Bedeutung der MAPK (mitogen-activated protein kinase) für die zelluläre Signalvermittlung
während der Reifung von porcinen Oozyten
Bedeutung der
MAPK (mitogen-activated protein kinase) für die zelluläre Signalvermittlung während der Reifung von
porcinen Oozyten
Habilitationsschrift zur Erlangung der Venia legendi an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Dr. med. vet. Silja Ebeling
Hannover 2011
Lernen ist wie Rudern gegen den Strom, sobald man aufhört, fällt man zurück.
Benjamin Britten/Laotse
Tag der nicht öffentlichen wissenschaftlichen Aussprache: 13.12.2011
Voraussetzung für eine erfolgreiche Befruchtung und die weitere embryonale Entwicklung ist eine optimale Eizellreifung. Diese ist abhängig von unterschiedlichen extra- und intrazellulären Signalen. Weiterhin spielt auch die interzelluläre Kommunikation zwischen der Eizelle und den somatischen Zellen innerhalb des Follikels eine entscheidende Rolle.
Je nach Spezies sind die Raten geborener Nachkommen bezogen auf die Anzahl in vitro gereifter Eizellen recht unterschiedlich. Beim Schaf sind es ca. 25 %, beim Rind ca. 15 % und beim Schwein unter 5 % (KIKUCHI et al. 1999). Auch beim Menschen gewinnt die In-vitro-Maturation (IVM) an Bedeutung, unter anderem bei der Behandlung von Patientinnen mit einem polyzystischen Ovarsyndrom. Bei einer durch Hormonapplikationen gesteuerten Eizellreifung in vivo läge bei diesen Patientinnen ein hohes Risiko für ein ovarielles Hyperstimulationssyndrom vor (PIQUETTE 2006). Die Geburtenraten nach künstlicher Befruchtung sind jedoch mit in vitro maturierten Eizellen deutlich geringer als bei der Verwendung von in vivo gereiften Eizellen (LONERGAN et al. 2003; RODRIGUEZ u. FARIN 2004).
Die vorliegende Habilitationsschrift beinhaltet Untersuchungen zur Bedeutung der mitogen-activated protein kinase (MAPK) für die intra- und interzelluläre Signalvermittlung während der Reifung von Eizellen. Weiterhin wurde der Einfluss des bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) als potentieller von der Eizelle sezernierter Faktor untersucht. Über die Sekretion von diversen Faktoren ist es der Eizelle möglich, die Entwicklung in Follikel als zentraler Regulator zu steuern (EPPIG 2001). Es wurden fünf wissenschaftliche Veröffentlichungen zusammenfassend betrachtet, deren Zusammenfassungen im Anhang eingefügt sind. Die vorliegende kumulative Schrift beginnt mit einer Einführung in die thematischen Grundlagen und der Ausformulierung der Fragestellungen. Anschließend werden die wichtigsten Resultate der Veröffentlichungen dargestellt und diese dann übergreifend diskutiert. Im Literaturverzeichnis werden nur die im Vorwort und in den Kapiteln 1 bis 4 zitierten Literaturstellen aufgeführt. Weitere Literaturzitate sowie nähere Angaben zu Material und Methodik sind den Publikationen zu entnehmen.
IN H A L T S V E R Z E I C H N I S
Inhaltsverzeichnis
Liste der verwendeten Publikationen... 7
Abkürzungsverzeichnis... 8
1 Einleitung... 10
1.1 Oogenese ... 10
1.2 Interzelluläre Wechselwirkungen ... 12
1.3 Mitogen-activated protein kinase (MAPK)... 15
1.4 Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6)... 18
2 Fragestellung... 20
3 Ergebnisse... 22
3.1 Bedeutung der MAPK-Kaskade während der Eizellreifung ... 22
3.1.1 MAPK... 22
3.1.2 p90rsk ... 24
3.2 Rolle der MAPK während der Eizellalterung in vitro... 26
3.3 Steroidhormonproduktion in den Kumuluszellen... 28
3.3.1 Einfluss der MAPK ... 29
3.3.2 Wirkung von BMP-6 ... 31
4 Übergreifende Diskussion... 33
4.1 Bedeutung der MAPK ... 33
4.2 Bewertung des In-vitro-Systems ... 37
4.3 Abschlussbetrachtung... 41
5 Zusammenfassung... 42
6 Summary... 44
7 Literaturverzeichnis... 46
8 Darstellung des eigenen Anteils an den Publikationen... 55
9 Anhang... 57
Danksagung... 63
Liste der verwendeten Publikationen
1. EBELING, S., C. SCHUON u. B. MEINECKE (2007):
Mitogen-activated protein kinase phosphorylation patterns in pig oocytes and cumulus cells during gonadotropin-induced resumption of meiosis in vitro.
Zygote 15(2), 139-147. doi: 10.1017/S0967199406004011
2. SCHUON, C., S. EBELING u. B. MEINECKE (2007):
Phosphorylation pattern of the p90rsk and mitogen-activated protein kinase (MAPK) molecule: comparison of in vitro and in vivo matured porcine oocytes.
Zygote 15(3), 215-223. doi: 10.1017/S0967199407004170
3. EBELING, S., A. LABUDDA u. B. MEINECKE (2010):
In vitro ageing of porcine oocytes: Changes in phosphorylation of the mitogen- activated protein kinase (MAPK) and parthenogenetic activability.
Reprod. Domest. Anim. 45, e398-404. doi: 10.1111/j.1439-0531.2010.01588.x.
4. EBELING, S., D. TÖPFER u. B. MEINECKE (2011):
Steroidogenesis and the influence of MAPK activity during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes.
Reprod. Domest. Anim. 46(3), 513-519. doi: 10.1111/j.1439-0531.2010.01699.x.
5. EBELING, S., D. TÖPFER, J. WEITZEL u. B. MEINECKE (2011):
Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6): mRNA expression and effect on steroidogenesis during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes.
Reprod. Fertil. Dev. 23(8), 1034-1042.http://dx.doi.org/10.1071/RD11027
Der eigene Anteil an den Publikationen ist in Kapitel 8 dargestellt.
AB K Ü R Z U N G S V E R Z E I C H N I S
Abkürzungsverzeichnis
AI Anaphase I
AII Anaphase II
Abb. Abbildung
AET-d Arbeitsgemeinschaft Embryotranfer deutschsprachiger Länder
BMP bone morphogenetic protein
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
ca. circa
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
cdc2 cell-division-cycle kinase 2 cdc25 cell-division-cycle kinase 25
cDNA copy/complementary-DNA
Cyp cytochrome, Cytochrom
Cyp11A1 Gen des side-chain cleavage enzyme, P450scc
Cyp17 Gen der 17α-Hydroxylase, P450C17
Cyp19A1 Gen der Aromatase, P450arom
d. h. das heißt
DNA desoxyribonucleotide acid
eCG equines Choriongonadotropin
EGF epidermal growth factor
ERK extracellular signal-regulated kinase
et al. et alii, und andere
FCS fetal calf serum
FSH Follikelstimmulierendes Hormon
G2-Phase gap 2-Phase
GDF-9 growth differentiation factor 9
GV germinal vesicle, Germinalvesikel
GVBD germinal vesicle breakdown
h hour, Stunde
hCG humanes Choriongonadotropin
17β-HSD 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase
IVF In-vitro-Fertilisation
IVM In-vitro-Maturation
kDa Kilodalton
KK Kumuluskomplex
KOK Kumulus-Oozyten-Komplex
LH Luteinisierendes Hormon
M-Phase Mitose-Phase
MI Metaphase I
MII Metaphase II
MAPK mitogen-activated protein kinase
MAPKK MAPK-Kinase
MEK MAP/ERK-Kinase, MAPKK
MPF M-phase promoting factor
Myt1 myelin transcription factor 1
mRNA messenger ribonucleic acid
OSF oocyte-secreted factor
P Probabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit
p90rsk protein 90 ribosomal S6 kinase
PCR polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion PD98059 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on,
MEK-Inhibitor
PDE3 Phosphodiesterase 3
PDE4 Phosphordiesterase 4
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PN pronuclei, Vorkerne
PVP Polyvinylpyrrolidon
RNA ribonucleic acid
RSK ribosomal S6 kinase
RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR
s. siehe
si-RNA small interferring RNA
StAR steroidogenic acute regulatory protein
TI Telophase I
Tab. Tabelle
TCM tissue culture medium
u. und
U0126 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis
[2-aminophenylthio]butadiene, MEK-Inhibitor
u. a. unter anderem
v/v volume per volume,
Volumenanteil einer Flüssigkeit in einer Lösung
w/v weigth per volume,
Gewichtsanteil eines Stoffes in einer Lösung
z. B. zum Beispiel
1 EI N L E I T U N G
1 Einleitung
1.1 Oogenese
Nach Einwanderung in die Gonadenanlage entwickeln sich im weiblichen Fetus die Urkeimzellen über Primordialkeimzellen zu Oogonien. Diese vermehren sich mitotisch weiter bis sie in die Meiose eintreten und ab dann als primäre Oozyten bezeichnet werden.
In der Prophase I der ersten meiotischen Reifeteilung (Reduktionsteilung) durchlaufen die Oozyten die Stadien Leptotän, Zygotän und Pachytän, in denen die Chromosomen kondensiert werden und die Rekombination von maternaler und paternaler DNA abläuft (SCHNORR u. KRESSIN 2006). Im Diplotän findet der erste meiotische Arrest der Eizelle statt. Dies geschieht bei den meisten Säugetieren um den Zeitpunkt der Geburt. Dieser Ruhezustand, auch als Diktyotän bezeichnet, dauert an, bis nach Eintritt in die Pubertät pro Zyklus jeweils einige Oozyten die Meiose wieder aufnehmen. Im Verlauf dieser meiotischen Pause finden jedoch umfangreiche Syntheseleistungen und eine Vergrößerung des Volumens der Eizelle statt (MOOR et al. 1990). Der Kern der Eizelle vergrößert sich ebenfalls, so dass er als Keimbläschen bzw. Germinalvesikel (GV) bezeichnet wird.
Innerhalb dieser Wachstumsphase erlangt die Eizelle ihre meiotische Kompetenz, d. h. die Fähigkeit nach entsprechendem Stimulus den meiotischen Block zu überwinden und die Meiose fortzusetzen (EPPIG 1996).
Als Eizellreifung oder –maturation bezeichnet man den Abschnitt ab Wiederaufnahme der Meiose im GV-Stadium bis zum Erreichen des befruchtungsfähigen Stadiums der Metaphase II (Abb. 1). Nach dem Abbau der Kernmembran, der als germinal vesicle breakdown (GVBD) bezeichnet wird, durchläuft die Eizelle die Stadien der Metaphase I, Anaphase I und Telophase I. Nach Ausschleusung des ersten Polkörpers wird die Eizelle in der Metaphase II erneut arretiert. In diesem Stadium befindet sich die Eizelle bei den meisten Säugetieren zum Zeitpunkt der Ovulation. Diese zweite Arretierung wird erst überwunden und die zweite meiotische Teilung (Äquationsteilung) abgeschlossen, wenn die Eizelle durch Eindringen eines Spermiums oder künstlich parthenogenetisch aktiviert wird. Dann wird ein zweiter Polkörper ausgeschleust und es bilden sich der weibliche und der männliche Vorkern.
Abb. 1: Wiederaufnahme der Meiose, Kernreifungsstadien.
GV= Germinalvesikel, GVBD= germinal vesicle breakdown, MI= Metaphase I, AI=
Anaphase I, TI= Telophase I, MII= Metaphase II, VK= Vorkernstadium
Diese Vorgänge der Kernreifung können mikroskopisch beurteilt werden und werden oft als Kriterium für eine erfolgreiche Eizellreifung verwendet. Allerdings reicht eine erfolgreiche Kernreifung für optimale Befruchtungs- und Entwicklungsergebnisse allein nicht aus (LAURINCIK et al. 1994). Auch die zytoplasmatische Reifung muss erfolgreich abgelaufen sein (EPPIG 1996). Im Zytoplasma werden während der Maturation Zellorganellen umstrukturiert. Zum Beispiel ordnet sich die kortikale Granula in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran an, um so den Polyspermieblock der Eizelle mit
GV
MII
GVBD
TI Aktivierung
Vorkerne Chromatin Germinal-
vesikel
MI
AI
VK
Polkörper
1 EI N L E I T U N G
gewährleisten zu können (DUCIBELLA 1996). Weiterhin werden in der Eizelle die Genexpression, die Proteinsynthese und Proteinaktivitäten moduliert. Auch an der zona pellucida, einer azellulären, die Eizelle umgebende Hülle, finden Veränderungen statt, die z. B. die Auslösung der Akrosomreaktion des Spermiums optimieren (RATH et al. 2005).
1.2 Interzelluläre Wechselwirkungen
Sowohl auf die Eizellentwicklung als auch auf die eigentliche Eizellreifung haben die Zellen, die die Eizelle umgeben, einen großen Einfluss und sind entscheidend für die Befruchtungs- und Entwicklungskompetenz. Die unter 1.1 beschriebene Oogenese muss zusammen mit der Follikulogenese betrachtet werden. Beim Erreichen des ersten meiotischen Arrestes im Diktyotän wird die Eizelle einschichtig von flachen somatischen Follikelzellen umgeben. Diese Anordnung wird als Primordialfollikel bezeichnet. Aus dem Vorrat an Primordialfollikeln beginnen kontinuierlich die Follikelzellen von einigen Follikeln sich zu Primärfollikeln umzuformen. In diesen Follikeln beginnt die Eizelle mit ihrer intensiven Wachstumsphase und die Follikelzellen nehmen eine kubische Form an und werden dann als Granulosazellen bezeichnet. Es folgt eine mitotische Proliferation der Granulosazellen, die dann im Sekundärfollikel die Eizelle mehrschichtig umgeben.
Spindelförmige Stromazellen ordnen sich als Thekaschicht um den Follikel an und zwischen der Oozyte und den Granulosazellen wird die zona pellucida gebildet. Der Follikel wird zum antralen bzw. Tertiärfollikel mit der Sezernierung von Follikelflüssigkeit durch die Granulosazellen und der damit verbundenen Ausbildung einer Follikelhöhle (Abb. 2). Durch diesen Schritt teilt sich die Population der Granulosazellen auf: in Kumuluszellen, die die Eizelle umgeben, und wandständige/murale Granulosazellen, die die Follikelwand auskleiden (EPPIG 2001). Mit der präovulatorischen Gonadotropineinwirkung nimmt die Eizelle die Meiose wieder auf und die Kumuluszellen expandieren und muzifizieren. Nach erfolgter Ovulation differenzieren sich die im Ovar verbliebenen Granulosazellen mit den Thekazellen weiter zum Gelbkörper. Nur ein sehr geringer Anteil der Primordialfollikel entwickelt sich jedoch wirklich bis zur Ovulation (<
0,1 %, HUNTER u. PARADIS 2009). Die meisten Follikel atresieren während der Follikulogenese.
Abb. 2: Tertiärfollikel mit Eizelle.
Färbung Hämatoxylin-Eosin, 120fache Vergrößerung (nach LIEBICH 2004)
Die interzelluläre Kommunikation innerhalb des Follikels zwischen Eizelle, Kumuluszellen und Granulosazellen ist essentiell für die prä- und postovulatorische Entwicklung der Eizelle (TANGHE et al. 2002). Die Kumuluszellen besitzen Zytoplasmaausläufer, die durch die zona pellucida hindurch mit der Eizelle über gap junctions in Verbindung stehen (ALBERTINI u. RIDER 1994). Die Kumuluszellen untereinander und die Kumuluszellen mit den muralen Granulosazellen im Bereich des cumulus oophorus kommunizieren ebenfalls über gap junctions. Diese gap junctions sind kanalbildende Proteinkomplexe, über die ein direkter Austausch von kleinen Molekülen wie Ionen, cAMP oder Aminosäuren zwischen zwei Zellen erfolgen kann. Größere Moleküle werden mittels rezeptorvermittelter Endozytose transferiert. Weiterhin ist die parakrine Signalvermittlung im Follikel von großer Bedeutung. Zunächst schrieb man der Eizelle eher eine passive Rolle zu, aber in den letzten ca. 15 Jahren kristallisierte sich immer mehr heraus, dass die Eizelle selbst der entscheidende Regulator der Follikulogenese ist (GILCHRIST et al. 2004).
Cumulus oophorus Kumuluszellen Follikelhöhle
murale Granulosazellen Theca follicularis interna Theca follicularis externa
Eizelle
1 EI N L E I T U N G
Wachstum Arretierung Transkription
Reifung
Abb. 3: Bidirektionale Kommunikation zwischen Oozyte und Kumuluszellen.
(nach EPPIG 2001)
Die Eizelle kommuniziert über sogenannte oocyte-secreted factors (OSFs) und steht mit den somatischen Follikelzellen in bidirektionaler Kommunikation (Abb. 3). Durch diesen Einfluss der Eizelle differenzieren sich auch die Kumuluszellen von den Granulosazellen.
Die muralen Granulosazellen sind stärker proliferativ als die Kumuluszellen und produzieren vermehrt Steroidhormone. Die Kumuluszellen versorgen die Eizelle mit Metaboliten und sind essentiell für die meiotische und zytoplasmatische Maturation (HASHIMOTO et al. 1998; HUNTER u. PARADIS 2009). Zunächst verhindern die Kumuluszellen eine vorzeitige Wiederaufnahme der Meiose, aber auch die Wiederaufnahme der Meiose wird durch die Kumuluszellen vermittelt (BUCCIONE et al.
1990). Im Gegensatz zu den Granulosazellen, die schon in präovulatorischen Follikel FSH- und LH-Rezeptoren besitzen, wird die Ausbildung der LH-Rezeptoren bei den Kumuluszellen erst durch die Einwirkung des FSH im Zyklus induziert (SHIMADA u.
TERADA 2002). Erst dann kann das LH auf die Kumuluszellen wirken und die Kumulusexpansion ausgelöst werden (CHEN et al. 1994). Die Kumuluszellen weichen immer mehr auseinander und sezernieren Hyaluronsäure, so dass eine muzine Matrix entsteht. Somit entfällt die hemmende Einwirkung auf die Eizelle und diese kann die Meiose wieder aufnehmen.
Proliferation Differenzierung
Steroidhormongenese Kumulusexpansion Ovulation Follikelformation
1.3 Mitogen-activated protein kinase (MAPK)
Bei den MAPK(mitogen-activated protein kinase)-Signalkaskaden handelt es sich um mehrstufige Signaltransduktionswege, die nicht nur bei der Eizellreifung und Embryonenentwicklung, sondern auch bei anderen Zelldifferenzierungen, Zellwachstum und Apoptosevorgängen eine Rolle spielen. Es gibt vier Untergruppen (SEGER u. KREBS 1995): 1. die ERK (extracellular signal-regulated kinase), 2. die JNK (c-Jun N-terminal kinase), 3. die p38MAPK und 4. die BMK (big MAPK). Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit ist die ERK. Sie wird als extracellular signal-regulated kinase bezeichnet, da sie von verschiedenen extrazellulären Signalen, wie z. B. Hormonen, Wachstumsfaktoren und Neurotransmittern, aktiviert wird (LEWIS et al. 1998). Die ERK wird in aktuelleren Studien auch nur als MAPK bezeichnet. Sie liegt in zwei Isoformen mit unterschiedlichem Molekulargewicht, MAPK1 (44 kDa) und MAPK2 (42 kDa), vor. Die MAPK wird durch die MAPK-Kinase (MEK) mittels zweifacher Phosphorylierung an Threonin- und Tyrosinresten aktiviert (CAMPBELL et al. 1995).
Während der Eizellmaturation ist die MAPK an verschiedenen Signaltransduktionen beteiligt. Ihre Aktivierung ist essentiell für die Wiederaufnahme der Meiose, die Organisation der Mikrotubuli und den Arrest in der Metaphase II (SUN et al. 1999b). In Oozyten im Germinalvesikelstadium ist die MAPK vollständig inaktiv. Erst während der Eizellreifung steigt die Aktivität an (Krallenfrosch: GOTOH et al. 1991; Maus:
SOBAJIMA et al. 1993; Schwein: INOUE et al. 1995, Ziege: DEDIEU et al. 1996; Rind:
FISSORE et al. 1996; Ratte: ZERNICKA-GOETZ et al. 1997; Pferd: GOUDET et al.
1998; Mensch: SUN et al. 1999a). Der Aktivitätsanstieg durch vermehrte Phosphorylierung beginnt zeitlich um den germinal vesicle breakdown (GVBD), das entspricht einer In-vitro-Maturation (IVM) von ca. 26 Stunden beim Schwein. Das Aktivitätsmaximum wird mit dem Erreichen des befruchtungsfähigen Stadiums der Metaphase II (nach ca. 46 h IVM beim Schwein) erlangt (FAN u. SUN 2004). Erst mit der Ausbildung der beiden Vorkerne fällt die Aktivität der MAPK wieder ab (MOOS et al.
1996).
Zu den Substraten der MAPK in den Oozyten gehören zytoplasmatische Proteine, Kernproteine und Transkriptionsfaktoren. Das als erstes identifizierte (ERIKSON u.
MALLER 1985) und am besten bekannte Substrat der MAPK ist die p90rsk, welche auch
1 EI N L E I T U N G
als RSK1 (ribosomal S6 kinase 1) bezeichnet wird. Es handelt sich dabei um eine Kinase von ca. 90 kDa, die das S6 Protein der 40 S-Ribosomenuntereinheit phosphorylieren kann.
Die Aktivierung der p90rsk erfolgt u. a. durch eine über die MAPK vermittelte Phosphorylierung (DALBY et al. 1998). Die p90rsk stellt eine Verbindung der MAPK zum MPF (M-phase promoting factor) dar, einer weiteren für den Zellzyklus sehr bedeutsamen Kinase. Der MPF ist ein Schlüsselfaktor beim Übergang der G2- in die M-Phase des Zellzyklus. Der MPF besteht aus zwei Untereinheiten, der enzymatischen Untereinheit p34cdc2 und der regulatorischen Untereinheit Cyclin B. Die inaktive Form wird als prä- MPF bezeichnet und die Aktivierung erfolgt durch die Dephosphorylierung der p34cdc2. Die p90rsk fördert die Bildung des aktiven MPF-Komplexes durch Hemmung der Kinase Myt1, die den MPF sonst inaktiviert (PALMER et al. 1998).
Bei der IVM von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOKs) konnte mit dem Zusatz eines MEK-Inhibitors (z. B. PD98059 oder U0126) die MAPK Phosphorylierung und die Eizellreifung verhindert bzw. deutlich reduziert werden (KAGII et al. 2000; MEINECKE u. KRISCHEK 2003). Dies weist darauf hin, dass ohne eine Aktivierung der MAPK in den Oozyten der Arrest im GV-Stadium nicht überwunden werden kann. Allerdings zeigten Studien, in denen gezielt die MAPK-Kinase-Kinase Mos (Produkt des c-mos Gens), welche nur in den Oozyten und nicht in den Kumuluszellen vorkommt, ausgeschaltet wurde, dass auch ohne MAPK Aktivierung in den Oozyten der GVBD statt finden kann (SU et al. 2002; OHASHI et al. 2003). Für die Wiederaufnahme der Meiose scheint also die Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen entscheidend zu sein.
Die MAPK als ubiquitär vorkommende Signaltransduktionskette spielt neben der Kernreifung auch eine Rolle bei der Steroidhormonbiosynthese in den Follikelzellen. Die Beteiligung der MAPK bei der Steroidproduktion wurde bisher vor allem bei Granulosazelllinien untersucht. Durch Deaktivierung der MAPK mittels Zugabe des MEK- Hemmstoffes U0126 wird die Progesteronsekretion gesenkt und die Estradiolsekretion gesteigert (Ratte: MOORE et al. 2001; TOSCA et al. 2005; ANDRIC u. ASCOLI 2006;
MIYOSHI et al. 2007; Mensch: DEWI et al. 2002; Maus: SU et al. 2006). Unter dem Einfluss des U0126 wurden dabei die mRNA-Expressionen von StAR, Cyp11A1 und 3β- HSD herabreguliert und von Cyp19A1 hingegen intensiviert (Übersicht
Steroidhormonsynthese s. Abb. 4). Analoge Versuche mit KOKs bestätigten diese Wirkungen auch für murine Kumuluszellen (SU et al. 2006). Zu anderen Ergebnissen kommen hingegen SEGER et al. (2001) und TAJIMA et al. (2005). Dort bewirkt die Hemmung der MAPK eine vermehrte Progesteronsekretion. SU et al. (2006) erklären diesen Unterschied durch die dortige Verwendung von Langzeitkulturen.
Abb. 4: Steroidhormonsynthese im Ovar.
Mitochondrium
Cholesterin
Cholesterin
Pregnenolon
Progesteron
17-Hydroxy- pregnenolon
17-Hydroxy- progesteron
Dehydroepi- androsteron
Androstendion
Estron
17β-Estradiol
Testosteron Cyp11A1
3β-HSD
Cyp17
Cyp17
Cyp17
Cyp17
3β-HSD 3β-HSD
17β-HSD
17β-HSD
Cyp19A1 StAR
Cyp19A1
Abk. vollständiger bzw. alter Name
StAR steroidogenic acute regulatory protein Cyp11A1 side-chain cleavage enzyme, P450scc
3β-HSD 3β-hydroxysteroid dehydrogenase Cyp17 17α-hydroxylase, P450C17
17β-HSD 17β-hydroxysteroid dehydrogenase Cyp19A1 aromatase, P450arom
1 EI N L E I T U N G
1.4 Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6)
In den letzten Jahren kristallisierte sich heraus, dass die Oozyte selbst bei der Regulation der Follikelzellfunktionen die zentrale Rolle zu spielen scheint (EPPIG 2001; GILCHRIST et al. 2004). Dies geschieht über so genannte oocyte-secreted factors (OSFs). Diese löslichen Faktoren sind in viele Prozesse wie z. B. Signalkaskaden, somatische Zellproliferation, Apoptose, Luteinisierung und Kumuluszellexpansion involviert (GILCHRIST et al. 2008). Weiterhin haben OSFs einen Einfluss auf die Luteinisierung von Kumulus- und Granulosazellen. Kennzeichnend für die beginnende Luteinisierung ist der Wechsel von der Estradioldominanz im Follikel hin zur gesteigerten Progesteronproduktion. Schon früh wurde die Fähigkeit der Oozyte beschrieben, die vorzeitige Luteinisierung des Follikels zu verhindern (EL-FOULY et al. 1970). Weiterhin zeigten LI et al. (2000), dass die Zugabe von denudierten, d. h. von Kumuluszellen befreiten Oozyten zu einer Granulosazellkultur deren Progesteronsekretion halbierte.
Bei den OSFs handelt es sich u. a. um bone morphogenetic proteins (BMPs). Dies sind Peptide, die als Dimer vorliegen, und eine Untergruppe der transforming growth factor β (TGF-β) Superfamilie bilden (ELVIN et al. 2000). Es gibt mindestens sieben verschiedene BMPs, die bei der Physiologie des Ovars eine Rolle spielen (KNIGHT u. GLISTER 2006).
Dabei stammen von der Oozyte selbst, soweit bisher untersucht, BMP-15, GDF-9 und BMP-6. Beim Schwein wurde neben diesen drei BMPs noch zusätzlich die Expression von BMP-4 mRNA und des BMP-2 Proteins dokumentiert (ZHU et al. 2008; BRANKIN et al.
2005a).
Zu den ersten und im Verlauf auch weiter am meisten untersuchten OSFs gehören der growth-differentiation factor-9 (GDF-9) und das bone morphogenetic protein-15 (BMP- 15). Das Fehlen einer dieser beiden Faktoren bewirkt jeweils eine weibliche Infertilität (Maus: DONG et al. 1996; Schaf: GALLOWAY et al. 2000).
Die Bedeutung des BMP-6 für die physiologische Fertilität wurde in Experimenten mit BMP-6 knockout Mäusen (BMP-6-/-) gezeigt. Die BMP-6-/- Mäuse waren zwar immer noch fertil, aber die Mutanten wiesen Veränderungen bei den Ossifikationsprozessen auf (SOLLOWAY et al. 1998). Weiterhin waren Fruchtbarkeitsparameter wie die Wurfgröße
und die Entwicklungskompetenz von in vitro maturierten Eizellen herabgesetzt (SUGIURA et al. 2010). BMP-6 beeinflusst außerdem die Steroidhormonproduktion von Follikelzellen. BMP-6 reduziert die FSH-induzierte Progesteronproduktion von Granulosazellen unter In-vitro-Bedingungen (Ratte: OTSUKA et al. 2001; MIYOSHI et al.
2007; Rind: GLISTER et al. 2004; Schwein: BRANKIN et al. 2005a; Schaf: JUENGEL et al. 2006). Dabei konnte, bis auf die Ergebnisse beim Rind, kein Einfluss auf die Estradiolproduktion festgestellt werden, jedoch bei der Kokultur von porcinen Granulosa- und Thekazellen sank die Estradiolproduktion unter der Wirkung des BMP-6 (BRANKIN et al. 2005b). Neben den Hormonkonzentrationen wurden auch die entsprechenden Enzyme der Steroidhormongenese untersucht. Analog zur verminderten Progesteronsekretion bewirkt BMP-6 eine verminderte mRNA-Expression von StAR und Cyp11A1 (OTSUKA et al. 2001) und reduzierte Proteinmengen von StAR und 3β-HSD (BRANKIN et al. 2005a).
2 FR A G E S T E L L U N G
2 Fragestellung
Die Signaltransduktion via MAPK ist ein wichtiger Signalübertragungsweg während der Reifung von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOKs). In der vorliegenden Arbeit wurden die Aktivierungsmuster und Einflüsse der MAPK während der In-vitro-Maturation (IVM) von porcinen KOKs näher charakterisiert.
Wird bei der IVM von KOKs die MAPK gehemmt, findet keine Reifung der Oozyten statt, sondern sie verbleiben im GV-Stadium. Nach neueren Erkenntnissen ist dabei für die Wiederaufnahme der Meiose die Aktivierung der MAPK in den Oozyten nicht essentiell (SU et al. 2002; OHASHI et al. 2003). Entscheidend für die Wiederaufnahme der Meiose scheint folglich die Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen zu sein.
Zu dieser Thematik wurde folgenden Fragestellungen nachgegangen:
Wie verhält sich die MAPK in den Kumuluszellen während der Reifung in vitro?
Wie sieht das Aktivierungsmuster der p90rsk als Substrat der MAPK während der IVM von KOKs aus? Besteht eine Abhängigkeit von der MAPK?
In wieweit kann das gewählte In-vitro-Modell auf die Verhältnisse in vivo übertragen werden?
Neben ihrer Bedeutung für die Wiederaufnahme der Meiose ist die MAPK auch an der Arretierung der befruchtungsfähigen Eizelle in der Metaphase II beteiligt. Dieser Zustand kann aber nur für einige Stunden aufrechterhalten werden. Während der Alterung der Eizelle im Metaphase II Stadium treten biochemische Veränderungen auf, die den Kernstatus morphologisch nicht verändern, aber eine eingeschränkte embryonale Entwicklung bewirken (MIAO et al. 2009).
Spielt die MAPK eine Rolle bei den Veränderungen während der Eizellalterung?
Die Eizelle beeinflusst über so genannte oocyte-secreted factors (OSFs) die Funktion der somatischen Follikelzellen. Ein potentieller OSF ist das BMP-6. Die Zugabe von BMP-6 zu Granulosazelllinien bewirkt eine verminderte Progesteronproduktion (z. B. OTSUKA et al. 2001; BRANKIN et al. 2005a). Somit wird durch das BMP-6 mit der Steroidhormonsynthese ein wichtiger Faktor innerhalb des Follikels für die Entwicklung und Befruchtungsfähigkeit der Eizelle beeinflusst.
In welcher Weise sind die 17β-Estradiol- und Progesteronsynthese abhängig von der MAPK?
Hat von der Eizelle sezerniertes BMP-6 einen Einfluss auf die Steroidhormonproduktion in den Kumuluszellen?
Wird die Wirkung des BMP-6 in den Kumuluszellen über die MAPK vermittelt?
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3 Ergebnisse
3.1 Bedeutung der MAPK-Kaskade während der Eizellreifung
Die MAPK-Kaskade spielt eine Schlüsselrolle bei der Signalvermittlung während der Wiederaufnahme der Meiose durch die Oozyte. Um die Wirkung der MAPK in diesem Zusammenhang näher untersuchen zu können, wurden wie bei vielen anderen Fragestellungen zunächst Versuche unter In-vitro-Bedingungen durchgeführt. Für die Untersuchung von Vorgängen während der Eizellreifung bietet sich die In-vitro- Maturation (IVM) an. Es können dafür Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) aus Ovarien von präpubertären Schlachtschweinen verwendet werden, so dass Tierversuche vermieden werden. Weiterhin wird durch die Verwendung von Schlachtorganen die Bereitstellung größerer Probenmengen, wie sie für die Proteinanalytik nötig sind, gewährleistet.
Allerdings kann nicht gänzlich auf die mit Tierversuchen verbundene In-vivo-Reifung verzichtet werden, da nur so überprüft werden kann, ob die unter In-vitro-Bedingungen gewonnenen Aussagen auf die physiologischen Verhältnisse übertragbar sind.
3.1.1 MAPK
Publikation 1: Mitogen-activated protein kinase phosphorylation patterns in pig oocytes and cumulus cells during gonadotropin-induced resumption of meiosis in vitro.
Ziel der Studie war es, das Phosphorylierungsmuster der MAPK sowohl in den Oozyten als auch in den Kumuluszellen näher zu charakterisieren. Die MAPK liegt in ihrem aktivierten Zustand im Vergleich zu ihrer inaktiven Form vermehrt phosphoryliert vor. Daher konnten vom Phosphorylierungsgrad der MAPK Rückschlüsse auf die Aktivität gezogen werden.
Zunächst wurden porcine KOKs für 0, 21, 25, 29 und 45 Stunden kultiviert. Im Anschluss wurde mittels Immunoblot die Phosphorylierung der MAPK in den Oozyten und
Kumuluszellen untersucht. Dabei wurden sowohl ein Antikörper gegen die phosphorylierte MAPK als auch ein Antikörper, der alle Formen der MAPK erkennt, eingesetzt.
In den Eizellen lag die MAPK zu Beginn der IVM zunächst unphosphoryliert vor. Nach 25stündiger Kultivierung waren ca. 50 % der MAPK phosphoryliert. Die Phosphorylierung der MAPK stieg dann weiter an, bis nach 45 Stunden fast die gesamte MAPK in den Oozyten phosphoryliert vorlag. Die beginnende Phosphorylierung korrelierte zeitlich mit dem GVBD. Nach 26 h IVM befanden sich ca. 82 % (n=149) der Eizellen in der Metaphase I. Bei der maximale Phosphorylierung/Aktivierung der MAPK hatten nach 45 h die meisten der Oozyten das Kernreifungsstadium der Metaphase II (ca. 87 %, n=119) erreicht. In den Kumuluszellen hingegen, war ein geringer Anteil der MAPK bereits schon vor der Kultivierung direkt nach der Isolierung aus dem Follikel aktiviert. Nach 21 h lag der höchste Phosphorylierungsgrad vor, welcher schon nach 25stündiger Kultivierung wieder deutlich abgenommen hatte. Nach 45 h IVM war die MAPK dann wieder annähernd komplett dephosphoryliert.
Diese Daten gelten für die gonadotropin-induzierte Maturation der Eizellen. Wurde auf den Zusatz der Hormone FSH und LH zum Maturationsmedium verzichtet, so verblieb die Mehrheit der Eizellen im Germinalvesikelstadium (nach 26 h: ca. 91 %, n=96; nach 46 h:
75 %, n=88) und nahm die Reifung nicht wieder auf. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass die Supplementation von FSH und LH nur in den ersten 10 Stunden der IVM für die Wiederaufnahme der Meiose notwendig ist. Wurde nur in dieser Zeit FSH und LH dem Maturationsmedium hinzugegeben, so hatten trotzdem nach 26 h ca. 83 % (n=81) der Eizellen den GVBD durchlaufen. Beim Vergleich der Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen nach nur 30minütiger und zweistündiger Kultivierung mit und ohne FSH und LH zeigte sich, dass nur mit den Gonadotropinen die Phosphorylierung der MAPK schon nach 30 Minuten deutlich anstieg. Ohne FSH und LH wurde die Phosphorylierung erst nach zwei Stunden deutlicher.
Um den Einfluss der MAPK auf die Eizellreifung näher bestimmen zu können, wurde diese mittels des MAPK-Kinase(MEK)-Inhibitors U0126 gehemmt. In den Eizellen wurde die MAPK durch den Zusatz des U0126 zum Medium vollständig gehemmt. Im Immunoblot konnte keine Erhöhung des Molekulargewichtes aufgrund vermehrter Phosphorylierung beobachtet werden. In den Kumuluszellen bewirkte der MEK-Inhibitor
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nur eine deutliche Reduktion der MAPK-Aktivität, vor allem in den ersten Stunden. Bei der IVM von KOKs wurde durch den Zusatz von U0126 die Wiederaufnahme der Meiose nach 26 h deutlich gehemmt, ca. 97 % der Eizellen verblieben im GV-Stadium (n=117).
Für die Vermittlung dieser Reifungshemmung des U0126 sind allerdings die Kumuluszellen nötig. Wurden KOKs für zunächst fünf Stunden ohne und dann für weitere 21 Stunden mit dem Hemmstoff inkubiert, so nahmen die Oozyten die Meiose nicht wieder auf (ca. 96 % im GV, n=84). Wenn man die Oozyten allerdings für den zweiten Inkubationsschritt mit dem U0126 denudierte, sprich die Kumuluszellen entfernte, so erreichten ca. 43 % die Metaphase I und sogar ca. 37 % die Metaphase II (n=67).
Diese Ergebnisse belegen die Rolle der MAPK bei der Signalvermittlung für die gonadotropin-induzierte Wiederaufnahme der Meiose durch die Oozyten. Dabei ist vor allem die schnelle Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen innerhalb der ersten Stunden der Reifung von Bedeutung.
3.1.2 p90rsk
Publikation 2: Phosphorylation pattern of the p90rsk and mitogen-activated protein kinase (MAPK) molecule: comparison of in vitro and in vivo matured porcine oocytes.
Die p90rsk ist das bekannteste Substrat der MAPK. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der p90rsk als Substrat der MAPK in Eizellen und Kumuluszellen während der Eizellreifung untersucht. Analog zur MAPK wird auch die p90rsk durch vermehrte Phosphorylierung aktiviert. Es wurde ein Antikörper verwendet, der alle Isoformen unabhängig vom Phosphorylierungsgrad erkennt. Durch eine vermehrte Phosphorylierung wird das Molekulargewicht der p90rsk erhöht. Dies wiederum bewirkt eine verkürzte Laufstrecke in der elektrophoretischen Auftrennung. Man spricht von einem sogenannten mobilityshift.
KOKs wurden für 22, 26, 30, 34 und 46 Stunden kultiviert und im Anschluss wurde die p90rsk in den Oozyten mittels Immunoblot analysiert. Nach einer IVM von 22 h lag die
p90rsk im Bereich von 90 kDa als Doppelbande vor. Nach 26 h wurde die Bande mit dem etwas geringeren Molekulargewicht schächer und nach 30 h war sie nicht mehr sichtbar.
Die obere Bande hingegen nahm in ihrer Intensität bis 30 h zu. Nach 34- und 46stündiger Kultivierung waren die beiden ursprünglichen Banden nicht mehr vorhanden, sondern nur noch eine weitere mit einem leicht höheren Molekulargewicht. Dieser mobilityshift während der In-vitro-Maturation ab 26 h bis 34 h gibt die vermehrte Phosphorylierung in dieser Zeit wieder. Diese Phosphorylierung wurde durch den Zusatz des MEK-Inhibitors U0126 zum Maturationsmedium komplett gehemmt. Dies spricht für die Aktivierung der p90rsk in den Oozyten durch die MAPK.
Weiterhin wurde versucht, nicht nur die Phosphorylierung sondern auch die eigentliche Aktivität der p90rsk direkt nachzuweisen. Dazu wurde ein kommerziell erhältlicher Kinase Assay Kit (S6 kinase assay kit, Upstate/Millipore, Schwalbach/Ts.) verwendet. Dieser Assay basiert darauf, die Aktivität der Kinase durch die Phosphorylierung eines bestimmten Substrates mit radioaktivem Phosphor darzustellen. Mit diesem Test konnte keine Zunahme der Aktivität festgestellt werden. Sie nahm sogar, wenn auch nicht signifikant, im Laufe der IVM etwas ab. Die dem Assay vorangeschaltete Immunopräzipitation der p90rsk war nicht spezifisch genug. Wahrscheinlich wurde mit dem Kinase Assay nicht die Aktivität der p90rsk, sondern die einer anderen S6 Kinase, der p70S6K, gemessen, deren Aktivität während der Eizellreifung abnimmt (SCHAB et al.
1999). Der Testkit wurde auch im Laufe der Versuche vom Hersteller von „S6 kinase assay kit“ in „p70S6K assay kit“ umbenannt.
Das Hauptanliegen dieser Studie war es jedoch zu überprüfen, ob die erhaltenen Ergebnisse aus der IVM mit den Vorgängen in vivo übereinstimmen. Dafür wurden weibliche Schweine im Schlachtalter mit eCG und hCG stimuliert. Die Ovarien wurden chirugisch nach 0, 22 und 30 Stunden nach der hCG-Injektion entfernt und im Anschluss die KOKs isoliert. Die Kernreifungsstadien dieser Eizellen stimmten mit denen aus der IVM in etwa überein. Zum Zeitpunkt 0 h befanden sich die Oozyten im GV-Stadium (in vitro: 99,1 % n=117; in vivo: 100 %, n=22). Nach 22stündiger Reifung befanden sich 35,5 % (n=93) der IVM Oozyten in der Metaphase I und bei den in vivo gereiften waren es 16,0 % (n=25). Nach 30 Stunden hatten jeweils um die 80 % (in vitro: n=81; in vivo: n=20) die Metaphase I erreicht. Die Zunahme des Phosphorylierungsgrads der p90rsk bei 30 h im
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Vergleich zu 22 h konnte bei der In-vivo-Reifung bestätigt werden. Allerdings lag hier die p90rsk in den Eizellen als Dimer vor, so dass die Banden der p90rsk bei etwas unter 200 kDa erschienen.
Die p90rsk wurde auch in den Kumuluszellen untersucht. Sowohl während der In-vitro- Reifung als auch bei In-vivo-Reifung lag die p90rsk stets als Monomer bei 90 kDa vor und wurde im Laufe der Maturation nicht weiter phosphoryliert.
Diese Untersuchung zeigt, dass die Phosphorylierung der p90rsk in den Oozyten während der Reifung zeitlich um den GVBD beginnt und beim Erreichen der Metaphase II in maximaler Form vorliegt. Weiterhin ist diese Phosphorylierung MAPK-abhängig. In den Kumuluszellen wird die p90rsk während der Eizellreifung jedoch nicht aktiviert. Sie scheint dort als Substrat der MAPK weniger von Bedeutung zu sein.
Die In-vivo-Versuche bestätigten die Phosphorylierungsmuster der p90rsk während der In- vitro-Maturation.
3.2 Rolle der MAPK während der Eizellalterung in vitro
Publikation 3: In vitro ageing of porcine oocytes: Changes in phosphorylation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) and parthenogenetic activability.
Die MAPK spielt nicht nur bei der Wiederaufnahme der Meiose eine Rolle, sondern auch bei der Arretierung der befruchtungsfähigen Eizellen in der Metaphase II. In diesem Stadium werden bei den meisten Säugetieren die Eizellen ovuliert. Als Eizellalterung wird die Alterung der fertilen Eizelle bezeichnet. Sie ist zu unterscheiden von der Alterung des gesamten Individuums. Die Eizellalterung kann bedingt sein durch eine verzögerte Ovulation oder eine verspätete Befruchtung der Eizelle sowohl in vivo als auch in vitro. Im Metaphase II-Arrest sind die Eizellen weniger als 10 Stunden befruchtungsfähig. Wenn die Eizelle nicht im optimalen Zeitfenster befruchtet wird, bewirkt die Alterung nicht nur sinkende Befruchtungsraten, sondern auch ein gehäuftes Auftreten von Polyspermie,
Parthenogenese, Chromosomenanomalien, frühen Schwangerschaftsverlusten und Entwicklungs- und Motorikstörungen bei den Nachkommen (MIAO et al. 2009).
In der Studie wurden die Auswirkungen der Eizellalterung auf den Kernstatus, die Phosphorylierung der MAPK und die parthenogenetische Aktivierbarkeit während der Kultivierung von porcinen Oozyten untersucht. Bei der IVM von Kumulus-Oozyten- Komplexen hatten nach 46 h 79,3 % (n=111) der Oozyten die Metaphase II erreicht. Für die Alterung wurden die Eizellen für weitere 12 bzw. 26 h kultiviert, so dass Kulturgesamtdauern von 58 und 72 Stunden erreicht wurden. Nach 58 h waren keine Veränderungen des Kernstatus im Vergleich zu 46 h zu beobachten. Es befanden sich immer noch 80,0 % (n=130) der Eizellen in der Metaphase II. Nach 72 h jedoch war der Anteil der Oozyten in der Metaphase II reduziert (42,9 %, n=119) und der Anteil der fragmentierten (17,6 %) und degenerierten Oozyten (39,9 %) stieg deutlich an. Die Phosphorylierung, sprich Aktivierung, der MAPK wurde wieder mittels Immunoblot untersucht. Die Signale der aktivierten MAPK wurden jedoch diesmal im Anschluss semiquantitativ ausgewertet. Die Phosphorylierung der MAPK nahm schon nach 12stündiger Alterung ab. Nach 26stündiger Alterung war sie noch etwas schwächer.
Weiterhin wurde der Einfluss der Alterung auf die parthenogenetische Aktivierbarkeit der Eizellen untersucht. Mittels einer Kombination von Ethanol und Cycloheximid wurden die Eizellen nach 46-, 58- bzw. 72stündiger Maturation aktiviert. Für die Aktivierung wurden nur Oozyten in der Metaphase II verwendet, die zuvor anhand ihres Polkörpers unter einem Stereomikroskop selektiert worden waren. Die meisten der parthenogetisch aktivierten Oozyten befanden sich in einem Furchungsstadium mit 2-4 Blastomeren. Der Anteil dieser Furchungsstadien war zwar nach 58 h (42,0 %, n=112) und 72 h (40,3 %, n=139) IVM geringer als nach 46 h (51,9 %, n=108), aber dieser Einfluss war nicht signifikant (P = 0,07). Nur ein kleiner Anteil der Eizellen entwickelte nach 46 (1,9 %) und 58 Stunden (0,0 %) ein oder zwei Vorkerne. Nach 72stündiger IVM waren jedoch vermehrt Vorkernstadien (8,6 %) zu beobachten. Der Anteil der fragmentierten Oozyten, d. h.
Oozyten mit blastomerartigen Zellen, jedoch zumeist ohne Zellkern, stieg mit zunehmender Alterung an (46 h: 1,9 %; 58 h: 5,4 %; 72 h: 7,9 %). Degenerierte Eizellen waren nach 58 h (17,0 %) und 72 h (12,9 %) IVM häufiger zu finden als nach einer Maturation von 46 h (6,5 %).
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In einem weiteren Ansatz wurde überprüft, ob eine Hemmung der MAPK während der Eizellalterung die Alterungsvorgänge beschleunigt. Dafür wurden die KOKs nach 46 h wieder für weitere 12 bzw. 26 h kultiviert, jedoch nun mit dem Zusatz des MEK-Inhibitors U0126. Die weitestgehende Inaktivierung der MAPK bei der Alterung bewirkte Veränderungen in der Kernreifung. Ein Teil der Oozyten überwand den Arrest in der Metaphase II. Ein frühes Stadium der Anaphase II erreichten 30,9 % (n=110) bzw. 39,7 % (n=116) der für 58 h und 72 h maturierten Oozyten. Nur wenige Eizellen wiesen Vorkerne auf (58 h: 2,7 %, 72 h: 2,6 %) oder waren fragmentiert (58 h: 3,6 %, 72 h: 2,6 %).
Furchungsstadien konnten nicht beobachtet werden.
Zusammenfassend betrachtet ist festzustellen, dass während der Eizellalterung, bevor sichtbare Anzeichen wie ein veränderter Kernreifungsstatus auftreten, Veränderungen in der Eizelle stattfinden, die die weitere Entwicklungsfähigkeit beeinflussen. Für die Aufrechterhaltung des Metaphase II-Arrestes einer fertilen Oozyte ist es wichtig, dass die MAPK nicht an Aktivität verliert.
3.3 Steroidhormonproduktion in den Kumuluszellen
Die Steroidhormonkonzentrationen in der Follikelfüssigkeit üben einen wichtigen Einfluss auf die normale Entwicklungs- und Befruchtungsfähigkeit von Eizellen aus (HAZALEGER et al. 1995). Zunächst liegt während der Follikelreifung eine Östrogendominanz vor. Durch den LH-Einfluss kurz vor der Ovulation wird mit beginnender Luteinisierung der Follikelzellen die Progestronsynthese induziert und die Östrogensynthese herabreguliert (RICHARDS 1994). Im Follikel produzieren hauptsächlich die Granulosazellen die Steroidhormone, aber auch die Kumuluszellen sind in der Lage 17β-Estradiol und Progesteron zu sezernieren. Die Steroidhormonproduktion in den Kumuluszellen wurde als Parameter gewählt, um den Einfluss der Eizelle auf die Follikelentwicklung näher zu untersuchen, da die Kumuluszellen als erste Zielzellen der Beeinflussung durch die Eizelle am intensivsten ausgesetzt sind.
3.3.1 Einfluss der MAPK
Publikation 4: Steroidogenesis and the influence of MAPK activity during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes.
Bevor der Einfluss der Oozyte auf die Steroidhormonproduktion in den sie umgebenden Kumuluszellen untersucht wurde, wurde in dieser Studie die Steroidgenese an sich und eine mögliche Abhängigkeit von der Aktivität der MAPK in den Kumuluszellen während der IVM von porcinen KOKs untersucht. Gruppen von jeweils 20 KOKs wurden für 0, 5, 26 oder 46 Stunden mit und ohne Zusatz des MEK-Inhibitors U0126 in vitro maturiert. Im Anschluss wurde die Phosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen und Oozyten untersucht und die Konzentrationen von 17β-Estradiol und Progesteron im Medium bestimmt. Mittels RT(reverse transcriptase)-PCR und anschließender semiquantitativer Auswertung wurde die mRNA-Expression der steroidalen Enzyme StAR, Cyp11A1, 3β- HSD und Cyp19A1 analysiert. Das StAR Protein vermittelt den Transport des Substrates Cholesterin von der äußeren zur inneren mitochondrialen Membran. Cyp11A1 ist das kodierende Gen für das cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme, welches Cholesterin zu Pregnenolon umsetzt. Im Anschluss wird Pregnenolon durch die 3β- Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD) in Progesteron umgewandelt. Durch die P450 Aromatase, das Protein des Genes Cyp19A1, wird aus Testosteron 17β-Estradiol gebildet (Übersicht Steroidhormonsynthese s. Abb. 4).
Im Immunoblot konnte der Verlauf der Phosphorylierung der MAPK in Kumuluszellen und Oozyten bestätigt werde. Durch den Hemmstoff U0126 wurde die Aktivität der MAPK in den Oozyten komplett gehemmt. In den Kumuluszellen wurde die MAPK nur nach 0 und 5 Stunden komplett gehemmt. Nach 26 h war eine schwache Phosphorylierung festzustellen und nach 46 h sogar eine deutlichere als nach der Kultivierung ohne Hemmstoff. Nach 5stündiger Kultivierung hatte sich die 17β-Estradiolkonzentration im Medium noch nicht verändert (0 h: 0,4 ng/ml; 5 h: 1,6 ng/ml). Nach 26 h IVM war sowohl mit als auch ohne U0126 ein deutlicher Anstieg zu beobachten (ohne U0126: 9,0 ng/ml;
mit U0126: 6,5 ng/ml). Ohne den MEK-Inhibitor sank die 17β-Estradiolkonzentration nach 46 h auf 5,4 ng/ml, mit U0126 hingegen stieg die Konzentration nach 46 h weiter auf 10,3 ng/ml an. Die Progesteronkonzentration im Medium war unabhängig vom
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Hemmstoffeinsatz während der ersten 26 h sehr niedrig (16,0-61,0 ng/ml). Zwischen 26 und 46 Stunden stieg die Progesteronkonzentration im Medium jedoch um das ungefähr neunfache auf 565,5 ng/ml an. Diese vermehrte Sekretion wurde durch den MEK-Inhibitor deutlich gehemmt (46 h mit U0126: 39,0 ng/ml).
Bei der mRNA-Expression von StAR und Cyp11A1 konnte kein Einfluss des U0126 beobachtet werden. Die Expression von StAR nahm zwischen 5 und 26 h deutlich zu und blieb auch nach 46 h auf diesem Niveau. Die Expression von Cyp11A1 blieb während der ganzen Kultivierungszeit weitestgehend unverändert. Die Hemmung der MAPK beeinflusste aber die mRNA-Expressionen von 3β-HSD und Cyp19A1. Die Expression des 3β-HSD wurde durch den Einsatz des Hemmstoffes bei allen Untersuchungszeitpunkten reduziert. Somit wurde auch der Anstieg zwischen 26 und 46 Stunden verhindert. Das Cyp19A1 wurde nach fünfstündiger IVM am stärksten exprimiert. Durch die Kultivierung mit dem MEK-Inhibitor wurde die Expression nach 5 h leicht reduziert, aber nach 26 und 46 h stiegen die mRNA-Levels unter der Wirkung des U0126 deutlich an.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die MAPK an der Steroidhormonproduktion von porcinen Kumuluszellen beteiligt ist. Während der In-vitro-Maturation wird der Wechsel von anfänglicher 17β-Estradiolsynthese zur Progesterondominanz am Ende der Reifung durch die Regulation der Expression von 3β-HSD und Cyp19A1 gesteuert. Für diesen Vorgang ist die Aktivität der MAPK erforderlich. Die MAPK ist somit an der Einleitung der Luteinisierung beteiligt.
3.3.2 Wirkung von BMP-6
Publikation 5: Bone morphogenetic protein-6 (BMP-6): mRNA expression and effect on steroidogenesis during in vitro maturation of porcine cumulus oocyte complexes.
Das bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) ist ein potentieller oocyte-secreted factor. Die Zugabe von BMP-6 zu Granulosazellkulturen bewirkt eine Reduzierung der Progesteronproduktion. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von BMP-6 als möglichen von der Oozyte serzernierten Faktor auf die Steroidhormonsynthese in porcinen Kumuluszellen während der IVM zu untersuchen. Weiterhin sollte geklärt werden, ob die Wirkung des BMP-6 über die MAPK vermittelt wird. Dafür wurden KOKs aus Ovarien von Schlachtschweinen für 0, 5, 26 und 46 Stunden in vitro maturiert. Im Anschluss wurden im Medium die Konzentrationen von 17β-Estradiol und Progesteron gemessen. In den Kumuluszellen wurde die Expression von den steroidalen Enzymen StAR, 3β-HSD und Cyp19A1 semiquantitativ mittels RT-PCR analysiert und die Phosphorylierung der MAPK im Immunoblot bestimmt. Weiterhin wurde die BMP-6 mRNA-Expression in den Kumuluszellen und Oozyten untersucht. Um den Einfluss der Oozyte untersuchen zu können, wurden die gleichen Versuche auch mit Kumuluskomplexen (KKs) ohne Oozyten durchgeführt. Die Oozyten wurden jeweils vor der Kultivierung aus den KOKs entfernt. In einem dritten Versuchsansatz wurden dann KKs untersucht, bei denen während der Kultivierung BMP-6 dem Medium zugesetzt worden war (KKs +BMP-6).
Eine Expression von BMP-6 konnte in den Kumuluszellen und in den Oozyten nach jeder Kultivierungszeit nachgewiesen werden. Bei beiden Zelltypen war nach 5stündiger IVM die mRNA-Expression am höchsten. Nach einer Kultivierungsdauer von 5 h konnte bei der 17β-Estradiolsekretion weder ein Einfluss durch die Oozyte noch durch die Zugabe von BMP-6 beobachtet werden. Nach 26 h IVM war in den beiden Kulturen ohne Oozyten (KKs: 5,5 ng/ml; KKs + BMP-6: 4,1 ng/ml) weniger 17β-Estradiol vorhanden als in der Kultur mit Oozyten (KOKs: 9,0 ng/ml). Die Supplementation von BMP-6 konnte jedoch nach 46stündiger Kultivierungsdauer die Reduktion der 17β-Estradiolsekretion, die durch das Fehlen der Oozyte hervorgerufen wurde, wieder ausgleichen. Die 17β- Estradiolkonzentration im Medium betrug nach der IVM von KOKs 5,4 ng/ml und nach der Kultur von KKs 3,0 ng/ml. Durch die Zugabe von BMP-6 zu den KKs konnte die
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Konzentration auf 6,6 ng/ml erhöht werden. Im Gegensatz zum 17β-Estradiol wurde die Progesteronproduktion durch die Entfernung der Oozyten nicht beeinflusst. Bei allen drei Versuchsansätzen bewegten sich die Progesteronkonzentrationen im Medium zu den Zeitpunkten 0 h, 5 h und 26 h zwischen 0 und 124,2 ng/ml. Erst nach 46stündiger Kultivierung stiegt die Progesteronkonzentration in allen drei Versuchsgruppen deutlich an (KOKs: 565,5 ng/ml; KKs: 763,1 ng/ml; KKs + BMP-6: 684,8 ng/ml).
Die Expression der StAR und 3β-HSD Transkripte stieg während der IVM kontinuierlich an. Dabei konnte kein genereller Einfluss durch die Entfernung der Oozyte und/oder durch die Zugabe von BMP-6 beobachtet werden. Die Cyp19A1 Expression in den Kumuluszellen war bei der Kultivierung von KOKs nach 5 h am höchsten. In Kumuluszellen der KKs war die Expression von Cyp19A1 nach 5 h geringer, wenn auch nicht signifikant (P = 0,061). Die Zugabe von BMP-6 zum Maturationsmedium bewirkte eine sehr deutliche Steigerung der Cyp19A1 Transkription nach 5stündiger Kultivierung.
Auch nach 26 und 46 Stunden wurde Cyp19A1 in der Gruppe der KKs mit BMP-6 am stärksten exprimiert.
Die Phosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen stieg in allen drei Versuchsansätzen während der ersten fünf Stunden an. Nach 26 h wurde sie wieder etwas geringer. Nur in den Kumuluszellen aus der Kultur der Kumuluskomplexe mit BMP-6 blieb der Phosphorylierungsgrad auch nach 26 h noch relativ hoch. Nach 46stündiger Kultivierung war ein Einfluss durch die Entfernung der Oozyte unabhängig von der BMP- 6 Supplementation zu beobachten. Die Phosphorylierung der MAPK war in den Kumuluszellen der KOKs niedriger als in denen von den KKs und den KKs mit BMP-6.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass BMP-6 ein potentieller oocyte-secreted factor ist. BMP-6 ist daran beteiligt, eine vorzeitige Luteinisierung zu verhindern, in dem es die 17β-Estradiolsynthese fördert. Diese Wirkung wird nicht über die MAPK vermittelt. Es wird angenommen, dass neben dem BMP-6 auch noch anderen Faktoren die Steroidhormongenese während der Eizell- und Follikelentwicklung regulieren.
4 Übergreifende Diskussion
4.1 Bedeutung der MAPK
In den beschriebenen Studien wurde die Rolle der MAPK für die Signalvermittlung während der Reifung von porcinen Kumulus-Oozyten-Komplexen untersucht. Die Versuche basierten darauf, dass die Aktivierung der MAPK anhand ihres Phosphorylierungsgrades zu bestimmten Zeitpunkten untersucht wurde. Mittels Inaktivierung der MAPK durch den MEK-Inhibitor U0126 wurden vor allem funktionelle Auswirkungen untersucht: Wird die Meiose von der Eizelle trotz Hemmung der MAPK wieder aufgenommen? Wie verändert sich die Steroidhormonproduktion? Gibt es Auswirkungen auf die Entwicklungskompetenz der Eizelle?
Es konnte gezeigt werden, dass die MAPK bei unterschiedlichen Prozessen von Bedeutung ist. Sie vermittelt den gonadotropin-induzierten GVBD. Dafür ist die Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen während der ersten Stunden der IVM von Bedeutung (Publikation 1). Weiterhin wirkt die MAPK mit bei der Steuerung der Steroidhormonproduktion in den Kumuluszellen. Durch die Aktivierung der MAPK wird die vermehrte Progesteronproduktion gegen Ende der Reifung eingeleitet und die Estradiolproduktion vermindert (Publikation 4). Die MAPK ist ebenfalls an der Aufrechterhaltung der Befruchtungsfähigkeit von Oozyten in der Metaphase II beteiligt.
Eine Reduktion der Aktivität der MAPK im Rahmen der Alterung von Metaphase II Oozyten korrelierte mit höheren Fragmentations- und Degenerationsraten nach parthenogenetischer Aktivierung (Publikation 3).
Die konkretere Signalvermittlung ober- und unterhalb der MAPK ist sehr komplex.
Einzelne Einflüsse sind schon geklärt (Abb. 5), aber es gibt noch genug offene Fragen. Die Aktivierungssysteme können parallel wirken, es gibt diverse Rückkoppelungsmechanismen und es besteht eine Abhängigkeit vom Entwicklungsstand der Zelle. In der Eizelle gibt es die Aktivierungskette Mos MEK MAPK p90rsk (SEGER u. KREBS 1995). Diese ist jedoch nicht als „einspurige Einbahnstraße“ zu verstehen. Es bestehen noch Alternativen zur Aktivierung. Zum Beispiel wird die MEK
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auch über die Kinasen Ras und Raf aktiviert. Weiterhin existieren Rückkopplungsmechanismen, u. a. auch vom MPF (GOTOH et al. 1991).
Abb. 5: : Wirkungsmechanismus der MAPK beim GVBD.
(Schema modifiziert nach LIANG et al. 2007)
Die Signalwege der MAPK in Kumulus- und Eizelle bei der Vermittlung der Wiederaufnahme der Meiose bei Säugetieren wurden vereinfacht schematisch dargestellt.
Zur besseren Übersicht wurden nur die wichtigsten Signalwege aufgezeichnet. Es existieren noch diverse bekannte und unbekannte Zwischenstufen und Rückkopplungsmechanismen.
cAMP= cyclisches Adenosinmonophosphat, cdc25= cell division cycle kinase 25, GVBD=
germinal vesicle breakdown, MAPK= mitogen-activated protein kinase, MEK= MAPK Kinase, Mos= MAPK-Kinase-Kinase, Produkt des c-mos Gens, MPF= M-phase promoting factor, Myt1= myelin transcription factor 1, p90rsk= protein 90 ribosomal S6 kinase, PDE3= Phosphodiesterase 3, PDE4= Phosphodiesterase 4, PKA= Proteinkinase A, PKC=
Proteinkinase C, Wee1= wee schottisch bzw. irisch umgangssprachlich für small
cAMP PKA
Rezeptor Gonadotropine
PKC
Steroid- synthese
PDE4 MAPK
Steroide
PKA
Rezeptor
MAPK PDE3
cAMP
MPF
PKC cdc25
Wee1
Myt1 Mos
MEK
GVBD
p90rsk Connexin 37
Kumuluszelle
Eizelle fördert hemmt
In den Kumuluszellen kann die MAPK über mindestens zwei verschiedene Wege aktiviert werden. Unterhalb des Gonadotropin-Rezeptors kann das Signal über die cAMP-abhängige Proteinkinase A oder über die Proteinkinase C weitergeleitet werden (LIANG et al. 2007;
FAN et al. 2004). Die genauen Mechanismen von der Vermittlung des Gonadotropinsignals über den Rezeptor bis zur MAPK sind dabei noch nicht vollständig geklärt.
Die beschriebenen Untersuchungen zeigen, dass der Einfluss und die Wirkungsweise der MAPK von der Zellart abhängig sind. Der Unterschied zwischen Eizelle und Kumuluszelle bezüglich der MAPK zeichnet sich nicht nur durch die unterschiedlichen Phosphorylierungsmuster aus. In den Oozyten konnte die p90rsk der MAPK als mögliches Substrat zugeordnet werden. Die p90rsk wurde im gleichen Zeitraum wie die MAPK aktiviert und die Aktivierung der p90rsk konnte durch die Hemmung der MAPK verhindert werden (Publikation 2). In den Kumuluszellen allerdings wurde die p90rsk während der Reifung, sowohl in vitro als auch in vivo, nicht aktiviert und scheint somit dort keine Rolle als Substrat der MAPK zu spielen. Allerdings zeigten FAN und Mitarbeiter (2003) in den Kumuluszellen eine Aktivierung der p90rsk durch vermehrte Phosphorylierung ab 12stündiger IVM, die sich innerhalb der nächsten 12 h noch steigerte. Dieser Unterschied könnte auf unterschiedliche Zusätze zum Maturationsmedium beruhen.
Weiterhin unterscheidet sich der Einfluss des second messengers cAMP (cyclisches Adenosinmonophosphat) auf die MAPK (TSAFRIRI et al. 1996). In den Kumuluszellen bewirkt ein erhöhter cAMP-Spiegel die Aktivierung der MAPK und somit die Wiederaufnahme der Meiose durch die Eizelle. In Eizellen hingegen resultiert die Erhöhung der cAMP-Konzentration durch die Hemmung der Phosphodiesterase 3 in einer Verhinderung des GVBD (LIANG et al. 2005). Der anscheinend für den GVBD benötigte Abfall der cAMP-Konzentration in der Eizelle kann zum einen durch den vermehrten Umsatz in der Eizelle erreicht werden. Zum anderen werden aber auch durch die Aktivierung der MAPK in den Kumuluszellen die Proteine Connexin 43 und Connexin 37 vermehrt phosphoryliert. Bei Connexin 43 und Connexin 37 handelt es sich Strukturproteine in den gap junctions. Durch die Phosphorylierung wird der Austausch von
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cAMP zwischen den somatischen Zellen und zwischen den Kumuluszellen und der Eizelle unterbrochen (SELA-ABRAMOVICH et al. 2005; LIANG et al. 2007).
In der Publikation 5 wurde untersucht, ob die Wirkung des BMP-6 über die MAPK vermittelt wird. BMP-6 verhindert eine vorzeitige Luteinisierung der Kumuluszellen während der IVM. Für diese Wirkung müsste BMP-6 die MAPK inaktivieren. Die Ergebnisse zeigten jedoch, dass die Supplementation von BMP-6 zu Kulturen mit Kumuluskomplexen ohne Eizellen keinen Einfluss auf die MAPK hatte. Vielmehr bewirkte die Entfernung der Eizelle unabhängig von einer BMP-6-Zugabe eine Verhinderung der Dephosphorylierung der MAPK in den Kumuluszellen nach 46stündiger IVM. Auch bei Granulosazellkulturen mit Zellen von Ratten hatte BMP-6 keinen Einfluss auf die Aktivität der MAPK (MIYOSHI et al. 2007). Daraus kann man schließen, dass im Follikel BMP-6 die Steroidhormonsynthese in der Signalkaskade unterhalb der MAPK oder unabhängig von ihr beeinflusst. In den somatischen Follikelzellen scheint das BMP-6 über den Smad 1/5/8 Signalweg zu agieren (GLISTER et al. 2004; HUSSEIN et al. 2005).
Die vorliegenden Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bedeutung des BMP-6 als möglichen oocyte-secreted factor (OSF) geben. In wieweit BMP-6 wirklich von der Eizelle sezerniert wird, ist jedoch noch nicht belegt. Es wurde zwar bereits in porciner Follikelflüssigkeit nachgewiesen (BRANKIN et al. 2005a), aber im Gegensatz zu anderen OSFs wie GDF-9 und BMP-15 wurde die Expression von BMP-6 nicht nur in der Eizelle, sondern auch in den somatischen Follikelzellen nachgewiesen (ZHU et al. 2008;
Publikation 5). Somit ist der Ursprung des BMP-6 in der Follikelflüssigkeit nicht eindeutig geklärt. Ein weiterer Beleg dafür, dass BMP-6 von der Oozyte sezeniert wird, wäre der Nachweis von BMP-6 im Medium gewesen. Die BMP-6-Konzentration im Medium hätte im Laufe der IVM der KOKs zunehmen müssen und bei der Kultivierung von Kumuluskomplexen ohne die Eizelle sollte dann keine oder nur eine sehr geringe Zunahme der BMP-6-Konzentration nachzuweisen sein. Dieser Nachweis wurde mittels Immunoblot versucht, aber er ist leider nicht gelungen. Lediglich der Zusatz des rekombinanten BMP-6 konnte im Medium nachgewiesen werden.
4.2 Bewertung des In-vitro-Systems
Die Versuche dieser Arbeit wurden zumeist unter In-vitro-Bedingungen durchgeführt. Bei den Untersuchungen zur Wiederaufnahme der Meiose, der Eizellalterung und der Hormonproduktion wurden Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) unter bestimmten Bedingungen in einem Maturationsmedium kultiviert. Dadurch sollte der Ablauf der physiologischen Eizellreifung nachempfunden werden. Für die Kultivierung wurden KOKs von präpubertären, ca. fünf bis sechs Monaten alten Schlachtschweinen verwendet. Diese Schweine stellen den Hauptanteil der üblicherweise auf Schlachthöfen geschlachteten Schweine dar. Adulte Sauen, die schon mindestens einen Wurf Ferkel hatten, werden nicht in so großer Anzahl geschlachtet. Bei der Beurteilung der Versuchsergebnisse ist also stets zu berücksichtigen, dass mit Zellen von noch nicht ausgewachsenen Tieren ohne regelmäßigen Ovarzyklus gearbeitet wurde. MARCHAL et al. (2001) beschreiben, dass die Oozyten von präpubertären Schweinen weniger sensitiv auf FSH und EGF (epidermal growth factor) reagieren, welches in verminderte Maturationsraten im Vergleich zu Eizellen von adulten Schweinen resultiert. Jedoch war beim gleichzeitigen Einsatz von FSH und EGF kein Unterschied bezüglich der Kernreifung mehr vorhanden. Die Verwendung von Eizellen präpubertärer Schweine scheint auch nicht für das weit verbreitete Problem der Polyspermie bei der IVM mit anschließender IVF beim Schwein verantwortlich zu sein. Allerdings sind mit der Verwendung von Eizellen von adulten Schweinen höhere Blastozystenraten zu erreichen (SHERRER et al. 2004). In den beschriebenen Versuchen konnten mit den Eizellen von präpubertären Schweinen gute Reifungsergebnisse erzielt werden. Die Eizellen der selektierten KOKs befanden sich direkt nach der Isolierung aus dem Follikel zu über 90 % im GV I Stadium und unter den beschrieben In-vitro-Bedingungen erreichten ca. 85 % das befruchtungsfähige Stadium der Metaphase II.
Bei der Beurteilung in wieweit von den In-vitro-Versuchen Rückschlüsse auf die tatsächlichen physiologischen Vorgänge gezogen werden können, muss auch die Zusammensetzung des Maturationsmediums berücksichtigt werden. Bis auf bei den Versuchen für die Publikation 3 wurde stets TCM (tissue culture medium) 199 als Grundmedium verwendet. Neben Insulin, L-Glutamin und Gentamycin wurden noch Hormone und eine Proteinkomponente dem Medium hinzugefügt. Bei den Hormonen
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wurde sich für die Zugabe von porcinem FSH und LH entschieden. Weiterhin wurde dem Medium FCS (fetal calf serum) in nicht unerheblicher Konzentration von 20 % (v/v) zugesetzt. Dadurch wurden die Eizellen gut ernährt und man erhielt gute Reifungsresultate.
Allerdings ist die Zusammensetzung des FCS sehr undefiniert. Unter anderem sind im FCS zahlreiche Wachstumsfaktoren und Hormone vorhanden, mit denen die KOKs des Schweines unter physiologischen Bedingungen eher weniger oder gar nicht in Kontakt kommen würden. Beispielsweise beruhen die vor der IVM im Medium gemessenen Steroidhormonkonzentrationen bei den Publikationen 4 und 5 auf dem FCS-Zusatz. Die im Verlauf der Versuche gemessenen 17β-Estradiol- und Progesteronkonzentrationen sind jedoch deutlich höher als zu Beginn im Medium, so dass einen Abgrenzung zwischen FCS- Ursprung und Sekretion durch die Kumuluszellen gut möglich war.
Es gibt natürlich auch Alternativen zum FCS-Zusatz. In der Publikation 3 wurde statt des TCM 199 das Whitten’s Medium (WHITTEN 1970) mit 0,3 % (w/v) BSA (bovines Serumalbumin) verwendet. Da es dort speziell um die Untersuchung der anhaltenden Aktivität der MAPK während der Eizellalterung ging, wurde sich für das Whitten’s Medium entschieden, da die Aktivität der MAPK in Metaphase II Oozyten nach der IVM mit diesem relativ einfach zusammengesetzten Medium im Vergleich zu anderen Medien höher ist (SETIADI et al. 2009). Ein möglicher Grund dafür wäre die geringere Natriumchloridkonzentration im Whitten’s Medium im Vergleich zum TCM 199. Mit BSA als Proteinzusatz konnten gute Reifungsergebnisse (ca. 80 % in der Metaphase II) erzielt werden. Allerdings stellte sich heraus, dass bei den Versuchen mit anschließender parthenogenetischer Aktivierung schon bei den nicht gealterten Eizellen die Furchungsraten sehr niedrig und die Degenerationraten recht hoch waren. Daher wurde für die parthenogenetische Aktivierung wieder FCS eingesetzt, welches die Erfolgsraten deutlich verbesserte und so eine vergleichende Untersuchung mit den gealterten Eizellen ermöglichte. Neben FCS und BSA gibt es noch andere mögliche Medienzusätze, z. B.
porcine Follikelflüssigkeit oder als proteinfreie Komponente PVP (Polyvinylpyrrolidon).
