrests verhindern.

Ein zweites Sicherungssystem liegt in der MPF-vermittelten Phosphorylierung eines Clusters von Resten im N-terminalen Emi2-Bereich, der zu einer Halbwertzeit-Verkürzung des Emi2- Proteins führt. Auf diese Weise führen ansteigende Cyclin B1-Konzenttrationen zu vermehrter MPF-Aktivität, die ihrerseits die Emi2-Konzentration über die verkürzte Halbwertzeit absinken lassen und so dafür Sorge tragen, dass mehr APC/C-Einheiten für den Cyclin B1-Abbau zur Verfügung stehen. Mit dieser fein austarierten Kontrolle der Emi2 Stabilität und Aktivität, die über MPF und PP2A gesteuert wird, ist die homeostatische Kontrolle der Cyclin B1-Konzentrationen möglich, so dass einerseits die längere CSF- Stabilität und andererseits die plötzliche CSF-Inaktivierung möglich wird (WU u.

KORNBLUTH 2008).

Abb. 3: Die MAPK bei der Regulierung des M II-Arrests in der Eizelle (WU u.

KORNBLUTH 2008). PP2A: Phosphatase 2A, APC/C: Anaphase-promoting complex/Cyclosome, Cdc2: cell-division-cycle-Gen 2, ZBR: zinc-binding region, Emi2:

endogenous-meiotic-inhibitor 2

In der MII-Eizelle aktiviert die MAPK die p90rsk, die Emi2 phosphoryliert. Daraufhin rekrutiert Emi2 Phosphatase2A Moleküle, (PP2A) die das Emi2-Protein am C-terminalen Ende dephosphorylieren und so die Assoziation zum APC/C stabilisieren. Diese Emi2- APP/C-Interaktion inaktiviert den APC/C, so dass kein Cyclin B1 abgebaut werden kann. Der CSF ist aktiv, die Eizelle verbleibt im MII-Stadium. Die PP2A-Rekrutierung hält auch die Reste im C-terminalen Ende dephosphoryliert und stabilisiert so die Emi2-Halbwertzeit. Da Cyclin B1 kontinuierlich synthetisiert wird, werden immer wieder kleine Mengen aktiven MPFs gebildet, die über ihre Phosphorylierung von Emi2 für die Aktivierung des APC/C sorgen, der Cyclin B1 degradiert (siehe auch Abb. 3) (WU u. KORNBLUTH 2008).

2 Alterung

Alterung ist ein universeller, graduell fortschreitender, akkumulativ verlaufender, irreversibler Prozess, dessen Ursache bei höher entwickelten Lebewesen bisher nicht geklärt werden konnte (YIN u. CHEN 2005). Es existieren zahlreiche Theorien zum Alterungsprozess, die sich jeweils auf verschiedene Ebenen des Organismus beziehen. Ausgehend vom Gesamtorganismus befassen sie sich auch mit der Organ-, Zell- und molekularen Alterung.

stehen, ist Alterung als ein generelles Resultat von Aktivitäten verschiedener Gennetzwerke zu verstehen. Diese steuern die regulierenden, kontrollierenden, abwehrenden und reparierenden Zellfunktionen vor allem bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und des Metabolismus. Dabei ist allgemein akzeptiert, dass der Alterungsprozess von einem Zusammenspiel genetischer und erworbener Faktoren diktiert wird (WARNER 2005, YIN u.

CHEN 2005).

2.1 Ovarielle Alterung

Bei weiblichen Säugetieren existiert bereits von der Geburt an ein endgültiger, nicht mehr vermehr- oder regenerierbarer Vorrat an follikulären Eizellen in den Eierstöcken. Dieser Vorrat ist ausreichend, um den Bedarf an Oozyten während des fortpflanzungsfähigen Lebensabschnitts zu decken. Unmittelbar nach der Etablierung dieses Follikelpools in den fetalen Ovarien vermindern apoptotische Prozesse kontinuierlich die Follikelzahl (VAN DEN HURK u. ZHAO 2005). Beim Menschen unterschreitet die Follikelpoolgröße in der vierten oder fünften Lebensdekade einen kritischen Schwellenwert, der zum Sistieren der Ovulation und zum Einsetzen der Menopause führt (DE BRUIN et al. 2004).

Zeitgleich zur quantitativen Abnahme des Follikelpools findet auch ein altersabhängiger qualitativer Verlust der ovulierten Oozyten statt. Dies wird auf eine Zunahme von Spindelanomalien zurückgeführt, die zu gehäufter meiotischer nondisjunction mit einer gesteigerten Rate von Aneuploidien in den resultierenden Embryonen führt (TE VELDE u.

PEARSON 2002, VON OTTE 2007). Jüngste Studien bestätigen diese Annahmen. So zeigten umfangreiche Array-CGH-Untersuchungen (Array-Comparative-Genomic-Hybridization) am ersten Polkörper von Eizellen, die von Frauen in fortgeschrittenem Alter gewonnen wurden, dass weit mehr als die Hälfte der Oozyten aneuploid waren (FRAGOULI et al. 2011, HANDYSIDE 2012). Die Ursache für die mit zunehmendem Alter stark ansteigende Aneuploidierate liegt wahrscheinlich in der Unfähigkeit der Oozyte, bestimmte meiotische Cohesinproteine, die die Chromatiden zusammenhalten, im Laufe des Lebens zu ersetzen (JESSBERGER 2010). Die herausragende Bedeutung dieser Cohesinproteine als Verursacher der altersbedingten Zunahme der Chromosomenfragilität, liegt in ihrer frühen Synthese. Sie werden in der meiotischen S-Phase, unmittelbar nach dem Ende der mitotischen Vermehrungsphase der Oogonien im fetalen Ovar synthetisiert und nicht wieder ersetzt. Die chronologisch fortschreitende allmähliche Verminderung des Proteinvorrats führt zu dem

steilen Anstieg aneuploider Oozyten bei Frauen im fortgeschrittenen Alter (EICHENLAUB- RITTER 2012).

Als weitere Faktoren für die reduzierte Oozytenqualität von reproduktiv älteren Frauen werden die Akkumulation von Zellschäden durch oxidativen Stress (HARMAN 1956, TARIN 1995), die reduzierte Sauerstoffkonzentration in der Follikelflüssigkeit, hervorgerufen durch die zunehmend beeinträchtigte Mikrozirkulation im perifollikulären Areal des dominanten Follikels (GAULDEN 1992, VAN BLERKOM et al. 1997) und die progressiv fortschreitende Häufung von Fehlfunktionen in den Granulosazellen (WARBURTON 1989) verantwortlich gemacht.

2.2 Oozytenalterung

Wird in der Eizelle die Reifung induziert und bleibt die zeitgerechte Ovulation oder Befruchtung aus, so beginnt sie zu altern. Im Wesentlichen führen folgende Bedingungen zur Alterung:

I) Intrafollikuäre Eizellalterung in vivo (bei verzögerter Ovulation)

II) Eizellalterung in vivo [post ovulationem, (p.ov.) bei verzögerter Befruchtung]

III) Eizellalterung in vitro (bei einer verlängerten Reifungsphase)

I) Intrafollikuäre Eizellalterung in vivo (bei verzögerter Ovulation)

Die präovulatorische Eizellalterung ist in den 60iger Jahren des vergangenen Jahrhunderts sowohl beim Afrikanischen Krallenfrosch (Xenopus leavis) als auch bei der Ratte als Ursache für Entwicklungs- und möglicherweise auch für meiotische chromosomale Verteilungsfehler erkannt worden (MIKAMO u. HAMAGUCHI 1975). Dieser Alterungstyp entwickelt sich im Gegensatz zur post ovulatorischen Eizellalterung im GV-Stadium (Xenopus: MIKAMO 1968;

Ratte: FREEMAN et al. 1970) und kann die erste und zweite Reifeteilung sowie den Befruchtungs- und die frühen embryonalen Entwicklungsprozesse beeinträchtigen.

Auch jüngere experimentelle Studien bestätigen und vertiefen die oben genannten Beobachtungen. So konnte in der nativen Mauseizelle mit Hilfe des DNA- Fluoreszenzfarbstoffes Hoechst 33342 die Chromatinkontur während der intrafollikulären

Entwicklungskompetenz, so stellen sie ihre Transkription ein und ihr Chromatin organisiert sich im GV um den Nukleolus herum zum sogenannten surrounded nucleolus (SN). Werden solche SN-Eizellen deutlich nach dem Erreichen der Reifungs- und Entwicklungskompetenz (präovulatorische Alterung) in vitro maturiert, dann weisen sie erheblich mehr Aneuploidien auf, als Eizellen, die zeitgerecht nach dem Erreichen des SN-Status isoliert und in vitro gereift wurden (ZUCCOTTI et al. 1998). Dies weist daraufhin, dass eine verlängerte Phase der Transkriptionsunterdrückung vor der Reifungsinitiierung mit dem zeitlichen Schema der Genexpression, der Spindelaktivität und dem Verhalten der Chromosomen in der Eizelle interferieren kann (EICHENLAUB-RITTER 2012).

II) Eizellalterung in vivo [post ovulationem, (p.ov.) bei verzögerter Befruchtung]

In frühen experimentellen Studien konnte die befruchtungsfähige Phase der Eizelle nach der Spontanovulation beim Meerschweinchen auf ca. 12-24 h fokussiert werden (BLANDAU 1949). Neuere Studien haben allerdings gezeigt, dass die Oozyte bei vielen Säugetieren wohl über 24 h p. ov. befruchtungs- (penetrierbar und aktivierbar), aber nicht entwicklungsfähig bleibt (AUSTIN 1970, BONHOFF u. ADAMS 1985). Heute wird eine 24stündige Zeitspanne nach der Ovulation als deutlich zu lang angesehen und die Variabilität der Eizellqualität beim selben Tier in verschiedenen Brunstzyklen, die natürlich auch jeweils eine variable Zeitspanne der vollständigen Befruchtungsfähigkeit nach sich zieht, wesentlich höher bewertet (HUNTER 2003). Für die meisten Plazentatiere (Eutheria) liegen realistische Schätzungen für eine vollständig erhaltenene post ovulatorische Befruchtungsfähigkeit von 6- 8 h vor (FISSORE et al. 2002, HUNTER 2003).

III) Eizellalterung in vitro (bei einer verlängerten Reifungsphase)

Bei der Erforschung der Mechanismen der Eizellalterung spielten neben den Tierversuchen auch experimentelle In-vitro-Ansätze zur Modellierung der zellulären Abläufe eine bedeutende Rolle. Hierbei musste zunächst geklärt werden, ob aus den In-vitro- Beobachtungen realistische Schlussfolgerungen für die In-vivo-Abläufe gezogen werden konnten. Auf morphologischer Ebene kamen bereits TAN (1985, 1988) und WEBB et al.

(1986) zu der eindeutigen Aussage, dass die Alterungsprozesse in der Eizelle in vivo und in vitro äquivalent verlaufen. Jüngere Untersuchungen schränken diese eher generelle Aussage jedoch ein, indem sie darauf hinweisen, dass, im Gegensatz zur In-vitro-Situation, die in vivo

gealterten Eizellen größere Spindeln aufweisen können. (ABBOTT et al. 1998). Zudem stellten ADENOT et al. (1997) bei einem Vergleich von in vivo und in vitro gealterten Oozyten bei den experimentell in vitro gealterten Eizellen fehlerhaft orientierte Spindeln fest, die sie unter In-vivo-Bedingungen nicht beobachten konnten.

Neben diesen morphologischen und feinmorphologischen Feststellungen erfahren unter klinischen Gesichtspunkten funktionelle Parameter eine besondere Gewichtung, da die Befruchtungs- und Entwicklungsfähigkeit der alternden Eizelle hier im Vordergrund des Interesses steht. Unter Berücksichtigung dieses Aspektes gelangten bereits MIAO et al.

(2009) in einer Übersichtsarbeit und in jüngster Vergangenheit auch TATONE (2011) in einer experimentellen Studie an Mauseizellen zu der übereinstimmenden Aussage, dass die funktionellen Parameter sich unter In-vivo- und In-vitro-Bedingungen äquivalent verändern.

Daraus kann gefolgert werden, dass die experimentelle In-vitro-Alterung wertvolle Hinweise auf die in vivo ablaufenden Mechanismen der Eizellalterung gibt.

2.2.1 Metabolische Modifikation während der Eizellalterung

Die in Oozyten ohnehin kaum differenzierten Mitochondrien verlieren im Laufe der Alterung weitere Christae und büßen deshalb auch einen Teil ihrer ATP-Bildungseffektivität ein (KUJJO u. PEREZ 2012). Unter klinischen Gesichtspunkten korreliert die beeinträchtigte Mitochondrienfunktion der Eizelle mit der deutlichen Reduktion erfolgreicher IVF-Zyklen reproduktiv alter Frauen, dem Mutationsfrequenzanstieg in den Eizellmitochondrien, der Abnahme der Mitochondrienaktivität, der zunehmenden Ineffektivität der ATP-Produktion und den Veränderungen der mitochondrialen Ca²⁺-Homöostase (KUJJO u. PEREZ 2012).

Eine der aktuell bestehenden Hypothesen geht davon aus, dass die Verminderung der ATP- Bereitstellung in der alternden Eizelle zu einer Beeinträchtigung der Enzymsysteme, die die Cohäsinstabilität gewährleisten, führt und somit zu der erhöhten Aneuploidierate in alten Eizellen beiträgt (KUJJO u. PEREZ 2012). Bei einer kritischen Bewertung der oben genannten Korrelationen und Hypothesen muss jedoch betont werden, dass ein direkter oder indirekter kausaler Zusammenhang zwischen der metabolischen Beeinträchtigung der Mitochondrien in der alternden Eizelle und den daraus folgenden pathophysiologischen Konsequenzen bis heute nicht eindeutig belegt sind.

Im Hinblick auf die ursächliche Beteiligung des Lipidstoffwechsels beim Alterungsprozess der Eizelle ist jüngst eine interessante Hypothese formuliert worden (KUJJO u. PEREZ 2012). Schweineeizellen speichern etwa zwei- bis dreimal so viel Fettsäuren wie Schaf- oder Rindereizellen, wobei Linolsäure nach Palmitin-, Olein- und Stearinsäure die vierthäufigste Vertreterin der Fettsäuren ist (McEVOY et al. 2000). Ceramide sind eine Untergruppe der Sphingolipide, die zu den Lipiden gehören. Ein wichtiges Ceramid unter zahlreichen anderen ist Ceramid I, ein Ester der Linolsäure, es könnte Bedeutung bei der Veränderung des mitochondrialen Metabolismus im Zuge des Alterungsprozesses haben. Exogenes Ceramid akkumuliert in den Mitochondrien der Oozyten von jungen Mäusen und verhindert hier die Einleitung der Apoptose. Im Gegensatz hierzu erreicht das exogen zugesetzte Ceramid die Mitochondrien von Eizellen alter Mäuse nicht, sammelt sich im Ooplasma an und löst die Apoptose aus (PEREZ et al. 2005, PEREZ 2011 unveröffentlicht, zit. nach KUJJO u. PEREZ 2012). Die Arbeitsgruppe um PEREZ hat jüngst ein Model entworfen, in dem ein Transportprotein von Ceramid (ceramide transport protein, CERT) eine Schlüsselstellung bei der Beeinträchtigung der Mitochondrienfunktion in alten Eizellen zukommt. Das CERT transportiert in jungen Eizellen das Ceramid vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgikomplex, um hier Sphingomyelin zu produzieren. In alten Eizellen wird das CERT down reguliert, mit der Folge, dass Ceramid im endoplasmatischen Retikulum akkumuliert und über den dadurch verursachten Stress die Apoptose eingeleitet wird. Darüber hinaus können durch die reduzierte Transportleistung nicht genügend Ceramidpräkursoren in die Mitochondrien transportiert werden, die ihrerseits an Ceramid verarmen und so in ihrer Morphologie und Funktion beeinträchtigt werden (KUJJO u. PEREZ 2012).

Obwohl die molekularen Zusammenhänge des mitochondrialen Funktionsverlustes während der Alterung noch genauer erforscht werden müssen, deuten auch die klinischen Erfahrungen auf eine Funktionsbeeinträchtigung der Mitochondrien im Verlaufe der Alterung. So führt z. B. eine drei- beziehungsweise fünftägige Kultivierung humaner MII-Eizellen zu einer 40 %- beziehungsweise 70 %igen Reduktion des zytoplasmatischen ATP-Gehaltes im Vergleich zu den während des ersten Kultivierungstages gemessenen Werten. Dies lässt auf eine erhebliche Beeinträchtigung der bioenergetischen Versorgung schließen (VAN BLERKOM et al. 1995).

2.2.2 Biochemische Modifikationen während der Eizellalterung

2.2.2.1 MPF

Ein Überschreiten der physiologischen Reifungsdauer in vitro (36-42 h) führt zu einer Reduktion der MPF-Aktivität und zu einer Zunahme des inaktiven Prä-MPF in der alternden Eizelle (KIKUCHI et al. 1995, 1999). Da die Cdk1-Menge in der Schweineeizelle während der Maturation unverändert bleibt (NAITO et al. 1995) und der Prä-MPF und MPF in MII- Eizellen in äquimolaren Mengen vorliegt, ist die Zunahme der Prä-MPF-Moleküle auf eine vermehrte inaktivierende Phosphorylierung der T545- und T551-Reste an der Cdk1- Untereinheit des MPF-Moleküls zurückzuführen, so dass dessen relativer Anteil zunimmt und der Anteil des aktiven dephosphorylierten MPF abnimmt. Diese Art der Reduktion des MPF steht im Gegensatz zur Reduktion des MPF bei der Aktivierung (Befruchtung oder Parthenogenese) der Eizelle, bei der die Cyclin B1-Degradierung im Vordergrund steht (KIKUCHI et al. 1999, 2000).

Die Korrelation zwischen einem verminderten MPF-Gehalt in porzinen Eizellen und einer Zunahme der spontanen Aktivierbarkeit zeigte sich auch bei einer experimentellen Reduktion des MPF-Gehalts in Oozyten, die nur 48 h lang kultiviert wurden (KIKUCHI et al. 2000).

2.2.2.2 MAPK

Die MAPK-Aktivität nimmt während einer dreitägigen Kultivierung von Schweineeizellen in den letzten 12 h der Inkubation auf etwa die Hälfte des Ausgangswertes ab (MA et al. 2005).

Eine ähnlich drastische Reduktion erfuhren das spindle checkpoint Protein MAD2 (mitotic arrest deficient 2) und das anti-apoptotische Protein BCL2 (B-cell lymphoma 2), während Tubulin und das Centromer-Protein B keine Veränderung im Laufe der Alterung aufwiesen.

Die Autoren weisen darauf hin, dass die geringen MAPK-Aktivitäten in den gealterten Eizellen mit dem Anstieg der Fragmentations- und der Apoptoserate korrelierten. Da geringe MAPK-Enzymaktivitäten zu einer beschleunigten BCL2-Degradierung führen, vermuten die Autoren hier den Grund der ansteigenden Apoptoserate.

2.2.2.3 Wiederherstellung des MPF- und MAPK-pools

Schweineeizellen, die mit Koffein inkubiert werden, zeigen eine gesteigerte MPF-Aktivität und eine verringerte parthenogenetische Aktivierbarkeit. Es wird vermutet, dass Koffein (C₈H₁₀N₄O₂) die Myt1-/Wee1-Kinase blockiert und so die inaktivierende Phosphorylierung an den T545- und T551-Resten der Cdk1 aufrecht erhält. Dadurch steigt der Gehalt an Prä-MPF und an freien unphosphorylierten Cdk1-Untereinheiten an, so dass die Eizelle ihren MPF- Gehalt lange konstant halten kann (KIKUCHI et al. 2000, 2002; SMYTHE u. NEWPORT 1992). LEE u. CAMPBELL (2006) bestätigten, dass Koffein bovine Eizellen vor einen Abfall der MPF- und MAPK-Aktivität schützen kann.

Werden dagegen porzine Eizellen mit Vanadat behandelt, einem PP2A-Inhibitor (LEIS u.

KAPLAN 1982), so sinkt die MPF-Aktivität schnell ab (KIKUCHI et al. 2000, 2002). Es wird angenommen, dass Vanadat die Cdc25 hemmt, die die Cdk1-Untereinheit des MPF aktivierend dephosphoryliert und so der Pool an aktiven MPF-Molekülen in der Eizelle schnell erschöpft ist.

2.2.2.4 Calcium (Ca

)

Während der Befruchtung von gealterten Mäuseeizellen ist die Amplitude der Calcium- Oszillation signifikant kleiner als die in jungen Eizellen (IGARASHI et al. 1997).

In Bezug auf die Apoptosevorgänge scheint es so, als sei das Gleichgewicht zwischen anti- und proapoptotischen Proteinen in gealterten Oozyten verloren oder gestört, mit der Konsequenz, dass das Calcium-Signal (Ca²⁺) sich während der Befruchtung in ein apoptoseinduzierendes Signal umwandelt (FISSORE et al. 2002, GORDO et al. 2002).

Sowohl die Menge an Bcl-2-mRNA und Protein, als auch der Gehalt an ATP sind in gealterten Eizellen reduziert, was wahrscheinlich einen negativen Einfluss auf die Funktion der Calciumpumpen ausübt und eine gestörte Ca²⁺-Freisetzung induziert (PEREZ u. TILLY 1997, GORDO et al. 2002, MA et al. 2005, TATONE et al. 2006, VERBERT et al. 2008).

3 Aktivierung der Eizelle

3.1 Physiologie

Die Aktivierung der Eizelle wird bei den Säugetieren durch das Eindringen des Spermiums ausgelöst, das einen plötzlichen Konzentrationsanstieg freier Ca²⁺-Ionen im Zytosol verursacht (STRICKER 1999). Dabei folgt einem initialen Calciumpeak eine Reihe wiederkehrende, mehrere Stunden andauernde, kleinere Anstiege (NAKADA u. MIZUNO 1998). Diese, auch als Calcium-Oszillationen bezeichneten Calciumschübe, verebben beim Schwein und Rind mit der Bildung des männlichen und weiblichen Vorkerns beziehungsweise mit dem Eintritt in den ersten mitotischen Zellzyklus (SUN et al. 1992, MIYAZAKI et al. 1993, SWANN u. OZIL 1994, NAKADA et al. 1995, JONES et al. 1998).

Calcium agiert hierbei als wichtiger Botenstoff auf eine Reihe von Proteinen, die den Zellzyklus kontrollieren. Der Peak entsteht am Ort des Spermieneintritts (MIYAZAKI et al.

1986, WHITAKER 2006) und die darauf folgenden Oszillationen erscheinen in der Rindenregion (DEGUCHI et al. 2000). Die Frequenz ist abhängig von der Tierart, dem Grad an Polyspermie und der Methode der Calciummessung (SWANN u. OZIL 1994). Der basale Calciumspiegel einer in MII ovulierten Eizelle beträgt etwa 100 nmol 1^1-. Die Amplitude des Calciumpeaks kann eine Konzentration von 1 µM erreichen (KLINE u. KLINE 1992).

Zahlreiche Untersuchungen belegen die besondere Bedeutung des Anstiegs der Calciumkonzentration bei der Kortikalreaktion und der Vollendung der 2. meiotischen Teilung. Calcium aktiviert nach der die CaMKII (Calmodulin abhängige Proteinkinase II) (LORCA et al. 1993) und dabei fungiert Calmodulin als Calciumsensor, der nach der Bindung an Calcium Enzyme aktiviert, wie z. B. die CaMKII. Steht kein Calcium zur Verfügung, so inhibiert sich die Kinase selbst.

Der Anstieg des Calciumgehalts in der Säugetiereizelle löst die frühen Ereignisse der Eizellaktivierung aus. Zunächst kommt es zur Exozytose kortikaler Granula, die in der Rindenregion der Eizelle, unter der Plasmamembran, lokalisiert sind (ABBOTT u.

DUCIBELLA 2001). Es folgt das so genannte ZP-Hardening, eine Modifikation der Zona pellucida, was durch freigesetzte Enzyme der Granula in den perivitellinen Spalt der Eizelle verursacht wird. Diese strukturelle Veränderung der Zona Pellucida verhindert das Eindringen weiterer Spermien in die Eizelle und wird auch als Polyspermieblock bezeichnet (BLEIL et.

Polyspermieblock auf der Ebene der Plasmamembran existiert, was beim Kaninchen von großer Bedeutung ist (YANAGIMACHI 1994). Der Kontakt des Spermiums mit dem Zytoplasma der Eizelle verursacht Veränderungen der Bestandteile des Spermienkopfes. Es kommt zu einem Zusammenbruch der Kernmembran des Spermiums (sperm nuclear envelope breakdown, NEBD) und die perinukleare Theca wird entfernt. Im Anschluss erfolgt eine Dekondensation des Spermienchromatins, bei der Protamine, die das Chromatin umschließen, gegen Histone aus dem Eizellzytoplasma zurückgetauscht werden.

Zu den späteren Ereignissen der Eizellaktivierung zählt die Vollendung der 2. meiotischen Reifeteilung.

Die bereits erwähnte intrazelluläre Zunahme der Calciumkonzentration bewirkt einen Abbau von Cyclin B (LORCA et al. 1993) und somit eine Inaktivierung des MPF, mit der Folge, dass die Oozyte die MII verlässt und der Zellzyklus zur AI fortschreitet.

Die Inaktivierung der MAPK setzt in Relation zum MPF verzögert ein und steht in kausalem Zusammenhang mit der Vorkernbildung (MOOS et al. 1995).

C Material und Methoden

1 In-vitro-Maturation

1.1 Allgemeine Maßnahmen

Die Herstellung aller verwendeten Medien wurde unter sterilen Arbeitsbedingungen in einer Reinraumwerkbank (AURA HZ 48, Nunc GmbH & Co. KG, Langenselbold, Deutschland) durchgeführt. Alle verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden (soweit nicht anders vermerkt) von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland) bezogen. Sämtliche Glaswaren wurden nach deren Verwendung in einem Laborspülautomaten gereinigt und im Anschluss für vier Stunden bei 180 °C in einem Heißluftsterilisator (Tuttnauer 2540) sterilisiert. Alle Chemikalien wurden laut Herstelleranweisung gelagert. Es wurde nur Wasser aus einer Reinstwasseranlage (Milli-Q Plus, Millipore) verwendet, welches einen höheren elektrischen Widerstand als 18 MegaOhm x cm aufwies. Medien für die Zellkultur wurden nach Herstellung durch einen Zellulose-Acetat-Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert und bei einer Temperatur von 4°C gelagert.

1.2 Gewinnung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe

Die Ovarien präpubertärer Schweine wurden auf den Schlachthöfen in Gleidingen und Hannover etwa fünfzehn Minuten nach der Tötung der Tiere gesammelt. Als Aufbewahrungs- und Transportmedium für die Ovarien auf dem Weg vom Schlachthof zum Labor wurde 37 °C warme, 0,9 %ige Natriumchloridlösung (NaCl-Lösung) verwendet, die zuvor in 500 ml Borosilikat-Glasflaschen autoklaviert worden war. Zur Isolierung der Kumulus-Oozyten- Komplexe (KOKs) wurden nur Follikel ausgewählt, die makroskopisch intakt waren und einen Durchmesser von 2-5 mm aufwiesen.

Um die Eizellen isolieren zu können, wurden die Follikel mit einem Skalpell aufgeschnitten, mit autoklavierter und mit 1 % hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FKS, Biochrom AG, Berlin, Deutschland) supplementierter, 0,9 %iger NaCl-Lösung gespült und der Inhalt in

die einen mehrschichtigen, gleichmäßigen und kompakten Kumuluszellverband aufwiesen.

Diese Beurteilung erfolgte unter einem Stereomikroskop (SZX-ILLB200, Olympus Deutschland GmbH) bei 10- bis 70facher Vergrößerung. Mit Hilfe einer ausgezogenen Pasteurpipette wurden die ausgewählten KOKs in Zellkulturschalen überführt, die als Sammelmedium eine Phosphat-gepufferte Lösung (PBS + 10 % FKS) enthielten und die bis zur weiteren Bearbeitung auf einem Wärmetisch bei 38 °C gelagert wurden. Direkt vor der Kultivierung der KOKs wurden diese zweimal in Sammelmedium und einmal im äquilibrierten Reifungsmedium gewaschen.

1.3 IVM der KOKs

Als Kultivierungsmedium wurde Whitten’s Medium (WHITTEN 1970) eingesetzt, dessen Lagerungsdauer bei 4 °C 14 Tage nicht überschritt. Am Kultivierungstag wurden entsprechend des jeweiligen Versuchsansatzes BSA (Bovines Serum Albumin, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) oder FKS (Fetales Kälberserum, Biochrom AG, Berlin) und die Hormone (s. Anhang) supplementiert. Es folgte eine Äquilibrierung für zwei Stunden im Brutschrank (Cytoperm Heraeus) bei 39 °C in einer 5 %igen CO₂- Atmosphäre und gesättigter Luftfeuchte.

Die Kultivierung der KOKs erfolgte in Mikrowell-Platten (Nunc, Roskilde, Dänemark). Jede Vertiefung enthielt 500 µl des je nach experimenteller Konzeption unterschiedlich zusammengesetzten Maturationsmediums. Die Inkubation fand in Gruppen von ca. 20 Kumulus-Oozyten-Komplexen je Vertiefung statt. Innerhalb der verschiedenen Versuchsansätze wurden unterschiedliche Kultivierungszeiten gewählt, die den folgenden Abschnitten zu entnehmen sind.

Kultivierungsbedingungen für die ersten 46 h

Innerhalb der ersten 46 h der IVM wurden die KOKs (wie unter 1.3 beschrieben) kultiviert, wobei nach 26 h ein Mediumwechsel erfolgte. Der Unterschied des Kultivierungsmediums nach dem Mediumwechsel war lediglich, dass auf die Hormonzusätze (LH, FSH) verzichtet wurde.

Polkörperkontrolle

Nach 46stündiger IVM wurden für alle folgenden Versuchsansätze (C 1.4 Eizellalterung, C 2 parthenogenetische Aktivierung sowie C 3 Analyse der MAPK-Phosphorylierung) Eizellen verwendet, die den Kernreifungszustand der Metaphase II erreicht haben. Um dies sicher zu stellen, wurden die Oozyten nach dem Denudieren stereomikroskopisch bei 90facher Vergrößerung auf die Anwesenheit des 1. Polkörpers untersucht. Die Eizellen, die keinen Polkörper aufwiesen, wurden verworfen.

Kultivierungsbedingungen für die Eizellalterung

Im Anschluss an die 46stündige IVM wurden die KOKs mit einer auf den Durchmesser der Eizellen ausgezogenen Pasteurpipette denudiert. Dafür wurden die KOKs für ca. drei bis fünf Minuten in 0,25 %iger Hyaluronidase bei Raumtemperatur inkubiert, um die Hyaluronsäure der extrazellulären Matrix zu verdauen. Die im Anschluss daran noch anheftenden Kumuluszellen wurden durch wiederholtes Aufziehen in die Pasteurpipette mechanisch entfernt. Die denudierten Eizellen wurden anschließend unter gleichbleibenden Kultivierungsbedingungen für 58- bzw. 72 h in Whitten’s Medium mit BSA-Zusatz inkubiert.

In Abb. 4 ist das Versuchsdesign der IVM zusammenfassend dargestellt. Ebenso sind in diesem Schema die Kultivierungszeiträume zu erkennen, nachdem jeweils Oozyten für die weiteren Experimente zur Verfügung standen.

Abb. 4: Überblick der IVM mit den gewählten Kultivierungszeiträumen und experimentellen Ansätzen. KOKs: Kumulus-Oozyten-Komplexe, IVM: In-vitro-Maturation, IVC: In-vitro- Kultur

2 Parthenogenetische Aktivierung

In der vorliegenden Studie wurden Oozyten nach 46, 58 und 72 h IVM anhand ihrer parthenogenetischen Aktivierbarkeit analysiert. Die parthenogenetische Induktion erfolgte mittels Ethanolbehandlung und anschließender Proteinsynthesehemmung durch Cycloheximid (PETR et al. 1996). Hierfür wurden zunächst jeweils Gruppen von ca. 15 Oozyten in Whitten’s Medium ohne Hormonzusatz gewaschen. Als Proteinkomponente diente zunächst 0,3 % (w/v) BSA (analog zur bisherigen IVM). Vorversuche zeigten unter diesen Bedingungen unbefriedigende Resultate, so dass BSA durch 20 % (v/v) FKS ersetzt wurde.

Nach dem Waschvorgang wurden die Eizellen in Whitten’s Medium mit 10 % (v/v) Ethanol (98 %, unvergällt) für 2 Minuten überführt, wobei der Alkohol erst direkt vor Gebrauch zugefügt wurde. Anschließend folgten drei erneute Waschschritte in Whitten’s Medium.

Daraufhin wurden die Eizellen ins Aktivierungsmedium (Whitten’s Medium mit 10 µg/ml Cycloheximid) für 24 h unter in den unter 1.3 beschriebenen Bedingungen kultiviert. Zum Schluss erfolgten drei Waschschritte und eine erneute Kultivierung in Whitten’s Medium mit 20 % (v/v) FKS. Für jeden Kultivierungszeitraum (46, 58 und 72 h) wurden mind. 100 Oozyten auf die oben beschriebene Weise parthenogenetisch aktiviert und mittels Aceto- Orcein-Färbung ausgewertet (C 3.1). Einen Überblick über den experimentellen Ansatz der parthenogenetischen Aktivierung zeigt Abb. 5.

Abb. 5: Übersicht zum Versuchsteil der parthenogenetischen Aktivierung. IVM: In-vitro-

3 Ermittlung des Kernreifungsstadiums

3.1 Fixierung und Färbung der Oozyten

Die Beurteilung des Kernreifungsstatus erfolgte nach 0 h (direkt nach Isolation aus dem Follikel) sowie nach 26, 46, 58 und 72stündiger Kultivierung, angelehnt und modifiziert nach HANCOCK (1958). Dafür wurden (wie unter 1.3 beschrieben) die Kumuluszellen entfernt, wobei für Oozyten nach 0 und 26 h IVM keine Hyaluronidase verwendet wurde. Die denudierten Eizellen wurden anschließend dreimal in einem Tropfen (50 µl) 0,7 %ige KCL- Lösung gewaschen. Anschließend konnten die Oozyten in einen Tropfen (50 µl) 0,7 %ige KCL-Lösung auf einem Deckgläschen (18 x 18 mm) pipettiert werden, welches mit einer Paraffin-Vaseline-Mischung (9 Teile Vaseline + 1 Teil Paraffin) als Abstandshalter an jeder Ecke versehen war. Der vorher mittels Ethanol entfettete Objektträger wurde anschließend auf das Deckgläschen gelegt und konnte nach dem Umdrehen des Präparates unter stereomikroskopischer Kontrolle festgedrückt werden. Die angefertigten Eizellpräparate wurden für mind. 24 h in einer frisch angesetzten Eisessig-Ethanol-Lösung (Mischungsverhältnis: 1 Teil C2H4O2 + 3 Teile C2H6OH) fixiert. Die Färbung erfolgte mit 2 %iger Aceto-Orcein-Lösung, wobei der überschüssige Farbstoff mit 25 %iger Essigsäure ausgewaschen wurde.

3.2 Beurteilung der Kernreifungs- und Teilungsstadien

Die Kernreifungsanalyse erfolgte mittels eines Phasenkontrastmikroskops (BX 60, Olympus GmbH) bei 200- bis 400facher Vergrößerung. Zur Fotodokumentation wurde die Software Cell D 2,6 System (Olympus GmbH) genutzt. Die Auswertung wurde anhand der beschriebenen morphologischen Aspekte (s. B 1.1.1) nach MOTLIK u. FULKA (1976) sowie NAGAI et al. (1988) durchgeführt und anhand folgender Merkmaler eingeordnet:

Germinalvesikelstadium (GV)

Die intakte Kernmembran ist deutlich zu erkennen und umgibt den großen vesikulären Kern vollständig. Das GV-Stadium lässt sich wie folgt unterteilen:

GV I: Der Nukleolus ist vorhanden. Um das Kernkörperchen sind ring- oder hufeisenförmige Ansammlungen von orceinpositiven Material erkennbar.

GV II: Der Nukleolus ist vorhanden. Es sind einige orceinpositive Bereiche an der Kernmembran zu erkennen.

GV III: Der Nukleolus ist vorhanden. Das Chromatin stellt sich als fädige bis klumpige Struktur dar.

GV IV: Der Nukleolus ist nicht mehr vorhanden. Das Chromatin ist als irreguläres Netzwerk oder als individuelle fadenförmige Bivalente anfärbbar.

Diakinese: Die Kernmembran löst sich auf und die Chromosomen sind als gut anfärbbare Körper sichtbar.

Metaphase I (M I): Der Zellkern ist nicht mehr vorhanden. Die Chromosomen sind maximal kondensiert und in einem Cluster in der Äquatorialebene einer bipolaren Spindel angeordnet.

Anaphase I (A I): Die Chromosomen migrieren zu den Polen einer elongierten Spindel.

Telophase I (T I): Die beiden Chromosomengruppen sind auseinander gewichen und stellen sich als hyperkondensierte Chromatinaggregate dar. Die meiotische Spindel ist deutlich zu erkennnen.

Metaphase II (M II): Die Chromosomen sind auf zwei Cluster verteilt. Teilweise ist die Membran des ersten Polkörpers darstellbar. Die Chromosomen der Eizelle sind erneut in der Äquatorialebene angeordnet.

Vorkernstadium: Es sind bläschenförmige Strukturen mit zahlreichen Nucleoli und scharf abgrenzbaren Membranen dargestellt.

Mehrzellstadium: Eine Morula mit mindestens zwei gleichmäßigen Blastomeren von einheitlicher Größe und jeweils einem intakten Zellkern wurden gebildet.

Fragmentierte Eizelle: Die Zelle weist ein mehrzelliges Furchungsstadium auf. Das Zytoplasma beinhaltet irreguläre Lipidvesikel und die jeweiligen Zellkerne fehlen.

Degenerierte Eizelle: Die Oozyte erscheint in einer unregelmäßigen Form, Kumulus- sowie Zellen der Corona radiata sind nur noch selten vorhanden. Polkörper und Zellkern sind fragmentiert, das Ooplasma erscheint dunkel.