3.6 Molekularbiologische Methoden
3.6.3 Bestimmung der RNA-Konzentration
Der Gehalt an Gesamt-RNA wurde für jede Probe photometrisch bestimmt. Vor jeder Messung wurde das Photometer mit DEPC-H2O geeicht. Jede RNA-Probe wurde 1:100 mit DEPC-H2O verdünnt und in UV-Einmal-Küvetten mit einer Zentrumshöhe von 15 mm bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Die RNA-Konzentration wurde anschließend nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz wie folgt berechnet:
cRNA [µg/µl] = A x f
Dabei steht A für Absorption und f ist der Umrechnungsfaktor des Photometers von 0,4 µg/µl. Eine optische Dichte bei 260 nm (OD260) von 1 entspricht daher einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Die RNA-Konzentrationen der Proben wurden aus dem Mittelwert der Messungen berechnet. Während der Durchführung wurden die Proben auf Eis gelagert.
3.6.4 Ermittlung PCR-Zyklusanzahl
Um eine semiquantitative Auswertung durchführen zu können, wurde für jedes Transkript die geeignete Zyklusanzahl der PCR (polymerase chain reaction) ermittelt. Dafür wurde die Zyklusanzahl gesucht, in der die PCR noch in der
exponentiellen Anstiegsphase abläuft. Dafür wurde die Anstiegsphase nach 28, 30 und 32 Zyklen für jedes Transkript untersucht und folgende Zykluslängen wurden festgelegt.
Tabelle 3: Zyklusanzahlen der PCR für die jeweiligen Transkripte.
Transkript Zyklusanzahl
GAPDH StAR CYP19A1 CYP19A1 3ß-HSD
BMP6
30 30 30 30 30 32
3.6.5 Allgemeines zur PCR
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ermöglicht eine rasche und sequenzspezifische Vervielfältigung definierter DNA-Abschnitte aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialen. Dabei lagern sich spezifische Oligonucleotidmoleküle am 5’- und 3’-Ende des zu amplifizierenden Bereiches der doppelsträngigen DNA an. In Anwesenheit von freien Desoxynucleosid-Triphosphaten (dNTPs) synthetisiert eine DNA-abhängige Polymerase den jeweiligen Gegenstrang in 5’-3’-Richtung. Jeder PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA durch eine Temperaturerhöhung auf 95 °C denaturiert, dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen der Basenpaare gelöst und somit liegt die DNA in zwei Einzelsträngen vor. Im nächsten Schritt binden die Oligonukleotidprimer bei
einer niedrigeren Temperatur (ca. 50-65 °C) an der DNA-Matrize. Im letzten Schritt des PCR-Zyklus wird der jeweilige Gegenstrang durch die DNA-Polymerase bei ca. 72-75 °C synthetisiert.
Eine Möglichkeit zur Analyse der Genexpression besteht in der Untersuchung der jeweils vorliegenden mRNA (messenger-RNA). Wenn RNA statt DNA als Ausgangsmaterial für die PCR vorliegt, ist zusätzlich eine Reverse Transkription (RT), d. h. ein Umschreiben der RNA in cDNA (complementary DNA), vor der PCR notwendig. Dieser cDNA-Einzelstrang dient als Template (Matrizen-Strang) für die folgenden Amplifikationszyklen.
In dieser Arbeit wurde das Verfahren der „one-step“ RT-PCR für die Quantifizierung der mRNA in Kumuluszellen bzw. Oozyten gewählt. Dabei finden alle Reaktionen in einem PCR-Gefäß statt, d. h. das Risiko der Kontamination wird durch diese Methode verringert.
Die verwendeten annealing-Temperaturen varierten entsprechend der Primerkombination, sie ist von der Länge und dem prozentualen G C-Gehalt (Guanin/Cytosin-Gehalt) der Primer abhängig. Für das Ermitteln der annealing-Temperatur wurde zunächst der mittlere Schmelzwert (TM-Wert) wie folgt berechnet und 2 °C unter dem errechneten Wert gewählt:
TM [°C] = 4 · (G+C) + 2 · (A+T)
Aus den Schmelztemperaturen beider Primer wurde anschließend die annealing-Temperatur wie folgt berechnet:
TA [°C] = - 2 °C
TM1 und TM2 stellen hierbei die Schmelztemperaturen der zwei eingesetzten Primer dar.
———————
(TM1 + TM2) 2
3.6.6 Durchführung der one-step Reverse Transkriptase-PCR
Von folgenden Genen wurde die mRNA aus porzinen Kumuluszellen bzw.
Oozyten mittels RT-PCR im one step-Verfahren quantifiziert. GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase) wurde dabei als Referenzgen verwendet.
Tabelle 4: Zielgene mit dazugehörigen Enzymen.
Zielgen Enzym/Protein
StAR
CYP11A1
CYP19A1
HSD3B1
GAPDH
BMP6
StAR P450scc P450arom 3ß-HSD GAPDH BMP6
Steroidogenic acute regulatory protein
Cytochrome P450 side-chain-cleavage enzyme Cytochrom P450 Aromatase
3ß-Hydroxysteroiddehydrogenase
Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase Bone morphogenic protein 6
Mit Hilfe der Datenbank des NCBI (National Center for Biotechnology Information) wurden folgende spezifische Primerpaare ermittelt und nach Synthese bei Eurofins MWG Operon verwendet. Spezifische Primer binden gezielt an der mRNA. Die cDNA hybridisiert daher mit der ursprünglichen Gesamt-RNA, bevor der Abbau durch den RNase-Inhibitor erfolgt.
Method
5’ – GGAGAGCCGGCAGGAGA - 3’
3’ – CTTCTGCAGGATCTTGATCTTCTTG – 5’
5’ – GTAGCCGCATGGGACACTAT – 3’
3’ – ATTGCAGCATCTTGCTTGTG – 5’
5’ – GCTAATTGCAGCACCAGACA – 3’
3’ – TGTTGGTTCCCTTTTTCACC – 5’
5’ – GCCAGCGTGCCGGTCTTCAT – 3’
3’ – GAATGGGCTCCCCTCCCCGT – 5’
5’ – ATTGCCCTCAACGACCACTT – 3’
3’ – ACATGACGAAGGCAGGTCTCC – 5’
5’ – GCGGCTCAAGACGCACGAGAAA – 3’
3’ – AGCATGAAGAGGGGCGCAGACT – 5’
Richtung
Tabelle 5: Übersicht der verwendeten spezifischen Primer.
Die Temperaturbedingungen wurden wie folgt gewählt:
92 °C 2 min 1 Zyklus
4 °C 3 min Hinzufügen des RT-Ansatzes
37 °C 40 min 1 Zyklus
80 °C 2 min 1 Zyklus 20 °C 2 min 1 Zyklus
4 °C 2 min Hinzufügen des PCR-Ansatzes 72 °C 30 sec
TA 30 sec
72 °C 30 sec 15 °C 10 min 4 °C ∞
Folgende Ansätze der PCR wurden vor jedem Versuch angesetzt.
1. Ansatz (Denaturierung): 40 pmol Primer Antisense 2,5 µl Gesamt-RNA 18 µl DEPC-H2O
2. Ansatz (Reverse Transkription) 40 U/µl RNaseOUT RNAse Inhibitor
200 U/µl Superscript II Reverse Transkriptase 16 µl RT-Puffer
Jedem Reaktionsgefäß wurde eine ½ Kugel Ampli Wax® hinzugefügt.
3. Ansatz (PCR) 40 pmol Primer Sense
5 U/µl Taq DNA Polymerase 20 µl PCR-Puffer
37,2 µl DEPC-H2O
30 bzw. 32 Zyklen (s. 3.6.4)
Alle Reaktionen der PCR erfolgten im Thermocycler bei genannten Temperaturbedingungen.
Als Negativkontrollen bei jeder PCR dienten RNA-Proben, denen kein RNase Inhibitor sowie keine Reverse Transkriptase zugefügt wurden, um die Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA auszuschließen. Weiterhin durchliefen Negativkontrollen die Reaktion mit allen Ansätzen, aber fehlender RNA zur Überprüfung auf Reinheit der Reaktionsansätze.
Die RT-PCR für das BMP6 lieferte nach oben genanntem Protokoll unzulängliche Ergebnisse, daher wurden die Ansätze und Reaktionsbedingungen modifiziert. Es wurden folgende Änderungen vorgenommen:
Als Template diente cDNA, die durch den Einsatz von random Hexamer-Oligonukleotiden synthetisiert wurde. Weiterhin wurden die Konzentrationen der Reagenzien im RT-Ansatz geändert und wie folgt eingesetzt und auf ein Gesamtvolumen von 30 µl DEPC-H2O aufgefüllt.
5 mM MgCl2
1 x PCR Puffer 1 mM dNTPs
2,5 µM random Hexamer-Oligonukleotide 20 U/µl RNaseOUT RNAse Inhibitor
50 U/µl Superscript II Reverse Transkriptase 2,5 µl Gesamt-RNA
Der PCR-Puffer sowie die MgCl2-Lösung wurde nicht, wie bisher, selbst hergestellt, sondern von Applied Biosystems bezogen.
Die Temperaturbedingungen für die Reverse Transkription lauteten wie folgt:
25 °C 10 min
42 °C 60 min
99 °C 5 min
alle Proben auf Eis 5 min
Nach dem Zufügen der ½ Kugel Ampli Wax® folgte die PCR in bereits beschriebener Weise. Die Zyklusanzahl für BMP6 wurde auf 32 erhöht (s. Tab. 3).
3.6.7 Agarose-Gelelektrophorese
Für die Herstellung des 1%igen Gels wurde Agarose in 8 ml 1fach TAE (Tris-Acetat-EDTA) auf 400 ml Reinstwasser unter Hitzezufuhr gelöst. Die PCR-Produkte wurden anschließend im Gel in einer MultiSUBmini Gelkammer bei 120 V und 400 mA in ca. 50 min elektrophoretisch aufgetrennt. Als Laufpuffer diente ca. 400 ml 1fach TAE. Zur Größenbestimmung der Amplifikationsprodukte wurde 3 µl eines 50 bp DNA-Markers verwendet. Als Molekularfarbstoff und zum gleichzeitigen Erhöhen der spezifischen Dichte wurde jedes PCR-Produkt vor dem Beladen der Kammern mit 4 µl Orange G versehen. Das Anfärben des Agarosegels nach der Elektrophorese erfolgte für 15 min in 500 ml Ethidiumbromidlösung (5 mg/ml). Abschließend wurden die entstandenen Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht und mittels Digitalfotographie dokumentiert.
3.6.8 Auswertung der Ergebnisse
Die Signale der PCR-Banden der Transkripte wurden visualisiert und digital dokumentiert. Die Intensität der Banden wurde anschließend mit der Software ImageQuant TL 7.0 gemessen.
Diese ermittelten Werte für die mRNA-Expressionslevel von StAR, CYP11A1, CYP19A1, 3ß-HSD und BMP6 wurden zu den dazugehörigen Werten des housekeeping-Gens GAPDH wie folgt ins Verhältnis gesetzt. Von den Messergebnissen der GAPDH-Intensität wurde der arithmetische Mittelwert gebildet und dann für jede Probe durch den exakten Messwert der GAPDH-Bande dividiert. Der errechnete Wert fungierte als Faktor, mit dem die Messwerte der PCR-Banden von StAR, CYP11A1, CYP19A1, 3ß-HSD und BMP6 multipliziert wurden und zum Ergebnis der relativen mRNA-Level führte. Diese Vorgehensweise ermöglichte es, standardisiert an der Transkription von GAPDH, die Transkription der gesuchten mRNA als relative mRNA-Level auszudrücken.
Für jedes Gen wurde die PCR mindestens von drei unabhängigen RNA-Proben der Kumuluszellen bzw. Oozyten von jeweils jedem Kultivierungszeitpunkt wiederholt.
3.6.9 Identifikation der PCR-Produkte
Die Identität der PCR-Produkte wurde durch Sequenzierungen überprüft, indem GATC Biotech AG Sequenzanalysen durchgeführt hat. Zur Auswertung der Sequenzierungsergebnisse diente die Software DNASTAR Lasergene 8 sowie BioEdit Sequence Alignment Editor version 7.0.9.0.
3.7 Analyse der MAPK-Phosphorylierung
Für diesen Versuchsteil wurden Kumuluszellproben verwendet, die jeweils nach genanntem IVM- und Versuchsschema von 20 KOKs gewonnen und gelagert wurden (s. 3.1 u. 3.2). Demnach standen für diesen proteinchemischen Untersuchungsteil Kumuluszellproben aus der IVM im BM, BM+U0126 sowie BM+BMP6 zur Verfügung.
3.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Proben wurden auf Eis aufgetaut und in 30 µl 2,5 fachen Ladepuffer (Laemmli-Autragspuffer) aufgenommen. Nach gründlichem Vortexen wurden die Proben für 5 min bei 95 °C aufgekocht. Anschließend folgte ein einminütiger Zentrifugationsschritt bei 13.000 x g. Die Auftrennung der Proteine erfolgte in einem vertikalen Polyacrylamidgel, welches sich aus einem 10,5%igem Trenngel und einem vorgeschalteten 4,5%igem Sammelgel zusammensetzte. Im Gel wurde die Polymerisation durch APS (Ammoniumperoxosulfat) als Radikalbildner und TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin) als Katalysator eingeleitet. Die Auftrennung der Proteine erfolgt dabei anhand der Molekülgröße mittels SDS (Natriumdodecylsulfat). Dadurch denaturierten die Proteine und erhielten eine negative Ladung durch Anlagerung der SDS-Sulfatgruppen. Die Elektrophorese erfolgte für ca. 20 min bei 100 V in einem Tris-, SDS- und Glycin-haltigem Elektrodenlaufpuffer bis sich die gebildete Lauffront kontinuierlich darstellte und das Sammelgel passiert hatte. Dann wurde die Spannung für ca. 55 min auf 200 V erhöht bis die Lauffront das Elektrophoresegel verlassen hatte. Zur späteren Beurteilung der Proteingröße wurde parallel ein farbiger Größenmarker (Prestained Proteinstandard Fermentas, 72 kDa rot) geladen, der neben der Lauffront durch die Farbgebung zur Orientierung während des Elektrophoreselaufs diente.
3.7.2 Immunoblot
Nach der gelektrophoretischen Auftrennung der Proteine erfolgte mittels Blotting ein Proteintransfer entlang eines elektrochemischen Gradienten auf eine 6 x 8 cm große proteinbindende Nitrocellulosemembran, wodurch die Proteine anschließend für die Immunodetektion zur Verfügung standen. In der horizontalen Blottingkammer befanden sich jeweils drei Lagen in Glycin-, Tris-, SDS- und Methanolhaltigem Blottingpuffer getauchtes Filterpapier, auf die die Membran, anschließend das Gel und abschließend erneut drei Lagen Filterpapier gebracht wurden. Die negative geladenen Proteine wandern während des Blottingverfahrens zur Anode und bleiben aufgrund hydrophober Wechselwirkungen an der Membranoberfläche haften. Der Proteintransfer erfolgte bei 2 mA/cm2 für 120 min. Zur Überprüfung des erfolgreichen Protein- und Standardtransfers auf die Membran erfolgte eine Ponceau S-Färbung für ca.
1 min.
Mit Hilfe spezifischer Antikörper (s. 9.2) wurden die Membranen zuerst auf die Anwesenheit der phosphorylierten MAPK und im nächsten Versuch auf die des α-Tubulins als Auftagskontrolle untersucht. Bevor eine Bindung mit Antikörpern herbeigeführt wurde, erfolgte eine Inkubation der Membranen in einer Blockierungslösung über Nacht im Kühlschrank, damit freie Bindungstellen mit einem für den Antikörper nicht erkennbares Protein abgesättigt sind. Nach der Blockierung erfolgten mehrere Waschschritte in TBS/Tween 1 %. Die Inkubation der Membranen mit einem antigenspezifischen Primärantikörper erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag folgten erneut drei Waschschritte, damit die schwächer haftenden, unspezifisch gebundenen Antikörpermoleküle von der Membran entfernt werden konnten. Der Sekundärantikörper, der ein mit Meerettich-Peroxidase (HRPO) gekoppelter Antikörper ist und gegen das Fc-Fragment des Primärantikörpers gerichtet ist, wurde für 1 h bei RT auf die Membran gebracht. Das Enzym Peroxidase, welches an den Sekundärantikörper gekoppelt ist, spaltet H2O2-Radikale ab, sodass Luminol oxidiert wird.
Anschließend erfolgten erneut fünf Waschschritte in TBS/Tween 1 %. Dann wurde
die Membran in einer Folientasche mit dem Chemilumineszenzsubstrat SuperSignal® West Dura Extended Duration blasenfrei eingeschweißt und für 5 min inkubiert. Die Membran wurde in eine Röntgenkasette gelegt und bei Rotlicht unter einen auf die Größe zugeschnittenen Röntgenfilm gebracht. Die Dauer der Exposition wurde dem jeweiligen Ergebnis angepasst. Nach der Exposition wurden die Filme entsprechend den Herstellerangaben der Entwicklungs- bzw.
Fixierungslösungen behandelt.
Um die gleiche Membran für eine weitere Proteinanalyse verwenden zu können, wurde die Antikörper durch mehrere Waschschritte mit TBS/Tween 1 % gewaschen. Anschließend wurde sie bei Raumtemperatur für 2 h im Stripping-Reagenz aufbewahrt. Die nächste Chemilumineszenz wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
3.7.3 Auswertung der Chemilumineszenz
Von den Membranen wurden die Banden der Anti-pMAPK- und Anti-α-Tubulin-Signale visualisiert und eingescannt. Anschließend wurde die Intensität dieser Banden mittels der Software ImageQuant TL 7.0 gemessen.
Die Messwerte des Tubulins dienten für jede Probe als Referenz, indem von jedem Versuch aus diesen Messwerten der arithmethische Mittelwert gebildet wurde und jeweils durch den exakten Messwert der α-Tubulinbande dividiert wurde. Dieser errechnete Wert diente als Faktor, mit dem die Werte der Banden der aktivierten MAPK-Isoform (42 kDa) multipliziert wurden. Diese Ergebnisse werden in dieser Arbeit als relative Intensität bzw. Dichte der Phosphorylierung der MAPK gewertet und bezeichnet.
3.8 Zusammenfassung des Versuchdesigns
Die folgende Abbildung (Abb. 6) stellt einen Überblick der durchgeführten Versuche dieser Arbeit dar. Dargestellt ist die Isolation der KOKs mit der jeweiligen In-vitro-Maturation (IVM) mit den dazugehörigen Kultivierungszeitpunkten für BM, BM+U0126 und BM+BMP6. Für alle Kultivierungsmethoden wurde der Kernreifungsstatus der Oozyten analysiert. Mit den Kumuluszellen wurden proteinchemische Analysen zur Phosphorylierung der MAPK mittels Immunoblot und Chemilumineszenz durchgeführt. Die mRNA-Expression der Gene der Steroidhormonbiosynthese wurde ebenfalls von Kumuluszellen aus allen Kultivierungsmethoden untersucht und mittels RT-PCR durchgeführt. Zusätzlich wurde das mRNA-Expressionsmuster von BMP6 in Kumuluszellen und Eizellen analysiert. Die Progesteron- und 17ß-Estradiolsekretion der KOKs wurde ebenso in allen Kultivierungsmedien mittels Radioimmunoassay gemessen.
Abbildung 6: Schema des Versuchsdesigns. KZ: Kumuluszellen
3.9 Statistische Auswertung
Für die Verteilung der Kernreifungsstadien (s. 4.1) wurden alle Zeitpunkte mittels χ2-Test miteinander verglichen. Durchschnittlich wurden ca. 100 Eizellen für jeden Versuchsansatz und jeden Zeitpunkt ausgewertet. Dafür wurde die Software SigmaStat 3.5 (Sysstat Software Inc., Erkrath) benutzt. Die genauen Anzahlen der beurteilten Eizellen sind Tab. 6 zu entnehmen.
Für die Hormonanalysen, die Ergebnisse der RT-PCR sowie der Phosphorylierungsgrade der MAPK wurden alle Werte mit Hilfe des Kolmogorov-Smirnov-Tests auf Normalverteilung mittels Software SigmaStat 3.5 geprüft.
Anschließend wurden die Daten mittels Varianzanalyse ausgewertet.
Die Hormonwerte, die relative Dichte der PCR-Transkripte sowie die relativen Phosphorylierungsgrade der MAPK wurden zum Vergleich des Kultivierungsverlaufs mit dem Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Multiple Range Test nach Tukey verglichen. Um den Einfluss des Kultivierungsansatzes zu jedem Zeitpunkt zu untersuchen, wurde der Tukey’s Studentized Range Test (HSD-Test) angewendet.
Jeder Versuch der Hormonmessung wurde viermal, jede PCR und jeder SDS-Gelektrophorese mit dazugehöriger Chemilumineszens dreimal als unabhängige Versuche wiederholt. Die Varianzanalysen wurden mit der Software SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) durchgeführt.
4 Ergebnisse
4.1 Kernreifungsraten
In diesem Versuchsteil wurden die Kernstadien der Oozyten in den drei Versuchsansätzen (BM, BM+U0126 sowie BM+BMP6) ermittelt. Insgesamt wurden 1973 Eizellen klassifiziert, wovon die Anzahlen der beurteilten Zellen nach den jeweiligen Kultivierungszeiten (0, 5, 26, 46, 72 und 94 h) Tab. 6 zu entnehmen sind.
Tabelle 6: Anzahl der anhand des Chromatinstatus beurteilten Oozyten.
Maturationszeit BM BM+U0126 BM+BMP6 0 h
26 h 5 h 46 h 72 h 94 h
117 137 146 138 119 98
120 115 131 189 - -
117 119 125 113 98 91
4.1.1 Einfluss von U0126 auf die Kernreifung der Oozyten
Für diesen Versuchsteil wurden jeweils die Kernreifungsergebnisse zum Zeitpunkt 0, nach 5, 26 und 46 h IVM miteinander verglichen. Die detaillierten Ergebnisse sind den Tab. 9 (s. 9.5) zu entnehmen. Als degenerierte Oozyten wurden diejenigen bezeichnet, die eine ungeordnete Chromatinverteilung im Ooplasma oder irreguläre, hyperkondensierte Chromatincluster aufwiesen. Eizellen, in deren Ooplasma keine orceinpositiven Strukturen nachgewiesen werden konnten, wurden gleichfalls als degeneriert eingeordnet. Die Oozyten, deren
Kernreifungsstatus als Germinalvesikel-Stadium I, II, III oder IV identifiziert werden konnte, wurden für die Auswertung als GV-Stadium zusammengefasst. Für die folgende grafisch dargestellte Auswertung (Abb. 7) wurden die Eizellen, die nach dem GVBD die Chromatincluster der Diakinese (Di), Metaphase I (MI) bzw.
Anaphase I (AI) aufwiesen, ebenfalls zusammengefasst. Die Oozyten in der Anaphase II (AII) und Teleophase II (TII) wurden ebenfalls gemeinsam gruppiert.
Abbildung 7: Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26 und 46 h IVM im BM verglichen mit U0126 supplementiertem BM. Säulen mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant mit p<0,01. GV: Germinalvesikel, Di/MI/AI/TI: Diakinese / Metaphase I / Anaphase I / Telophase I, MII: Metaphase II, deg: degeneriert
Direkt nach der Isolation der Eizellen aus dem Follikel sowie nach 5stündiger Kultivierung konnte zwischen beiden Kultivierungsansätzen kein signifikanter Unterschied festgestellt werden, zu beiden Zeitpunkten befanden sich über 95 % der Eizellen beider Gruppen im GV-Stadium. Nach 26 h sowie 46 h IVM mit dem MEK-Inhibitor U0126 verblieben die Eizellen weiterhin in 93,1 % bzw. 93,7 % der Fälle im GV-Stadium. Ohne Hemmstoff setzten nach 26 h 69,9 % der Oozyten die
0 20 40 60 80 100
5 26 46
Kernreifungsstadium (%) a a a a b a c a
0
GV Di/MI/AI/TI MII deg.
+ U0126
IVM (h)
0 Polkörperchen ausgeschleust. Zu allen Kultivierungszeitpunkten wiesen jeweils unter 2 % der Eizellen degenerative Veränderungen auf.
4.1.2 Einfluss von BMP6 auf die Kernreifung der Oozyten
Für diese Untersuchung wurden die Kernreifungsstadien von Eizellen nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94stündiger IVM im BM und BMP6 supplementiertem BM untersucht und miteinander verglichen. Die detaillierten Ergebnisse sind Tab. 10 (s. 9.5) zu entnehmen. Die Verfahrensweise des Gruppierens der Meiosestadien für die vergleichende Auswertung ist beibehalten worden.
Abbildung 8: Anteil (%) der Kernstadien nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h IVM im BM verglichen mit BMP6 supplementiertem BM. Säulen mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant, p<0,05. GV: Germinalvesikel, Di/MI/AI/TI: Diakinese / Metaphase I / Anaphase I / Telophase I, MII: Metaphase II, AII/TII: Anaphase II/Telophase II, deg.: degeneriert
deg.
AII/TII MII
GV
+ BMP6
In beiden Versuchsansätzen haben ca. 70% der Oozyten nach 26 h die Meiose wieder aufgenommen, über 80 % erreichten nach 46 h das Stadium der Metaphase II. Nach 72 und 94 h haben ca. 15 % die Meiose bis zur Ana- bzw.
Telophase II fortgesetzt. Während der gesamten IVM mit BMP6 zeigten sich gegenüber der Maturation im BM nur geringfügige Unterschiede in der Kernreifung, die zu keinem Zeitpunkt eine Signifikanz aufwiesen.
4.2 Kumuluszellexpansion im BM, BM+U0126 und im BM+BMP6
Die folgende Abbildung (Abb. 9) soll einen vergleichenden Überblick über die Morpholgie der KOKs geben, mit dem Ziel, die Kumuluszellexpansion nach den verschiedenen IVM-Zeiten qualitativ zu beurteilen. Nach 5 h Kultivierung der KOKs zeigte sich in allen Medien kein Unterschied bezüglich der qualitativen Beurteilung des Kumuluszellverbandes, die Zellen lagen als kompakte Zellmasse um die Eizelle herum und zeigten nur teilweise eine geringfügige Auflockerung am äußeren Rand des Cumulus oophorus. Nach 26 h konnte nach der Kultivierung im BM und im BM+BMP6 eine deutliche Zunahme der Auflockerung der äußeren Kumuluszellen beobachtet werden, die Corona radiata lag weiterhin als dichte Zellschicht vor. Nach der IVM mit U0126 blieb diese Expansion der Kumuluszellen aus. Nach 46 h konnte bei KOKs aus dem BM und BM+BMP6 eine vollständige Auflockerung des Cumulus oophorus einschließlich der corona radiata festgestellt werden. Mit U0126 hingegen war nur teilweise eine geringgradige Lockerung der äußeren Zellen des Kumuluszellverbandes aufgefallen. Die KOKs lagen als dichte Gruppe mit direktem Zellkontakt vor. Nach Verlängerung der Kultivierungszeit auf 72 bzw. 94 h konnte der fortschreitende Prozess der Kumuluszellauflockerung beobachtet werden. Weiterhin kam es zu einer clusterartigen Anordnung einzelner Kumuluszellgruppen. Beim Vergleich der IVM-Ansätze BM mit BM+BMP6 konnte diesbezüglich kein Unterschied festgestellt werden.
Ergebnis
0 h 5 h 26 h 46 h 72 h 94 h IVM
Abbildung 9: Stereomikroskopische Übersicht der KOKs nach IVM im BM, BM+U0126, BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h, 22,5-90fache Vergrößerung
BM
BM+ U0126
BM+BMP6
4.3 Hormonanalysen im Medium
4.3.1 17ß-Estradiolkonzentrationen (E2)
Die detaillierten Messwerte der E2-Konzentrationen sind Tab. 12 (s. 9.5) zu entnehmen. Für die Auswertung (Abb. 10a+b) wurden jeweils die Hormonwerte nach IVM im BM mit denen aus dem BM+U0126 und BM+BMP6 verglichen. Die statistischen Untersuchungen beziehen sich zum Einen auf die Unterschiede in dem jeweiligen Kultivierungsansatz und zum Anderen auf die Einflüsse der Zusätze U0126 und BMP6 innerhalb der Zeitpunkte.
E2 im BM und der Einfluss von U0126
Während der Kultivierung im BM sezernierten die KOKs nach 5 h unter 2 ng/ml 17ß-Estradiol, nach 26 h zeigte sich eine signifikant erhöhte Hormonkonzentration, die nach 46 h signifikant gehemmt wurde (p<0,05). Im Vergleich mit der E2 -Sekretion unter dem Einfluss von U0126 zeigte sich bis 26 h kein statistisch relevanter Unterschied. Jedoch am Ende der IVM konnte eine signifikant höhere E2-Konzentration als im BM gemessen werden.
E2 im BM und der Einfluss von BMP6
Nach verlängerter Kultivierungszeit im BM stieg die E2-Konzentration weiter an und erreichte gleichzeitig nach 94 h ihr Maximum von 12,0 ng/ml. Im Vergleich der E2-Messungen nach den sechs Kultivierungszeiträumen mit dem BM6 supplementiertem Medium zeigten sich keine relevanten Unterschiede.
0
Abbildungen 10a+b: E2-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h (Abb. 10a) und verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h (Abb. 10b). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede (p<0,05) innerhalb des Ansatzes hin, Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen innerhalb eines Zeitpunktes (p<0,01). Dargestellt sind die
Abbildungen 10a+b: E2-Werte in ng/ml im BM verglichen mit BM+U0126 nach 0, 5, 26 und 46 h (Abb. 10a) und verglichen mit BM+BMP6 nach 0, 5, 26, 46, 72 und 94 h (Abb. 10b). Unterschiedliche Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede (p<0,05) innerhalb des Ansatzes hin, Sterne über den Säulen zeigen Signifikanzen innerhalb eines Zeitpunktes (p<0,01). Dargestellt sind die