4.1 Kernreifungsraten
4.1.2 Einfluss von BMP6 auf die Kernreifung der Oozyten
Für diese Untersuchung wurden die Kernreifungsstadien von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger IVM im BM und BMP6 supplementiertem BM untersucht und miteinander verglichen. Die detaillierten Ergebnisse sind Tab. 10 (s. 9.5) zu entnehmen. Die Verfahrensweise des Gruppierens der Meiosestadien für die vergleichende Auswertung ist beibehalten worden.
Abbildung 8: Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h IVM im BM verglichen mit BMP6 supplementiertem BM. Säulen mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant, p<0,05. GV: Germinalvesikel, Di/MI/AI/TI: Diakinese / Metaphase I / Anaphase I / Telophase I, MII: Metaphase II, AII/TII: Anaphase II/Telophase II, deg.: degeneriert
deg.
AII/TII MII
GV
+ BMP6
In beiden Versuchsansätzen haben ca. 70% der Oozyten nach 26 h die Meiose wieder aufgenommen, über 80 % erreichten nach 46 h das Stadium der Metaphase II. Nach 72 und 94 h haben ca. 15 % die Meiose bis zur Ana- bzw.
Telophase II fortgesetzt. Während der gesamten IVM mit BMP6 zeigten sich gegenüber der Maturation im BM nur geringfügige Unterschiede in der Kernreifung, die zu keinem Zeitpunkt eine Signifikanz aufwiesen.
4.2 Kumuluszellexpansion im BM, BM+U0126 und im BM+BMP6
Die folgende Abbildung (Abb. 9) soll einen vergleichenden Überblick über die Morpholgie der KOKs geben, mit dem Ziel, die Kumuluszellexpansion nach den verschiedenen IVM-Zeiten qualitativ zu beurteilen. Nach 5 h Kultivierung der KOKs zeigte sich in allen Medien kein Unterschied bezüglich der qualitativen Beurteilung des Kumuluszellverbandes, die Zellen lagen als kompakte Zellmasse um die Eizelle herum und zeigten nur teilweise eine geringfügige Auflockerung am äußeren Rand des Cumulus oophorus. Nach 26 h konnte nach der Kultivierung im BM und im BM+BMP6 eine deutliche Zunahme der Auflockerung der äußeren Kumuluszellen beobachtet werden, die Corona radiata lag weiterhin als dichte Zellschicht vor. Nach der IVM mit U0126 blieb diese Expansion der Kumuluszellen aus. Nach 46 h konnte bei KOKs aus dem BM und BM+BMP6 eine vollständige Auflockerung des Cumulus oophorus einschließlich der corona radiata festgestellt werden. Mit U0126 hingegen war nur teilweise eine geringgradige Lockerung der äußeren Zellen des Kumuluszellverbandes aufgefallen. Die KOKs lagen als dichte Gruppe mit direktem Zellkontakt vor. Nach Verlängerung der Kultivierungszeit auf 72 bzw. 94 h konnte der fortschreitende Prozess der Kumuluszellauflockerung beobachtet werden. Weiterhin kam es zu einer clusterartigen Anordnung einzelner Kumuluszellgruppen. Beim Vergleich der IVM-Ansätze BM mit BM+BMP6 konnte diesbezüglich kein Unterschied festgestellt werden.
Ergebnis
0 h 5 h 26 h 46 h 72 h 94 h IVM
Abbildung 9: Stereomikroskopische Übersicht der KOKs nach IVM im BM, BM+U0126, BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h, 22,5-90fache Vergrößerung
BM
BM+ U0126
BM+BMP6
4.3 Hormonanalysen im Medium
4.3.1 17ß-Estradiolkonzentrationen (E2)
Die detaillierten Messwerte der E2-Konzentrationen sind Tab. 12 (s. 9.5) zu entnehmen. Für die Auswertung (Abb. 10a+b) wurden jeweils die Hormonwerte nach IVM im BM mit denen aus dem BM+U0126 und BM+BMP6 verglichen. Die statistischen Untersuchungen beziehen sich zum Einen auf die Unterschiede in dem jeweiligen Kultivierungsansatz und zum Anderen auf die Einflüsse der Zusätze U0126 und BMP6 innerhalb der Zeitpunkte.
E2 im BM und der Einfluss von U0126
Während der Kultivierung im BM sezernierten die KOKs nach 5 h unter 2 ng/ml 17ß-Estradiol, nach 26 h zeigte sich eine signifikant erhöhte Hormonkonzentration, die nach 46 h signifikant gehemmt wurde (p<0,05). Im Vergleich mit der E2 -Sekretion unter dem Einfluss von U0126 zeigte sich bis 26 h kein statistisch relevanter Unterschied. Jedoch am Ende der IVM konnte eine signifikant höhere E2-Konzentration als im BM gemessen werden.
E2 im BM und der Einfluss von BMP6
Nach verlängerter Kultivierungszeit im BM stieg die E2-Konzentration weiter an und erreichte gleichzeitig nach 94 h ihr Maximum von 12,0 ng/ml. Im Vergleich der E2-Messungen nach den sechs Kultivierungszeiträumen mit dem BM6 supplementiertem Medium zeigten sich keine relevanten Unterschiede.
0
Abbildungen 10a+b: E2-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h (Abb. 10a) und verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h (Abb. 10b). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede (p<0,05) innerhalb des Ansatzes hin, Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen innerhalb eines Zeitpunktes (p<0,01). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
Die E2-Sekretion der KOKs wurde durch den Hemmstoff U0126 nach 46 h gesteigert, ein Einfluss durch BMP6 konnte jedoch nicht gezeigt werden.
IVM (h)
4.3.2 Progesteronkonzentrationen (P4)
Die Ergebnisse der Konzentrationsmessungen von P4 im Medium nach der jeweiligen Kultivierungszeit der KOKs sind Tab. 11 (s. 9.5) zu entnehmen. Für die Auswertung (Abb. 11a+b) wurden jeweils die Hormonwerte nach IVM im BM mit denen aus dem BM+U0126 und BM+BMP6 verglichen. Die statistischen Untersuchen beziehen sich zum Einen auf die Unterschiede in dem jeweiligen Kultivierungsansatz und zum Anderen auf die Einflüsse der Zusätze U0126 und BMP6 innerhalb der Zeitpunkte.
P4 im BM und der Einfluss von U0126
Zunächst zeigten die Konzentrationsbestimmungen im BM eine geringe P4 -Sekretion (<100 ng/ml) der KOKs innerhalb des ersten Kultivierungszeitraumes bis 26 h. Nach 46 h stieg die Konzentration signifikant auf mehr als das Fünffache an.
Nach der Supplementierung des Mediums mit dem Hemmstoff U0126 zeigten sich im Verlauf deutlich geringere P4-Messwerte mit einem Maximum von 69,4 ng/ml nach 46 h (p<0,01). Innerhalb der Untersuchungszeitpunkte konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden.
Beim Vergleich der beiden Ansätze wird deutlich, dass U0126 die P4-Sekretion nach 46 h signifikant hemmt.
P4 im BM und der Einfluss von BMP6
Der signifikante Anstieg der P4-Sekretion im BM, der sich zuvor nach 46 h zeigte, setzte sich nach 72 und 94 h kontinuierlich fort. Nach 94 h konnte die höchste P4 -Konzentration von 1839,0 ng/ml ermittelt werden. Nach der IVM mit dem Zusatz von BMP6 zeigten sich im Vergleich zum BM kaum Unterschiede, lediglich nach 72 h wurde die P4-Sekretion durch BMP6 signifikant gesteigert (p<0,01).
0
Die Ergebnisse der Untersuchungen auf Einflüsse durch U0126 und BMP6 auf die P4-Konzentration sind in den folgenden Abbildungen dargestellt.
Abbildungen 11a + b: P4-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 (Abb.
11a) nach 0, 5, 26 und 46 h bzw. verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h (Abb. 11b). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede (p<0,01) innerhalb des Ansatzes hin, Sterne über den Säulen zeigen signifikanten Einfluss durch U0126 (p<0,01) bzw. BMP6. Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
Während der IVM der KOKs konnte durch den MEK-Inhibitor U0126 die Progesteronsekretion nach 46 h unterdückt werden. Eine Wirkung von BMP6 auf die P4-Produktion blieb aus, lediglich nach 72 h zeigte sich eine erhöhte P4 -Konzentration im Medium.
4.4 RNA
4.4.1 RNA-Integrität
Die RNA-Qualität wurde anhand der 28S-RNA (5,0 kb) und der 18S-RNA (1,9 kb) mittels denaturierender Gelelektrophorese beurteilt. Für weitere Untersuchungen wurden nur Proben verwendet, bei denen das Vorhandensein beider Untereinheiten nachgewiesen wurde. Außerdem wurden die Proben nicht weiter verwendet, wenn sich eine Degradierung der RNA durch RNasen als breiter
„Schmier“ im kurzen Fragmentbereich darstellte oder genomische DNA als Banden nahe der Auftragstelle auftraten. In Abbildung 12 ist ein Beispiel für intakte RNA nach der Extraktion dargestellt.
Abbildung 12: Denaturierendes Agarosegel einer RNA-Extraktion von Kumuluszellen nach IVM (0, 5, 26 und 46 h). Die 28S- und 18S-RNA-Banden sind deutlich und mit gutem Kontrast ausgeprägt, es ist keine genomische DNA oder degradierte RNA vorhanden, die extrahierte RNA ist intakt und von guter Qualität.
Zusätzlich wurde zur Überprüfung des Systems die RNA-Qualität stichprobenartig untersucht, indem der Degradierungsgrad der RNA mit dem Agilent Bioanalyzer 2100 analysiert wurde.
Es wurde nur extrahierte RNA verwendet, die eine RIN (RNA integrity number) von mindestens 7,5 aufwies und keine RNase-Degradierung zeigte. In Abbildung 13 ist ein Beispiel einer intakten RNA-Probe mittels Elektropherogramm dargestellt.
Abbildung 13: Elektropherogramm einer intakten Gesamt-RNA-Probe. Der linke Peak stellt den Ladder dar, die Integrität der 18S-und 28S-RNA werden durch die folgenden (gekennzeichneten) Peaks angezeigt.
4.4.2 RNA-Konzentration
In der vorliegenden Arbeit wurden die mRNA-Konzentrationen bestimmt, um anschließend die geeignete Konzentration von mRNA für die Reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) zu ermitteln. Die Mittelwerte der Gesamt-RNA Konzentrationen für jeweils 20 Oozyten betrug 11,67 µg/ml und
RIN: 9,2
28S Ladder 18S
für die dazugehörigen Kumuluszellverbände 82,42 µg/ml. Folgende RNA-Mengen wurden in der RT-PCR eingesetzt.
Tabelle 7: Für die RT-PCR eingesetzte Gesamt-RNA-Mengen der beiden Zelltypen (Kumuluszellen und Oozyten).
Zelltyp Transkripte cRNA in µg
Kumuluszellen GAPDH, StAR, CYP11A1,
CYP19A1, 3ß-HSD, BMP6 0,2
Oozyten BMP6 0,05
4.4.3 Identifikation der PCR-Produkte
Um eine semiquantitative Auswertung der mRNA-Level der zu untersuchenden Gene durchführen zu können, muss die Spezifität der Primer und der PCR-Amplifikate sicher gestellt sein. Dafür wurden 20 ng/µl PCR-Produkt an GATC Biotech AG (Konstanz) versendet, dort aufgereinigt und einer Single Read Sequenzanalyse unterzogen.
Nach der Sequenzierung der PCR-Produkte für GAPDH, StAR, CYP11A1, CYP19A1, 3ß-HSD und BMP6 wurde ein Vergleich mit den jeweiligen in der BLAST-Datenbank (NCBI) veröffentlichten kodierenden Gensequenzen durchgeführt. Dieser Vergleich zeigte 98-100%ige Übereinstimmungen für die gesuchten Gene. Die Abbildung 14 zeigt ein Sequenzierungsbeispiel mit guter Qualität des PCR-Produktes und 98%iger Übereinstimmung mit der veröffentlichten Gensequenz.
Abbildung 14: Sequenzierergebnis für den Sense Read von BMP6 (GATC Biotech AG). Der Datenabgleich zeigte eine 98%ige Übereinstimmung der in NCBI veröffentlichten Datenbank (NM_001168001.1, bone morphogenetic protein 6 [sus scrofa]).
4.5 RT-PCR
Die Messergebnisse wurden, wie unter 3.6.8 beschrieben, ermittelt und anhand der Transkriptions-Level von GAPDH standardisiert. Abbildung 15 zeigt eine repräsentative Gelelektrophorese im 1%igen Agarosegel des housekeeping-Gens GAPDH mit Ethidiumbromid markierten Banden unter UV-Licht.
Abbildung 15: Gelelektrophorese einer RT-PCR von GAPDH als house-keeping-Gen. Als Proben dienten Kumuluszellen von KOKs nach Kultivierung von 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h im BM. RNA-Proben, die Expressionsmuster in dieser Qualität beim GAPDH zeigten, wurden für die weiteren RT-PCR-Analysen in dieser Arbeit verwendet.
Im Folgenden werden die Ergebnisse der RT-PCR der mRNA der steroidalen Gene grafisch dargestellt. Dabei wurden jeweils die Transkriptions-Level der mRNA nach Kultivierung im BM mit BM+U0126 und mit BM+BMP6 verglichen. Die statistischen Untersuchen beziehen sich zum Einen auf die Unterschiede im zeitlichen Verlauf des jeweiligen Kultivierungsansatzes. Zum Anderen wurden die Einflüsse der Zusätze U0126 und BMP6 untersucht, indem jeweils die Ergebnisse nach gleicher Kultivierungszeit miteinander verglichen wurden.
4.5.1 StAR
Die Expressionsmuster der mRNA von StAR, welches Cholesterin von der inneren zur äußeren mitochondrialen Membran transportiert, zeigten in allen Kultivierungsansätzen einen kontinuierlichen Anstieg der Expression mit Zunahme der Kultivierungszeit.
Im BM nahm die relative mRNA-Dichte der Kumuluszellen nach 26 h signifikant zu und blieb bis zum Ende der IVM auf diesem erhöhten Niveau ohne weitere statistische Relevanz. Beim Vergleich mit dem mit U0126 supplemetiertem Medium zeigte sich zu keinem der Untersuchungszeitpunkte ein Unterschied.
Gleichermaßen konnte kein signifikanter Einfluss durch den Zusatz von BMP6 im Medium nachgewiesen werden.
Zunächst ist jeweils ein exemplarisches 1%iges Agarosegel für jeden Kultivierungsansatz nach Ethidiumbromidfärbung der RT-PCR-Produkte dargestellt (Abb. 16), die der folgenden Auswertung zu Grunde lag.
relative Dichte x 103
0 50 100 150 200 250 300
0 5 26 46 IVM (h)
BM
BM+U0126
a
a
b
b
a
a
b b
Abbildung 16: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von StAR in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
Für die folgende Auswertung wurden jeweils die relativen Dichten der mRNA nach IVM im BM mit denen aus dem BM+U0126 (Abb. 17) und BM+BMP6 (Abb. 18) verglichen. Die statistische Auswertung bezieht sich auf die Unterschiede in dem jeweiligen Kultivierungsansatz und auf die Einflüsse der Zusätze U0126 und BMP6 innerhalb der Zeitpunkte.
Abbildung 17: Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h.
Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede (p<0,01) innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
0
Abbildung 18: Relative Dichte der mRNA-Expression von StAR in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
4.5.2 CYP11A1
CYP11A1 codiert für das Cytochrom P450 side-chain-cleavage enzyme (P450scc), welches die Synthese von Cholesterin zu Pregnenolon metabolisiert.
Während der Maturation im BM wurde die mRNA des CYP11A1 in den Kumuluszellen auf einem konstanten Niveau bis zum Zeitpunkt 46 h exprimiert und es zeigten sich keine statistisch relevanten Unterschiede. Nach 72 und 94 h erhöhte sich das Expressions-Level (p<0,05).
Mit der Verwendung des MEK-Inhibitors U0126 während der IVM stellt sich die Expression nach 5 h signifikant erhöht dar (p<0,005). Jedoch zeigte sich beim Vergleich beider Ansätze zu jedem Zeitpunkt kein Unterschied, so dass U0126 auf die mRNA-Expression von CYP11A1 keinen Einfluss hatte.
BMP6 supplementiertes Medium hatte ebenfalls keinen Einfluss auf die Expressions-Level, außer zum Zeitpunkt 46 h. Nach dieser Kultivierungszeit
IVM (h) 0
50 100 150 200 250 300 350
0 5 26 46
a
b BM
BM+U0126
b b
a
a a
a
relative Dichte x 103
konnte die Expression von CYP11A1-mRNA durch BMP6 signifikant gesteigert werden (p<0,05).
Die folgendende Abbildung (Abb. 19) zeigt zunächst jeweils beispielhafte Bandenmuster der RT-PCR-Transkripte und anschließend folgt die grafische Darstellung der Ergebnisse der relativen Dichte der mRNA-Transkripte (Abb. 20 und 21).
Abbildung 19: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von CYP11A1 in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
Abbildung 20: Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP11A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
0
Abbildung 21: Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP11A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05), Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen während eines Zeitpunktes (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
4.5.3 3ß-HSD
Dieses Enzym katalysiert während der Steroidhormongenese unter anderem die Umwandlung von Pregnenolon zu Progesteron.
Während der IVM im BM nimmt die mRNA-Expression von 3ß-HSD bis zum Zeitpunkt 46 h stetig zu und erreicht gleichzeitig ihr signifikantes Maximum (p<0,05). Mit der Verwendung des Hemmstoffs U0126 konnte dieser zeitliche Anstieg von 0 bis 46 h Kultivierung zu jedem Zeitpunkt signifikant gehemmt werden (p<0,05).
Im BMP6 supplementiertem Medium wurde kein Effekt auf die Expression beobachtet. Nach der Verlängerung der Kultivierungszeit wurde lediglich die Expression nach 94 h durch BMP6 verringert.
Auch an dieser Stelle sind zunächst beispielhafte Bandenmuster der RT-PCR von den verschiedenen Kultivierungsansätzen dargestellt (Abb. 22), gefolgt von den Ergebnissen der relativen Dichte der PCR-Transkripte (Abb. 23 u. 24).
0 50 100 150 200 250 300
5
26 46
a
a
a
b
a a
a a
0 5 BM
BM+U0126
IVM (h)
relative Dichte x 103
Abbildung 22: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von 3ß-HSD in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
Abbildung 23: Relative Dichte der mRNA-Expression von 3ß-HSD in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05), Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen während eines Zeitpunktes (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
0 Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05), Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen während eines Zeitpunktes (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
4.5.4 CYP19A1
CYP19A1 codiert für die P450 Aromatase, die unter anderem Testosteron zu 17ß-Estradiol synthetisiert.
Wurden die KOKs im BM kultiviert, zeigte sich nach 5 h IVM ein signifikant erhöhtes Expressions-Level, welches nach 26 und 46 h wieder auf das Niveau des Kultivierungsbeginns (0 h) sank. Hingegen wurde mit U0126 nach 26 und 46 h die mRNA-Expression signifikant gesteigert (p<0,005).
Nach der Kultivierung mit BMP6 änderte sich das Expressionsmuster der mRNA von CYP19A1 nicht. Auch nach der verlängerten Kultivierungszeit zeigte sich kein Unterschied, in beiden Ansätzen (BM sowie BM+U0126) stieg nach 72 h die Expression auf das signifikant erhöhte Niveau (p<0,05) von 5 h an, um am Ende
b a b
0 20 40 60 80 100 120 140
0 5 26 46
a BM
BM+U0126
a b
a
ab
c
bc
IVM (h) der IVM nach 94 h wieder auf das 0 h-Niveau abzusinken. Es folgen Abbildungen der Bandenmuster der RT-PCR (Abb. 25) und anschließend die Darstellung der Ergebnisse (Abb. 26 u. 27).
Abbildung 25: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von CYP19A1 in Kumuluszellen aus den jeweiligen Kultivierungsansätzen BM, BM+U0126 und BM+BMP 6 mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
Abbildung 26: Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+U0126 über 0, 5, 26 und 46 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,005), Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen während eines Zeitpunktes (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
relative Dichte x 103
IVM (h)
Abbildung 27: Relative Dichte der mRNA-Expression von CYP19A1 in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im BM verglichen mit BM+BMP6 über 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05), Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen während eines Zeitpunktes (p<0,05). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
4.5.5 BMP6
In den bisherigen Versuchen wurde unter anderem der Einfluss von supplementiertem BMP6 während der IVM auf die mRNA-Expression der steroidalen Enzyme in den Kumuluszellen untersucht. Anhand der folgenden Versuchsergebnisse sollte jedoch das Expressionsmuster der zelleigenen BMP6-mRNA in den Oozyten und Kumuluszellen ermittelt werden.
Die relativen mRNA-Dichten zeigten in beiden Zelltypen ähnliche Ergebnisse innerhalb der Zeitpunkte. Nach 5 h IVM stieg die Expression signifikant mit gleichzeitigem Maximum an (p<0,05 Kumuluszellen, p<0,01 Oozyten). Nach dieser Maturationszeit sank in beiden Zelltypen die relative Dichte nach 26 und 46 h auf das Niveau von 0 h ab. Die Ergebnisse sind in Abbildung 29a+b dargestellt, nachdem in Abbildung 28 exemplarische Bandenmuster der RT-PCR von beiden Zelltypen nach Kultivierung im BM aufgeführt sind.
0
relative Dichte x 103 160 140 120 100
relative Dichte x 103
Abbildung 28: 1%ige Agarosegele der gefärbten PCR-Transkripte von BMP6 in Kumuluszellen und Oozyten aus dem Kultivierungsansatz BM mit dazugehörigen Kultivierungszeiten.
Abbildung 29a (Kumuluszellen) Abbildung 29b (Oozyten)
Abbildung 29a+b: Relative Dichte der mRNA-Expression von BMP6 in Kumuluszellen (a) und Oozyten (b) nach IVM der KOKs im BM nach 0, 5, 26 und 46 h. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05 Kumuluszellen, p<0,01 Oozyten). Dargestellt sind die Mittelwerte (x) mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD).
4.6 MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen
Um einen möglichen Einfluss durch den MEK-Inhibitor U0126 oder durch BMP6 auf die Phosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen ermitteln zu können, wurde das Phosphorylierungsmuster für die Kultivierungsansätze BM, BM+U0126 und BM+BMP6 untersucht. Dabei wurden, wie in Abbildung 6 beschrieben, die Zeitpunkte 0, 5, 26 und 46 h der IVM gewählt. Für die Maturation mit BMP6 wurde zusätzlich die Kultivierungszeit erhöht und Intensität der MAPK-Phosphorylierung zu den Zeitpunkten 72 und 94 h analysiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Antikörper verwendet, der beide Isoformen der MAPK (MAPK 1 44 kDA, MAPK 2 42 kDa) erkennt. Für die Analyse der relativen Dichte und somit der Analyse des Phosphorylierungsgrades wurden die Ergebnisse der aktivierten MAPK 2 ausgewertet.
4.6.1 MAPK-Aktivität im BM und der Einfluss von U0126
Der Phosphorylierungsgrad der MAPK in porzinen Kumuluszellen war schon zum Zeitpunkt 0 h relativ hoch und erreichte bereits nach 5 h sein Aktivitätsmaximum.
Im weiteren Verlauf der IVM sank die Aktivität und zum Ende der IVM nach 46 h lag die MAPK fast vollständig dephosphoryliert vor.
Durch Zugabe des MEK-Inhibitors zum Kultivierungsmedium sollte eine Hemmung der MAPK erzielt werden. Anhand der Ergebnisse wurde deutlich, dass die MAPK in den ersten 5 Stunden fast vollständig desphoshoryliert vorlag, erst nach 26 h konnte ein statistisch nicht relevanter Anstieg ermittelt werden. Nach 46 h intensivierte sich der Phosphorylierungsgrad und erreicht signifikant die maximale Aktivität der Untersuchungszeiträume.
Mit dem MEK-Inhibitor U0126 wurde die Aktivität der MAPK in den Kumuluszellen innerhalb der ersten Hälfte der IVM (bis 26 h) gehemmt. Die Ergebnisse sind in folgender Abbildung 31 dargestellt sowie zuvor jeweils ein repräsentativer Westernblot nach der entsprechenden Kultivierungsmethode (Abb. 30).
a a
relative Dichte x 103
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0 5 26 46 IVM (h)
a
b
a ab
BM
BM+U0126
a
b
Abbildung 30: Westernblots mit aufgetrennter p42- und p44-MAPK von Kumuluszellen nach IVM im BM (links) und im BM+U0126 (rechts) nach 0, 5, 26 und 46 h.
Abbildung 31: Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Kumuluszellen nach IVM der KOKs im Medium BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h.
Dargestellt sind die Mittelwerte (x) zu jedem Zeitpunkt mit angegebener empirischer Standardabweichung (SD). Unterschiedliche Kleinbuchstaben über den Säulen weisen auf signifikante Unterschiede innerhalb des Ansatzes hin (p<0,05), Sterne zeigen eine Signifikanz innerhalb eines Zeitpunktes (p<0,05).
4.6.2 Einfluss von BMP 6 auf die MAPK-Aktivität
Während der Kultivierung der KOKs mit dem Zusatz von BMP6 ließ sich ein ähnlicher Verlauf der MAPK-Aktivität wie nach der Basiskultivierung erkennen.
Innerhalb der ersten Stunden bis zum Zeitpunkt 5 h erreichte die MAPK ihr Aktivitätsmaximum, welches im weiteren Verlauf kontinuierlich abnahm. Auch nach verlängerter Kultivierungszeit sank die Aktivität weiterhin ab, so dass am Ende der IVM (94 h) die MAPK wie zum Zeitpunkt 0 h phosphoryliert vorlag.
Innerhalb der ersten Stunden bis zum Zeitpunkt 5 h erreichte die MAPK ihr Aktivitätsmaximum, welches im weiteren Verlauf kontinuierlich abnahm. Auch nach verlängerter Kultivierungszeit sank die Aktivität weiterhin ab, so dass am Ende der IVM (94 h) die MAPK wie zum Zeitpunkt 0 h phosphoryliert vorlag.