Parthenogenetische Aktvierbarkeit in vitro gealterter Oozyten

Wie unter C 1.3 beschrieben, wurde die Eizellalterung in vitro nach 46stündiger IVM eingeleitet und es wurden ausschließlich Oozyten verwendet, in denen unter stereomikroskopischer Kontrolle der erste ausgeschleuste Polkörper nachweisbar war.

Abb. 12 zeigt exemplarisch eine native Eizelle mit diesem Kriterium.

Abb. 12: Stereomikroskopische Aufnahme einer Oozyte nach 46 h IVM mit 1. Polkörper (PK)

Um die parthenogenetische Aktivierbarkeit in vitro gealterter Eizellen zu untersuchen, wurden Eizellen anhand ihres Entwicklungsstadiums nach erfolgter biochemischer Aktivierung mittels Ethanol und Cycloheximid verglichen. Dafür wurden die Oozyten jeweils nach 46-, 58- und 72 h Kultivierung parthenogenetisch aktiviert und anhand ihres Entwicklungsstadiums untersucht (s. C 2, C 3). Tab. 4 zeigt eine Übersicht der in diesem Versuchsteil aktivierten, gefärbten und zytogenetisch beurteilten Eizellen.

Tab. 4: Anzahl der parthenogenetisch aktivierten Eizellen nach 46-, 58- und 72stündiger IVM

IVM (h) 46 58 72

n (Anzahl EZ) 108 112 139

Nach den verschiedenen Kultivierungszeiträumen wurden die Entwicklungsraten wie unter C 2.3 beschrieben identifiziert und in folgende Gruppen zur Auswertung zusammengefasst:

• Metaphase II (M II)

• Vorkernstadium (VK)

• Mehrzellstadium (MZ)

• fragmentiert (fragm.)

• degeneriert (deg.)

In den Abb. 13, 14, 15 u. 16 sind beispielhaft phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen fixierter und gefärbter Entwicklungsstadien dieser Gruppierungen dargestellt.

Abb. 13: Aceto-Orceinfärbung einer nach parthenogenetischer Aktivierung in der M II (Metaphase II) verbliebenen Oozyte.

PK: Polkörper, M: Metaphasenplatte

Abb. 14: Aceto-Orceinfärbung einer Eizelle nach parthenogenetischer Aktivierung mit 2 Vorkernen. VK:

Vorkern, PK: Polkörper

Abb. 15: Aceto-Orceinfärbung eines intakten parthenogenetischen Zwei-zellstadiums mit gleichmäßigen Blastomeren und intakten Zellkernen

Abb. 16: Aceto-Orceinfärbung eines parthenogenetischen Vierzellstadiums mit gleichmäßigen Blastomeren und intakten Zellkernen

Anhand der Ergebnisse dieses experimentellen Ansatzes wurde untersucht, inwieweit sich das Auftreten der parthenogenetisch induzierten frühembryonalen Entwicklungsstadien nach den jeweiligen Kultivierungszeiten unterschied. Die Anzahl der Oozyten, die nach der parthenogenetischen Aktvierung die M II nicht verließen, war nach jedem Kultvierungszeitraum auf einem ähnlichen Niveau, wobei mit dem Fortschreiten der Eizellalterung eine sinkende Tendenz zu verzeichnen war (46 h: 38,0 %; 41/108, 58 h:

35,7 %; 40/112, 72 h: 30,2 %; 42/139). Die höchste Teilungsrate konnte nach 46stündiger Kultivierung verzeichnet werden (51,9 %; 56/108). Mit zunehmender Kultvierungszeit nahm dieser Anteil der mehrzelligen Parthenogenone mit statistischer Auffälligkeit (P=0,07) ab (58 h: 42 %; 47/112, 72 h: 40,3 %; 56/113). Die Vorkernentwicklung stieg nach 72stündigen Kultivierung signifikant an (P<0,05). Die Fragmentierungsrate nahm mit fortlaufender Eizellalterung kontinuierlich zu und zeigte nach der längsten Kultivierungszeit einen signifikant differierenden Höchstwert (46 h: 1,9 %; 2/108, 58 h: 5,4 %; 6/112, 72 h: 7,9 %;

11/139). Die Degeneration der Eizellen stieg zwischen 46 und 58 h signifikant an. Abb. 19 zeigt die Ergebnisse in einer grafischen Zusammenfassung.

Abb. 17: Aceto-Orceinfärbung einer degenerierten Oozyte nach partheno-genetischer Aktvivierung mit fehlendem Kontakt des Ooplasma zum Oolemm.

Abb. 18: Aceto-Orceinfärbung einer fragmentierten Oozyte nach partheno-genetischer Aktivierung mit ungleichen Zytoplasmateilungen und irregulären Lipidvesikeln, ein Zellkern ist nicht zu erkennen.

Abb. 19: Ergebnisse der Entwicklungsstadien (%) nach parthenogenetischer Aktivierung in vitro gealterter Eizellen nach 46-, 58- und 72stündiger Kultivierung. Unterschiedliche Buchstaben über den Säulen kennzeichnen signifikante Unterschiede der Entwicklungsstadien zwischen den Kultivierungszeiträumen (P<0,05). M II: Metaphase II, MZ: Mehrzellstadium, VK: Vorkernstadium, fragm.: fragmentiert, deg.:degeneriert

3 Phosphorylierung der MAPK

Um den Phosphorylierungsgrad der MAPK in den Oozyten zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Antikörper verwendet, der beide Isoformen der MAPK (MAPK 1 = 44 kDA, MAPK 2 = 42 kDA) erkennt. Um anhand der relativen Dichte die Phosphorylierungsintensität zu ermitteln, wurde jeweils die gemessene Bandenintensität beider Isoformen addiert und als Mittelwert für die statistische Auswertung genutzt. Für jeden Kultivierungszeitpunkt wurden drei unabhängige Proben mit je 40 Oozyten analysiert. Da jede Probe mit einer definierten Zellzahl (40 Oozyten) in den Versuchen verwendet wurde und ein gesicherter Proteintransfer mittels Ponceau S-Färbung überprüft wurde, konnte auf ein Referenzprotein in diesem Experiment verzichtet werden. In Abb. 20 ist ein exemplarischer Westernblot nach IVM der KOKs bzw. Oozyten dargestellt.

Abb. 20: Westernblot mit aufgetrennter p44- und p42-MAPK von Oozyten nach 0-, 26-, 46-, 58- und 72stündiger Kultivierung.

In Oozyten, die unmittelbar nach der Isolation aus dem Follikel (0 h) analysiert wurden, konnte keine MAPK-Aktivität nachgewiesen werden. Mit zunehmender Kultivierungszeit wurde ein Anstieg beobachtet, der sich nach 46 h mit signifikant differierenden Aktivitätsmaximum (P<0,05) darstellte. Im weiteren Verlauf der zunehmenden Kultivierungszeit (58 h) sank der Phosphorylierungsgrad signifikant ab und behielt am Ende der Kultivierung nach 72 h diese Tendenz ohne statistische Auffälligkeit bei. Die Ergebnisse der Phosphorylierungsmuster nach den gewählten Kultivierungszeiträumen sind zusammenfassend in Abb. 21 dargestellt.

Abb. 21: Relative Dichte der MAPK-Phosphorylierung in Oozyten nach 0-, 26-, 46-, 58- und 72stündiger IVM. Dargestellt sind die Mittelwerte (x) zu jedem Zeitpunkt mit angegebener

empirischer Standardabweichung (SD). Unterschiedliche Buchstaben über den Säulen weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Kultivierungszeiträumen (P<0,05).

E Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand funktioneller und biochemischer Parameter die Auswirkungen einer experimentell induzierten Eizellalterung näher zu charakterisieren. Dazu wurde zunächst ein Alterungsmodell der Eizelle nach der In-vitro-Maturationsphase (IVM) etabliert. Als funktionelle Parameter dienten die morphologisch feststellbaren degenerativen Veränderungen des Ooplasmas und des Chromatins sowie die parthenogenetische Aktivierbarkeit. Als biochemischer Parameter wurde die Phosphorylierung der MAPK analysiert.

Als wesentlichstes Ergebnis der ersten Experimentalreihe, bei der die Dynamik der Degenerationsanzeichen und der Kernreifungsverlauf in den Oozyten während der Kultivierungszeitspanne zwischen 48 und 72 h ermittelt wurde, liegt in der Beobachtung, dass es erst im zweiten Abschnitt dieser verlängerten Inkubationsphase (58 – 72 h) zu einer signifikanten Zunahme des Anteils an fragmentierten und degenerierten Oozyten kam. Die detektierten Zelluntergangsanzeichen betrafen dabei zu etwa gleichen Teilen sowohl das Ooplasma (Zytofragmentation) als auch das Chromatin (Chromosomen, die nicht in der Äquatorialebene liegen, defekte Spindelphänotypen). Die eigenen Beobachtungen stehen in deutlichem Gegensatz zu den von KIKUCHI et al. (1995, 2000) publizierten Mitteilungen.

Diese Autoren verzeichneten bei ihren Studien zur In vitro-Alterung der Schweineeizelle in der Kultivierungszeitspanne von 48 bis 72 h einen stets gleichbleibenden Anteil an degenerierten Oozyten von maximal 9 %. Eine jüngere Experimentalerhebung zur In-vitro-Alterung der Schweineeizelle (MA et al. 2005) widerspricht den Mitteilungen von KIKUCHI et al. (1995, 2000) und kommt zu prinzipiell gleichen Resultaten wie sie auch in den eigenen Studien dokumentiert wurden. So beobachteten MA et al. (2005) beispielsweise in der Kultivierungsphase zwischen 40 und 72 h einen steilen Anstieg der Chromatin-Degenerationen von 9,5 auf 42,9 %, ein Anteil, der mit den eigenen Untersuchungen sehr gut übereinstimmt. Bei der kritischen Hinterfragung dieser stark voneinander abweichenden Beobachtungen muss zunächst an die Kultivierungsbedingungen gedacht werden. KIKUCHI et al. (1995, 2000) inkubierten die Oozyten in modifiziertem Waymouth’s Medium, das neben einem 10 %igen FKS- zusätzlich einen 10 %igen porzinen Follikelflüssigkeitszusatz enthielt.

In den eigenen Experimenten und in den Studien von MA et al. (2005) kam dagegen

beziehungsweise PVA (MA et al. 2005) zum Einsatz. Porzine Follikelflüssigkeit unterstützt die Verteilung und Funktion der Mitochondrien in der Schweineeizelle während der IVM, ein Phänomen, das mit einer verbesserten zytoplasmatischen Entwicklungskompetenz nach parthenogenetischer Aktivierung assoziiert ist (BREVINI et al. 2005). Dieses Resultat lässt vermuten, dass die Follikelflüssigkeit einen positiven Einfluss auf das zytoplasmatische Mikrotubulusnetzwerk hat, das die Mitochondrienbewegung kontrolliert. Dieser günstige Effekt könnte damit auch eine der Ursachen für die auffällig geringen Degenerationsraten bei den Experimenten von KIKUCHI et al. (1995, 2005) sein. Ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt ist in dem Einfluss der Follikelflüssigkeit auf die Kinetik der Kernreifung der porzinen Eizelle zu sehen. Follikelflüssigkeit führt zu einer Verzögerung des Wiedereintritts der Oozyte in die Meiose und so zu einer Retardierung der Eizellreifungsdynamik (TSAFRIRI et al. 1977). Dieser Effekt lässt sich an Hand der Daten von KIKUCHI et al.

(1995, 2000) belegen. Im Gegensatz zu den eigenen Untersuchungen, bei denen bereits nach 26stündiger Kultivierung ca. 10 % der Eizellen das MII-Stadium aufwiesen, beobachteten KIKUCHI et al. (1995, 2000) frühestens nach 30 Stunden Eizellen, die bis zum MII-Stadium gereift waren. Beide Effekte (Effekt auf die Mitochondrien Verteilung und Effekt auf die Kernreifungskinetik) haben protektiven Charakter und lassen die Vermutung zu, dass der Zusatz von Follikelflüssigkeit zum Kultivierungsmedium den Alterungsprozess sowohl des Chromatins als auch des Zytoplasmas verzögert.

Als weitere mögliche Ursache der differenten Degenerationsraten, muss der genetisch unterschiedliche Hintergrund der Eizellen betrachtet werden. KIKUCHI et al. (1995, 2000) gewannen die Eizellen von Schlachtschweinen der japanischen Landrasse sowie der Rassen Large White und Duroc. Das eigene Untersuchungsmaterial stammte dagegen nahezu ausschließlich von Schlachtschweinen der Deutschen Landrasse. Untersuchungen zur Reifungskinetik und zur Dynamik der Mitochondrienverteilung in Eizellen unterschiedlicher Schweinerassen konnten in der verfügbaren Fachliteratur nicht aufgefunden werden, deshalb soll auf die hohe Variabilität des Anteils transfertauglicher, in vitro produzierter Blastozysten (9,1–23,2 %) unterschiedlicher Rinderrassen hingewiesen werden (MOOR et al.1997), die u. a. auf einen Einfluss des genetischen Hintergrundes der Eizellen deuten. POLAŃSKI (1997) veröffentlichte eine Studie an Mäuseoozyten, in der er darüber berichtet, dass die Oozyten verschiedener Mäusestämme während der IVM unterschiedliche Kernreifungszeitspannen aufweisen. Es ist damit nicht auszuschließen, dass, wie im vorliegenden Fall, unterschiedliche Reifungskinetiken und damit assoziiert auch ein Teil der Alterungsprozesse auf genetische Ursachen zurückzuführen sind.

In den eigenen Studien erreichte ein hoher Prozentsatz (79,3 %) der in vitro gereiften Oozyten nach 48stündiger Kultivierung das MII-Stadium, verblieb in der ersten Alterungszeitspanne (46-58 h) unverändert in diesem Kernreifungsstadium und erst in der zweiten Alterungsphase (58-72 h) verließen ca. die Hälfte der alternden Eizellen das MII-Stadium über den Weg der Chromatin- oder Zytoplasmadegeneration. KIKUCHI et al. (1995, 1999, 2000) beobachteten in der Alterungsphase zwischen 48 und 72 h keine Verminderung des prozentualen Anteils der Oozyten (ca. 65%), die sich im MII-Stadium befanden. Auch PETROVA et al. (2004) konnten erst in der Alterungsphase zwischen 72 bis 96 h bei ca. zwei Drittel der Oozyten ein Verlassen des MII-Stadiums (von 92 auf 39 %) bei zeitgleicher Zunahme lysierter, fragmentierter und spontan aktivierter Eizellen detektieren. Für diese unterschiedlichen Zeitverläufe der einsetzenden Alterungsprozesse kann ursächlich auf die oben bereits genannten Gründe (Kultivierungsbedingungen, genetischer Hintergrund des biologischen Materials) hingewiesen werden. Bedeutungsvoller erscheint, dass in den Experimentaluntersuchungen (KIKUCHI et al.1995, 1999, 2000; PETROVA et al. 2004) einschließlich der eigenen Arbeit (EBELING et al. 2010) als Hauptphänomen das Verlassen des MII-Stadiums und die Zunahme der Degenerationsanzeichen im Zuge des Alterungsprozesses übereinstimmend festgestellt wurde. Die Ursache für diesen Vorgang liegt vermutlich in einer Reduktion der MPF-Aktivität und einer Zunahme des inaktiven Prä-MPF in der alternden Eizelle (KIKUCHI et al. 1995, 1999). Da die Cdk1-Menge in der Schweineeizelle während der Maturation unverändert bleibt (NAITO et al. 1995) und der MPF und MPF in MII-Eizellen in äquimolaren Mengen vorliegen, ist die Zunahme der Prä-MPF-Moleküle auf eine vermehrte inaktivierende Phosphorylierung der T545- und T551-Reste an der Cdk1-Untereinheit des MPF-Moleküls zurückzuführen. Mit der Abnahme der MPF-Aktivität verliert die Eizelle allmählich das Vermögen das Chromatin in einem kondensierten Zustand zu halten und wird über die damit verbunden intrazellulären Signalkaskaden in den Zelluntergang oder in das parthenogenetische Entwicklungsprogramm getrieben.

Als weiterer funktioneller Parameter bei der Etablierung des Eizellalterungsmodells diente die Überprüfung der parthenogenetischen Aktivierbarkeit. Mit länger werdender IVM-Zeitspanne ist für die Schweineeizelle eine zunehmende Tendenz zur spontanen Aktivierung und anschließender Fragmentation beobachtet worden (NAGAI 1987, KIKUCHI et al., 1995, PETROVA et al. 2004, 2005). Diese Tendenz gilt auch für die durch einen elektrischen Impuls ausgelöste parthenogenetische Entwicklung (PETROVA et al. 2005, IWAMOTO et al.

transienten, aktivierenden Ca-Anstiegs in der jungen Eizelle aufgrund ihrer kontinuierlich fortlaufenden CSF-Produktion nicht ausreicht, um das MII-Stadium zu verlassen. Während man bei der alternden Oozyte davon ausgeht, dass ihre CSF-Synthese diskontinuierlich abläuft und so der Ca-Anstieg genügt, die Arretierung in der MII zu überwinden (IWAMOTO et al. 2005b).

In der eigenen Arbeit zeigte sich in einem ersten vergleichenden Untersuchungsansatz bei dem FKS und BSA als Proteinsupplementierung der Kultivierungsmedien verwendet wurde, dass der BSA-Zusatz kaum Eizellaktivierungen zuließ, aber signifikant höhere Degenerationsraten nach sich zog. Das Unvermögen bestimmter Mediumzusammensetzungen die Aktivierung der Schweineeizelle zu unterstützen, ist seit längerem bekannt (MACHÁTY u. PRATHER 1998). Den eigenen Studien lag das Bestreben zu Grunde, ein möglichst einfaches, chemisch weitgehend definiertes Medium zu verwenden, um eine hohe Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Deshalb wurde als Basismedium Whitten‘s Medium und nicht TCM 199 oder Waymouth‘s Medium, die beide eine komplexe Zusammensetzung aufweisen, eingesetzt. Zudem konnte bereits von JOLLIFF u. PRATHER (1997) demonstriert werden, dass nach elektrischer Aktivierung die parthenogenetischen Entwicklungsraten von follikulären Schweineeizellen nach der IVM in Whittens‘s oder Waymouth‘s Medium nicht signifikant differieren.

Ein zusätzliches Argument, das für den Einsatz von Whitten‘s Medium bei den eigenen Studien spricht, liegt darin begründet, dass Whitten’s definierte Mengen an Na-Pyruvat (3,5 mg/100 ml) sowie Na-Lactat (0,37 ml/100 ml) enthält, während TCM 199 und Waymouth’s Medium diesen Energieträger in ihrer Formulierung nicht aufweisen, da sie für die Kultivierung von somatischen Zellen konzipiert wurden. GARDNER u. LANE (1997) wiesen darauf hin, dass die Konzentration der beiden Carbohydrate im humanen Eileiter dreimal (Na-Pyruvat) beziehungsweise doppelt (Na-Lactat) so hoch wie im Uterus ist und daher wahrscheinlich für die ovulierte Eizelle und die frühe embryonale Entwicklung eine kritische Bedeutung hat. Auch die präimplantive Entwicklung von IVF- und Kerntransferembryonen beim Schwein wurde durch den Austausch der Energiequelle Glucose gegen Pyruvat/Lactat verbessert (LEE et al. 2003, KIKUCHI et al. 2002).

Bei der Wahl der Proteinkomponente erfolgte die Verwendung von BSA, weil Serumalbumin im Gegensatz zu Serum keine unbekannten Wachstumsfaktoren enthält, die die parthenogenetischen Entwicklungsraten beeinflussen könnten (SON et al. 2013). Nachdem sich zeigte, dass BSA ungeeignet war, wurde FKS als Proteinkomponente verwendet.

Das wesentlichste Ergebnis der Versuche zur parthenogenetischen Aktivierung alternder Schweineeizellen ist in der nahezu gleichbleibenden Entwicklungsrate (ca. 40-50 %) mehrzelliger Parthenogenone (MZ) bei zunehmender Alterung zu sehen. Zwar kam es mit länger werdender Kultivierungszeit zu einer nicht signifikanten (P=0,07) Verminderung der Parthenogenone, die von einem signifikanten (P<0,05) Anstieg der PN-Stadien begleitet wurde, jedoch ließ sich die Ausgangshypothese, dass mit zunehmender Eizellalterung um ca.

24 h die parthenogenetische Aktivierbarkeit der Schweineizelle kontinuierlich ansteigt, nicht sicher belegen. Die eigenen Resultate deuten eher auf einen diskontinuierlichen Anstieg der Aktivierbarkeit hin.

Beste Aktivierungsraten bei geringsten Degenerations- und Fragmentierungsanzeichen zeigten sich in den eigenen Experimenten nach einer 46stündigen IVM-Phase. Beim Schwein liegen bei der alternden Oozyte keine eingehenden Untersuchungen zur kombinierten Aktivierung mit Ethanol und Cycloheximid vor. Bei der Erstbeschreibung der Methode durch PETR et al. (1996) wurde eine 48stündige IVM-Phase gewählt, die in der Folgezeit nur geringfügig variiert und nicht unter dem Aspekt der Eizellalterung untersucht wurde (YI u.

PARK 2005, CHENG et al. 2007). Ein Hinweis, der mit den eigenen Erhebungen übereinstimmt, findet sich bei JOLLIFF u. PRATHER (1997). Die Autoren erwähnen, dass sie beim kombinierten Einsatz von Ethanol und Cycloheximid nach einer 36- und 48stündigen Kultivierung follikulärer Schweineeizellen gleich hohe Aktivierungsraten erhalten haben, allerdings belegen sie diese Aussage nicht mit Zahlen. Eine weitere Bestätigung der eigenen Untersuchungsergebnisse findet sich bei PRESICCE u. YANG (1994), die bei der Rindereizelle nach Aktivierung mit Ethanol und Cycloheximid eine altersunabhängige parthenogenetische Entwicklungsinduktion beobachteten. Diese Autoren äußern die Vermutung, dass die altersunabhängige Aktivierung der Oozyten nach der Ethanol/Cycloheximid-Aktivierung auf die Ethanol-Induktion eines vorübergehenden Ca-Anstieges zurückzuführen sei, der das in der Eizelle vorhandene CSF degradiert und anschließend das Cycloheximid die Synthese von neuem CSF und Cyclin verhindert.

Bei der Bewertung der Parthenogenone steht die Abwägung, ob die Fragmentation des Ooplasmas als Degenerations- oder als Begleitphänomen der parthenogenetischen Blastomerenbildung eingestuft wird, unterschiedlichen Meinungsbildern gegenüber. Trotz der bis heute ungeklärten Ätiologie, ist vermutet worden, dass die Fragmentation eine Manifestation letaler Entwicklungsdefekte auf Blastomerenebene ist. Dabei tritt sie assoziiert

alterierten ATP-Generierungen (VAN BLERKOM et al. 1995) chromosomalen Abnormitäten (MUNNÉ et al. 1993) und sowohl apoptotischen als auch nekrotischen Prozessen auf (JURISCOVA et al. 1996). Bei der Qualitätseinschätzung einer Oozyte oder eines Parthenogenons beziehungsweise eines frühembryonalen Furchungsstadiums muss berücksichtigt werden, dass die Fragmentation keine einheitliche Ursache hat, sondern eine einheitliche Manifestation von unterschiedlichen mehr oder weniger schwerwiegenden zellulären Abweichungen ist. Eine Fragmentation ist nicht gleichbedeutend mit dem sicheren Zelluntergang, sondern kann, wenn sie z.B. im präimplantativen Embryo festgestellt wird, durchaus zur Geburt eines gesunden Jungtiers führen, sie kann aber auch Anzeichen eines nahenden, irreversiblen Zellunterganges sein (ANTCZAK u. VAN BLERKOM 1999).

In der eigenen Arbeit nahm die Zytoplasmafragmentation der Eizellen, die nach 46, 58 und 72 h aktiviert wurden, signifikant zu [(von ca. 2 (46 h) auf 8 % (72 h)]. Auch KIKUCHI et al.

(1995, 2000) kamen zu diesem Resultat, bewerteten aber die fragmentierten Oozyten als regulär aktiviert und verzeichneten so bereits in ihrer 48 h-Gruppe (verglichen wurden 36, 48, 60 und 72 h) eine signifikante Zunahme aktivierter Eizellen. Dies hat zur Folge, dass bei den Untersuchungen dieser Autoren die parthenogenetische Aktivierbarkeit der Schweineeizelle mit zunehmender IVM-Dauer kontinuierlich ansteigt, eine Schlussfolgerung, die die eigenen Daten nicht zuließen (s.o.).

Bei der Etablierung des Eizellalterungsmodells in der vorliegenden Arbeit diente die Überprüfung der parthenogenetischen Aktivierbarkeit als zusätzlicher funktioneller Parameter, um neben den Chromatin- auch einen Hinweis auf die Zytoplasmaveränderungen zu erhalten. Trotz der zum Teil unterschiedlichen Bewertung der phänotypischen Manifestation der Alterungsvorgänge (KIKUCHI et al. 1995, 2000; PETROVA et al. 2005;

vorliegende Resultate) kann übereinstimmend festgestellt werden, dass die parthenogenetische Aktivierung ein geeigneter und aussagekräftiger Parameter ist. Dieser Aussage liegt die Beobachtung zugrunde, dass die Genome der Eizelle und des Spermiums unter dem Einfluss von Ooplasmafaktoren tiefgreifende Modifikationen durchlaufen, die sie in ihrer Gesamtwirkung zum embryonalen Genom transformieren (HAN et al. 2005).

Besonders bemerkenswert ist die Fähigkeit des Ooplasmas die Transkriptionsinitiierung des männlichen Genoms über den Protamin/Histon-Austausch zu vermitteln. Während dieser kritischen frühembryonalen Phase werden die metabolischen und homeostatischen Funktionen über maternal ererbte, im Ooplasma gespeicherte Proteine, mRNAs und andere Makroproteine gesteuert. Hierzu gehört auch die Reorganisation des Endoplasmatischen

Retikulums (ER), das den Hauptkalziumspeicher der Oozyte darstellt, die Zunahme der IP₃ -Rezeptoren und deren biochemische Modifikation, um ihre Sensitivität zu steigern sowie die Erhöhung der Ca²⁺ Konzentration im ER und die Neuverteilung der Ca²⁺-bindenden Proteine im ER (AJDUK et al. 2008).

Der Alterungsprozess, dem die Eizelle in den eigenen Untersuchungen ausgesetzt wurde, traf demnach u. a. alle Komponenten, die in der Oozyte des Schweines die lang anhaltenden, repetitiven Ca²⁺-Freisetzungen, mit der sich anschließenden Zytoplasmateilungen einleiten.

Aus diesem Grunde stellt die parthenogenetische Aktivierung und anschließende Entwicklung eines Parthenogenons einen zwar indirekten Parameter der Ooplasmaqualität dar, aber er kann gut mit anderen Eizellgruppen verglichen werden, da die Komponenten des Teilungsmechanismus stets gleich betroffen sind.

Bei der Analyse des biochemischen Parameters wurde in den eigenen Untersuchungen ermittelt, dass die MAPK-Aktivität in den ersten 12 h der In-vitro-Alterung um etwa 25 % einhergeht. Da die p90^rsk für die Phosphorylierung von Emi2 verantwortlich ist und auf diese Weise die inhibierende Assoziation von Emi2 an den APC/C aufrecht erhält, kann eine abnehmende MAPK-Aktivität (über die reduzierte p90^rsk) zu einer Dissoziation von Emi2 und dem APC/C führen. Dies hätte eine Aktivierung des APC/C und somit eine zunehmende Degradierung von Cyclin B und daraus resultierend einen Abfall der MPF-Aktivität zur Folge. Die Wirkung des CSF wäre vermindert oder aufgehoben, AII und TII könnten durchlaufen werden und die Eizelle kann in die Interphase eintreten. Auf diese Weise ist auch die zunehmende Neigung der alternden Eizelle in die Interphase einzutreten durch die abnehmende MAPK-Aktivität erklärbar.

Obwohl dieses Szenario sich aus Beobachtungen an der Mauseizelle ableitet (WU u.

KORNBLUTH 2008) deuten experimentelle Befunde, die an der Schweineeizelle erhoben wurden, in die gleiche Richtung. FAN u. SUN (2004) konnten zeigen, dass bei einer MAPK-Inhibierung auch die MPF-Aktivität sinkt. Gleichlautende Resultate erzielten TATEMOTO

Viertel bis zur Hälfte der behandelten MII-Oozyten eine Interphase, z. T. mit Vorkernausbildung induzieren konnten.

Unter physiologischen Bedingungen bleibt der Expressions- und der Phosphorylierungsgrad der MAPK bis zur Initiierung der Vorkernbildung in der Schweineeizelle stabil (FAN u. SUN 2004, FAN et al. 2003). Welche genauen molekularen Abläufe im Verlaufe der Eizellalterung zu einer protrahiert zunehmenden MAPK-Inaktivierung führen, ist bis heute nicht geklärt, jedoch belegen die Studien von ITO et al. (2003), dass die Proteinkinase C (PKC) eine wichtige Funktion in diesem Prozess übernimmt.

Vor diesem Hintergrund hat sich die Ermittlung der MAPK-Aktivität zur Beschreibung des fortschreitenden In-vitro-Alterungsprozesses in den eigenen Studien als charakteristisches Merkmal der biochemischen Veränderung bewährt.

Methodische Aspekte

Eine In-vitro-Untersuchung kann immer nur sehr eingeschränkt die Vorgänge, die sich unter

Eine In-vitro-Untersuchung kann immer nur sehr eingeschränkt die Vorgänge, die sich unter

Im Dokument Experimentelle Untersuchungen zur Alterung porziner Eizellen in vitro (Seite 45-0)