und dem
Institut für Anatomie und Reproduktionsbiologie der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
____________________________________________________________
Der Einfluss der in vitro Kultur boviner Embryonen auf die Struktur der extraembryonalen Matrix (Zona pellucida) –
eine rasterelektronen- und lichtmikroskopische Studie
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin (Dr.med.vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover ____________________________________
Vorgelegt von Eva-Maria Mertens
aus Aachen Hannover 2006
1. Gutachterin: Frau Prof. Dr. Edda Töpfer-Petersen 2. Gutachterin: Frau PD Dr. Christine Wrenzycki
Abb. Abbildung
Aqua bidest. Aqua bidestillata
BHV-1 Bovines Herpes Virus-1
BSA Bovines Serumalbumin
BVDV Bovines Virus Diarrhoe Virus
bZP bovines Zonaprotein
bzw. beziehungsweise
Ca Kalzium
°C Grad Celsius
CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy
CO2 Kohlendioxid
Cr-1 Medium Charles Rosenkrans-1 Medium
d.h. das heißt
EC Embryonic Coats
EEM Extraembryonale Matrix
g Gramm
IGF insulin-like growth factor
IGFBP3 insulin-like growth factor Bindungsprotein 3
ICM Inner Cell Mass
IVF In vitro Fertilisation
IVM In vitro Maturation
IVP In vitro Produktion
KOK Kumulus-Oozyten-Komplex
M Molarität
mg Milligramm
ml Milliliter
MMP Matrixmetalloproteinase
mOsm Milliosmol
n Anzahl
nm Nanometer
O Sauerstoff
OCS Oestrus Cow Serum
OPU Ovum Pick Up
OSP Oviductal Secretory Glykoprotein
p Irrtumswahrscheinlichkeit
PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1
PBS Phosphat Buffered Saline
PVS Perivitelliner Spalt
pZP porcines Zonaprotein
Q Qualität
SD Standard Deviation (Standardabweichung)
SEM Standard Error of Mean (Standardfehler)
SOF Synthetic Oviductal Fluid
Tab. Tabelle
TCM 199 Tissue Culture Medium 199
TIMP-1 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1
u. und
Vergr. Vergrößerung
z.B. zum Beispiel
ZP Zona pellucida
ZPA Zonaprotein A
2D-SDS-PAGE 2 dimensional-sodium dodecylsulfate-polyacrylamid gel electro- phoresis
µm Mikrometer
1 Einleitung__________________________________________________________9 2 Schrifttum ________________________________________________________11 2.1 Frühe Embryonalentwicklung des Rindes __________________________________11 2.2 In vitro Produktion von Rinderembryonen _________________________________12 2.3 Gewinnung von in vivo Embryonen _______________________________________14
2.3.1 Tubale Embryonalstadien ____________________________________________________ 14
2.3.2 Uterine Embryonalstadien ____________________________________________________ 15 2.4 Aufbau und Funktion der Zona pellucida___________________________________15
2.4.1 Aufbau der Zona Pellucida____________________________________________________ 16
2.4.2 Funktion der ZP / EEM_______________________________________________________ 21 2.5 Einfluss der in vitro Kultur auf den Embryo ________________________________24 3 Material und Methoden ______________________________________________25 3.1 Eizellen und Embryonen ________________________________________________25 3.2 Lichtmikroskopische Untersuchung zur Bestimmung des retikulären Anteils der
extraembryonalen Matrix (EEM) und der Breite der EEM ______________________26
3.2.1 Einbettung der Proben in Araldit _______________________________________________ 26
3.2.2 Semidünnschnitte __________________________________________________________ 26
3.2.3 Lichtmikroskopische Untersuchung _____________________________________________ 27 3.3 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung ____________________________34
3.3.1 Vorbereitung der Proben _____________________________________________________ 34
3.3.2 Kritisch-Punkt-Trocknung_____________________________________________________ 34
3.3.3 Aufbringen der Eizellen und Embryonen auf rasterelektronenmikroskopische Probenhalter __ 34
3.3.4 Rasterelektronenmikroskopie__________________________________________________ 35
3.3.5 Klassifizierung der rasterelektronenmikroskopischen Bilder __________________________ 35
3.3.6 Bestimmung der Variationsbreite der Porenfläche auf der Probenoberfläche _____________ 44 3.4 Statistische Auswertung ________________________________________________45
4.1.1 Der retikuläre Anteil der EEM _________________________________________________ 46
4.1.2 Bestimmung der Breite der EEM _______________________________________________ 52 4.2 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen __________________________54
4.2.1 Deskriptive Auswertung ______________________________________________________ 54
4.2.2 Die Variationsbreite der Fläche der Poren auf der Oberfläche der EEM _________________ 76 4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse _______________________________________77
4.3.1 Ergebnisse für die Oozyten ___________________________________________________ 77
4.3.2 Ergebnisse für die in vivo Embryonalstadien ______________________________________ 78
4.3.3 Ergebnisse für die in vitro Embryonalstadien ______________________________________ 79 5 Diskussion________________________________________________________81 5.1 Zona pellucida der Oozyte_______________________________________________81
5.1.1 Einfluss der Maturation auf die Morphologie der Zona pellucida _______________________ 81
5.1.2 Einfluss der Fertilisation auf die Morphologie der Zona pellucida ______________________ 86 5.2 Extraembryonale Matrix des frühen Embryos _______________________________88 6 Zusammenfassung _________________________________________________98 7 Summary ________________________________________________________101 8 Literaturverzeichnis _______________________________________________103 9 Anhang__________________________________________________________124 9.1 Verzeichnis der verwendeten Medien und Chemikalien______________________124 9.2 Abbildungsverzeichnis ________________________________________________126 9.3 Tabellenverzeichnis ___________________________________________________127
1 Einleitung
Die in Vitro Fertilisation (IVF) ist eine etablierte Methode mit einer großen Bandbreite an Anwendungsmöglichkeiten in der Grundlagenforschung und den angewandten Wissen- schaften. Diese Technologie hat besondere Bedeutung für die Produktion tierischer Em- bryonen für wissenschaftliche Untersuchungen, zur Steigerung der Reproduktionsfähig- keit von Nutztieren, für die Erhaltung bedrohter Tierarten und nicht zuletzt zur Behandlung menschlicher Unfruchtbarkeit (BAVISTER 2002).
1982 wurde das erste Kalb nach Transfer eines in vitro produzierten Embryos geboren (BRACKETT et al. 1982).
Interessanterweise sind die Trächtigkeitsraten von Kühen, bei denen ein Embryotransfer (ET) mit in vitro produzierten Embryonen durchgeführt wurde, signifikant niedriger als die Trächtigkeitsraten von Kühen bei denen in vivo produzierte Embryonen zum Transfer verwendet wurden. So zeigten FARIN und FARIN (1995), dass die Trächtigkeitsrate am 53. Tag nach dem Transfer für die Empfänger von in vitro produzierten Embryonen 42%
niedriger war als die von Empfängern in vivo produzierter Embryonen.
In der Humanmedizin verhält es sich ähnlich. In Vitro Fertilisation ist dort eine allgemein akzeptierte Behandlungsmethode für unerklärbare Unfruchtbarkeit. Ihre Effizienz, die bei erwarteten Geburtenraten zwischen 13% und 28% pro Zyklus liegt, konnte aber in den letzten Jahren im Vergleich zu anderen Behandlungsmethoden, wie z.B. der intracyto- plasmatischen Spermieninjektion (ICSI), nicht signifikant gesteigert werden (PANDIAN et al. 2002).
Es stellte sich die Frage nach der Ursache für diese niedrigen Trächtigkeits- bzw.
Geburtenraten.
Eine große Anzahl an Untersuchungen zeigte Unterschiede in der frühen embryonalen Entwicklung von in vivo und in vitro produzierten Embryonen. Hierbei wurde bei dem Großteil der Untersuchungen der Schwerpunkt auf die Veränderungen des Embryos selbst und nicht auf die ihn umgebende Hülle, die Zona pellucida bzw. die extraembryonale Matrix gelegt (unter anderem ABE et al. 1999, CROSIER et al. 2001).
Die Zona pellucida beziehungsweise extraembryonale Matrix umgibt sowohl die Eizelle als auch den frühen Embryo.
Ihre wichtigen Funktionen während der Fertilisation, wie die Vermittlung der Spermien- Eizell-Interaktion, das Auslösen der Akrosomenreaktion und die Ausbildung eines Poly- spermieblocks, führten zu intensiven Untersuchungen der Zona pellucida von Oozyten und deren Beeinflussung durch die in vitro Maturation (unter anderem SUZUKI et al. 1994, MAGERKURTH et al. 1999, RATH et al. 2005)
Die extraembryonale Matrix hat aber auch für den frühen Embryo eine große Bedeutung.
Sie schützt den Embryo unter anderem vor pathogenen Faktoren und sichert dessen Individualität. Außerdem bildet sie das Interface zwischen dem Embryo und seiner Mutter, durch das der Austausch von Boten- und Nährstoffen stattfindet, die essentiell sind für die Entwicklung des präimplantativen Embryos (HERRLER und BEIER 2000).
Eine veränderte Struktur der extraembryonalen Matrix könnte damit die frühe Entwicklung des Embryos behindern.
Ziel dieser morphologisch vergleichenden Arbeit ist es, herauszufinden, ob die Struktur der extraembryonalen Matrix durch eine in vitro Kultur beeinflusst wird.
Die Rasterelektronenmikroskopie ist die Methode der Wahl zur Oberflächenuntersuchung der extraembryonalen Matrix. Bei einer Querschnittsuntersuchung der extraembryonalen Matrix des Rindes bietet die Transmissionselektronenmikroskopie keine Vorteile gegen- über der Lichtmikroskopie, wie durch eigene Vorstudien festgestellt wurde.
2 Schrifttum
2.1 Frühe Embryonalentwicklung des Rindes
Nach der Befruchtung der Eizelle in der Eileiterampulle (SCHNORR 1996) beginnt die Teilung meist innerhalb von 24 Stunden (GELDERMANN 2005a). Die ersten drei Teilungs- schritte finden in der Eileiterampulle statt (RÜSSE und SINOWATZ 1991a). Nach 2 bis 2,5 Tagen sind 2 - Zeller zu finden. Nach 2,5 Tagen haben sich 4 - Zeller und nach 4 Tagen 8 - Zellstadien entwickelt. Im 8 - Zellstadium gelangt der Embryo beim Rind von der Eilleiterampulle über den Isthmus des Eileiters in die Uterushornspitze (siehe Abb. 01).
Abb. 01: Embryotransport im Eileiter und Uterus
Dort erreicht der Embryo am 5. bis 6.Tag der Gravidität das Morula-Stadium und entwickelt sich am 7. bis 8. Tag der Gravidität zur Blastozyste (RÜSSE und SINOWATZ 1991a). Laut SCHNORR (1996) wird der Uterus erst durch die frühe Morula mit 16 Blasto- meren erreicht.
Die Blastozyste differenziert sich in den innen liegenden Embryoblast (innere Zellmasse, ICM) und den außen liegenden Trophoblast (RÜSSE und SINOWATZ 1991a). Aus der inneren Zellmasse entwickelt sich der Rinderfetus und von den Fruchthüllen der Dottersack und die Allantois. Aus dem Trophoblasten gehen das Amnion und das Chorion hervor (RÜSSE und SINOWATZ 1991a). Am 9. bis 10. Tag der Gravidität schlüpft der Embryo im mittleren Uterushornabschnitt in Höhe des Ovars aus der ihn umgebenden Zona pellucida; die Blastozyste behält zunächst ihre kugelige Form, ab Tag 13 beginnt dann das Elongationsstadium. Der Embryo wird zu einem lang gestreckten, fadenförmigen Gebilde, das am 18. und 19. Tag der Gravidität auch in das nicht gravide Uterushorn einwächst. Zu diesem Zeitpunkt beginnt auch die Implantation. Spätestens am 17. Tag hat auch das Muttertier die Gravidität erkannt. (RÜSSE und SINOWATZ 1991a)
2.2 In vitro Produktion von Rinderembryonen
Die in vitro Produktion (IVP) von Rinderembryonen gliedert sich in folgende Schritte:
Die Eizellgewinnung, die Selektion der Eizellen, die in vitro Maturation (IVM) der Eizellen, die in vitro Kapazitation der Spermien, die in vitro Fertilisation und die in vitro Kultur.
Bovine Eizellen können aus Ovarien von Schlachttieren oder durch „Ovum pick up“ (OPU) von lebenden Tieren gewonnen werden (GELDERMANN 2005b). Aus den so gewonnen- en Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOKs) werden diejenigen selektiert, die eine geschlos- sene, mindestens aus zwei Lagen bestehende Kumuluszellschicht ohne Zelldegenera- tionen besitzen. Außerdem soll das Ooplasma gleichmäßig granuliert sein und die Eizelle einen bestimmten Durchmesser (ca. 140 µm) haben (GELDERMANN 2005b).
andere Zellen angewendet werden. Die Reifung findet über 24 Stunden bei 39°C und 5%iger CO2-Atmosphäre statt (GELDERMANN 2005b).
Die Spermien müssen ebenfalls einen Reifungsprozess (Kapazitation) durchlaufen, der sie befähigt, die gereifte Eizelle zu befruchten. Die Kapazitation stellt eine Veränderung von Oberflächensubstanzen der Spermien dar und ist lichtmikroskopisch nicht erkennbar.
Nach der in vitro Kapazitation werden die gereiften Spermien nach ihrer Motilität (z.B.swim up-Methode, Zentrifugation in einem diskontinuierlichen Percollgradienten, Filtration mit Glaswolle in einer Zentrifuge) selektiert, da nur bewegliche Spermien zur Befruchtung befähigt sind, und den gereiften Eizellen zugesetzt. Die gereiften Eizellen und Spermien werden mit einem Fertilisierungsmedium über 6 bis 24 Stunden bei 39°C und 5%iger CO2- Atmosphäre inkubiert (GELDERMANN 2005b). Anschließend erfolgt die in vitro Kultur der in vitro erzeugten Zygoten. Cirka 6 - 8 Tage post inseminationem erreichen die Embryonen das Morula- bzw. Blastozystenstadium (NIEMANN und MEINECKE 1993).
Als Grundmedien für die in vitro Kultur dienen einfache und komplexe Medien. Man unterscheidet:
• Systeme, die somatische Zellen in einem Co-Kultivierungsverfahren verwenden oder bei denen das Medium mit solchen Zellen in Kontakt war (konditioniertes Medium).
• Definierte Systeme ohne Abhängigkeit von somatischen Zellen und Serumzusätz- en. Sie sind aus chemisch bekannten, zellfreien Komponenten zusammengesetzt (GELDERMANN 2005a).
Bei den komplexen Medien wurde das Co-Kultivierungsverfahren eingesetzt. Am ge- bräuchlichsten ist das Tissue Culture-Medium 199 (TCM 199) oder Ménézo`s B2 Medium, meist mit Zusatz von fetalem Kälberserum (THOMPSON und DUGANZICH 1996). Die verwendeten somatischen Zellen sind meist bovine Granulosazellen oder bovine Oviduktepithelzellen.
Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von Medium somatischer Zellen. Man ver- wendet dann das zellfreie, durch die Zellen angereicherte Medium zur Kultur (konditioniert-
es Medium). Kultursysteme ohne Abhängigkeit von somatischen Zellen werden in semi- definierte und definierte Systeme unterschieden. Bei semidefinierten Systemen werden Sera und Proteine verwendet, bei definierten Systemen werden synthetische Makro- moleküle zugesetzt.
Der große Unterschied zwischen Co-Kultur und zellfreien Systemen ist, dass bei letzteren die Konzentration jeder Hauptkomponente bekannt ist (außer bei Serum). Diese Kenntnis ist für die wissenschaftliche Beurteilung eines möglichen Effektes neuer Komponenten der in vitro Kultur auf die Embryonalentwicklung essentiell. (THOMPSON 1997)
Beispiele für definierte einfache Medien sind SOF-Medium (Synthetic Oviductal Fluid) (TERVIT et al. 1972) und Cr1aa Medium (ROSENKRANS und FIRST 1994). SOF-Medium wird oft mit Aminosäuren und bovinem Serumalbumin (BSA) versetzt (GARDNER et al.
1994, THOMPSON 1997).
2.3 Gewinnung von in vivo Embryonen 2.3.1 Tubale Embryonalstadien
Schon 1998 wurde von BESENFELDER und BREM der transvaginale Zugang zum Eileiter beschrieben. 1999 wurde zum ersten Mal über die transvaginale Endoskopie zur Gewinnung früher Embryonalstadien beim Rind berichtet (HAVLICEK et al. 1999, BESENFELDER et al. 2000, HAVLICEK 2002, MOSSLACHER et al. 2001, 2003).
Bei dieser minimal invasiven Methode wird bei superovulierten Färsen eine Epidural- anästhesie durchgeführt, ein Uterusspülkatheter wird im Uterushorn platziert und das Endoskop transvaginal bewegt. Danach wird eine Spülkanüle über das Infundibulum in den Eileiter eingeführt und zunächst mit wenigen Millilitern Spülmedium der Inhalt des Eileiters in das Uterushorn gespült. Von dort konnten die Embryonen über den Uterusspül- katheter gewonnen werden.
2.3.2 Uterine Embryonalstadien
Die Embryogewinnung erfolgt beim Rind transzervikal, d.h. „unblutig“. Ein Ballonkatheter wird unter rektaler Kontrolle in ein Uterushorn eingeführt, durch Aufblasen des Ballons wird das Uterushorn nach kaudal abgedichtet. Durch Spülung des Uterushorns mit einer Pufferlösung (meist PBS: Phosphat Buffered Saline) werden die Embryonen aus dem Uterus entnommen. Jedes Uterushorn wird getrennt gespült und die Spülflüssigkeit in einem Gefäß aufgefangen. (GELDERMANN 2005c)
2.4 Aufbau und Funktion der Zona pellucida
Die Zona pellucida (ZP) umgibt die Eizelle als extrazelluläre, transparente Hülle und nach deren Befruchtung den Embryo.
Fast alle Embryonen sind über eine mehr oder weniger lange Periode der frühen Em- bryonalentwicklung von einer extraembryonalen Matrix umgeben. Bei Insekten erscheint diese Hülle fast lederartig und auch die Embryonen von Fischen, Reptilien, Säugetieren und Vögeln, die die festeste extraembryonale Matrix besitzen, weisen eine extraembryo- nale Matrix auf (HERRLER 2000).
Die Zona pellucida ist eine phylogenetisch sehr alte Struktur, so berichteten XIAO et al.
(1998) von cirka 600 Millionen Jahre alten fossilen Oozyten beziehungsweise Embryonen, die eindeutig von einer extraembryonalen Matrix umgeben waren.
Beim Säugetier lassen sich hinsichtlich des Zeitpunktes des Schlüpfens aus der ZP zwei Formen der präimplantativen Embryonalentwicklung unterscheiden. Zum einen Embryo- nen, die bis kurz vor der Implantation von der ZP umgeben sind und somit kugelförmig bleiben, was bei Mensch, Pferd, Kaninchen, Maus, Hund und Katze der Fall ist. Zum anderen Embryonen, die 3 bis 4 Tage nach der Ausbildung der Blastozystenhöhle aus der ZP schlüpfen und bei denen vor der Implantation noch eine Elongation des Embryos statt- findet, wie es sich zum Beispiel bei Schwein und Rind verhält (HERRLER und BEIER 1999).
2.4.1 Aufbau der Zona Pellucida
2.4.1.1 Chemischer Aufbau der Zona pellucida
Die ZP besteht bei der Maus aus drei verschiedenen Glykoproteinen: Zonaprotein 1 (mZP1), mZP2 und mZP3. Die Zonaproteine anderer Spezies unterscheiden sich auf Grund posttranslationeller Modifikation, einschließlich Glykosilierung (N- und O- ge- bundene Oligosaccharidseitenketten) und Sulfatierung in ihrem Molekulargewicht und ihrem isoelektrischem Punkt stark von denen der Maus (DUNBAR et al. 1980, 1981, 1991, 1994, WASSARMAN 1988). Sie werden deshalb nach neuer Nomenklatur auch auf der Basis der Gensequenz als ZPA, ZPB und ZPC beschrieben (HARRIS et al. 1994).
Diese drei Glykoproteine bilden eine dreidimensionale netzartige Struktur, dabei bilden bei der Maus mZP2-mZP3 heterodimere Ketten, die jeweils über mZP1 Dimere verbunden sind (GREEN 1997). Nach HINSCH und HINSCH (1999) werden die mZP2-mZP3 Hetero- dimere durch mZP1 über Disulfidbrücken stabilisiert und bilden so eine dreidimensionale Struktur. Nach neuer Nomenklatur werden bei der Maus also ZPA-ZPC Heterodimerketten über ZPB Dimere verbunden (WASSARMAN 1988).
Beim Rind konnten diese Glykoproteine als bovines Zonaprotein 1 (bZP1), bZP2, bZP3α, bZP3β und bZP4 identifiziert werden, wobei bZP2 und bZP4 Fragmente von bZP1 dar- stellen, die nach Reduzierung der Zonaproteine entstehen (TOPPER et al. 1997).
Dies zeigt beim Rind eine ähnliche Situation wie beim Schwein, wo ebenfalls 4 Sets von Proteinspots gefunden werden konnten, und wo porcines Zonaprotein 2 (pZP2) und pZP4 Teilungsprodukte von pZP1 darstellen (HASEGAWA et al. 1994).
Demnach wird bZP1 vom ZPA Gen kodiert, bZP3β vom ZPC Gen und bZP3α analog zum Schwein vom ZPB Gen (TOPPER et al. 1997).
2.4.1.2 Entstehung der Zona Pellucida
in dem Spalt zwischen Granulosazellschicht und Oozyte gebildet (EPIFANO et al. 1995, GREEN 1997). Nach RÜSSE und SINOWATZ (1991b) kommt es mit zunehmender Dicke der ZP zu einer Verlängerung der Mikrovilli der Eizelle und der Fortsätze der Follikelzellen (Granulosazellen), die Kontakt zu der Eizelle haben. Die Mikrovilli der Eizelle und die Follikelzellfortsätze reichen in die Zona hinein beziehungsweise durch sie hindurch. Die eigentliche Verankerung der Follikelzellen an der Eizelloberfläche findet über die kolbenartig verdickten Follikelzellfortsätze statt, die das Plasmalemm der Eizelle regelrecht eindrücken und dort Desmosomen ausbilden.
Die Synthese der Zonaproteine bei Säugetieren findet speziesabhängig entweder nur in der Oozyte oder in der Oozyte und den Follikelzellen statt. Die Herkunft der Zonaproteine bei der Maus, die eine relativ dünne Zona pellucida besitzt, geht nach EPIFANO et al.
(1995) ausschließlich auf die Oozyte zurück. Im Gegensatz dazu konnte bei den folgenden Spezies eine Beteiligung von Oozyte und Follikelzellen an der Synthese der Zonaproteine nachgewiesen werden: beim Menschen (GROOTENHUIS et al. 1996), Affen (GROOTEN- HUIS et al. 1996, MARTINEZ et al. 1996), Kaninchen (DUNBAR et al. 1994, GROOTEN- HUIS et al. 1996), Hund (TRESORIERO 1981) und Schwein (SINOWATZ et al. 1995, KÖLLE et al. 1996). Es konnte auch nachgewiesen werden, dass bovines ZPC von der Oozyte des Primärfollikes und von der Oozyte und den Follikelzellen des Sekundär- und Tertiärfollikels synthetisiert wird (KÖLLE et al. 1998). Von TROTZAUER et al. (1998) konnte für bovines ZPB (ZP3α) und ZPC (ZP3β) nachgewiesen werden, dass diese in der frühen Phase der Entwicklung vor allem von der Oozyte gebildet werden, in späteren Entwicklungsphasen aber die die Oozyte umgebenden Follikelzellen verstärkt die Glykoproteine der ZP synthetisieren. Die Zonae pellucidae dieser Spezies sind im Ver- gleich zur Maus sehr gut ausgebildet und SCHULTZ et al. (1979) nehmen an, dass die Proteinsyntheserate der Eizelle nicht ausreicht und deshalb die Follikelzellen an der Bildung der Zonaproteine beteiligt sind.
2.4.1.3 Morphologie der Zona pellucida
Das durch die Zonaproteine gebildete dreidimensionale Netzwerk lässt sich auch raster- elektronenmikroskopisch darstellen.
1977 untersuchten DUDKIEWICZ und WILLIAMS die Morphologie der Oberfläche der Ei- zellen verschiedener Spezies (Katze, Kaninchen, Hamster, Maus, Ratte, Opossum und Rind) mit Hilfe eines Rasterelektronenmikroskops. Die ZP stellte sich bei allen unter- suchten Spezies als ein komplexes, fibröses Netzwerk mit einer Vielzahl von Poren dar.
Bei Kaninchen und Katze wurden die größten Poren festgestellt, wohingegen die kleinsten Poren bei Rind und Opossum zu finden waren. Sie beobachteten, dass die Poren auf der äußeren Oberfläche der ZP am größten waren und sich deren Größe in die Tiefe gehend zentripetal veränderte. Die Anordnung der Poren erschien bei allen Spezies willkürlich. Es waren runde und eher elliptische Poren zu finden, außer bei der Katze, wo es sich um eine definierte, beinahe konzentrische Anordnung der Poren zu handeln schien. Es konnten auch Unterschiede in der Dicke der Fasern des Netzwerkes beobachtet werden:
Beim Hamster wurde das breiteste, ein plattenähnliches Retikulum festgestellt. Bei allen anderen Spezies waren die Fasern weniger breit, und die schmalsten Fasern waren bei Rind und Opossum zu finden. DUNBAR et al. (1991) stellten erhebliche Dickenunter- schiede der Zona pellucida bei verschiedenen Spezies fest. Die Dicke der Zona pellucida maturierter Oozyten variiert demnach von 1 - 2 µm beim Opossum, 5 µm bei der Maus, 13 µm beim Mensch, 15 µm beim Kaninchen und bis zu 27 µm beim Rind.
PHILIPS und SHALGI (1980b) untersuchten die ZP der Eizellen beim Goldhamster raster- elektronenmikroskopisch. Die innere und die äußere Oberfläche der ZP stellten sich als morphologisch unterschiedlich dar. Während die äußere Oberfläche gitterartig erschien, war die innere Oberfläche von einer regelmäßigen und rauen Beschaffenheit. Raster- elektronenmikroskopisch wurde die netzartige Struktur der Zona pellucida boviner Blasto- zysten erstmals 1978 von FLECHON und RENARD dargestellt und als eine fibrilläre, schwammartige Struktur beschrieben.
Auch bei Oozyten von Mensch und Schwein gibt es eine netzartige Struktur der Zona pellucida mit einer großen Anzahl von Poren. Neben dieser Struktur wurden aber auch Oozyten mit einer glatten, kompakten Oberfläche gefunden (MAGERKURTH et al. 1999, RATH et al. 2005). Auch für das Rind konnten diese beiden Strukturen nachgewiesen
Wie oben beschrieben stehen die Zellen der Corona radiata (Granulosazellen) über Zytoplasma Filamente, die die Zona pellucida durchqueren, in engem Kontakt mit dem Plasmalemm der Eizelle (SUZUKI et al. 1994). MACCHIARELLI et al. (1992) vermuteten, dass die netzartige Struktur der Zona pellucida durch die Penetration dieser Filamente entsteht. Diese Theorie lässt sich aber nicht mit den Ergebnissen von MAGERKURTH et al. (1999), RATH et al. (2005) und VANROOSE et al. (2000) vereinbaren, da sie neben Eizellen mit netzartiger Oberfläche auch solche mit kompakter, porenloser Oberfläche gefunden haben. Diese kompakte und porenlose Oberfläche könnte aber auch durch Um- bauvorgänge an der ZP nach erfolgter Reifung oder Befruchtung entstehen, worauf in der Diskussion genauer eingegangen werden wird.
2.4.1.4 Strukturveränderungen an der Zona pellucida während der frühen Embryonalentwicklung
Während der frühen Embryonalentwicklung kommt es zu mehr oder weniger ausgeprägten Strukturveränderungen an der Zona pellucida.
Während der Eileiterpassage werden erste morphologische Veränderungen sichtbar.
Eileitermaterial durchdringt die Zona pellucida, wird ein- und aufgelagert und ist im Spalt zwischen Zona pellucida und Embryo, dem perivitellinen Spalt (PVS), nachweisbar. Der PVS enthält eine fein vernetzte perivitelline Matrix, welche rasterelektronenmikroskopisch dargestellt werden konnte und für Maus, Hamster, Mensch und Beuteltier beschrieben worden ist (TALBOT und DICARLANTONIO 1984, DANDEKAR und TALBOT 1992, DANDEKAR et al. 1995). Diese perivitelline Matrix wird von kortikalen Granula, die bei der Fertilisation von der Oozyte ausgeschleust werden und auch von Eileitermaterial, gebildet (BETTERIDGE 1995, DENKER 2000).
Bei Kaninchen und Pferd wird Eileitermaterial auch als seperate Schicht auf die Zona pellucida aufgelagert, wobei beim Kaninchen die relativ mächtige Mukoproteinschicht entsteht, die dem relativ dünnen „Smooth Layer“ des Pferdes entspricht (BETTERIDGE 1989). Nach dem Übertritt in den Uterus kommt es bei Kaninchen und Pferd zur Bildung einer weiteren Schicht, die beim Kaninchen als Neozona und beim Pferd als Kapsel bezeichnet wird. Beim Kaninchen bildet sich die Neozona unterhalb der Mukoprotein- schicht und ersetzt die Zona pellucida (zur Übersicht siehe DENKER 2000). Hierbei
handelt es sich um embryonales (LEISER und DENKER 1988) und maternales Material (FISCHER et al. 1991). Beim Kaninchen kommt es weiterhin zur Auflagerung von uterinem Material auf die Mukoproteinschicht, die als Gloiolemma bezeichnet wird (BÖVING 1957).
Beim Pferd bildet sich eine neue Schicht unterhalb der Zona pellucida, die so genannte Kapsel (FLOOD et al. 1982, BETTERIDGE 1989, DENKER 2000). Als Ursprung dieses Materials wird der Trophoblast angesehen. Es scheinen aber auch Teile der Kapsel vom maternalen System zu stammen, wobei es sich um uterines Sekret handelt (ORIOL et al.
1993).
Elektronenmikroskopisch nachweisbare Veränderungen an der Zona pellucida des sich entwickelnden Embryos konnten auch bei anderen Spezies nachgewiesen werden. So konnten ENDERS et al. (1989) beim Pavian eine Dreischichtung der Zona pellucida von 6 Tage alten Blastozysten nachweisen. DENKER (2000) diskutierte diese innere Schicht als möglicherweise neu eingelagertes, uterines Material, das der Kapsel des Pferdes be- ziehungsweise der Neozona beim Kaninchen entspricht. Vergleichbare Mehrschichtig- keiten der Zona pellucida sind auch bei Katze, Hund, Bär, Dachs, Maulwurf, Stinktier und Pelzrobbe nachgewiesen worden (zur Übersicht siehe DENKER 2000). Auch beim Rind gibt es Anhaltspunkte für eine Beteiligung des maternalen Systems an der Ausbildung der Zona pelluicda beim frühen Embryo, worauf im Rahmen der Diskussion weiter ein- gegangen werden wird. Bei vielen anderen Spezies konnte eine entsprechende Ein- lagerung von Eileitermaterial über den Nachweis bestimmter Proteine, wie zum Beispiel dem Östrogen abhängigem „oviductal secretory glycoprotein“ (OSP) in der Zona pellucida, dem PVS oder dem präimplantativen Embryo nachgewiesen werden (zur Übersicht siehe BUHI et al. 2000).
Die oben beschriebenen Veränderungen an der Zona pellucida verdeutlichen, dass die zum Zeitpunkt der Ovulation als Zona pellucida bezeichnete Matrix morphologisch wie auch in ihrer Proteinzusammensetzung mit der Zona pellucida einer Blastozyste nur sehr wenig gemeinsam hat (BETTERIDGE 1989, DENKER 2000, HERRLER und BEIER 2000).
Deshalb wurde der Oberbegriff „Embryonic coats“ geprägt (International Symposium on
belegt ist (HERRLER und BEIER 2000). Im Folgenden wird bei der Oozyte weiterhin von ZP und beim frühen Embryo von extraembryonaler Matrix (EEM) gesprochen.
2.4.1.5 Das Schlüpfen (Hatching) des Embryos
Wie oben beschrieben schlüpft der Embryo beim Rind an Tag 9 bis 10 aus der EEM, um sich nach der Elongation in die Uterusschleimhaut einzunisten. Bei niederen Tieren sind Hatchingenzyme bekannt, die das Schlüpfen des Embryos vorbereiten und eine große Homologie zu den Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) aufweisen (NOMURA et al. 1997).
Bei Säugetieren wurden solche Enzyme vielfach diskutiert (DENKER 2000) und bei der Maus konnten MMPs nachgewiesen werden (TACHI 1998). Die genaue Funktion der MMPs beim Hatchingprozeß konnte aber noch nicht ermittelt werden. Ein embryonaler Ursprung dieser Enzyme wird diskutiert, da Embryonen auch in in vitro Kultur schlüpfen können. Zusätzlich werden aber auch maternale Faktoren zur Unterstützung ange- nommen, da es nach in vitro Kultur oft zu einer Behinderung des Schlüpfvorganges kommt (HERRLER und BEIER 1999). Es wird angenommen, dass unzureichende in vitro Bedingungen zu einer Härtung der EEM führen, wodurch der Schlüpfvorgang behindert wird. In dem Zusammenhang sei noch das „Assisted Hatching“ angesprochen, bei dem eine Öffnung der EEM erfolgt, um dem Embryo das Schlüpfen zu erleichtern (zur Über- sicht siehe DE VOS und STEIRTEGHEM 2000).
2.4.2 Funktion der ZP / EEM
Die Zona pellucida hat wichtige Funktionen während der Befruchtung der Eizelle und der frühembryonalen Entwicklung.
Der erste Kontakt zwischen Spermium und ZP (attachment) ist eine lockere, unspezifische Verbindung zwischen den Gameten (AITKEN 1995). Es folgt eine relativ enge Verbindung, die von komplementären Rezeptoren auf der ZP und auf der Oberfläche des Spermiums vermittelt wird, wobei den Oligosaccharidseitenketten eine Schlüsselrolle zukommt (zur Übersicht siehe SINOWATZ et al. 2001). Bei der Vermittlung der Spermien-Eizell- Interaktion scheinen beim Rind besonders die Zonaproteine bZP3α (ZPB) und bZP3β
(ZPC) eine Rolle zu spielen (TOPPER et al. 1997). Einmal gebunden durchlaufen die Spermien die Akrosomenreaktion, bei der hydrolytische Enzyme aus dem Akrosom des Spermienkopfes freigesetzt werden. Diese ermöglichen es dem Spermium, die ZP-Matrix durch eine Kombination aus hydrolytischer Auflösung der ZP-Glykoproteine und kräftigem Antrieb durch den Spermienschwanz zu durchdringen. Während dieses Prozesses werden akrosomenreagierte Spermien zeitweise von ZP-Glykoproteinen durch sekundäre Bin- dungsmechanismen (sekundäre Spermienrezeptoren) gebunden. HINSCH et al. (2003) berichten, dass ein ZP2 (ZPA) Epitop eine funktionelle Relevanz für die Interaktion zwischen Spermium und Zona pellucida beim Rind hat.
Sobald das erste Spermium mit der Eizelle verschmilzt und diese damit befruchtet, wird eine Exozytose sekretorischer Ca2+-abhängiger Granula, den kortikalen Granula der Ei- zelle, getriggert. Der Inhalt dieser Granula modifiziert die Eizellmembran und die ZP, so dass die Penetration weiterer Spermien verhindert wird. Bei der Maus scheint bei dem Polyspermieblock ZP3 (ZPC) seine Fähigkeit zur Spermienbindung und dem Auslösen der Akrosomenreaktion zu verlieren (FLORMAN und WASSARMAN 1985, LITSCHER und WASSARMAN 1996). Die molekulare Basis für diesen Funktionsverlust ist aber noch unklar. Gesichert ist aber, dass die kortikale Reaktion ein „zona hardening“ verursacht (unter anderem DE FELICI et al. 1985). Dieses „zona hardening“ scheint in einer erhöhten Resistenz der ZP gegen proteolytische Enzyme zu bestehen, könnte aber auch zusätzlich aus einer erhöhten Festigkeit der ZP durch Kreuzverbindungen in der ZP resultieren. Zwei Enzyme scheinen an diesem Prozess beteiligt zu sein. Eine kortikale Granula-Protease, die ZPA bei fast allen Spezies (Maus, Schwein, Mensch, Rind) an einer vorgegebenen Spaltstelle in ZP2 und ZP4 überführt, welche über Disulfidbindungen verbunden bleiben und so zu einer Strukturveränderung der ZP führen (MOLLER und WASSARMAN 1989;
BAUSKIN et al. 1999; HASEGAWA et al. 1994; IWAMOTO et al. 1999) und eine Peroxidase, die Tyrosinreste verbindet (GULYAS und SCHMELL 1980).
Außer den genannten Funktionen bildet die ZP beziehungsweise EEM einen physi- kalischen und chemischen Schutz, sowie einen Schutz gegen Bakterien, Viren, Pilze und
nur locker verbundenen Blastomeren und sichert die Individualität des Embryos, indem sie eine Aggregation mehrerer Embryonen verhindert. Neben den genannten Funktionen spielt die EEM außerdem eine wichtige Rolle im embryo-maternalen Dialog.
Die EEM bildet das Interface zwischen dem Embryo und seiner Mutter, durch welches ein Austausch von Boten- und Nährstoffen stattfindet (HERRLER und BEIER 2000). Alle Signale des embryo-maternalen Dialoges müssen die extraembryonale Matrix durch- dringen, wobei es ich dabei nicht nur um eine Passage, sondern teilweise auch um eine Modulierung der Signale zu handeln scheint.
Dies konnte bereits für das IGF-(insulin-like growth factor) System beschrieben werden. In der EEM von 10 Tage alten Pferdeembryonen konnte das „ Insulin-like Growth Factor Bindungsprotein 3“ (IGFBP3) durch 2D-SDS-PAGE (2 dimensional-sodium dodecyl- sulfate-polyacrylamid gel electrophoresis) gefunden werden, welches IGF an die EEM bindet und embryonalen Ursprungs ist (HERRLER et al. 2000). Durch uterine Proteasen wird IGFBP3 gespalten und somit IGF für den Embryo freigesetzt (LEE et al. 1998). IGFs beeinflussen die frühe Embryonalentwicklung positiv, indem sie als „Survival Factor“
wirken (HERRLER et al. 1998). Sie werden aktiv über den Trophoblasten aufgenommen (SMITH et al. 1993). Die durch Proteolyse entstandenen Fragmente des IGFBP-3 findet man in hohem Maße in der EEM, da sie an Glykosaminglykane gebunden werden (FOWLKES und SERRA 1996). Diese Bindung schützt den Embryo zum einen vor ihrer Fähigkeit Apoptose aus-zulösen (RECHLER 1997), und zum anderen wird so ein Schutzwall für den Embryo gegen phagozytierende Zellen aufgebaut. (HERRLER und BEIER 1999)
In diesem Zusammenhang sei noch erwähnt, dass nicht die Größe einer Substanz aus- schlaggebend zu sein scheint, ob sie die EEM penetrieren kann oder nicht, sondern be- stimmte physiko-chemische Eigenschaften. TURNER und HOROBIN (1997) zeigten, dass lipohile Substanzen mit niedrigen Van der Waals-Kräften die EEM leicht penetrieren, während hydrophile Substanzen mit niedrigen Van der Waals-Kräften abgestoßen werden.
Hydrophile Substanzen mit hohen Van der Waals-Kräften werden in der EEM angerei- chert. Zusätzlich findet eine Beeinflussung durch Bindungsproteine in der EEM statt und auch bestimmte Domänen innerhalb einer Substanz können deren Penetrationsfähigkeit beeinflussen.
2.5 Einfluss der in vitro Kultur auf den Embryo
In vitro produzierte Embryonen zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Kälte und Einfrierprozessen, was auf ihren höheren Lipidanteil zurückgeführt wird. Der vor allem in den Trophoblastzellen höhere Anteil an Lipidtropfen (unter anderem ABE et al. 1999, CROSIER et al. 2001) lässt sich nach CROSIER et al. (2001) durch einen unzureichenden Metabolismus der Mitochondrien begründen und nicht, wie zuerst angenommen, durch eine erhöhte Lipidaufnahme bei Zusatz von Serum in der in vitro Kultur.
Bei in vitro produzierten Embryonen ist eine geringere Dichte an Mitochondrien zu beobachten. Die Tight Junctions zwischen den Trophoblastzellen sind schlechter aus- gebildet als bei den in vivo Embryonen und die apikalen Mikrovilli auf den Trophoblast- zellen sind kürzer und von geringerer Anzahl, was zu einem schlechteren Zusammenhalt und vermindertem Stoffaustausch führt (ABE et al. 1999, CROSIER et al. 2001). Die Entwicklung der in vitro Blastozysten erfolgt schneller (VAN SOOM et al. 1997), aber die Differenzierung der ICM-Zellen ist schlechter und deren Anzahl geringer als bei den in vivo Embryonen (CROSIER et al. 2001). Die Zytoplasma-Kern-Relation ist bei den in vitro produzierten Embryonen erhöht (CROSIER et al. 2001). Dies geht auch mit der Be- obachtung von VAN SOOM et al. (1997) konform, dass die Zellteilungsaktivität der in vitro Embryonen geringer ist. VAN SOOM et al. (2003) stellten außerdem fest, dass der peri- vitelline Spalt (PVS) bei in vivo Embryonen breiter ist als bei in vitro produzierten Embryonen. Sie begründeten dies mit einer Schwellung der Blastomeren der in vitro pro- duzierten Embryonen, die zu einem engeren PVS führt.
Auch durch Genexpressionstudien konnte der negative Einfluss der in vitro Kultur auf die Entwicklung des Embryos bestätigt werden (NIEMANN und WRENZYCKI 2000).
3 Material und Methoden
Die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Chemikalien ist, sofern nicht im Text angegeben, im Anhang beschrieben.
Im Folgenden wird bei der Oozyte von Zona pellucida (ZP) und bei den Embryonalstadien von extraembryonaler Matrix (EEM) gesprochen (siehe Abschnitt 2.4.1.4. Strukturver- änderungen an der ZP während der frühen Embryonalentwicklung).
3.1 Eizellen und Embryonen
Die unreifen Eizellen stammen aus Ovarien von Schlachttieren aus den Schlachthöfen Düren und Euskirchen. Sie wurden von dort in 39°C warmer physiologischer Koch- salzlösung zum Biotechnologielabor des Lehr- und Versuchsgut Frankenforst der Rheinischen Friedrich Wilhelm-Universität Bonn transportiert und dort durch Punktion ge- wonnen.
Die anschließende in vitro Maturation, in vitro Fertilisation und in vitro Kultur wurde im Biotechnologielabor des Lehr- und Versuchsgut Frankenforst durchgeführt. Die Methode ist detailliert bei NGANVONGPANI et al. (2006) beschrieben, wobei Charles Rosenkrans 1 (CR-1) Kulturmedium unter Zusatz von OCS (Oestrus Cow Serum) verwendet wurde.
Die in vivo Stadien wurden von Rindern des Lehr- und Versuchsgut Frankenforst nach Superovulation durch transvaginale Endoskopie (gereifte Eizelle bis 8 - /16 - Zeller) und durch Uterusspülung (Morulae und Blastozysten) gewonnen. Die genaue Methode ist bei BESENFELDER und BREM (1998) und BESENFELDER et al. (2000) beschrieben.
Die immaturen Eizellen wurden zur Untersuchung 2,5 Minuten in einer bovinen Hyaluronidase-Lösung (1mg Hyaluronidase, Sigma; Deutschland pro ml Medium) gevortext (Voretexgenie 2, Scientific Industries; USA), um sie von den umgebenden Kumuluszellen zu befreien. Die Qualitätsbestimmung der KOKs erfolgte nach dem Klassifizierungsschema von LEIBFRIED und FIRST (1979). Die Qualitätsbestimmung der Embryonen erfolgte nach den Kriterien der "International Embryo Transfer Society"
(ROBERTSON und NELSON, 1998). Soweit nicht anders angegeben, wurden nur Oozyten und Embryonen der Qualität 1 und 2 verwendet.
3.2 Lichtmikroskopische Untersuchung zur Bestimmung des retikulären Anteils der extraembryonalen Matrix (EEM) und der Breite der EEM
3.2.1 Einbettung der Proben in Araldit
Für die lichtmikroskopische Untersuchung wurden die bovinen Eizellen bzw. Embryonen in 2,5% Glutaraldehyd eine Stunde lang fixiert. Anschließend wurden sie dreimal für jeweils zehn Minuten in 0,1M Cacodylatpuffer (ph 7,4) gespült. Es folgte eine weitere einstündige Fixierung in 2% Osmiumtetroxidlösung (OSO4) und erneutes dreimaliges Spülen mit 0,1M Cacodylatpuffer für jeweils zehn Minuten. Es schloss sich eine Dehydrierung der Em- bryonen für jeweils zweimal zehn Minuten in einer Alkoholreihe mit ansteigender Konzentration an (30%, 50%, 70%, 80%, 90% iges und absolutes Ethanol). Es folgten zweimal zehn Minuten in einem Gemisch aus absolutem Ethanol und Propylenoxid zu gleichen Teilen; dann zweimal je fünf Minuten in Propylenoxid. Die Embryonen wurden anschließend über Nacht in einem Gemisch aus Aralditgrundgemisch und Propylenoxid zu gleichen Teilen und 1,5% Beschleuniger (Araldit Accelerator), bezogen auf das Volumen an Aralditgrundgemisch, belassen. Danach wurden sie für vier bis sechs Stunden in Aralditgrundgemisch mit 2% Beschleuniger verbracht. Dann erfolgte eine 48 stündige Polymerisation in Aralditgrundgemisch mit 2% Beschleuniger bei 60°C in einem Inkubator (Heraeus; Deutschland).
3.2.2 Semidünnschnitte
Von den in Aralditblöcken befindlichen Embryonen wurden mit einem Mikrotom (Mod.570 AO Instrument Company, Reichert; Österreich) Semidünnschnitte von 0,5 µm angefertigt.
Die Semidünnschnitte wurden auf Objektträger aufgetragen und nach zehnminütiger Trocknung mit einer gesättigten Natriumhydroxid-Lösung für eine Minute angeätzt (zur
3.2.3 Lichtmikroskopische Untersuchung
Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte an einem Axiophot Fotomikroskop (Zeiss;
Deutschland) mit 63 facher Vergrößerung. Von jedem Embryo und jeder Eizelle wurden jeweils fünf Semidünnschnitte untersucht. Die Embryonen bzw. Eizellen wurden ohne Kenntnis, ob es sich um in vivo oder in vitro produzierte Proben handelt, untersucht.
3.2.3.1 Bestimmung des retikulären Anteils der EEM
Die EEM zeigt, wie in den Abbildungen 02 und 03 ersichtlich, neben innen liegenden optisch dichten, kompakten auch lockere Strukturen im äußeren, retikulären Bereich.
Abb. 02: Semidünnschnitt einer in Araldit eingebetteten in vivo Zygote; Färbung nach Richardson, lichtmikroskopisch Vergr. 63x
Gemessen wurde der retikuläre Anteil der ZP jeder Eizelle bzw. der EEM des Embryos.
Die Auswertung erfolgte nach folgendem Schema:
Mit dem Computer-Programm Lucia (Laboratory Imaging Ltd., Nikon; Japan) wurden pro Schnitt drei Flächen berechnet:
• Fläche 1 bis zum äußeren Rand der EEM
• Fläche 2 bis zum inneren Rand des retikulären Anteils der EEM
• Fläche 3 bis zum inneren Rand der EEM
Abb. 03: Bild der in vivo Zygote (Abb. 02) zur Messung durch Graukonvertierung und Kontrastierung aufbereitet. Die Veränderungen wurden automatisch durch das Programm „Lucia“ vorgenommen;
Zur Bestimmung der Fläche 1 und der Fläche 3 wurde der innere bzw. äußere Rand der EEM mit der Computermouse umfahren, wodurch die Flächen durch eine Linie begrenzt wurden.
Zur Bestimmung der Fläche 2 wurde der innere Rand des retikulären Anteils der EEM in gleicher Weise umfahren. Dabei wurden die Leerräume berücksichtigt, die nicht mehr als 5 µm von der äußeren Begrenzung der EEM und nicht mehr als 5 µm vom nächsten Leerraum entfernt sind.
Die Abbildung 03 zeigt die „Radien“ der zu bestimmenden Flächen und die bestimmten Begrenzungen.
Durch Subtraktion der Fläche 3 von der Fläche 1 wurde die Fläche der EEM berechnet.
Die Subtraktion der Fläche 2 von der Fläche 1 ergab die Fläche des retikulären Anteils der EEM.
Aus diesen beiden Werten wurde der retikuläre Anteil der EEM an der Gesamtfläche der EEM in Prozent berechnet.
Pro Eizelle und Embryo wurden jeweils fünf Semidünnschnitte ausgewertet und aus diesen Ergebnissen der Mittelwert gebildet.
Anzahl der zur Bestimmung des retikulären Anteils an der ZP bzw. EEM verwendeten Proben:
Unreife Eizellen: n = 5
Zygoten in vitro: n = 4
Zygoten in vivo: n = 4
2 - / 4 - Zeller in vitro: n = 7
2 - / 4 - Zeller in vivo: n = 4
8 - / 16 - Zeller in vitro: n = 5
Morulae in vitro: n = 3
Morulae in vivo: n = 3
Blastozystenin vitro: n = 4
Blastozysten in vivo: n = 4 1
3.2.3.2 Validierung der Messmethode des retikulären Anteils an der ZP/EEM
Zur Validierung dieser Messmethode wurden fünf verschiedene Semidünnschnitte unter- schiedlicher Entwicklungsstadien jeweils fünfmal unabhängig voneinander nach der oben beschriebenen Methode gemessen. Bei der Messung bestand weder Kenntnis darüber, um welches Entwicklungsstadium es sich handelte, noch ob diese Proben aus in vivo bzw.
in vitro Kultur stammten.
Dabei konnten die in Tabelle 02 dargestellten Messwerte ermittelt werden. Die Flächen- angaben sind keine Absolutwerte in µm2, sondern dienen zur Bestimmung des pro- zentualen Anteils des retikulären Bereiches an der Gesamtfläche der ZP bzw. EEM.
Weiterhin wurden die Mittelwerte, sowie die Standardabweichungen und der Standard- fehler zwischen mehreren unabhängigen Messungen einer Probe an Probe 1 bis 5 be- stimmt (siehe Tab.01).
Probe Mittelwert
% Standard-
abweichung (SD) Standardfehler
(SEM) Standardabweichung in
%
1 28,04 ±1,92 0,86 6,85
2 7,08 ±1,29 0,58 18,22
3 10,45 ±1,07 0,48 10,24
4 26,50 ±0,87 0,39 3,28
5 22,45 ±0,52 0,23 2,32
Tab. 01: Mittelwerte, Standardabweichungen, Standardfehler (SEM) der Proben 1 - 5
Die mittlere Standardabweichung zwischen mehreren unabhängigen Messungen einer Probe beträgt somit 8,18%. Das heißt, dass von einer 92% igen Genauigkeit der Messungen ausgegangen werden kann.
Probe ( jeweils Messung 1 bis 5 )
Fläche bis zum äußeren Rand der EEM
in µm2 Fläche 1
Fläche bis zum retikulären Anteil der EEM in µm 2
Fläche 2
Fläche bis zum inneren Rand der EEM
in µm2 Fläche 3
Ver- größ- erung 63x und X
Gesamt- fläche der
EEM in µm2
Fläche des retikulären
Anteils in µm2
Retikulärer Anteil an
der EEM in %
Mittel- wert
1.1 31440,6 27556,5 18678,4 1,5 12762,2 3884,0 30,43 1.2 31296,9 27853,2 18714,1 1,5 12582,8 3443,6 27,37 1.3 31501,4 28267,6 18721,2 1,5 12780,2 3233,8 25,30 1.4 31511,5 27950,4 18786,6 1,5 12724,9 3561,1 27,99
1.5 31475,5 27767,0 18741,7 1,5 12733,9 3708,5 29,12 28,04%
2.1 24156,0 23868,1 18971,8 1,4 5184,2 287,9 5,5 2.2 24062,1 23762,6 18992,5 1,4 5069,5 299,5 5,9 2.3 24159,2 23762,5 18922,1 1,4 5237,1 396,8 7,58 2.4 24128,7 23718,7 19026,8 1,4 5101,9 410,0 8,04
2.5 24135,9 23705,8 18994,5 1,4 5141,4 430,1 8,36 7,08%
3.1 25306,2 24641,4 19435,0 1,4 5871,2 664,8 11,32 3.2 25284,1 24605,4 19430,0 1,4 5854,2 678,7 11,59 3.3 25272,3 24711,5 19395,8 1,4 5876,5 560,9 9,54 3.4 25335,1 24708,9 19450,7 1,4 5884,4 626,2 10,64
3.5 25354,4 24809,6 19396,7 1,4 5957,7 544,9 9,15 10,45%
4.1 22016,4 17239,8 4777,1 1,7 17239,4 4776,6 27,70 4.2 22027,3 17626,5 4885,2 1,7 17142,1 4400,7 25,67 4.3 22046,6 17525,4 4879,3 1,7 17167,4 4521,2 26,34 4.4 22039,7 17395,0 4867,6 1,7 17172,1 4644,7 27,05
4.5 22104,1 17665,8 4857,7 1,7 17246,4 4438,3 25,73 26,49%
5.1 25773,0 22108,6 9629,6 1,7 16143,4 3664,4 22,69 5.2 25878,8 22157,3 9631,5 1,7 16247,3 3721,5 22,91 5.3 25741,1 22219,5 9605,3 1,7 16135,8 3521,5 21,82 5.4 25766,2 22059,4 9558,6 1,7 16207,6 3706,8 22,87
5.5 25692,5 22174,1 9660,3 1,7 16032,3 3518,4 21,95 22,45%
Tab. 02: Messwerte zur Validierung der Messmethode des retikulären Anteils der ZP / EEM
3.2.3.3 Bestimmung der Breite der EEM
Zur Bestimmung der Breite der EEM wurden die Embryonen durch ein Mikroskop (Leica, DM IRB; Deutschland) bei einer 20 fachen Vergrößerung mit einer Digital- farbbildkamera (JVC TK-C 1360D; Japan) fotografiert. Auf diesen Bildern wurde mit Hilfe des Computerprogramms Lucia an fünf verschiedenen Stellen die Breite der EEM gemessen. Aus diesen fünf Werten wurde der Mittelwert bestimmt.
Abb. 04: In vitro Blastozyste, Bild durch Graukonvertierung mit dem Computerprogramm „Lucia“ zur Messung aufbereitet.
Vergr. 20x
Anzahl der zur Bestimmung der Breite der EEM verwendeten Proben:
2 - / 4 - Zeller in vitro: n = 21
2 - / 4 - Zeller in vivo: n = 17
8 - / 16 - Zeller in vitro: n = 20
8 - / 16 - Zeller in vivo: n = 16
Morulae in vitro: n = 20
Morulae in vivo: n = 6
Blastozysten in vitro: n = 20
Blastozysten in vivo: n = 14
3.3 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung 3.3.1 Vorbereitung der Proben
Für die rasterelektronenmikroskopische Untersuchung wurden die Eizellen bzw.
Embryonen eine Stunde in 2,5% Glutaraldehyd fixiert und danach in 0,1 M Cacodylatpuffer dreimal jeweils zehn Minuten gewaschen. Anschließend erfolgte eine einstündige Fixierung in 2% Osmiumtetroxidlösung. Es folgte erneut dreimaliges Waschen in 0,1M Cacodylatpuffer für jeweils zehn Minuten. Die Proben wurden in Cacodylatpuffer unter dem Stereomikroskop (Wild Heerbrugg, Schweiz) in Lumitainer (Dr. Lerche KG, Berlin;
Deutschland) überführt.
Danach schloss sich eine Dehydrierung in einer Alkoholreihe mit ansteigender Kon- zentration an, dabei wurden die Proben jeweils zweimal für 10 Minuten in 30%, 50%, 70%, 80%, 90% igem und absolutem Ethanol dehydriert.
3.3.2 Kritisch-Punkt-Trocknung
Die Lumitainer mit den Proben wurden aus dem absoluten Ethanol in Aceton überführt und dann in einem Kritisch-Punkt-Trocknungsgerät (Polaron, Watford; Großbritannien) in Kohlendioxid über den kritischen Punkt getrocknet.
3.3.3 Aufbringen der Eizellen und Embryonen auf rasterelektronenmikroskopische Probenhalter
Die Proben wurden unter dem Stereomikroskop aus den Lumitainern entfernt und auf rasterelektronenmikroskopische Probenhalter (Modell Amray, Plano; Deutschland) über- führt, die mit doppelseitiger Klebefolie (Haft-Aufkleber, Plano; Deutschland) überzogen waren.
3.3.4 Rasterelektronenmikroskopie
Die Proben wurden in einer Kathodenzerstäubungsanlage (SCD 030, Balzers Union;
Liechtenstein) mit Gold beschichtet (Schichtdicke 30 nm).
Die rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden mit einem ESEM XL 30 FEG, FEI (Philips, Eindhoven; Niederlande) in der elektronenmikroskopischen Einrichtung des Instituts für Pathologie der RWTH Aachen durchgeführt.
Die Untersuchungen erfolgten im Hochvakuum mit einer Beschleunigungsspannung von 5 bis 10 kV.
3.3.5 Klassifizierung der rasterelektronenmikroskopischen Bilder
Die Oberfläche der untersuchten Eizellen und Embryonen zeigte im rasterelektronen- mikroskopischen Bild unterschiedliche Strukturierungen, die zur Vergleichbarkeit der einzelnen Stadien in verschiedene Kategorien eingeteilt wurden, die im Folgenden er- läutert werden. Es wurden folgende Kategorien unterschieden:
1.) Poröse Oberfläche
mit Unterteilung nach ungefährer Anzahl Poren pro Fläche:
• Sehr große Anzahl an Poren: >100 Poren pro 132,5 µm2
• Große Anzahl an Poren: cirka 60 – 100 Poren pro 132,5 µm2
• Mittlere Anzahl an Poren: cirka 15 – 60 Poren pro 132,5 µm2
• Geringe Anzahl an Poren: cirka 0 – 15 Poren pro 132,5 µm2
2.) Porenlose Oberfläche
3.) Granula-Typen der Oberfläche
• Granula-Typ 1: flache Granula
• Granula-Typ 2: Mischform mit flachen und kugeligen Granula
• Granula-Typ 3: kugelige Granula zusätzliche Strukturformen:
4.) Netzartige Oberfläche
5.) Degradiert erscheinende Oberfläche
3.3.5.1 Poröse Oberfläche
Abb. 05: Probe mit poröser Oberfläche; Vergr. 3500x
Zur Bestimmung der ungefähren Anzahl der Poren pro Flächen wurde bei 3500 facher Vergrößerung in 3 Messrahmen (je 132,5 µm2) die Anzahl der Poren mit dem Computer- programm Lucia bestimmt und der Mittelwert ermittelt. Es gibt folgende Unterteilungen:
• Sehr große Porenanzahl: > 100 Poren pro 132,5 µm2
• Große Porenanzahl: ca. 60 - 100 Poren pro 132,5 µm2
3.3.5.2 Porenlose Oberfläche
Abb. 06: Probe mit porenloser Oberfläche; Vergr. 3500x
3.3.5.3 Granula-Typ der Oberfläche
Alle Proben zeigen eine granulierte Struktur, wobei sie sich in der Ausprägung der Granula unterscheiden. Die Granula werden in drei Typen eingeteilt. Granula-Typ 1 (siehe Abb. 07) hat relativ wenige Granula, die sich kaum über die Oberfläche erheben und wie eingeschmolzen wirken. Granulat-Typ 2 (siehe Abb. 08) hat neben flachen Granula auch kugelige Granula. Der Granula-Typ 3 (siehe Abb. 09) hat eine große Anzahl gut aus- gebildeter, kugelförmiger Granula.
Granula-Typ 1: flache Granula
Abb. 07: Probe mit Granula-Typ 1 (flache Granula); Vergr. 15000x
Granula-Typ 2: Mischform mit flachen und kugeligen Granula
Abb. 08: Probe mit Granula-Typ 2 (flache und kugelförmige Granula); Vergr. 15000x
Granula-Typ 3 : kugelige Granula
Abb. 09: Probe mit Granula-Typ 3 (kugelförmige Granula); Vergr. 15000x
Zusätzlich zu den oben genannten Kategorien zeigen bestimmte Proben auch andere Strukturformen, wobei eine netzartige Struktur und eine degradiert erscheinende Struktur vorkommen:
3.3.5.4 Netzartige Oberfläche
Proben mit netzartiger Struktur zeigen eine Oberfläche mit feinen Verästelungen, wie sie in Abbildung 10 zu sehen ist.
Netzartige Struktur:
Abb. 10: Probe mit netzartiger Struktur; Vergr. 15000x
3.3.5.5 Degradiert erscheinende Oberfläche
Proben mit degradiert erscheinender Oberfläche zeigen eine ausgefranste Struktur (siehe Abb. 11).
Degradiert erscheinende Struktur:
Abb. 11: Probe mit degradiert erscheinender Sruktur; Vergr. 15000x
Anzahl der zur rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung verwendeten Proben:
Unreife Eizellen Q1 - 2: n = 15
Unreife Eizellen Q3: n = 6
Gereifte Eizellen in vitro Q1 - 2: n = 8
Gereifte Eizellen in vitro Q3: n = 4
Gereifte Eizellen in vivo: n = 3
Zygoten in vitro: n = 7
Zygoten in vivo: n = 6
2 - / 4 - Zeller in vitro: n = 7
2 - / 4 - Zeller in vivo: n = 3
8 - / 16 - Zeller in vitro: n = 10
Morulae in vitro: n = 11
Morulae in vivo: n = 13
Blastozysten in vitro: n=14
Blastozysten in vivo: n=6
3.3.6 Bestimmung der Variationsbreite der Porenfläche auf der Probenoberfläche Zur Bestimmung der Variationsbreite der Fläche der Poren auf der EEM wurden Bilder der EEM mit einer 15000 fachen Vergrößerung angefertigt. Mit Hilfe des Computerpro- grammes „Lucia“ wurde die größte und die kleinste Fläche der Poren in der obersten Schicht der EEM ausgemessen, die sich auf einer Fläche der EEM von ca. 50 µm2 befinden. Hierzu wurde der innere Rand der Poren mit Hilfe der Computermouse gekennzeichnet (Abb. 12). Das Computerprogramm „Lucia“ berechnete die darin enthaltene Fläche. Aus diesen Werten wurde der Mittelwert errechnet.
Abb. 12: Bestimmung der Porenfläche mit dem Computerprogramm „Lucia“ (8 - / 16 – Zeller in vitro) Vergr. 15000x
Anzahl der zur Bestimmung der Variationsbreite der Porenfläche verwendeten Proben:
Unreife Eizellen Q 1 - 3: n = 17
gereifte Eizellen in vitro: Q 1 - 3: n = 11
gereifte Eizellen in vivo: n = 3
Zygoten in vivo: n = 5
Zygoten in vitro: n = 7
2 - / 4 - Zeller in vivo: n = 3
2 - / 4 - Zeller in vitro: n = 7
8 - / 16 - Zeller in vitro: n = 9
Morulae in vivo: n = 13
Morulae in vitro: n = 11
Blastozysten in vivo: n = 6
Blastozysten in vitro: n = 14
3.4 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung wurde mit dem Computerprogramm Prism (Graphpad Software, San Diego; USA) gemacht.
Es wurde je Probe der Mittelwert sowie der Standardfehler des Mittelwertes bestimmt.
Die statistische Auswertung erfolgte über den parameterfreien Mann-Whitney-U-Test.
Als Signifikanzgrenzen wurden p < 5% = */signifikant unterschiedlich und p < 1% = **/
hochsignifikant unterschiedlich festgelegt.
4 Ergebnisse
4.1 Lichtmikroskopische Untersuchungen 4.1.1 Der retikuläre Anteil der EEM
Bei der Untersuchung des retikulären Anteils der EEM wurde dessen Anteil an der gesamten EEM in Prozent bestimmt (siehe Abb. 03).
Ergebnis dieser Untersuchung ist, dass bei allen in vivo Eizellen und Embryonen der prozentuale retikuläre Anteil an der ZP / EEM signifikant größer ist als bei den in vitro Stadien (siehe Abb. 13 und Tab. 03). Einzige Ausnahme bilden die in vivo und in vitro Morulae. Er ist am größten bei den in vivo Morulae (Mittelwert = 32,32% ±0,59a) und bei den in vivo 2-/4-Zellern (Mittelwert = 31,21% ±3,22a).
Es finden sich signifikante Unterschiede beim Vergleich der retikulären Anteile der ZP bzw. EEM von:
a)
unreifen Eizellen (retikulärer Anteil an der ZP:
Mittelwert = 30,54% ±2,26a) und
Zygoten in vitro (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 9,08% ±3,03a) p= 0,0159
b)
Zygoten in vivo (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 27,07% ±0,54a) und
Zygoten in vitro (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 9,08% ±3,03a) p= 0,0286
(siehe Abb. 14 und 15)
Hochsignifikante Unterschiede finden sich beim Vergleich von
c)
2-/4-Zeller in vivo (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 31,21% ±3,22a) und
2-/4-Zeller in vitro (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 13,04% ±0,78 a) p= 0,0061
a=SEM
Signifikante Unterschiede finden sich weiterhin beim Vergleich von
d)
Blastozysten in vivo (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 29,55% ±4,21a) und
Blastozysten in vitro (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 13,71% ±1,68 a) p= 0,0286
(siehe Abb. 16 und 17)
Bei den Blastozysten ist der retikuläre Anteil der Blastozysten unabhängig von deren Expansionsgrad, da die Größe der Blastozyste durch die Bestimmung deren Gesamt- fläche in die Berechnung des retikulären Anteils einbezogen wird.
Bei den Morulae ist der retikuläre Anteil der EEM bei den in vivo Stadien ebenfalls größer als bei den in vitro Stadien, wobei der Unterschied nicht signifikant ist.
e)
• Morulae in vivo (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 32,32% ±0,59a) und
• Morulae in vitro (retikulärer Anteil an der EEM:
Mittelwert = 15,15% ±1,66a)
Probe unreife Eizellen
Zygoten in vivo
Zygoten in vitro
2 -/4 - Zeller in vivo
2 -/4 – Zeller in vitro
1 28,66% 28,56% 7,10% 26,63% 16,74%
2 24,63% 26,30% 18,11% 40,74% 10,99%
3 37,43% 26,23% 5,35% 28,70% 10,70%
4 28,21% 27,18% 5,76% 28,77% 13,79%
5 33,75% 11,91%
6 13,53%
7 13,64%
Mittel- wert in
%
30,54
±2,26 a
27,07
±0,54 a
9,08
±3,03 a
31,21
±3,22 a
13,04
±0,78 a
Tab. 03 a: Retikulärer Anteil der ZP / EEM der unreifen Eizellen, in vivo und in vitro Zygoten, 2 - / 4 -Zeller in %
Probe 8 -/16- Zeller in vitro
Morulae
in vivo Morulae
in vitro Blastozysten
in vivo Blastozysten in vitro
1 18,14% 31,50% 15,00% 30,22% 12,80%
2 12,29% 33,46% 18,10% 20,31% 18,48%
3 9,98% 32,01% 12,35% 40,55% 12,95
4 9,09% 27,11% 10,59
5 11,18%
Mittel- wert in
%
12,14
±1,59 a
32,32
±0,59 a
15,15
±1,66 a
29,55
±4,21 a
13,71
±1,68 a
Tab. 03 b: Retikulärer Anteil der EEM von in vitro 8 - / 16 – Zeller, in vivo und in vitro Morulae und Blastozysten in %
a=SEM
