Die Abhängigkeit der Steroidhormonsynthese in porzinen Kumuluszellen von
der MAPK (mitogen activated protein kinase) und dem BMP6 (bone morphogenetic protein 6)
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium -
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von Dagmar Töpfer
Magdeburg
Hannover 2011
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Burkhard Meinecke
2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Bernd Schröder
Tag der mündl. Prüfung: 25.11.2011
Diese Arbeit entstand in Zusammenarbeit des Instituts für Reproduktionsbiologie mit dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin.
Es irrt der Mensch, so lange er strebt.
Johann Wofgang von Goethe
1 EINLEITUNG... 11
2 LITERATURÜBERSICHT... 13
2.1 Oogenese und Follikulogenese ... 13
2.2 Signalvermittlung ... 16
2.2.1 MAPK (mitogen-activated protein kinase)...17
2.2.2 OSFs (oocyte-secreted factors) ...21
2.3 Steroidhormone im Ovar... 24
2.3.1 Steroidhormonbiosynthese im Ovar...26
2.3.2 Einfluss der MAPK ...29
2.3.3 Einfluss von BMP6...30
2.4 Zielsetzung der Arbeit ... 33
3 METHODEN... 34
3.1 Isolierung und Klassifizierung der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) ... 34
3.2 Kultivierung der KOKs... 35
3.3 Vitalfärbung der Kumuluszellen ... 36
3.4 Beurteilung des Kernreifungsstatus ... 38
3.5 Bestimmung der Hormonkonzentrationen im Medium ... 40
3.6 Molekularbiologische Methoden ... 41
3.6.1 RNA-Extraktion ...41
3.6.2 Kontrolle der RNA-Qualität...42
3.6.3 Bestimmung der RNA-Konzentration ...43
3.6.4 Ermittlung der PCR-Zyklusanzahl ...43
3.6.5 Allgemeines zur PCR...44
3.6.6 Durchführung der one-step Reverse Transkriptase-PCR ...46
3.6.7 Agarose-Gelelektrophorese ...50
3.6.8 Auswertung der Ergebnisse ...51
3.6.9 Identifikation der PCR-Produkte...51
3.7 Analyse der MAPK-Phosphorylierung... 52
3.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)...52
3.7.2 Immunoblot ...53
3.7.3 Auswertung der Chemilumineszenz...54
3.8 Zusammenfassung des Versuchdesigns ... 55
3.9 Statistische Auswertung... 57
4 ERGEBNISSE ... 58
4.1 Kernreifungsraten ... 58
4.1.1 Einfluss von U0126 auf die Kernreifung der Oozyten ...58
4.1.2 Einfluss von BMP6 auf die Kernreifung der Oozyten ...60
4.2 Kumuluszellexpansion im Basismedium (BM), BM+U0126 und im BM+BMP6 ... 61
4.3 Hormonanalysen im Medium ... 63
4.3.1 17ß-Estradiolkonzentrationen (E2) ...63
4.3.2 Progesteronkonzentrationen (P4)...65
4.4 RNA ... 67
4.4.1 RNA-Integrität ...67
4.4.2 RNA-Konzentration ...68
4.4.3 Identifikation der PCR-Produkte...69
4.5 RT-PCR ... 70
4.5.1 StAR ...71
4.5.2 CYP11A1 ...73
4.5.3 3ß-HSD...75
4.5.4 CYP19A1 ...77
4.5.5 BMP6 ...79
4.6 MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen... 81
4.6.1 MAPK-Aktivität im BM und der Einfluss von U0126 ...81
4.6.2 Einfluss von BMP 6 auf die MAPK-Aktivität ...83
5 DISKUSSION ... 85
5.1 Kernreifung während der Maturation... 85
5.2 Zelleigenes BMP6 in den KOKs... 88
5.3 Steroidhormongenese... 90
5.3.1 Einfluss der MAPK ...90
5.3.2 Einfluss des BMP6...95
5.3.3 BMP6 und der MAPK-Signalweg ... 98
5.4 Methodische Aspekte... 100
5.5 Ausblick ... 101
6 ZUSAMMENFASSUNG... 103
7 SUMMARY ... 106
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 108
9 ANHANG... 124
9.1 Abkürzungsverzeichnis ... 124
9.2 Verwendete Chemikalien und Reagenzien mit Bezugsquellen... 127
9.3 Zusammensetzung von Medien, Lösungen, Puffern und Gelen ... 130
9.4 Geräte und Verbrauchsmaterialien ... 135
9.5 Tabellen zum Ergebnisteil... 137
Tab. 1 Klassifizierung der KOKs S. 35 Tab. 2 Einteilung der Kernstadien nach HUNTER und POLGE (1966) sowie
MOTLIK und FULKA (1976) S.39
Tab. 3 Zyklusanzahlen der PCR für die jeweiligen Transkripte S. 44
Tab. 4 Zielgene mit dazugehörigen Enzymen S. 46
Tab. 5 Übersicht der verwendeten spezifischen Primer S. 47 Tab. 6 Anzahl der anhand des Chromatinstatus beurteilten Oozyten S. 58 Tab. 7 Für die RT-PCR eingesetzte Gesamt-RNA-Mengen der beiden
Zelltypen (Kumuluszellen und Oozyten) S. 69
Tab. 8 Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger
IVM im BM S. 137
Tab. 9 Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26 und 46stündiger IVM im
BM+U0126 S. 138
Tab. 10 Chromatinstatus von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger
IVM im BM+BMP S. 139
Tab. 11 Progesteronkonzentration (ng/ml) in unterschiedlichen Medien S. 140 Tab. 12 17ß-Estradiolkonzentration (ng/ml) in unterschiedlichen Medien S. 140 Tab. 13 mRNA-Expression nach RT-PCR von StAR in Kumuluszellen S. 140 Tab. 14 mRNA-Expression nach RT-PCR von CYP11A1 in Kumuluszellen S. 141 Tab. 15 mRNA-Expression nach RT-PCR von CYP19A1 in Kumuluszellen S. 141 Tab. 16 mRNA-Expression nach RT-PCR von 3ß-HSD in Kumuluszellen S. 141 Tab. 17 mRNA-Expression nach RT-PCR von BMP6 in Kumuluszellen S. 142 Tab. 18 mRNA-Expression nach RT-PCR von BMP6 in Oozyten S. 142 Tab. 19 MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen S. 142
Abb.1 Bidirektionale Kommunikation der Oozyten mit den
Follikelzellen. Modifiziert nach EPPIG (2001) S. 16 Abb.2 Vereinfachte Darstellung des MAPK-Signalwegs S. 19 Abb.3 Bidirektionale Kommunikation der Oozyte (Ooz) mit
Kumuluszellen (KZ), muralen Granulosazellen (MZ) und Thekazellen (TZ) über oocyte-secreted factors (OSFs).
Modifiziert nach KNIGHT und GLISTER (2006)
S. 22
Abb.4 Überblick der Steroidhormonbiosynthese S. 28 Abb.5 Vitalfärbung der Kumuluszellen mit Trypanblau nach 94 h IVM S. 37
Abb.6 Schema des Versuchsdesigns S. 56
Abb.7 Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26 und 46 h IVM im BM
verglichen mit U0126 supplementiertem BM S. 59 Abb.8 Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h IVM im
BM verglichen mit BMP6 supplementiertem BM S. 60 Abb.9 Stereomikroskopische Übersicht der KOKs nach IVM im BM,
BM+U0126, BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h S. 62 Abb. 10a+b E2-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5,
26 und 46 h und verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
S. 64
Abb. 11a+b P4-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h bzw. verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
S. 66
Abb. 12 Denaturierendes Agarosegel einer RNA-Extraktion von
Kumuluszellen nach IVM S. 67
Abb. 13 Elektropherogramm einer intakten Gesamt-RNA-Probe S. 68 Abb. 14 Sequenzierergebnis für den Sense Read von BMP6 (GATC
Biotech AG) S. 70
Abb 15 Gelelektrophorese einer RT-PCR von GAPDH als house-
keeping-Gen S. 70
Abb. 16 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von StAR in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten
S. 72
Abb. 17 Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
S. 72
Abb 18 Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
S. 73
Abb. 19 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von CYP11A1 in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten
S. 74
Abb. 20 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP11A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
S. 74
Abb. 21 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP11A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
S. 75
Abb. 22 1 %ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von 3ß- HSD in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten
S. 76
Abb. 23 Relative Dichte der mRNA-Expression von 3ß-
HSD in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
S. 76
Abb. 24 Relative Dichte der mRNA-Expression von 3ß-HSD in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94
S. 77
Abb. 25 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von CYP19A1 in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten
S. 78
Abb. 26 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h
S. 78
Abb. 27 Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
S. 79
Abb. 28 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von BMP6 in Kumuluszellen und Oozyten aus dem Kultivierungsansatz BM mit dazugehörigen Kultivierungszeiten
S. 80
Abb. 29a+b Relative Dichte der mRNA-Expression von BMP6 in Kumuluszellen (a) und Oozyten (b) nach IVM der KOKs im BM nach 0, 5, 26 und 46 h
S. 80
Abb. 30 Westernblots mit aufgetrennter p42- und p44-MAPK von Kumuluszellen nach IVM im BM und im BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h
S. 82
Abb. 31 Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im Medium BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h
S. 82
Abb. 32 Westernblots mit aufgetrennter p42- und p44-MAPK von Kumulsuzellen nach IVM im BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h
S. 83
Abb. 33 Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im Medium BM verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26 und 46 h bzw. 72 und 94 h
S. 84
1 Einleitung
Die wesentlichen Grundlagen weiblicher Fertilität sind zyklisch ablaufende Prozesse, in denen dominante Follikel heranwachsen, in ihnen befruchtungsfähige Eizellen reifen und anschließend ovulieren. Die Steuerung dieser Prozesse ist von vielen Faktoren abhängig und setzt ein regulatorisches Wechselspiel zwischen Eizelle und den sie umgebenden Follikelzellen vorraus. Einer der bedeutenden Prozesse ist die erfolgreiche Synthese der Steroidhormone im Ovar. Die Eizelle interagiert in diesem Zusammenhang nicht nur mit den Theka- und Granulosazellen, sondern auch mit den sie direkt umgebenden Kumuluszellen.
Für den koordinierten Ablauf der Hormonsynthese ist eine Kontrolle der steroidalen Genaktivität notwendig. In der vorliegenden In-vitro-Studie wurden porzine Kumulus-Oozyten-Komlexe (KOKs), in ihrer Fähigkeit 17ß-Estradiol (E2) und Progesteron (P4) während der Maturation zu sezernieren, charakterisiert indem die produzierten Hormonmengen analysiert und die mRNA- Expressionsmuster einiger ausgewählter steroidaler Gene in den Kumuluszellen semi-quantitativ beurteilt wurden.
Die Kontrolle der Genaktivität in ovariellen Zellen ist wie in anderen eukaryotischen Zellen von vielen signalvermittelnden Mechanismen abhängig. Es ist bekannt, dass der MAPK-Signalweg (mitogen-activated protein kinase- Signalweg) als Singalkaskade bedeutend für die intra- und interzelluläre Kommunikation ist und auch im Follikel wichtige Funktionen übernimmt. Sie hat deshalb erheblichen Einfluss auf die Qualität und Entwicklung der Eizelle. Daher wurde in der vorliegenden Studie nach einer Antwort gesucht, ob die MAPK in porzinen Kumuluszellen regulatorsich an der Steroidhormonbiosynthese beteiligt ist.
Neben dem intrazellulären Netzwerk der Signalkaskaden gibt es noch die Möglichkeit der parakrinen Zellkommunikation über so genannte oocyte-secreted factors (OSFs), die bedeutende Prozesse wie Zellproliferation, Apotose, Signalweiterleitung, Steroidhormon- und Inhibinsynthese und
Kumuluszellexpansion regulieren. Von diesen löslichen parakrinen Faktoren sind bisher 35 OSFs der TGF-ß-Superfamilie (transforming growth factor-beta) bei Säugetieren bekannt, wohingegen die Funktion sowie der Ursprung in den verschiedenen Zelltypen noch weitgehend unklar ist. Einer der möglichen OSFs ist das BMP6 (bone morphogenetic protein 6). In wenigen Studien, vor alllem mit Granulosazellen, wurde eine Beteiligung des BMP6 an der Steroidhormonsynthese gezeigt. Daher wurde in dieser Arbeit die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass dieser Faktor auch in Kumuluszellen des Schweins einen Einfluss auf die Steroidhormonproduktion hat. Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wurde den KOKs während der Maturation exogenes BMP6 zugeführt, und anschließend die Menge der sezernierten Steroidhormone E2 und P4
gemessen. Neben den Produkten der Steroidhormonsynthese wurde auf der mRNA-Ebene der dafür notwendigen Enzyme nach einem Einfluss des BMP6 gesucht.
Nachdem eine Beteiligung der MAPK an der Steroidhormongenese in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, entstand die Hypothese, dass BMP6 als möglicher OSF auf den MAPK-vermittelten Regulationsmechanismus der Hormonsynthese Einfluss hat. Dafür wurde die MAPK-Aktivität der mit BMP6 behandelten Kumuluszellen untersucht.
Die folgende Studie soll dazu beitragen, zeitliche und funktionelle Abläufe innerhalb des Follikels bis zur Ovulation einer befruchtungsfähigen Eizelle besser zu verstehen und somit zur Verbesserung der IVM-Bedingungen beizutragen.
2 Literaturübersicht
2.1 Oogenese und Follikulogenese
Die in der Rindenschicht des Ovars stattfindende Oogenese ist die Entwicklung einer Eizelle bis zum Zeitpunkt ihrer Befruchtung. Der Ursprung der Oogonien, die Primordialkeimzellen, entstehen in den ersten Wochen der embryonalen Entwicklung und wandern aus dem Entoderm des Embryos in die Genitalleiste, wobei der Mechanismus dieser Wanderung noch nicht vollständig erklärbar ist (FREEMAN 2003).
Die Oogonien teilen sich nun mehrfach mitotisch in relativ kurzer Zeit. Dieser Teilungsprozess in der Gonadenanlage ist in den meisten Tierarten in der frühen pränatalen Entwicklung abgeschlossen und endet mit dem Verlust ihrer Motilität.
Nach der mitotischen Vermehrungsphase treten die Oogonien in die erste meiotische Teilung, der Reduktionsteilung, ein. Die jetzt als primäre Oozyten bezeichneten Eizellen durchlaufen die fünf Stadien der Prophase I (Leptotän, Zygotän, Pachytän, Diplotän, Diakinese), um zwischen dem Diplotän- und Diakinese-Stadium, im sogenannten Diktyotän ihre weitere Entwicklung vorläufig einzustellen. Somit unterbricht diese Arretierung die Meiose I bis zur Pubertät. Bis dahin nimmt der Kern der Eizelle an Größe zu und wird als Germinalvesikel (GV) bezeichnet. Die Eizelle ist während dieser Phase durch eine hohe metabolische und mRNA-Syntheseleistung gekennzeichnet, während die Chromosomen im Kern in despiralisierter Form verharren. Die Oozyte besitzt nun die Fähigkeit die Meiose wieder aufzunehmen. Mit der Aufhebung dieser Arretierung beginnt gleichzeitig die meiotische Endreifung. Sie ist durch die Auflösung der Kernhülle, die Kondensation des Chromatins und den Aufbau des Spindelapparates charakterisiert und wird als germinal vesicle breakdown (GVBD) bezeichnet (MOTLIK u. FULKA 1976).
Nach dem GVBD organisieren sich die Chromosomen an der Äquatorialplatte und erreichen die Metaphase I (M I). Anschließend durchläuft die Eizelle die Stadien der Anaphase I (Ana I), Telophase I (Telo I) und erreicht schließlich das Stadium der befruchtungsfähigen Eizelle, die Metaphase II (M II). Mit dem Erreichen der M II vollendet die Oozyte ihre erste Reifeteilung, hat das erste Polkörperchen ausgeschleust und arretiert erneut (KECK et al. 2002). Die beschriebene Zeitspanne vom GVBD bis zum zweiten Arrest in der M II wird als Maturation bezeichnet und umfasst die nukleären, zytoplasmatischen und molekularen Reifungsvorgänge der Eizelle (SIRARD et al. 2006).
Das Wachstum und die Reifung der Eizellen kann nur im Zusammenhang mit der funktionalen Gesamtheit des Ovars und der Follikulogenese betrachtet werden.
Den Ursprung der Follikulogenese stellen die Primordialfollikel dar, aus denen dominante präovulatorische Follikel selektiert werden. Zum Zeitpunkt der Geburt liegen die meisten im Diktyotän der Meiose arretierten Oozyten, den primären Oozyten, als funktionale Einheit des Ovars vor und bilden zusammen mit einer einzelnen Schicht außen aufliegender epithelialer Zellen, den Granulosazellen, und der umgebenden Basallamina den Primordialfollikel (EPPIG 1996). Durch mitotische Zellproliferation entsteht aus den epithelialen Follikelzellen eine mehrlagige Granulosazellschicht. Die innere Granulosazellschicht baut sich säulenartig auf der Zona pellucida auf und wird als Corona radiata bezeichnet. Die Regulation der Granulosazellproliferation und –differenzierung umfasst Vorgänge, die bisher noch Gegenstand aktueller Forschung sind. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Ratteneizellen im Stadium des Primordialfollikels Wachstumsfaktoren produzieren, die daran beteiligt sind. GDF9 (growth differentiation factor 9) und BMP15 (bone morphogenetic protein 15) aus der Familie der TGF-ß-Familie (transforming growth factor beta) wurden dabei in In- vitro-Studien als Faktoren für die Granulosazellproliferation in präantralen Follikeln ausfindig gemacht (VITT et al. 2000a; OTSUKA et al. 2000).
Im weiteren Verlauf des Follikelwachstums sezernieren die Granulosazellen Follikelflüssigkeit, den Liquor folliculi. Durch die Einlagerung dieses Liquors entsteht im Granulosazellepithel ein Hohlraum, das Antrum folliculi. Es ist bisher
nicht genau geklärt, welche Mechanismen zur Antrumbildung im Follikel führen. Es wird jedoch von einer zunehmenden Hyaluronsäuresekretion von Granulosazellen durch Stimulation von paracrinen oocyte-secreted factors (OSFs) ausgegangen, die zu einer Schwellung im extrazellulären Raum führt (ELVIN et al. 2000).
Im Stadium des Sekundärfollikels, noch vor der Antrumbildung, entwickelt sich das Follikelepithel zur mehrschichtigen Körnerzellschicht, dem Stratum granulosum.
Um diese Schicht differenziert sich die zweischichtige Theca folliculi, bestehend aus Theka interna (innen) und Theka externa (außen). Diese Zellen exprimieren zusammen mit dem Follikelepithel FSH-(follikelstimulierendes Hormon) und LH- (luteinisierendes Hormon)–Rezeptoren. Während der Flüssigkeitseinlagerung reift der Tertiärfollikel zum Graafschen Follikel heran. Die Granulosazellen unterscheiden sich jetzt zwischen den wandständigen Granulosazellen (murale Granulosazellen, MZ), die die Follikelwand auskleiden und den Granulosazellen des Cumulus oophorus mit den so genannten Kumuluszellen (KZ), die die Eizelle umgeben (EPPIG1991; 2001). Die MZ, die keinen direkten Kontakt zur Oozyte haben, besitzen eine niedrigere Proliferationsrate, eine höhere Synthesekapazität und eine höhere Expression von LH-Rezeptoren (RICHARDS et al. 1976).
Am Ende der Wachstumsphas erreicht der Follikel seine präovulatorische Größe, die beim Schwein 6-7 mm, Pferd 35-50 mm, Rind 15-20 mm und beim Schaf 8-20 mm beträgt (VAN DEN HURK u. ZHAO 2005). Die Kumuluszellen sezernieren unter dem Einfluss des FSH/LH-Anstiegs Hyaluronsäure, dadurch werden die Abstände zwischen den Kumuluszellen erweitert. Die Oozyten und Kumuluszellen werden in eine muzigene Masse eingebettet und das Follikelvolumen nimmt durch die erhöhte Produktion von Liquor folliculi zu.
Hydrolytische Enzyme initiieren die Stigma-Bildung und zusammen mit kontraktilen Mechanismen der Follikelwand erfolgt die Ovulation (ERICKSON 1986).
2.2 Signalvermittlung
Für die Entwicklung der Oozyten und den Follikelzellen vom Primordialfollikel bis zur Ovulation sind koordinierte Regulationsmechanismen in beiden Zelltypen notwendig. Innerhalb dieser Regulationsvorgänge sollten Keimzellen im Follikel zusammen mit den somatischen Zellen als funktionale Einheit betrachtet werden, da sie eng miteinander verbunden und voneinander abhängig sind (BUCCIONE et al. 1990). Die Interaktion zwischen Oozyten und Follikelzellen erfolgt bidirektional (EL-FOULY et al. 1970; EPPIG 2001), so dass einerseits das Follikelwachstum, die Differenzierung und Proliferation der Granulosazellen, die Steroidhormongenese sowie die Kumuluszellexpansion durch Faktoren der Eizelle beeinflusst werden. Andererseits werden die Eizellreifung mit ihrem meiotischen Arrest, die Transkription und somit auch die Entwicklungskompetenz der Oozyte von den Granulosa- und Kumuluszellen beeinflusst (EPPIG 2001). Abbildung 1 fasst die Aspekte der beidseitigen Kommunikation schematisch zusammen.
Abbildung 1: Bidirektionale Kommunikation der Oozyten mit den Follikelzellen.
Modifiziert nach EPPIG (2001)
Die Eizelle selbst ist mit den Kumuluszellen und deren trans-zonalen zytoplasmatischen Fortsätzen direkt assoziiert. An den Enden dieser Zytoplasmaausläufer stehen kanalbildende Proteinkomplexe, so genannte gap junctions, zum Austausch kleiner Moleküle wie z. B. Ionen oder Aminosäuren zur Verfügung (ALBERTINI et al. 2001). Der Kommunikationsweg über gap junctions wird ebenfalls zwischen den Kumuluszellen selbst sowie zwischen Kumulus- und Granulosazellen genutzt (PICTON et al. 1998). Weiterhin gibt es die Möglichkeit der parakrinen Zellkommunikation über so genannte oocyte-secreted factors.
Diese löslichen parakrinen Faktoren sind an der Regulation bedeutender Prozesse, wie z. B. Zellproliferation, Signalweiterleitung, Steroidhormon- und Inhibinsynthese, Apoptose und Kumuluszellexpansion beteiligt (GILCHRIST et al.
2004; 2008).
2.2.1 MAPK (mitogen-activated protein kinase)
Eine Möglichkeit der eukaryotischen Zellen auf ständig wechselnde extrazelluläre Signale zu reagieren, ist das umfangreiche Netzwerk der intrazellulären Signalkaskaden, die auch durch gegenseitige Beeinflussung den Zellen ermöglichen, koordiniert zu reagieren (ROBINSON u. COBB 1997). Dabei gehören Cytokine und Hormone zu den bedeutendsten Signalmolekülen. Eine Möglichkeit der Weiterleitung dieser Signalmoleküle innerhalb der Zelle stellt die Kaskade der Proteinkinasen dar (CAMPBELL et al. 1995). Die Proteinkinasen übertragen die endständige Phosphatgruppe eines ATP-Moleküls auf die Hydroxylgruppe der Serin-, Threonin- oder Thyrosinreste spezifischer Substratproteine. Die Phosphorylierung eines Proteins kann zu dessen Aktivierung oder auch Inaktivierung führen. Einzelne Proteinkinasen sind oft hintereinander geschaltet, d. h. sie werden selbst durch Phosphorylierung aktiviert und stellen das Substrat einer weiteren Proteinkinase dar. Somit werden Signale innerhalb einer strukturierten und mehrstufigen Proteinkinase-Kaskade transportiert und
können bis in den Zellkern gelangen. Einer dieser Singalwege ist die MAPK- Kaskade. Die MAPK-Signalübermittlung ist in allen eukaryotischen Zellen zu finden und umfasst mehrere Signalwege. Der Begriff MAPK leitet sich von der Regulierbarkeit der mitogen wirkenden Liganden ab. Gleichermaßen wird die MAPK oft als extrazellulär regulierte Kinase (ERK) bezeichnet, jedoch bezeichnet dieser Begriff eher einen der bisher vier bekannten Subtypengruppen der MAPK.
Diese Familien der Subtypen lauten wie folgt:
ERK extrazellulär regulierte Kinase (BOULTON et al. 1991)
JNK/SAPK c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase (DÉRIJARD et al., 1994; KYRIAKIS et al. 1994)
p38MAPK p38 mitogen activated protein kinase (ROUSE et al. 1994, PEARSON et al. 2001) BMK Big MAPK
(LEE et al. 1995, ZHOU et al. 1995)
In der vorliegenden Arbeit wurde der Schwerpunkt bezüglich der Proteinkinaseregulation auf die beiden Isoformen MAPK2 (ERK2) und MAPK1 (ERK1) gelegt. Sie werden entsprechend ihres Molekulargewichts auch als p42MAPK und p44MAPK bezeichnet.
Innerhalb der verschiedenen MAPK-Signalwege konnte allgemein gezeigt werden, dass immer aufeinander folgend drei hintereinander geschaltete Proteinkinasen wirksam sind, die sich nacheinander aktivieren. Die MAPK-Kinase-Kinase (MAPKKK) aktiviert eine dualspezifische MAPK-Kinase (MAPKK), zu denen unter anderem die verschiedenen Raf-Kinasen (rapidly growing fibrosarcoma-kinase), Mos-Kinasen (moloney sarcoma oncogene) und MEK-Kinasen (MAPK/ERK- Kinasen) gehören. Diese MAPKK aktiviert letztendlich die jeweilige MAPK (ERK, pMAPK) (SEGER u. KREBS 1995).
Die MAPK1/MAPK2-Kaskade wird durch eine Vielzahl von zellspezifischen Liganden stimuliert, z. B. Wachstumsfaktoren, Cytokine, Neurotransmitter oder
Liganden für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Die extrazellulären Stimulatoren werden über Rezeptor-Thyrosinkinasen an das Ras-Protein (rat sarcoma-Protein) weitergeleitet. Ras-GTP aktiviert Proteinkinasen, die zur bereits erwähnten Gruppe der MAPKK-Kinasen (Raf/Mos) zählen. Die nachgeschalteten MAPKK (MEK1,MEK2) werden dadurch an zwei Serin-Resten phosphoryliert.
Anschließend können die nächste Gruppen von Proteinkinasen, die MAPK1 und MAPK2 am Tyrosin- bzw. Threonin-Rest phosphoryliert werden. In Abbildung 2 ist der MAPK1/MAPK2-Signalweg zur Übersicht vereinfacht dargestellt.
Abbildung 2: Vereinfachte Darstellung des MAPK-Signalwegs.
MAPK: mitogen activated protein kinase, MAPKK/MEK: MAPK-Kinase, MAPKKK:
MAPK-Kinase-Kinase, Ras: Rat sarcoma, Raf: rapidly growing fibrosarcoma, ERK:
extrazellulär regulierte Kinase
Der MAPK1/MAPK2-Signalweg reguliert in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Mechanismen und übernimmt auch im Follikel wichtige Funktionen, die Einfluss auf die Qualität und Entwicklung der Eizelle haben. Schon frühzeitig wurde in vitro in Xenopus-Oozyten durch exogene MAPK-Substrate die Maturation inhibiert. Die erhöhte Phosphorylierung, also die Aktivierung der MAPK vor dem GVBD und vor dem Erreichen der Metaphase II konnte immunhistochemisch nachgewiesen werden (GOTOH et al. 1991;1995).
SANGHERA et al. (1990) wiesen die MAPK-Aktivität in reifenden Eizellen vom Seeigel nach. Im Unterschied zum Xenopus wurden bei Säugetieren zwei zeitgleich aktivierte MAPK-Isoformen bekannt, die sich außerdem im Molekulargewicht zum Xenopus unterschieden .
Während der Eizellreifung ist die MAPK-Kaskade regulatorisch an der Wiederaufnahme der Meiose, der Organisation der Mikrotubuli im Cytoskelett und dem Arrest der Oozyte in der Metaphase II beteiligt (SUN et al. 1999). Dabei unterscheidet sich die zeitliche MAPK-Aktivität zwischen den Spezies und ist abhängig vom meioseinduzierenden Stimulus. Die spontane Wiederaufnahme der Meiose erfolgt in Säugeroozyten MAPK-unabhängig, wohingegen sie für den gonadotropininduzierten GVBD essentiell ist (FAN u. SUN 2004; FAN et al. 2009).
Während In-vitro-Studien unterschied sich die zeitliche Aktivität der MAPK ebenfalls zwischen den Spezies und war abhängig von den Kulturbedingungen.
Allgemein stieg der Phosphorylierungsgrad um den GVBD an und behielt dieses erhöhte Aktivitätsniveau bis zum Erreichen der Metaphase II bei. Nach der Befruchtung der Eizellen bis hin zur Vorkernbildung wurde die MAPK zunehmend dephosphoryliert und somit inaktiv (FAN u. SUN 2004).
In Eizellen wurde Mos als eine keimzellspezifische Serin/Threonin-Proteinkinase (MAPKK) ausfindig gemacht, die während der Maturation an der Aktivierung der MAPK- Phosphorylierungskaskade beteiligt ist (GEBAUER u. RICHTER 1996). SU et al. (2002) kultivierten KOKs von Mos-/--Mäusen mit U0126 (1,4-Diamino-2,3- dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadiene), einem MEK-Inhibitor, und trotz Stimulation mit FSH, EGF (epidermal growth factor) und 8-Brom-cAMP blieb die Kumuluszellexpansion aus und die Oozyten erreichten nicht den GVBD. In
porzinen KOKs wurde durch Injektion von c-mos-mRNA in die Oozyte die GVBD- Rate erhöht und die frühzeitige MAPK-Aktivierung festgestellt. Hingegen wurde durch antisense-c-mos-mRNA-Injektion die Phosphorylierung unterdrückt, jedoch erfolgte die Wiederaufnahme der Meiose (OHASHI et al. 2003). Somit wurde bei der Maus (SU et al. 2002; 2003) und auch beim Schwein (OHASHI et al. 2003) gezeigt, dass die aktive MAPK in den Kumuluszellen und nicht in den Oozyten essentiell für die Auslösung des GVBD und somit für die Induktion der Wiederaufnahme der Meiose ist (LIANG et al. 2005; 2007).
Die Phosphorylierung der MAPK in KOKs während der IVM (In-vitro-Maturation) ist u. a. von den Maturationsbedingungen und der untersuchten Spezies abhängig.
Zum Beispiel geht man in porzinen KOKs von einer deutlich früheren MAPK- Aktivierung in den Kumuluszellen aus, als in den Oozyten. Während die Eizellen erst zeitlich nah um den GVBD (INOUE et al. 1995, 1998) die ansteigende MAPK- Phosphorylierung aufwiesen, konnte dies bei Kumuluszellen schon zum Beginn der IVM (0-2 h) festgestellt werden (EBELING et al. 2007).
2.2.2 OSFs (oocyte-secreted factors)
Ursprünglich wurde angenommen, dass die somatischen Zellen im Follikel die stoffwechselinaktive Eizelle mit Nährstoffen versorgen und für die Regulation der Follikulogenese mit dem Heranreifen der Eizelle verantwortlich sind. Inzwischen belegen zahlreiche Studien deutlich, dass von der Eizelle sezernierte parakrine Faktoren, die oocyte-secreted factors (OSFs), an der Regulation zellulärer Prozesse beteiligt sind.
Bei Säugetieren sind zur Zeit 35 OSFs der TGF-ß-Superfamilie bekannt, von denen mindestens 9 zur GDF (growth differentiation factor)- und 20 zur BMP (bone morphogenic protein)-Subfamilie gehören. Weiterhin existieren die Subfamilien der Activine/Inhibine, der glial cell-derived neurotrophic factors (GDNF) sowie der Anti-Müller-Hormone (AMH) (KNIGHT u. GLISTER 2006).
Soweit bisher bekannt, werden GDF9, BMP15 und BMP6 von der Oozyte selbst sezerniert, BMP4 und BMP7 gelangen von den Thekazellen zu den Rezeptoren der Granulosazellen (SHIMASAKI et al. 1999). Von den Granulosazellen aus erfolgt die Sekretion des BMP2 und BMP5 zu den Thekazellen und den Oozyten.
BMP6 hingegen scheint nicht nur von der Eizelle selbst, sondern auch von den Granulosazellen sezerniert zu werden. Demnach könnte BMP6 neben GFD9 und BMP15 als einer der zentralen Regulatoren der Follikelfunktionen betrachtet werden (KNIGHT u. GLISTER 2006; HUNTER u. PARADIS 2009). Abbildung 3 zeigt eine Möglichkeit der bidirektionalen Kommunikation über OSFs zwischen Theka- und Granulosazelle sowie zwischen Granulosa- und Eizelle.
Abbildung 3: Bidirektionale Kommunikation der Oozyte (Ooz) mit Kumuluszellen (KZ), muralen Granulosazellen (MZ) und Thekazellen (TZ) über oocyte-secreted factors (OSFs). Modifiziert nach KNIGHT u. GLISTER (2006)
Auch in porzinen Follikelzellen sind einige Studien zur Identifikation der OSFs und ihrer Funktion durchgeführt worden. Die teilweise abweichenden Ergebnisse zu bisher genannten Untersuchungen zeigen die Bedeutung der Speziesspezifität
und verdeutlichen die Komplexität des OSFs-Systems. ZHU et al. (2008) wiesen BMP6, BMP15 und GDF9 in den Oozyten des Schweins nach, deren mRNA- Expression während der IVM der KOKs über 44 h abnahm. Zusätzlich stellten sie eine konstante BMP4-mRNA-Expression während der Kultivierung fest. In Kumuluszellen hingegen erhöhte sich das BMP4-Expressionslevel und die BMP6- Expression wurde vermindert. BMP15 wurde in den Kumuluszellen nicht nachgewiesen. BRANKIN et al. (2005b) detektierten BMP 2- und BMP6-Proteine in porzinen Granulosa- und Eizellen sowie im Maturationsmedium. PARADIS et al.
(2009) konnten in präovulatorischen Follikelzellen des Schweins eine BMP6-, GDF9- und eine BMP15-mRNA-Expression in allen Zellen ermitteln, jedoch fehlte BMP6-mRNA in den Granulosazellen. Nicht nur die speziesspezifischen Unterschiede in der Sekretion sondern auch die Funktionen der OSFs sind nur unzureichend geklärt. So zeigte sich zum Beispiel die Bedeutung von BMP6 für die Fertilität von Mäusen durch eine verringerte Ovulationsrate einhergehend mit deutlicher Reduktion der Wurfgröße nach einer Deletion im BMP6-Gen (SUGIURA et al. 2010). SOLLOWAY et al. (1998) hingegen verzeichneten nach einer Null- Mutation im BMP6-Locus lebensfähige Mäuse ohne einen Einfluss auf die Fruchtbarkeit. Die Mutation führte lediglich zu einer verzögerten Ovulation und interessanterweise schien der BMP6-Mangel zu einem kompensatorischen BMP2- Einfluss zu führen. Das Schaf scheint eine Ausnahme bezüglich der BMP6- mRNA-Expression darzustellen, da sie lediglich in den Oozyten und nicht in den Theka- bzw. Granulosazellen nachgewiesen wurde (JUENGEL et al. 2006). Auf welche Regulationsmechanismen die OSFs im Follikel Einfluss nehmen, ist ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung.
Die bisher am häufigsten untersuchten OSFs sind GDF9 (growth differentiation factor 9) und BMP15 (bone morphogenic protein 15). Den bedeutenden Einfluss von GDF9 auf die follikuläre Entwicklung zeigten DONG et al. (1996) an Mäuseoozyten. Die Deletion im GDF9-Gen führte zur Infertilität, da das Wachstum des Follikels bereits im Präantralstadium gehemmt wurde. Knock-out-Ratten wurden ebenfalls infertil und ihre Granulosazellen wiesen in vitro eine gehemmte
Progesteron- und Östradiolsekretion auf. Gleichzeitig war die LH-Rezeptorbildung geschwächt (VITT et al. 2000a;b).
BMP15 wird eine ähnlich bedeutsame Rolle im Bezug auf die Entwicklung des Follikels und der Eizelle zugesprochen. GALLOWAY et al. (2000) wiesen nach dem Auslösen einer Punktmutation im BMP15-Gen die Infertilität beim Schaf nach.
GDF9 und BMP15 ähneln sich nicht nur in ihrer Funktion im Säugerovar, sondern scheinen sich auch gegenseitig zu beeinflussen (KNIGHT u. GLISTER 2006). Die Immunisierung von Schafen mit GDF9- und BMP15-Peptiden wirkte ovulationshemmend und führte zu morphologischen Veränderungen im Ovar (JUENGEL et al. 2002). Mutationen in beiden Genen führten zwar zu einer erhöhten Ovulationsrate, jedoch phänotypisch zur Sterilität (HANRAHAN et al.
2004). BMP15-Deletionen der Maus haben im Vergleich zu GDF9-Mutationen nur Subfertilität und geringe histologische Defekte zu Folge. Allerdings nach der Paarung von GDF9-Mäusen mit BMP15-Knock-out-Mäusen reiften die Oozyten spontan, aber führten aufgrund fehlerhafter Follikulogenese zur Infertilität (YAN et al. 2001).
2.3 Steroidhormone im Ovar
Der Vorgang der Follikulogenese und somit das Heranreifen einer entwicklungskompetenten Eizelle kann als regulatorisches Wechselspiel zwischen Hypothalamus, Hypophyse und Ovar betrachtet werden. Dabei ist das Ovar nicht nur hormoneller Befehlsempfänger, sondern steuert durch seine sekretorischen Produkte des heranreifenden Follikels und des Corpus luteum (Gelbkörper) das Hypothalamus-Hypophysen-System. Dabei sind GnRH (Gonadotropin-Releasing- Hormon) aus dem Hypothalamus, FSH und LH aus der Adenohypophyse sowie die Steroidhormone Östrogen und Progesteron aus dem Ovar die wichtigsten Hormone, die in einem präzisen Zusammenspiel von positiver und negativer Wechselwirkung an der Steuerung beteiligt sind. Die ovarielle Steroidproduktion
hat bedeutenden Einfluss auf die Entwicklung und Funktionen des Uterus, der Milchdrüse, des Skeletts und des Gehirns. Außerdem sind die Steroidhormone lokal am Ovar entscheidend für die Prozesse des Follikelwachstums, der Eizellreifung und der Ovulation. Dabei gelangen die lipophilen Steroidhormone durch Diffusion aus dem Blutgefäßsystem in ihre Zielzellen, in denen sie an ihren Rezeptor binden und einen Steroid-Rezeptor-Komplex bilden. Dieser Komplex wird direkt in den Zellkern transportiert, in dem der aktive Rezeptor an einer spezifischen Sequenz der DNA bindet, die er als response element erkennt. Durch diese Bindung wird der Promotor aktiviert und die Transkription bis hin zur Proteinbiosynthese aufgenommen.
Während der Follikelphase wird die Hypophyse zur LH- und FSH-Produktion durch GnRH vom Hypothalamus stimuliert. Das Wachstum des Follikels wird durch FSH stimuliert und die Zellen der Theca interna beginnen Östrogen, vor allem Östradiol, zu sezernieren. Durch den wachsenden Follikel steigt im Verlauf die Östrogenproduktion rasant an und führt zu einer vermehrten GnRH-Produktion im Hypothalamus. Die Folge ist ein drastischer LH-Anstieg. Inzwischen haben die oder der Follikel LH-Rezeptoren ausgebildet und können auf das Hormon reagieren. Nach dem so genannten LH-Peak erfolgt die Ovulation. LH stimuliert nach der Ovulation die Transformation des zurückgebliebenen Follikelgewebes in den Gelbkörper. Das Corpus luteum sezerniert jetzt neben dem Östradiol das graviditätsichernde Progesteron, wobei das Zusammenspiel dieser beiden Steroidhormone durch ein negatives Feedback die weitere Freisetzung von LH und FSH aus der Hypophyse hemmt (CAMPBELL 1997).
Zusammenfassend wirken Östradiol und Progesteron als Hauptprodukte der Ovarien auf die hypothalamisch-hypophysäre Funktionseinheit und auf das Endometrium. Während der Follikelreifungsphase proliferiert das Endometrium östrogenabhängig und transformiert in der Corpus-luteum-Phase progesteronabhängig. Dabei laufen die hormonellen Prozesse zeitlich koordiniert ab, so dass nach einer erfolgreichen Follikelreifung in der Regel eine befruchtungsfähige Eizelle ovuliert und für den Fall einer Gravidität die physiologischen Bedingungen im weiblichen Genitaltrakt geschaffen sind.
2.3.1 Steroidhormonbiosynthese im Ovar
Im Ovar erfolgt die Synthese der Steroide durch das enge Zusammenspiel von Theka- und Granulosazellen (NAGAHAMA 1997). Die Granulosazellen des reifenden Follikels exprimieren FSH-Rezeptoren, während die LH-Rezeptoren initial nur auf den Thekazellen vorhanden sind (LIU et al. 1998). Das aus dem Hypophysenvorderlappen freigesetzte LH bindet an den Rezeptoren der Thekazelle und stimuliert die Aufnahme von Cholesterin als unmittelbare Vorstufe der Steroidhormonbiosynthese. Nach der Synthese der Androgene (Androstendion, Testosteron und Dehydroepiandrosteron) werden diese in die benachbarten Granulosazellen transportiert. In diesen Zellen werden die Androgene zu Östrogenen aromatisiert, nachdem FSH an den Rezeptoren gebunden wurde. Die Synthese von Androgen in den Thekazellen sowie die Aromatisierung zu Östrogenen in den Granulosazellen werden durch cAMP (cyclisches Adenosinmonophosphat) vermittelt. In porzinen Granulosazellen zeigten SHIMADA und TERADA (2002) die FSH-induzierte LH- Rezeptorexpression unter der Regulation von cAMP.
Den Beginn und gleichzeitig geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Steroidhormongenese stellt der Transport des Cholesterins von der äußeren zur inneren Mitochondrienmembran dar. Die Regulation erfolgt durch das Enzym StAR (steroidogenic acute regulatory protein), welches die Fähigkeit zur Cholesterinbindung aufweist (STOCCO u. CLARK 1996). Die Aktivität von StAR und somit die Initiierung der Steroidhormongenese im Ovar wurde bereits mehrfach in porzinen Granulosazellen untersucht. FSH und IGF-1 (Insulin-like Growth Factor 1) stimulieren cAMP als second messenger-Moleküle, welches wiederum die PKA (Proteinkinase A) aktiviert (BALASUBRAMANIAN et al. 1997;
PESCADOR et al. 1999; SEKAR et al. 2000). Die PKA phosphoryliert Aminosäurereste von verschiedenen Proteinen, welche wiederum Transkriptionsfaktoren unterschiedlicher Zielgene regulieren. Außerdem wird die Beteiligung der Proteinkinase C (PKC)-abhängigen Signaltransduktion an der Steroidhormonregulation diskutiert (PESCADOR et al. 1999).
An der inneren Mitochondrienmembran wird vom Cholesterin die Seitenkette zwischen den Kohlenstoffatomen 20 und 22 abgespalten und es entsteht Pregnenolon. Diesen Schritt metabolisiert die CYP11A1 (P450scc oder side chain cleavage-enzyme), welche zu der Familie der P450-Enzyme gehört. FLORES et al. (1999) zeigten auch hier eine Beteiligung der PKC an der cAMP-abhängigen Aktivität des Enzyms.
Die Utilisierung von Cholesterin zu Pregnenolon stellt den Stoffwechselschritt dar, bei dem aus dem C27-Substrat ein C21-Steroid entsteht. Vom Pregnenolon ausgehend gibt es zwei weitere Synthesemöglichkeiten, zum einen den
∆4- Syntheseweg und zum anderen den ∆5-Syntheseweg (s. Abb. 4). Im
∆4- Syntheseweg befindet sich die Doppelbindung im A-Ring zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5, während beim ∆5- Syntheseweg diese im B-Ring zwischen Kohlenstoffatom 5 und 6 lokalisiert ist. Die einzelnen Syntheseschritte, in denen die C-Atome im Steroidgerüst verringert werden, wird im Folgenden nicht detailliert betrachtet. Vielmehr werden die Schwerpunkte auf Enzyme bzw.
Steroide, die in dieser Arbeit untersucht werden, gesetzt. Im weiteren Syntheseverlauf im ∆4-Weg metabolisiert 3ß-HSD (3ß- Hydroxysteroiddehydrogenase) Pregnenolon zu Progesteron. Während des
∆5- Synthesewegs entsteht jedoch aus Pregnenolon über mehrere Zwischenstufen das Androstendion. Auch im ∆4- Stoffwechselweg entsteht letzendlich das C19-Steroid Androstendion sowie das Testosteron. Um aus den Androgenen Testosteron und Androstendion durch Aromatisierung des A-Ringes die Östrogene zu synthetisieren, ist das Enzym CYP19A1 (Cytochrom P450- Aromatase oder P450arom) notwendig. Somit wandelt diese Aromatase unter anderem Testosteron in 17ß-Östradiol um. CYP19A1 gehört ebenso wie CYP11A1 zu der Gruppe der P450-Enzyme. Die Aromataseaktivität von CYP19A1 ist bereits in verschiedenen Geweben nachgewiesen und deren Regulation scheint neben cAMP von vielen weiteren Faktoren abhängig zu sein (PAYNE u.
HALES 2004).
In folgender Abbildung (Abb. 4) ist der Vorgang der Steroidhormonbiogenese schematisch in vereinfachter Form dargestellt.
Abbildung 4: Überblick der Steroidhormonbiosynthese.
StAR: steroidogenic acute regulatory protein, CYP11A1: P450scc oder side chain cleavage-enzyme, CYP17A1: P450c17, CYP19A1: P450arom oder Cytochrom P450-Aromatase, 3ß-HSD: 3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase, 17ß-HSD: 17ß- Hydroxysteroiddehydrogenase, rot markierte Gene und blau markierte Steroide sind inhaltliche Schwerpunkte dieser Arbeit.
2.3.2 Einfluss der MAPK
Innerhalb der Steroidhormongenese wurde die Rolle der MAPK bereits mehrfach untersucht, jedoch lag dabei der Schwerpunkt der Studien auf den Granulosazellen. Wurde die Signalkaskade mittels MEK-Inhibitor unterbrochen, zeigten MOORE et al. (2001), TOSCA et al. (2005), ANDRIC und ASCOLI (2006) und MIYOSHI et al. (2007) in Granulosazellen der Ratte eine verminderte Progesteronsekretion. Die Ergebnisse von Untersuchungen mit murinen (SU et al.
2006) und humanen Granulosazellen (DEWI et al. 2002) unterstrichen dies. Bei den Granulosazellen der Ratte beschrieben die Autoren gleichzeitig eine gesteigerte Östradiolproduktion. Zum Teil wurde in diesen Studien auch die mRNA-Expression der steroidalen Enzyme untersucht. Dabei kam es zu einer gehemmten StAR-, CYP11A1- und 3ßHSD-Expression, jedoch wurde CYP19A1 vermehrt exprimiert. Diese Expressionsmuster korrelierten mit den Ergebnissen der Hormonsekretion. Lediglich MOORE et al. (2001) konnten keinen Einfluss auf CYP11A1 durch die Hemmung mit U0126 feststellen. Gegensätzlich zu den genannten Studien beschrieben SEGER et al. (2001) den MAPK-Signalweg als Downregulationsmechanismus innerhalb der Steroidhormongenese in Granuloszellen der Ratte, da die Hemmung zu einer erhöhten Progesteronsekretion und gesteigerten StAR-Expression führte. Auch TAJIMA et al. (2005) postulierten den Verlauf der Steroidhormonsynthese in bovinen Thekazellen als PKA-abhängigen aber MEK-unabhängigen Mechanismus, und beschrieben die MAPK ebenfalls als Downregulator für die Progesteron- und Androstendionsynthese. Die meisten Untersuchungen bezüglich der Steroidhormongenese und ihrer Genregulation wurden mit Granulosazellen durchgeführt. Eine ebenso bedeutsame Rolle scheinen jedoch auch die Kumuluszellen zu spielen, die wichtige Funktionen während der Eizellmaturation, des meiotischen Arrests und der Zytoplasmareifung übernehmen (TANGHE et al.
2002). Hinzu kommt, dass die Kumuluszellen durch einen engeren Kontakt zur Eizelle gekennzeichnet sind, als die Granulosazellen und somit eine interessante Untersuchungsgrundlage bezüglich der Steroidhormonsynthese darstellen.
2.3.3 Einfluss von BMP6
Da die MAPK-Kaskade an der Regulation der Steroidhormongenese beteiligt zu sein scheint, stellt sich die Frage, ob und wie die OSFs die Fähigkeit besitzen, auf diese Regulationsmechanismen Einfluss zu nehmen.
Schon 1970 konnten EL-FOULY et al. zeigen, dass die Entfernung von Kaninchenoozyten in Granulosazellkulturen zur Luteinisierung führt. Auch NEKOLA und NALBANDOV (1971) verhinderten in vitro die Luteinisierung von Granulosazellen der Ratte, indem sie zusammen mit Eizellen kultiviert wurden. Es wurde demnach frühzeitig erkannt, dass die Eizelle eine frühzeitige Luteinisierung somatischer Zellen im Follikel verhindert. Es folgten Studien, in denen die damit verbundene gesteigerte Progesteronsekretion sowie die gehemmte Östadiolsynthese gezeigt werden sollte. Darüber hinaus wurde begonnen, eizellspezifische Faktoren als Ursache zu suchen. VANDERHYDEN et al. (1993) zeigten in murinen Kumuluszellen, aus denen vorher die Oozyten entfernt wurden (OOX, oocyteectomized complexes), eine erhöhte Progesteron- und verminderte Östradiolsekretion. Gleichzeitig konditionierten sie das Maturationsmedium mit Eizellen und zeigten eine Hemmung der Progesteron- und Erhöhung der Östradiolsynthese in den OOX. 1995 konnten VANDERHYDEN und TONARY den hemmenden Einfluss von cAMP auf die Progesteronproduktion in Kumuluszellen der Maus und der Ratte ausfindig machen. Zusätzlich schlussfolgerten sie nach der Verwendung von Aromatasehemmern während der IVM, dass die OSFs die Steroidgenese voneinander unabhängig regulieren. Auch beim Schwein zeigten COSKUN et al. (1995) nach der Entfernung der Oozyte eine signifikant erhöhte Progesteronkonzentration im Maturationsmedium der OOX. Im Gegensatz zu bisher genannten Studien erhöhte sich hier gleichzeitig die Östradiolsekretion der Kumuluszellen. Die Hormonsekretion schien in diesen Untersuchungen ebenfalls cAMP-abhängig reguliert zu sein. Mit der Verwendung von Heptanol als gap- junction-Blocker wurde festgestellt, dass die OSFs nicht über diese Zellkommunikationskanäle in die Kumuluszellen gelangen. LI et al. (2000) legten ebenfalls Ergebnisse vor, die eine Luteinisierungshemmung der OSFs beim Rind
bestätigen. Dafür wurden denudierte Oozyten (von Kumuluszellen befreite Eizellen) Granulosazellkulturen zugefügt und dies hatte eine Halbierung der Progesteronkonzentration im Medium zur Folge.
Um die Fragestellung zu beantworten, welche OSFs die Steroidhormonsynthese regulieren, wurde auch hier am häufigsten der Einfluss von GDF9 und BMP15 untersucht. OTSUKA et al. (2001a;c) führten durch BMP15 eine verminderte FSH- Rezeptor-mRNA-Expression in Granulosazellen der Ratte herbei und hemmten dadurch die Progesteronsekretion. Rekombinantes GDF9 in humanen Granulosa- und Thekazellkulturen bewirkte eine verminderte CYP11A1- und CYP19A1- Expression (YAMAMOTO et al. 2002). Auf welche Weise die Sekretion der OSFs auf dem parakrinen Weg reguliert wird, ist überwiegend unklar. Für GDF9 wurde der SMAD (Small mothers against decapentaplegic)-2/3-Weg und für BMP15 der SMAD-1/5/8-Weg diskutiert. Da die Rezeptoren für die Mitglieder der TGF-ß- Superfamilie durch ihre Phosphorylierung nicht nur Proteine der SMAD-Familie aktivieren können, sondern auch andere Proteinkinasen, scheinen die OSFs u. a.
die Funktionen der Kumuluszellen über den MAPK-Signalweg beeinflussen zu können (GILCHRIST et al. 2008).
Nach GDF9 und BMP15 soll an dieser Stelle BMP6 als möglicher Einflussfaktor auf die Regulation der Steroidhormongenese in Betracht gezogen werden. In einigen Spezies war diese Hypothese bereits Bestandteil von Studien, in denen auch wiederum hauptsächlich Granulosazellen verwendet wurden. OTSUKA et al.
(2001b) zeigten in Kulturen von Rattengranuloszellen nach Supplementierung der Medien mit BMP6 ähnliche Ergebnisse wie mit BMP15. Die Progesteronsekretion wurde gehemmt, ebenso die mRNA-Expression von StAR und CYP11A1. Jedoch schien sich die Regulation der Steroidhormongenese durch BMP6 von BMP15 zu unterscheiden, denn die FSH-Rezeptorexpression wurde nicht gehemmt, sondern die cAMP-Produktion. GLISTER et al. (2004) postulierten, dass BMP6 in bovinen Antralfollikeln in Granulosazellen und Oozyten exprimiert wird. Die IVM der Zellen mit BMP6 führte bei dieser Spezies ebenfalls zur verminderten Progesteronsekretion. Zusätzlich konnte immunochemisch die Aktivierung des SMAD-1/5/8-Signalweges durch BMP6 gezeigt werden.
Innerhalb der porzinen Steroidhormongenese wurde die mRNA-Expression von StAR und 3ß-HSD mit BMP6 in den Granulosazellen signifikant unterdrückt, nachdem auch hier eine reduzierte Progesteronproduktion nach 48 h IVM gezeigt wurde (BRANKIN et al. 2005a).
In den genannten Studien scheint BMP6 regulatorisch auf die cAMP-Synthese zu wirken und deshalb Einfluss auf die Steroidhormonproduktion zu nehmen. Es wurde jedoch nicht nur der Einfluss auf cAMP diskutiert, sondern auch mögliche Regulationen unterhalb des second messenger-Moleküls, direkt an den Signalkaskaden der Proteinkinasen.
In humanen Brustkrebszellen scheint BMP6 die Apoptose neben dem SMAD- Signalweg über die p38MAPK als Subtypen der MAPK zu hemmen (DU et al.
2008; VALERA et al. 2010). In Kleinhirnzellen von Ratten wurde die kaliumvermittelte Apoptose durch BMP6 scheinbar nur über den MEK/ERK- Signalweg reguliert (BARNEDA-ZAHONERO et al. 2009). In Granulosazellkulturen der Ratte schrieben die Autoren den direkten Einfluss auf die MAPK dem BMP7 zu, welches die FSH-induzierte MAPK-Phosphorylierung blockiert. BMP6 soll dabei lediglich gemeinsam mit BMP7 die cAMP-Synthese hemmen (MIYOSHI et al. 2007).
2.4 Zielsetzung der Arbeit
Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Kenntnisse über den Zusammenhang der Steroidhormongenese in porzinen Kumumuluszellen mit MAPK und OSFs zu gewinnen.
Dafür ergaben sich folgende Fragestellungen:
Welche Mengen an Progesteron und 17ß-Östradiol werden von porzinen KOKs während der Maturation sezerniert?
Welche Expressionsmuster der mRNA von StAR, CYP11A1, CYP19A1 und 3ß- HSD existieren in Kumuluszellen während der IVM von KOKs nach verschiedenen Kultivierungszeiträumen?
Wie reguliert die MAPK die mRNA-Expression steroidaler Enzyme und beinflusst die Hormonsynthese von Progesteron und 17ß-Estradiol?
Welchen Effekt hat BMP6 als möglicher OSF auf die MAPK-Aktivität?
Ist BMP6 an der Regulation der Steroidhormonsynthese in Kumuluszellen des Schweins beteiligt?
3 Methoden
Alle Herstellerangaben der verwendeten Geräte, Materialien, Chemikalien, Reagenzien sowie Software bzw. Datenbanken des Internets sind im Anhang (9.3) aufgeführt und werden daher nicht im Text erwähnt. Ausnahmen stellen Methoden dar, die an anderen Instituten durchgeführt wurden. In diesen Fällen sind die Angaben im laufenden Text angegeben.
3.1 Isolierung und Klassifizierung der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die Ovarien von präpubertären Schweinen wurden auf den Schlachthöfen in Hannover und Gleidingen etwa 15-30 min nach der Schlachtung der Tiere gewonnen. Die Schweine waren zwischen 5-6 Monate alt und wiesen ein Körpergewicht von 85-100 kg auf. Nach der Abtrennung der makroskopisch intakten Ovarien ohne Gelbkörper vom Genitaltrakt wurden diese in ca. 37 °C warmer 0,9%iger NaCl-Lösung in einem Thermosgefäß gesammelt und innerhalb von ein bis zwei Stunden in das Labor transportiert. Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Eierstöcke erneut in frischer, 37 °C warmer 0,9%iger NaCl-Lösung gelagert.
Für die Isolation der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) wurden intakte Follikel mit einem Durchmesser von 3-5 mm mit einem sterilen Skalpell aufgeschnitten und mit 37 °C warmen Spülmedium gespült. Die Spülflüssigkeit wurde in einem Uhrglas aufgefangen und die darin enthaltenen KOKs unter stereomikroskopischer Kontrolle (200-400facher Vergrößerung) mit einer ausgezogenen, zuvor silikonisierten Pasteurpipette entnommen. Anschließend wurden sie in Petrischalen mit 2 ml Sammelmedium überführt und zweimal gewaschen.
Anhand der Morphologie des Zytoplasmas und der Anzahl von Kumuluszellschichten wurden die KOKs in Anlehnung an LEIBFRIED und FIRST (1979) wie folgt klassifiziert.
Tabelle 1: Klassifizierung der KOKs.
Kategorie I
Oozyten, die von einem kompakten, nicht expandierten Cumulus oophorus mit drei oder mehr Zellschichten umgeben sind und ein gleichmäßig granuliertes Zytoplasma besitzen.
Kategorie II
Oozyten mit einem kompakten, nicht expandierten Cumulus oophorus von weniger als drei Zellschichten und teilweise ungleichmäßiger Granulation des Zytoplasmas
Kategorie III Oozyten, die lediglich von der Corona radiata umgeben sind.
Kategorie IV Oozyten ohne anhaftende Zellschichten an der Zona pellucida.
Für alle Versuche wurden nur KOKs der Kategorie I und II verwendet.
3.2 Kultivierung der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Als Basis für die Kultivierung der KOKs diente das Maturationsmedium TCM 199 (tissue culture medium 199 mit Earls’s Salzen und NaHCO3), welches bei 4 – 8 °C gelagert und nicht länger als drei Wochen verwendet wurde. Vor Versuchsbeginn wurde dem Medium 2,5 µg/ml porzines FSH; 5,0 µg/ml porzines LH sowie 100 nM Androstendion frisch hinzugefügt. Die Inkubation der KOKs erfolgte in Multischalen mit vier Vertiefungen zu Gruppen von 20 KOKs in jeweils 500 µl Medium in einer 5%igen CO2-Atmosphäre und gesättigter Luftfeuchte bei 39 °C.
Als Kultivierungszeiträume wurden zunächst jeweils 0 h, 5 h, 26 h und 46 h gewählt. Das beschriebene Medium TCM 199 mit den Hormonen LH, FSH und Androstendion diente bei allen Versuchen als Basismedium und wird nachfolgend
in dieser Arbeit als BM bezeichnet. Um den Einfluss der MAPK zu untersuchen, wurden die KOKs unter den o. g. Bedingungen kultiviert und das BM wurde zusätzlich mit dem MEK-Inhibitor U0126 (20 µM) versetzt.
Um zu analysieren, in welcher Weise BMP6 die Steroidhormongenese oder die MAPK-Aktivität beeinflusst, wurde das BM ebenfalls wie oben beschrieben verwendet, nur dass zusätzlich BMP6 (100 ng/ml) dem Medium zugefügt wurde.
Nach Beenden der Maturationszeit von 26 und 46 h wurden die KOKs für ca. 30 Sekunden in 0,25 %iger Hyaluronidase bei Raumtemperatur inkubiert, um anschließend die anheftenden Kumuluszellen durch wiederholtes Aufziehen mit einer ausgezogenen Pasteurpipette mechanisch zu entfernen. Für KOKs direkt nach Isolation (0 h) und Kultivierung von 5 h wurde das Denudieren ohne die Inkubation mit Hyaluronidase durchgeführt. Die entfernten Kumuluszellen sowie die Oozyten wurden nach dreimaligem Waschen in ca. 4 µl proteinfreien PBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline) bei -80 °C in Eppendorfreaktionsgefäßen gelagert. Die Lagerung des Maturationsmediums erfolgte bei -20 °C.
Verlängerung der Kultivierungszeit
Um den möglichen Einfluss von BMP6 näher zu untersuchen, wurde nach den ersten Ergebnissen die Kultivierungsdauer der KOKs verlängert und als zusätzliche Untersuchungszeitpunkte 72 und 94 h gewählt. Die verlängerte Kultivierung im BM wurde zum Vergleich mit BMP6-kultivierten KOKs ebenfalls durchgeführt.
3.3 Vitalfärbung der Kumuluszellen
Zusätzlich zur Kernreifungsuntersuchung der Eizellen sollte bei der verlängerten Kultivierungsdauer gewährleistet sein, dass die Kumuluszellen ebenfalls keine degenerativen Erscheinungen aufweisen. Deshalb wurden in Vorversuchen Vitalfärbungen mittels Trypanblau durchgeführt. Der Farbstoff wurde 1:100 in PBS
verdünnt. Die Kumuluszellen wurden nach der Zentrifugation (300 x g für 2 min) in 10 µl PBS resuspendiert und mit einem Tropfen des verdünnten Farbstoffs versehen. Anschließend wurden die Zellen lichtmikroskopisch bei 200-400facher Vergrößerung beurteilt und ausgezählt. Die Zellen, deren Membranintegrität der Plasmamembran nicht mehr gegeben war, nahmen den blauen Farbstoff auf und wiesen im Zelleib nur noch einen Zytoplasmarest auf (Abb. 5). Diese Kumuluszellen konnten als degeneriert eingestuft werden. Vitale Kumuluszellen hingegen erschienen nicht nur größer, sondern deutlich blasser und unterschieden sich durch ihre intakte, runde bis ovale Form mit glatter Zellmembran und erkennbaren Zellkern (Abb. 5).
Insgesamt wurden 314 Zellen ausgezählt und beurteilt. Davon waren 278 (88,5 %) vital und 36 Zellen (11,5 %) degeneriert. Dieser Vorversuch zusammen mit den Ergebnissen der Kernreifungsanalyse (s. 4.1) wurde so gewertet, dass die In-vitro- Bedingungen für die KOKs auch nach 72 bzw. 94 h geeignet sind.
vitale Kumuluszelle
degenerierte Kumuluszelle
Abbildung 5: Vitalfärbung der Kumuluszellen mit Trypanblau nach 94 h IVM bei 200facher Vergrößerung.
3.4 Beurteilung des Kernreifungsstatus
Für alle IVM-Versuche, mit BM, BM+U0126 sowie BM+BMP6 wurde parallel der Kernreifungsstatus der Oozyten ermittelt. Dafür wurden die Eizellen, wie unter 3.2 beschrieben, nach der jeweiligen Kultivierungszeit denudiert. Ein Deckgläschen wurde mit einer Paraffin-Vaseline-Mischung (9 Teile Vasline : 1 Teil Paraffin) als Abstandshalter in jeder Ecke sowie einem 50 µl Tropfen 0,7%iger Kaliumchloridlösung (KCL) in der Mitte versehen, worin die Eizellen pipettiert wurden, nachdem sie zweifach in 0,7%iger KCL gewaschen wurden. Der vorher mittels Ethanol entfettete Objektträger wurde anschließend auf das Deckgläschen gelegt und konnte unter stereomikroskopischer Kontrolle nach dem Umdrehen des Präparates festgedrückt werden. Das Oozytenpräparat wurde für mindestens 24 h in einer Lösung aus Eisessig:Ethanol im Mischungsverhältnis 1:3 fixiert.
Anschließend erfolgte die Färbung mit 2%iger Aceto-Orceinlösung, wobei der überschüssige Farbstoff mit 25%iger Essigsäure ausgewaschen wurde.
Die Beurteilung des Kernreifungstatus erfolgte mit einem Phasenkontrastmikroskop (BX 60, Olympus) bei 200 – 400-facher Vergrößerung.
Die Fotodokumentation wurde mit der Software Cell D 2,6 System (Olympus) in Anlehnung an HUNTER und POLGE (1966) sowie MOTLIK und FULKA (1976) durchgeführt.
Tabelle 2: Einteilung der Kernstadien nach HUNTER und POLGE (1966) sowie MOTLIK und FULKA (1976).
Germinalvesikelstadium (GV)
Die intakte Kernmembran ist deutlich zu erkennen und umgibt den großen vesikulären Kern vollständig.
GV I
Der Nukleolus ist vorhanden. Um das Kernkörperchen sind ring- oder hufeisenförmige Ansammlungen von orceinpositiven Material zu erkennen.
GV II
Der Nukleolus ist vorhanden. Es sind einige orceinpositive Bereiche an der Kernmembran zu erkennen.
GV III
Der Nukleolus ist vorhanden. Das Chromatin stellt sich als fädige bis klumpige Struktur dar.
GV IV
Der Nukleolus ist nicht mehr vorhanden. Das Chromatin ist als irreguläres Netzwerk oder als individuell
fadenförmige Bivalente anfärbbar.
Diakinese Die Kernmembran löst sich auf. Die Chromosomen sind als gut anfärbbare Körper sichtbar.
Metaphase I Der Zellkern ist nicht mehr vorhanden. Die
Chromosomen sind maximal kondensiert und in einem Cluster in der Äquatorialebene einer bipolaren Spindel angeordnet.
Anaphase I Die Chromosomen migrieren zu den Polen einer elongierten Spindel.
Telophase I Die beiden Chromosomengruppen sind auseinander gewichen und stellen sich als hyperkondensierte Chromatinaggregate dar. Die meiotische Spindel ist deutlich zu erkennen.
Metaphase II Die Chromosomen sind auf zwei Cluster verteilt.
Teilweise ist die Membran des ersten Polkörpers
darstellbar. Die Chromosomen der Eizelle sind erneut in der Äquatorialebene anegordnet.
Befruchtung oder Alterung der Eizelle
Anaphase II Die Chromatiden werden am Centromer getrennt und wandern zu den Zellpolen.
Der Spindelapparat ist deutlich zu erkennen.
Telophase II Die Chromatidengruppen sind auseinander gewichen und befinden sich an den Zellpolen.
3.5 Bestimmung der Hormonkonzentrationen im Medium
Die Hormonsekretion der Kumuluszellen unter den verschiedenen In-vitro- Bedingungen wurde mittels der Bestimmung der 17ß-Estradiol- und Progesteronkonzentration im Medium analysiert. Die Messungen mittels Radioimunoassay (RIA) erfolgten am Leibnitz-Institut für Nutztierbiologie in Dummerstorf (AG Prof. Dr. W. Kanitz).
Progesteron (P4)- und 17-Estradiol (E2)- Konzentration
Das Verfahren des Radioimunoassays beruht auf einer Antigen- Antikörperreaktion. Die Trennung der freien und antikörpergebundenen Hormone erfolgte mittels der Dextran-Aktivkohle-Methode. Die P4-Konzentration wurde dabei mit einem direkten kompetitiven 3H-RIA gemessen. Als radioaktives Isotop zur Markierung und Detektion (Tracer) wurde ein 1,2,6,7-3H(N) Progesteron (GE Healthcare, Freiburg) verwendet. Der Antikörper wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit einem 11-OH-Progesteron-Konjugat erzeugt und chromatografisch mit einem Titer 1:30.000 aufgereinigt. Die Messansätze wurden zuerst bei 37 °C für 30 min und anschließend für 2 h bei 4°C inkubiert. Für die Konzentrationsermittlung wurde eine Eichkurve im Bereich von 6,25 – 1600 pg/ml gewählt. Mit Hilfe eines Flüssigszintillationssprektrometers (LSC) mit integriertem RIA-Auswertprogramm (TriCarb 2900 TR, Perkin-Elmer, Rodgau) erfolgten die Messungen der Radioaktivität und die Kalkulation der RIA-Qualität sowie der Standard/Medienkonzentration. Die Variationskoeffizienten betrugen für VKintra 7,6 % und für VKinter 9,8 %. Die Empfindlichkeit des P4-RIA ist durch wiederholte Messung des Nullstandards ermittelt wurden und betrug 7 pg/ml.
Die Messung der E2-Konzentration im Medium erfolgte mit einem modifizierten kompetitiven 3H-RIA mit 15 µl Medium. Der Antikörper wurde ebenfalls durch Immunisierung von Kaninchen mit einem Titer 1:70.000 erzeugt und als Tracer diente ein 2,4,6,7-3H Estradiol-17ß (GE Healthcare, Freiburg). Die Versuchsbedingungen für die Inkubationsschritte, Radioaktivitätsmessung sowie
Berechnung der Hormonkonzentration erfolgten wie unter oben beschrieben. Die ermittelte Empfindlichkeit des E2-RIA betrug 3 pg/ml. Als Variationskoeffizienten ergaben sich für VKintra 6,9 % und für VKinter 9,9 %.
3.6 Molekularbiologische Methoden
3.6.1 RNA-Extraktion
Bei allen Arbeitsschritten wurden die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um Verunreinigungen und Kontaminationen der RNA (ribonucleic acid) mit RNasen oder genomischer DNA (desoxyribonucleic acid) zu vermeiden. Für die Arbeiten mit RNA wurden grundsätzlich Nitrileinmalhandschuhe, Pipettenspitzen mit Filter und RNase-freie Materialien verwendet. Alle Lösungen, Glas- und Reaktionsgefäße wurden für 20 min bei 121 °C und 1,5 bar autoklaviert.
Zur Gewinnung der Gesamt-RNA aus den Kumuluszellproben bzw. aus den Oozyten von jeweils 20 Kumulus-Oozyten-Komplexen wurde das RNeasy Mini Kit eingesetzt, wobei die im Handbuch beschriebene Anleitung als Grundlage für die einzelnen Arbeitschritte diente. Es wurden nur Puffer und Lösungen verwendet, die im Kit enthalten sind. Die genauen Zusammensetzungen sind nicht bekannt.
Vor jeder RNA-Extraktion wurde eine Lösung aus RLT-Puffer mit ß-Mercaptoethanol (10 µl ß-ME/1 ml Puffer) frisch hergestellt.
Die zuvor bei -80 °C gelagerten Kumuluszell- bzw. Oozytenpellets wurden jeweils in 330 µl dieses RLT-Puffers mit ß-Mercaptoethanol resuspendiert und auf DNA- shredder-Säulen pipettiert und anschließend bei ca. 10.000 x g für 3 min zentrifugiert. Die Säulen mit der überschüssigen genomischen DNA wurden verworfen und das Lysat mit 330 µl 70%igem Ethanol versetzt, um die Vorraussetzung für die Bindung der RNA zu schaffen. Nach dem Mischen durch mehrfaches Auf- und Abpipettieren wurde das Lysat in 2 ml RNA-Sammelgefäße überführt und erneut bei ca. 10000 x g für 3 min zentrifugiert. Der Durchlauf wurde
anschließend verworfen und die RNeasy-Säulen auf 2 ml Eppendorfreaktionsgefäße ohne Deckel überführt. Die Säulen mit der gebundenen RNA wurden dann einmal mit 500 µl RW1-Puffer und zweimal mit 500 µl RPE- Puffer versetzt und nach jedem Schritt für 3 min bei ca. 10000 x g zentrifugiert.
Danach wurden die Säulen in 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt und mit jeweils 30 µl RNase-freiem Wasser versetzt. Die Proben kamen danach für 5 min auf den Rüttler und wurden anschließend ein letztes Mal für 3 min bei 10000 x g zentrifugiert. Die Säulen wurden verworfen und die extrahierte RNA bei -80 °C gelagert.
3.6.2 Kontrolle der RNA-Qualität
Um die Nativität der extrahierten RNA zu überprüfen, wurde diese in einem 1%igem denaturierenden Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und auf das Auftreten der 28S- und 18S-Banden der ribosomalen RNA (rRNA) hin untersucht.
Die Herstellung des Agarosegels ist dem Anhang (9.3) zu entnehmen. Im Anschluss an die Herstellung des Gels wurden in heißem Zustand 9,6 ml 37%iges Formaldehyd hinzugefügt und erneut für 30 s aufgekocht. Das Gel wurde in die Kammer gegossen und polymerisierte innerhalb von 20-30 min. Jeweils 4 µl der Proben wurden mit 4 µl Ladepuffer versetzt. Als RNA-Größenmarker wurden 2 µl RNA-Ladder mit 2 µl Ladepuffer verwendet. Die Proben und der Größenmarker wurden bei 70 °C für 10 min denaturiert und anschließend sofort auf Eis gelagert.
Als Elektrophoresepuffer wurde 1fach MOPS-Lösung (3-(N-morpholino)- Propansulfonsäure-Lösung) verwendet. Jede Geltasche wurde mit 8 µl Gesamtvolumen bzw. 4 µl beim Größenmarker gefüllt. Die Elektrophorese lief konstant für 60 min bei 70 V und 400 mA. Aufgrund der Ethidiumbromideinlagerungen des Ladepuffers konnte die Auftrennung der RNA in 28S- und 18S-rRNA Untereinheiten unter UV-Licht sichtbar gemacht und fotodokumentatorisch festgehalten werden.
Zusätzlich zum denaturierenden Agarosegel wurde die RNA-Qualität stichprobenartig anhand ihres Degradierungsgrades mittels Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent technologies, Böblingen) beurteilt. Diese Untersuchungen wurden an der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (AG Prof. Dr. C. Wrenzycki) durchgeführt.
3.6.3 Bestimmung der RNA-Konzentration
Der Gehalt an Gesamt-RNA wurde für jede Probe photometrisch bestimmt. Vor jeder Messung wurde das Photometer mit DEPC-H2O geeicht. Jede RNA-Probe wurde 1:100 mit DEPC-H2O verdünnt und in UV-Einmal-Küvetten mit einer Zentrumshöhe von 15 mm bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die RNA-Konzentration wurde anschließend nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz wie folgt berechnet:
cRNA [µg/µl] = A x f
Dabei steht A für Absorption und f ist der Umrechnungsfaktor des Photometers von 0,4 µg/µl. Eine optische Dichte bei 260 nm (OD260) von 1 entspricht daher einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Die RNA-Konzentrationen der Proben wurden aus dem Mittelwert der Messungen berechnet. Während der Durchführung wurden die Proben auf Eis gelagert.
3.6.4 Ermittlung PCR-Zyklusanzahl
Um eine semiquantitative Auswertung durchführen zu können, wurde für jedes Transkript die geeignete Zyklusanzahl der PCR (polymerase chain reaction) ermittelt. Dafür wurde die Zyklusanzahl gesucht, in der die PCR noch in der
