Charakterisierung der porcinen Zona pellucida
und ihrer Veränderungen während der In-vitro-Maturation
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Silja Ebeling
aus Hannover
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen
1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen 2. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 04. Juni 2002
You hold a candle in your heart You shine the light on hidden parts You make the whole world wanna dance You‘ve bought yourself a secound chance
(Garbage, beautifulgarbage)
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS··· 7
A EINLEITUNG··· 11
B LITERATURÜBERSICHT··· 14
1. Vorbemerkungen··· 14
2. Das Spermium··· 17
2.1. Aufbau und Entwicklung···17
2.2. Epididymale Reifung und Einfluss des Seminalplasmas··· 19
2.3. Spermienveränderungen im weiblichen Genitale··· 20
3. Die Oozyte···22
3.1. Entwicklung und Aufbau···22
3.2. Maturation der Oozyte in vivo···24
4. Gameteninteraktion··· 26
5. Die Zona pellucida··· 28
5.1. Aufbau und Entwicklung···29
5.2. Oligosaccharidstrukturen···31
5.3. Spermien-Zona pellucida-Interaktionen···37
5.4. Die Zona pellucida nach der Befruchtung···41
5.5. Antikörper gegen Zona pellucida als Immunokontrazeptiva··· 43
C MATERIAL UND METHODEN··· 44
1. Isolierung der Zona pellucida··· 44
1.1. Massenaufarbeitung···44
1.2. Gewinnung von Zonae pellucidae aus frischen Ovarien···45
1.3. In-vitro-Maturation der Oozyten··· 47
1.4. Überprüfung des Kernreifungsstatus···47
2. Elektrophoretische Auftrennungen···48
2.1. Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der ZP···48
2.2. Zweidimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der ZP··· 50
3. Immuno- und lektinologische Analyse der ZP Glykoproteine am Proteinblot··· 52
3.1. Chemilumineszenzverfahren··· 52
3.2. Immunologische Identifizierung der Glykoproteine der ZP···54
3.3. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP··· 55
4. Rasterelektronenmikroskopie··· 57
5. Funktioneller Vergleich von ZP ungereifter und in vitro gereifter Oozyten···58
5.1. Aufbereitung der Spermien···58
5.2. Spermatologische Untersuchungen···59
5.3. Induktion der Akrosomreaktion durch die Zona pellucida···61
5.4. Statistische Auswertung···62
D ERGEBNISSE··· 64
1. Gewinnung der Oozyten und Isolierung der Zonae pellucidae··· 64
2. SDS-Gelelektrophorese··· 65
2.1. 1D-PAGE der Glykoproteine der Zona pellucida···65
2.2. 2D-PAGE der Glykoproteine der Zona pellucida···67
3. Immunologische Charakterisierung der ZP Proteine··· 69
4. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP··· 71
5. Rasterelektronenmikroskopische Studien··· 78
6. Die Fähigkeit der ZP zur Induktion der Akrosomreaktion in Abhängigkeit vom Reifungsstatus der Oozyte ··· 80
E DISKUSSION··· 92
1. Verhalten der porcinen ZP in der PAGE··· 92
2. Charakterisierung der ZP durch Antikörper und Lektine···96
3. Ultrastrukturelle Untersuchung der ZP··· 102
4. Funktioneller Vergleich von ungereifter und gereifter ZP··· 104
5. Unterschiede zwischen der ZP von in vitro und in vivo gereiften Oozyten··· 108
6. Abschlussbetrachtung und Ausblick··· 109
F ZUSAMMENFASSUNG··· 111
G SUMMARY··· 113
H LITERATURVERZEICHNIS··· 115
J ANHANG··· 136
1. Rezeptverzeichnis···136
2. Tabellen zur Auswertung der funktionellen Bindungstests···139
3. Multifaktorielle Varianzanalyse··· 142
K DANKSAGUNG···144
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
aggl. agglutinin (Lektin)
AK Antikörper
APS Ammoniumpersulfat
AQN Protein der porcinen Spermadhäsine; A, Q und N stehen für die ersten drei Aminosäuren des N-Terminus
Aqua bidest. Aqua bidestillata
Asn203 Asparagin an der 203. Stelle
ATP Adenosintriphosphat
AWN Protein der porcinen Spermadhäsine; A, W und N stehen für die ersten drei Aminosäuren des N-Terminus
BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
bZP bovine Zona pellucida
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celcius
ca. circa
Ca2+ Kalziumionen
cAMP cyclic adenosin monophosphate
cm Zentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
conj. conjugiert
Da Dalton
db-cAMP dibutyryl-cAMP
DNA desoxyribonucleotide acid, Desoxyribonukleinsäure 1D-Membran PVDF-Membran mit transferierten Proteinen nach 1D-PAGE 2D-Membran PVDF-Membran mit transferierten Proteinen nach 2D-PAGE 1D-PAGE eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese
2D-PAGE zweidimensionale Polyacrylamidgelektrophorese
DTT Dithiothreitol
EM Elektronenmikroskop
et al. et alii (und andere) etc. et cetera (und so weiter)
evtl. eventuell
g Gramm
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
GalTase Galaktosyltransferase
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GV Germinalvesicle
GVBD Germinalvesicle Breakdown
h hour (Stunde)
hCG human Chorionic Gonadotropin
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
HRPO horse radish peroxidase (Meerrettichperoxidase)
hZP humane Zona pellucida
ICSI intrazytoplasmatische Spermieninjektion
IP isoelektrischer Punkt
IPG immobilisierter pH-Gradient
IVF In-vitro-Fertilisation
IVM In-vitro-Maturation
IVP In-vitro-Produktion
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KOK Kumulus-Oozyten-Komplex
l Liter
LM Lichtmikroskop
LMW Low Molecular Weight
LPC Lyso-Phosphatidylcholin
M Molar
M II Metaphase II
mA/cm2 Milliampere pro Quadratzentimeter
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mM Millimolar
mm Millimeter
mmHg Millimeter Quecksilbersäule
mod. modifiziert
mZP murine Zona pellucida
NaCl Natriumchlorid
NCSU North-Carolina-State-University
neg. negativ
ng Nanogramm
N-Glykan/glykosidisch Protein mit Zuckerkette, welche über eine NH2-Gruppe einer Aminosäure mit diesem verknüpft ist
NH2-Gruppe Aminogruppe
nm Nanometer
Nr. Nummer
OD Optische Dichte
OH-Gruppe Hydroxylgruppe
O-Glykan/glykosidisch Protein mit Zuckerkette, welche über eine OH-Gruppe einer Aminosäure mit diesem verknüpft ist
p Probabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS Phosphat-Buffered-Saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) pH pondus Hydrogenii, Wasserstoffionenkonzentration
PI Propidiumjodid
pI pH-Wert am isoelektrischen Punkt
PMSG Pregnant Mare’s Serum Gonotropin
pos. positiv
PSP porcine Seminalplasmaproteine
PVA Polyvinylalkohol
PVDF Polyvinylidene Difluoride
PVM perivitelline Matrix
pZP porcine Zona pellucida
REM Rasterelektronenmikroskop
s. siehe
SDS Sodium-Dodecyl-Sulfate
Standardabw. Standardabweichung
sec Sekunde
SUZI subzonale Insemination
Tab. Tabelle
TBS Tris-Buffered-Saline (Trisgepufferte Kochsalzlösung) TEMED N,N,N’N’-Tetramethylethylendiamin
TG-Sperma Tiefgefriersperma
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
u. und
u.a. unter anderem
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
V Volt
vgl. vergleiche
v/v volume/volume (Volumen/Volumen)
vWW van der Waal’sche Wechselwirkungen
w/v weight/volume (Gewicht/Volumen)
xg x-fache der Erdbeschleunigung
z.B. zum Beispiel
ZBP Zona pellucida bindende Proteine
ZP Zona pellucida
Einbuchstaben- und Dreibuchstabencode der angesprochenen Aminosäuren
A Ala Alanin P Pro Prolin
C Cys Cystein Q Gln Glutamin
D Asp Asparaginsäure R Arg Arginin
E Glu Glutaminsäure S Ser Serin
G Gly Glycin T Thr Threonin
I Ile Isoleucin V Val Valin
K Lys Lysin W Trp Tryptophan
L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin
N Asn Asparagin
Erläuterungen zu den Zuckerstrukturen
Fuc Fukose
Gal Galaktose
GalNAc N-Acetylgalaktosamin
Glc Glukose
GlcNAc N-Acetylglukosamin
Man Mannose
Neu Neuramin- oder Sialsäure
NeuNAc, NANA N-Acetylneuramin- oder N-Acetylsialsäure
Manα Mannose in α-Stellung verknüpft (gilt auch für andere Zucker) Manβ Mannose in β-Stellung verknüpft (gilt auch für andere Zucker) (1-4) zwei Monozucker sind über ihre Kohlenstoffatome C1 und C4
verknüpft, gilt auch für andere Zahlenkombinationen
Lektine
AAA Anguilla anguilla agglutinin ACA Amaranthus caudatus agglutinin Con A Concanavalin A agglutinin DSA Datura stramonium agglutinin ECA Erythrina cristagalli agglutinin GS I Griffonia simplicifolia agglutinin I Jacalin Artocarpus integrifolia agglutinin MAA II Maackia amurensis agglutinin II PNA Peanut agglutinin
RCA I Ricinus communis agglutinin I SNA Sambucus nigra agglutinin
Die Begriffe Spermium und Spermatozoon werden synonym verwendet, ebenso die Bezeichnungen Eizelle und Oozyte.
A Einleitung
Im Laufe der letzten Jahre haben die assistierenden und In-vitro-Produktionstechniken (IVP) im Bereich der Fortpflanzung immer mehr an Bedeutung gewonnen. Gerade die IVP humaner Blastozysten und der kommerzielle Transfer boviner mittels IVF (In-vitro-Fertilisation) erzeugten Blastoysten (BOUSQUET et al. 1999) werden schon routinemäßig angewendet.
Beim Schwein hingegen sind die Methoden auf Laborebene gut entwickelt (PRATHER u.
DAY 1998), aber zur Zeit nicht als praxisrelevant zu betrachten.
Als Ursachen der geringen Befruchtungsraten der IPV sind u.a. Polyspermie und übermäßiges Zona hardening zu nennen. Ein weiterer Aspekt ist die In-vitro-Reifung der Eizellen im Vorfeld der eigentlichen IVF. Die Oozyte wird als gereift angesprochen, wenn sie sich im überprüfbaren Kernstatus der Metaphase II befindet. Von der Kernreifung sind jedoch noch die zytoplasmatische Reifung und die Reifungsprozesse an der Zona pellucida abzugrenzen.
Die beiden zuletzt genannten Veränderungen sind schwerer zu erfassen, scheinen aber eine funktionelle Bedeutung zu besitzen. Um Ansatzpunkte für Verbesserungen der Fertilisationsraten der IPV zu erreichen, bietet sich eine genauere Untersuchung der die Oozyte umgebenden Zona pellucida (ZP) an.
Die erste Kontaktaufnahme zwischen Spermium und Eizelle, Bindung und Gametenerkennung finden an der ZP statt. Sie induziert die Akrosomreaktion der kapazitierten Spermien und ist am Polyspermieblock beteiligt. Die Polyspermie ist ein Problem der IVP, welches als insuffizienter Zonablock zwischen Spermium und Oozyte anzusehen ist (KOUBA et al. 2000). Weiterhin schützt die ZP die Eizelle und die Blastocyste vor äußeren Einflüssen.
Aufgrund der Bedeutung der ZP für die Befruchtung wurden Hemizonabindungsassays (BURKMAN et al. 1988) etabliert, um die Qualität und Eignung von Spermien für bestimmte Oozyten testen zu können.
Ein weiteres Forschungsgebiet ist die Entwicklung von immunologischen Kontrazeptiva (KIRKPATRICK et al. 1996), die gegen bestimmte Antigene der ZP gerichtet sind.
Die Bindung und Signalübertragung des Spermatozoons an die ZP wird über oberflächenassozierte Proteine der Spermien und die Zuckerseitenketten der ZP vermittelt.
Bei der Maus sind die Strukturen weitestgehend aufgeklärt, bei den höheren Säugetieren jedoch noch nicht. Die fehlende Schichtung in der räumlichen Struktur (TALBOT u. DI CARLANTONIO 1984) und die alleinige Synthese der ZP durch die Eizelle bei der murinen ZP (BLEIL u. WASSARMAN 1980b) stehen den Variationen in der morphologischen Architektur (VANROOSE et al. 2000) und der zusätzlichen Beteiligung von Granulosazellen (SINOWATZ et al. 2001) an der ZP Synthese bei höheren Säugern gegenüber. Dies spricht für auch genauso große Unterschiede in der Kohlenhydratstruktur und der dreidimensionalen Architektur der Zona pellucida.
Gerade das Schwein eignet sich gut als Modelltier für biochemische Analysen, da über das Schlachthofmaterial relativ große Mengen von Eizellen zur Verfügung stehen und homologe Gensequenzen (HARRIS et al. 1994) mit denen der ZP z.B. von Rind und Mensch nachgewiesen worden sind. Viele Strukturen wurden bereits über die Lektinhistochemie und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit anschließender Aminosäuren- und Zuckeranalyse untersucht.
Nur bei der Maus ist ebenfalls schon aufgeklärt, wie die drei Glykoproteine der ZP strukturell zu einander angeordnet (WASSARMAN u. MORTILLO 1991) und welches ihre einzelnen Aufgaben sind (WASSARMAN 1988). Bei den höheren Haussäugetieren und beim Menschen stehen genauere Erkenntnisse, beispielsweise welches ZP Protein nun für welche Bindung an das Spermium verantwortlich ist, noch aus.
In der vorliegenden Arbeit sollten nun mögliche Veränderungen der Zona pellucida während der In-vitro-Maturation näher untersucht werden. Um Veränderungen aufzeigen zu können, mussten zunächst Charakterisierungen der ZP ungereifter Oozyten vorgenommen werden.
Dazu wurden die Proteine durch eine zweidimensionale SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese nach isoelektrischen Punkt und relativen Molekulargewicht aufgetrennt.
Nach Transfer auf PVDF-Membranen erfolgte eine Analyse der Kohlenhydratstrukturen.
Diese wurde mit Lektinen durchgeführt, die an definierte Zuckerstrukturen binden. Mittels Antikörpern wurden die einzelnen Glykoproteine der ZP charakterisiert. Im Anschluss an die lektinologischen und immunologischen Untersuchungen der ZP Glykoproteine von ungereiften Eizellen sollten sich entsprechende Analysen von Glykoproteinen der ZP in vitro gereifter Eizellen anschließen. So ist es möglich, Umstrukturierungen bezüglich des isoelektrischen Verhaltens und/oder der Kohlenhydratstrukturen der ZP während der In-vitro- Reifung auf die Spur zu kommen.
Neben der biochemischen Untersuchung sollten auch Analysen zur Verteilung der exponierten Kohlenhydrate über die die Oberfläche der ZP angefertigt werden. Dies geschah mittels rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der ZP von intakten Eizellen, nachdem diese mit goldgekoppelten Lektinen und einer Silverenhancement-Technik behandelt worden waren.
Damit die funktionelle Bedeutung eventueller Veränderungen gezeigt werden kann, sollte zum Abschluss ein Spermatozoen-Zona pellucida-Bindungstest folgen. Als Untersuchungs- parameter wurde die Fähigkeit der Zona pellucida zur Induktion der Akrosomreaktion von kapazitierten Spermien gewählt. Ein diesbezüglicher Vergleich von ungereifter und gereifter ZP sollte nähere Erkenntnisse über die Modifikationen der Zona pellucida während der Reifung liefern.
Diese Untersuchungen sollten einen Beitrag leisten zur biochemischen, morphologischen und funktionellen Charakterisierung der ZP und ihrer Reifungsprozesse, um so ein besseres Verständnis der physiologischen Befruchtungsvorgänge und Ansätze zur weiteren Forschung zwecks Optimierung von Biotechniken zu ermöglichen.
B Literaturübersicht
1. Vorbemerkungen
Um eine erfolgreiche Befruchtung zu gewährleisten, müssen beide Gameten Entwicklungsprozesse und Aktivierungsstufen durchlaufen. Die Spermatozoen unterliegen nach ihrer Bildung im Hoden bestimmten Reifungsvorgängen und einer Versetzung in einen Ruhezustand der eigentlich schon befruchtungskompetenten Spermien durch das Nebenhodensekret und das Seminalplasma. Nach der Ejakulation werden sie im weiblichen Genitaltrakt durch Barrieren selektiert und durch Sequenzen von Aktivierungsstufen reaktiviert. Erst kapazitierte Spermien sind in der Lage, eine Eizelle zu befruchten.
Die Eizelle ihrerseits muss durch die Wiederaufnahme der Meiose nach Arretierung in der Prophase I im Sexualzyklus das fertile Stadium der Metaphase II erreichen. Neben dieser Kernreifung laufen auch Maturationsveränderungen an der Zona pellucida, den Zellorganellen und dem Zytoplasma ab (PRATHER u. DAY 1998). Diese sind sehr schwer zu definieren und noch nicht sehr weit erforscht.
Diese physiologischen Konditionierungen müssen nun entsprechend der jeweiligen künstlichen Manipulationen auf dem Weg zu einer befruchteten Eizelle berücksichtigt werden. Bei der künstlichen Insemination ist also ein Verdünnungsmedium und eventuelle Lagerungsbedingungen für das Ejakulat so zu wählen, dass die Spermien zwar ernährt werden, aber keine übermäßige Aktivierung mit Energieverlusten entsteht. Weiterhin ist es von Bedeutung, dass durch die Verdünnungsmedien keine größeren Veränderungen des weiblichen Genitalsekretes hervorgerufen werden, sei es durch Milieuveränderungen oder übermäßige Induktion von Entzündungsreaktionen auf Fremdantigene. Eine zentrale Rolle bei der Samenkonservierung spielt die Erhaltung der Membranintegrität. Bei größeren Schäden stirbt die Zelle ab, aber auch kleine Veränderungen können für die Kontaktaufnahme mit dem Eileiterepithel und der Eizelle erhebliche Einschränkungen mit sich bringen. Dies kommt gerade bei der Verwendung von Tiefgefriersperma zum Tragen. So wurden spezielle Einfriermedien und Programme entwickelt, um einen bestmöglichen Schutz der Plasmamembran zu gewährleisten. Bei aktuellen Forschungen zum Einsatz von
flowzytometrisch gesexten Spermien hat sich die Bedeutung der Zusammensetzung der Plasmamembran gezeigt, da durch Anlegen eines elektrischen Feldes die Membranstrukturen der Spermatozoen so verändert werden, dass eine Erkennung durch die Oozyte und die Auslösung erforderlicher Mechanismen zur Induktion des Zonablocks kaum noch stattfinden (RATH et al. 1999).
Der Einsatz von Frischsamen in der künstlichen Besamung ist inzwischen bei Warmblutpferden und Schweinen zur Routine geworden. Gleiches gilt für Tiefgefriersamen in der Rinderzucht.
Bei Befruchtung außerhalb des weiblichen Genitaltraktes, also in vitro, muss neben der Spermaaufbereitung noch die Vorbereitung der Eizelle berücksichtigt werden. Für den Kontakt mit den Spermien müssen die Oozyten gereift sein und sich im Metaphase II Kernstatus befinden. Dies ist zum einen durch eine Superovulation beim weiblichen Spender durch Hormoneinsatz und anschließender operativer Gewinnung von Eizellen aus sprungreifen Follikeln zu erzielen. Eine andere Möglichkeit ist, unreife Eizellen, sei es mittels invasiver Methoden oder einer Gewinnung nach der Schlachtung, in vitro zu reifen (In-vitro- Maturation, IVM).
Bei der In-vitro-Produktion (IVP) stehen nun verschiedene Verfahrensweisen zur Verfügung.
Für die In-vitro-Fertilisation (IVF) müssen die Spermien in künstlichen Medien kapzitiert werden und es folgt eine Koinkubation mit der gereiften Eizelle. Weiterhin gibt es mikroassistierte Fertilisationstechniken wie die Zona-Öffnung (Zona drilling), die subzonale Injektion (SUZI) von Spermien und die intrazytoplasmatische Injektion (ICSI) (CATT 1996).
Die Verfahren wurden an Labortieren erprobt, dann in der Humanmedizin zur Therapie bei andrologischer Sub- und Infertilität eingesetzt und anschließend auf die Haussäugetiere übertragen (IRITANI 1991). Bei den Nutztieren steht weniger eine therapeutische Absicht im Vordergrund, vielmehr spielen züchterische und genetische Einsatzmöglichkeiten, wie z.B.
die Anwendung von gesextem Sperma (RATH et al. 1996), eine Rolle. Auch für die Arterhaltung, wenn nur wenige Tiere mit schlechter Samenqualität zur Verfügung stehen, kommt ICSI zum Einsatz (z.B. Katzen: POPPE et al. 1997).
Für das Zona drilling und SUZI sind Grenzen gesetzt, weil für diese Verfahren die Spermienpopulation nur begrenzt Schädigungen aufweisen darf. Bevor die Spermien erfolgreich in Kontakt mit der Eizelle gebracht werden können, müssen sie erst kapazitiert
und akrosomreagiert vorliegen. Eine künstliche Auslösung dieser beiden Prozesse ist jedoch bei intakten Spermien möglich. Bei ICSI müssen die Spermien weder kapazitiert noch akrosomreagiert sein (PAYNE 1995), da durch die Injektion eines einzelnen Spermiums die natürliche Penetration umgangen wird und ein Signal an die Zona pellucida für den
Polyspermieblock nicht von Nöten ist. Der Erfolg von ICSI in der Humanmedizin zeigt sich daran, dass laut der Ergebnisse der Datenerhebung des Deutschen IVF-Registers 1996 die ICSI-Behandlungen (16.233) die Anzahl der IVF-Behandlungen (14.494) überschritten hatten (FELBERBAUM u. DAHNKE 1997).
Wie dieser Überblick zeigt, sind die Nachahmungen oder Umgehungen der physiologischen Reifungsvorgänge sowohl für Spermien als auch für Oocyten für die Fertilisation essentiell.
Es kann zwar durch sehr spezielle Techniken (ICSI) Kapazitation und Akrosomreaktion umgangen werden, jedoch eine gereifte Eizelle bleibt Grundvoraussetzung. Daher sind die Veränderungen der Eizelle während der IVM Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Die Zona pellucida, als erste Kontaktstelle zwischen Oocyte und Spermium, stellt dabei das Untersuchungsobjekt dar.
Im folgenden werden nun die angesprochenen Entwicklungsprozesse von Spermium und Oocyte näher erläutert. Es folgen detailliertere Angaben zur Zona pellucida.
2. Das Spermium
2.1. Aufbau und Entwicklung
Das Spermatozoon setzt sich aus Kopf, Hals und Schwanz, welcher in Mittel-, Haupt- und Endstück unterteilt wird, zusammen (SETCHEL 1982). Die Gesamtlänge des Spermiums beträgt 50 bis 70 µm. Der Spermienkopf wird fast vollständig vom Zellkern eingenommen, welcher das Erbmaterial in Form von hochgradig kondensiertem Chromatin enthält (MONESI 1976). Der Zellkern wird von einer inneren und äußeren Kernmembran umgeben, an die sich in den vorderen zwei Dritteln die Kopfkappe, das Akrosom, anschließt. Die akrosomale Matrix wird ebenfalls durch eine innere und äußere Membran begrenzt (EDDY u. O’BRIAN 1994). Das Akrosom entsteht aus Vesikeln des Golgikomplexes und enthält hydrolytische Enzyme u.a. Hyaluronidase, Neuraminidase und Akrosin, welche die Penetration der ZP ermöglichen (YANAGIMACHI 1994).
Im Spermienhals, ein bewegliches Gelenkstück zwischen Kopf und Schwanz, befinden sich das proximale Zentriol und der Rest des distalen. Das proximale Zentriol wird nach der Befruchtung für die erste Zellteilung benötigt, da der Eizelle ein eigenes Zentriol fehlt. Der Schwanz besitzt eine für Geißeln typisches Mikrotubulussystem mit einer 9+2 Fibrillenstruktur. Im Mittelstück wird in den Mitochondrien die Menge ATP produziert, die für die Beweglichkeit von Nöten ist, so dass Geschwindigkeiten bis 4 mm/min erreicht werden können (SAYONSKI u. SMOLLICH 1990).
Bei einem ausgereiften Spermium ist die Plasmamembran, welche das ganze Spermatozoon umhüllt, für die Kontaktaufnahme der Zelle mit ihrer Umwelt verantwortlich. Sie besteht aus einer Phospholipiddoppelschicht, in der verschiedene Proteine eingebaut sind. Die die Membran völlig durchziehenden Tunnelproteine bilden Poren und Kanäle. Des Weiteren existieren wasserunlösliche integrale Proteine, die nur in einer Lipidschicht eingelagert sind, und lösliche Proteine, die sich peripher an der Membranaußenfläche befinden (ALBERTS et al. 1990).
Während der Reifung im Nebenhoden, der Ejakulation, den Kapazitationsvorgängen und der Akrosomreaktion finden zahlreiche Umbauvorgänge an der Plasmamembran des Spermatozoons statt, die für die jeweiligen Funktionen eine Grundvoraussetzung darstellen
(TÖPFER-PETERSEN et al. 1996). An der Plasmamembran gibt es verschiedene Areale, die sich entsprechend ihrer Aufgabe spezifisch zusammensetzen (GADELLA et al. 1994). Das Apikalsegment der Kopfkappe ist an der Akrosomreaktion beteiligt, daher haben einige über der akrosomalen Region liegende Glykoproteine die Aufgabe, die Plasmamembran zu stabilisieren und so eine vorzeitige Akrosomreaktion zu verhindern.
Andere Proteine sind für die Interaktionen zwischen Spermium und Zona pellucida bzw.
Eizelle zuständig. So fusionieren während der Akrosomreaktion nur der apikale und periakrosomale Teil der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran. Im Gegensatz dazu leitet die Plasmamembran über dem Äquatorialsegment die Fusion des Spermiums mit der Zellmembran der Eizelle ein (DRIESCH et al. 1991). Mit der Plasmamembran des Schwanzes scheinen Moleküle in Verbindung zu stehen, die an der Bewegungsaktivität beteiligt sind. Eine verfrühte Hyperaktivierung könnte so durch die Absorption und Integration von bestimmten Glykoproteinen vermieden werden.
Die Reifung der diploiden Stammzellen im Hoden zu morphologisch ausdifferenzierten haploiden Spermatozoen bezeichnet man als Spermatogenese. Im Gegensatz zur Oogenese, die bereits in der Embryonalphase ihre Anfänge hat, beginnt die Spermatogenese erst mit der Geschlechtsreife und dauert beim Eber ca. 34 Tage (SCHNORR 1989).
Die Spermatogenese besteht aus drei Phasen:
1. die mitotischen Teilungen und Differenzierungen der diploiden Spermatogonien , 2. die meiotischen Reifeteilungen der tetraploiden Spermatozyten und
3. die Entwicklung der haploiden Spermatiden zu Spermatozoen (Spermiogenese).
Die wesentlichen Schritte der Spermiogenese, die weitreichende morphologische und funktionelle Umbauprozesse mit sich bringt, sind die Fusion der Golgi-Vesikel zur Akrosomvakuole und Bildung des Akrosoms, die Kondensation des Chromatins und die damit verbundene speziesspezifische Formung des Spermienkopfes und die Entwicklung der Geißel (WUTTKE 1990). Gegen Ende der Reifungsphase wird das überschüssige Zytoplasma abgeschnürt und von Sertolizellen im Hoden phagozytiert. Erst im Nebenhoden wird der kleine Teil, der als Zytoplasmatröpfchen in der Halsregion bestehen bleibt, abgebaut.
2.2. Epididymale Reifung und Einfluss des Seminalplasmas
Im männlichem Geschlechtstrakt schließt sich an die Spermatogenese im Hoden die posttestikuläre Spermienreifung bzw. –modifikation an, da die Spermien trotz abgeschlossener morphologischer Entwicklung noch nicht befruchtungsfähig sind. Die Spermien erlangen während ihrer Passage durch den Nebenhoden durch den Erwerb einer gerichtete Vorwärtsbeweglichkeit und der Fähigkeit, an die Zona pellucida zu binden, ihre Fertilität (KIRCHHOFF u. IVELL 1995). Dies dauert beim Säuger 10-15 Tage (HAFEZ 1987), wobei die Spermatozoen je nach Spezies ihre Befruchtungskompetenz in unterschiedlichen Nebenhodenabschnitten erreichen. Obwohl beim Eber die Spermien erst im Nebenhodenschwanz voll befruchtungsfähig werden, können sie bereits mit ihrem im Nebenhodenkopf erreichten Status in vitro eine Eizelle befruchten (COOPER 1996).
Die biochemischen Umbauprozesse der Spermienplasmamembran während der Nebenhodenreifung bestehen u.a. aus Lokalisationsänderungen einiger Membranproteine, Glykosylierung von Proteinen und Lipiden, sowie Maskierung, Entfernung und teilweiser Einlagerung von Peptidstrukturen aus Proteinen, die im Nebenhoden sezerniert werden (OVERSTREET 1983; DACHEUX et al. 1989). Im Nebenhoden wird auch Cholesterin synthetisiert, dass in die Plasmamembran des Spermiums eingebaut wird (SEKI et al. 1992) und so eine Membranstabilisierung bewirkt, die vor mechanischen Schädigungen schützt. Die negative Ladung der Spermienoberfläche wird durch den Einbau von Sialoglykoproteinen, Steroidsulfaten und Sulfoglycerolipiden verstärkt (TULSIANI 1993). Durch die erhöhte Abstoßung aufgrund gleichgerichteter Ladung wird die laterale Beweglichkeit der Makromoleküle in den Membranen reduziert und die Membran so stabilisiert. Durch den Kontakt mit dem Seminalplasma während der Ejakulation werden die Spermien durch bestimmte Inhaltsstoffe vor Schädigungen, Umwelteinflüssen und frühzeitiger Kapazitation geschützt (SHIVAIJI 1990).
Das Seminalplasma setzt sich beim Eber aus Sekreten der Samenblase, der Prostata und der Bulbourethraldrüse zusammen. Es besteht aus vielerlei Komponenten, u.a. die Peptidhormone LH, FSH und Prolaktin, Enzyme wie Glykosidasen, Glykosyltransferasen, Phosphatasen, den biogenen Amine Spermin und Carnitin, Proteaseinhibitoren, Monosaccharide (Fruktose und Glukose), sowie Östrogenen und Prostaglandinen (MANN u. LUTWACK-MANN 1981).
(TÖPFER-PETERSEN et al. 1994). Durch die erwähnten Inhaltsstoffe wird den prinzipiell befruchtungskompetenten Spermien ihre Befruchtungsfähigkeit vorläufig entzogen. Die Versetzung in diesen Ruhestatus verhindert Energieverluste, verfrühte Umbauprozesse und unspezifische Bindungen bis kurz vor Erreichen der Eizellen im weiblichen Eileiter und vergrößert die Chance auf eine erfolgreiche Befruchtung.
2.3. Spermienveränderungen im weiblichen Genitale
Mit Eintritt in den weiblichen Genitaltrakt nach der Ejakulation müssen die Spermien verschiedene Barrieren überwinden. Es existieren mechanische (Falten, Krypten, Cilien), physikochemische (Vaginalsekret, Zervixmucus) und immunologische Abwehrvorgänge als Selektionsstufen (HUNTER 1988). Bei den Scheidenbesamern (z.B. Rind, Kaninchen, Affe und Mensch) gilt als erste Hürde der Gebärmuttermund mit dem Zervixschleim, welche die Spermien überwinden, in dem sie durch Micellenkomplexe des Zervikalmucus in die Krypten der Schleimhaut geleitet werden. Dort entsteht so ein erstes Spermienreservoir. Das Schwein zählt zu den Arten (wie Pferd und Hund) mit uteriner Samenportionierung, bei denen die Passage durch die uterotubale Verbindung die erste Barriere darstellt. Die Schleimhautfalten in diesem Bereich, welche während des Östrus ödematisieren, verhindern den Eintritt von Seminalplasma und Uterusekret in den Eileiter und reduzieren den Anteil der Spermien, der bis in den Isthmus des Eileiters vordringt (HUNTER 1995). Der caudale Teil des Isthmus stellt für beide angesprochenen Besamungstypen ein funktionelles Spermienreservoir dar, in dem in einem bestimmten Zeitfenster die Vitalität der Spermien geschützt wird. An Spermatozoen, die sich im Lumen befinden, laufen die Alterungsprozesse in beschleunigter Form ab.
Wichtig für das Überleben und die Kapazitation der Spermien ist eine Bindung zwischen dem apikalen Teil des Spermienkopfes und dem Eileiterepithel (SUAREZ et al. 1991). Dieser Kontakt wird wahrscheinlich durch Kohlenhydrate des Oviduktepithels und kohlenhydratbindenden Proteinen des Spermatozoons, entsprechend einer Lektin-Zucker- Bindung, hergestellt (SUAREZ 1998). Die Tatsache, dass Kohlenhydrate diese Bindung hemmen können (WAGNER et al. 2002), spricht für einen solch vermittelten Kontakt. Es ist
von großer Bedeutung, dass die Spermien in dem präovulatorischen Zeitraum nicht weiter den Eileiter hinauf wandern, da sie sonst die ovulierte Eizelle nicht mehr befruchten können (HUNTER 1995).
Für eine erfolgreiche Befruchtung müssen die Spermatozoon ihre Befruchtungsfähigkeit wieder erlangen, in dem sie verschiedene Kapazitationsprozesse durchlaufen. Ein Spermium gilt als kapazitiert, wenn bei seinem intakten Akrosom durch die Zona pellucida, die Akrosomreaktion induziert werden kann (KOPF u. GERTON 1991). Die ersten Schritte der Kapazitation bestehen aus der Entfernung der oberflächenassozierten Inhaltsstoffe aus dem Seminalplasma von den Spermien. Dies geschieht je nach Samendeponierung in der Zervix oder erst im Bereich der uterotubalen Verbindung (YANAGIMACHI 1994). Der Anteil der Spermien, der eine Bindung mit dem Eileiterepithel im Bereich des caudalen Isthmus eingehen kann, durchläuft weitere Schritte der Kapazitation. Kapazitierte Spermien weisen eine reduzierte Bindungsfähigkeit zum Oviduktepithel auf (FAZELI et al. 1999) und kennzeichnen sich durch sichtbare hyperaktive Geißelbewegungen, mit denen sie aktiv zum Ort der Befruchtung, der Ampulla, gelangen (SMITH 1998).
Die biochemischen Veränderungen von Membrankomponenten und intrazellulären Ionenkonzentrationen (BEDFORD u. HOYKINS 1990), die Hyperaktivität und Ablösung von dem Oviduktepithel zur Folge haben, sind von einer sehr komplexen Natur. Im wesentlichen werden die durch die Komponenten des Nebenhodensekretes und des Seminalplasmas hervorgerufenen Veränderungen rückgängig gemacht. Hydrolasen des weiblichen Genitalsekretes bewirken eine Entfernung von Sialsäuren und Sulfatresten aus der Spermienplasmamembran, so dass die negative Oberflächenladung wieder abnimmt (LANGLAIS et al. 1981). Durch diese Vorgänge und die Entfernung von Cholesterin aus der Plasmamembran wird diese durchlässiger und es kommt zu einem zweiphasigen Kalziumeinstrom. Der zweite, stärkere Influx ist für die Auslösung der Akrosomreaktion verantwortlich (FRASER 1995) und der erste scheint mit der Kapazitation verbunden zu sein.
So bewirkt die Aktivierung einer Ca2+-abhängigen Adenylatzyklase über weitere Enzymaktivierungskaskaden Tyrosinphosphorylierung. Dies konnte an einer Reihe von Proteinen des Spermatozoons bei der Maus (VISCONTI et al. 1997), beim Eber und Bullen (TÖPFER-PETERSEN et al. 1996) nachgewiesen werden. Weitere Forschungsergebnisse zur genaueren Bedeutung stehen noch aus.
3. Die Oocyte
3.1. Entwicklung und Aufbau
Die Entwicklung der Eizellen beginnt schon im weiblichen Fetus mit der Einwanderung der Urkeimzellen in die Gonadenanlagen und anschließender Differenzierung über Primordialkeimzellen zu Oogonien. Diese vermehren sich mitotisch und werden mit dem Eintritt in die Prophase der ersten meiotischen Reifeteilung als primäre Oozyten bezeichnet.
Es folgt nach Rekombination homologer Chromosome (LEIBFRIED-RUTLEDGE et al.
1989) eine Arretierung der Eizellen in der Prophase I (Diplotän). Dieser Block wird unter In- vivo-Bedingungen mit dem Eintritt in die Geschlechtsreife durch den präovulatorischen Gonadotropinimpuls wieder aufgehoben (BUCCIONE et al 1990) und die Meiose fortgesetzt (sekundäre Oozyte). Allerdings nur wenige der arretierten Oozyten gelangen wirklich zur Ovulation, viele verfallen einer Atresie. Während der beschriebenen meiotischen Pause ruht aber nicht die ganze Entwicklung der Oozyte. Es finden vielmehr hohe Syntheseleistungen und eine 200fache Vergrößerung ihres Volumens statt (MOOR et al. 1990). Erst durch diese Wachstumsphase erhält die Oozyte die Fähigkeit, die Meiose wieder aufzunehmen.
Die ablaufenden Prozesse zwischen Wiederaufnahme und erneuter Arretierung im Kernstadium der Metaphase II ist die eigentliche Eizellreifung, auch Maturation genannt. Der Abschluss der zweiten Reifeteilung erfolgt erst nach der Aktivierung durch das Spermium oder einem entsprechenden Stimulus.
In dem Zeitraum bis zur Aktivierung im Geschlechtszyklus bilden die primären Oozyten mit dem sie einschichtig und flach umgebenden Follikelepithel die Primordialfollikel. Mit der Aktivierung wird er als Primärfollikel bezeichnet. Es folgt eine mitotische Proliferation des umgebenden Follikelepithels mit der Folge, dass dieses mehrschichtig wird (Sekundärfollikel). Die Follikelzellen, welche die Eizelle unmittelbar umgeben, produzieren Fortsätze und an der Oberfläche der Eizelle entwickeln sich Mikrovilli. Zwischen der Oozyte und den Follikelzellen beginnt die Bildung der Zona pellucida. Der Follikel wird zum Tertiärfollikel, wenn die Follikelzellen beginnen, Flüssigkeit (Liquor follikuli) in den Interzellularraum auszuscheiden. Dadurch wird die Eizelle an den Rand des Follikels
gedrängt und der Cumulus oophoros entsteht. Die innerste Schicht, die Corona radiata, entsendet durch die Zona pellucida Zellfortsätze in das Ooplasma (ALBERTINI u. RIDER 1994). Die Kumuluszelllen sind sowohl unter einander als auch mit den wandständigen Granulosazellen über Gap junctions verbunden. So wird ein Austausch von Metaboliten und Signalen von der Follikelperipherie bis in das Innerste der Eizelle gewährleistet (MOTTA et al. 1994).
Abb. 1: Tertiärfollikel mit Eizelle, Follikelhöhle und Theca follicularis Färbung Hämatoxylin-Eosin, 120fache Vergrößerung (nach LIEBICH 1993)
Corona radiata Ooplasma
Follikelhöhle Kern
Zona pellucida
Theca follicularis externa
Theca follicularis interna
Follikelhöhle Follikelepithelzellen
Corona radiata
Cumulus oophorus
3.2. Maturation der Oozyte in vivo
Die Maturation der Oozyte ist in Kernreifung, zytoplasmatische Reifung und strukturelle Veränderungen untergliedert. Noch im Fetus tritt die DNA der Oozyte in die Prophase I ein und wird nach Durchlaufen der Stadien Leptotän, Zygotän und Pachytän im Diplotän arretiert.
Dieser Ruhestatus wird als Diktyotän bezeichnet und wird bis zur Induktion der Reifung beibehalten (LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. 1989). Während der Wachstumsphase vergrößert sich der Nukleus so, dass er als Keimbläschen bzw. Germinalvesikel (GV) bezeichnet wird. Als Germinalvesikle Breakdown (GVBD) wird von MOTLIK und FULKA (1976) der gesamte Kernreifungsprozess von der Auslösung der Reifung bis zum Beginn der Metaphase I bezeichnet und sie unterteilten den Vorgang in sechs Stadien, die lichtmikroskopisch zu unterscheiden sind:
GV I:
Der Zellkern und der Nukleolus sind deutlich zu erkennen. Das Chromatin ist ring- oder hufeisenförmig um das Kernkörperchen verdichtet.
GV II:
Zellkern und Nukleolus sind erhalten und im Bereich der Kernmembran sind einige orcein- positive Strukturen, Chromozentren, nachzuweisen.
GV III:
Nukleolus und Zellkern sind noch intakt und das Chromatin liegt in einzelnen Clustern oder fädigen Strukturen vor.
GV IV:
Der Nukleolus ist bei einem erhaltenen Zellkern nicht mehr zu erkennen. Das Chromatin stellt sich in der Orceinfärbung als irreguläres Netzwerk oder einzelne Bivalente dar.
Frühe Diakinese:
Die Membran des Zellkerns ist nicht mehr zu sehen. In der Region des ehemaligen Zellkerns befinden sich nun die Bivalente.
Späte Diakinese:
Die Chromosomen sind kondensiert und als individuelle Teile darstellbar.
Nach dem GVBD schließen sich die Stadien Metaphase I, Anaphase I, Telophase I und die Metaphase II an, in der es zu einem erneuten Block kommt.
Metaphase I:
Der Zellkern existiert nicht mehr und die Chromosomen sind bei maximaler Kondensation in einem Cluster angeordnet.
Anaphase I:
Die Chromosomen befinden sich in der Äquatorialebene und eine Spindel ist zu erkennen.
Telophase I:
Die meiotische Spindel ist nun deutlich zu sehen und Chromosomen weichen in zwei Gruppen auseinander.
Metaphase II:
Die Chromosomen sind auf zwei Cluster verteilt und ein Polkörper ist zu finden.
Die zytoplasmatische Reifung ist von der Kernreifung abzugrenzen, beide Prozesse treten jedoch in Wechselwirkung (EPPIG 1996). Eine befriedigende Befruchtungs- und embryonale Entwicklungskompetenz wird keines Falls nur durch eine erfolgreich abgelaufene Kernreifung garantiert (LAURINCIK et al. 1994). So konnte CRAN 1985 nachweisen, dass in vivo gereifte porcine Eizellen eine Umstrukturierung der Zellorganellen aufzeigen. Die Mitochondrien beispielsweise verteilen sich aus ihrer Gruppierung am Rande der Eizelle gleichmäßig im gesamten Ooplasma. Die kortikale Granula verdoppelt sich in ihrer Menge und ordnet sich in einem ca. 4 µm breiten Bereich unterhalb der Plasmamembran an. Die Verfügbarkeit der Granula in dieser Lokalisation korreliert mit dem Vermögen der Eizelle zum Polyspermieblock (DUCIBELLA 1996).
4. Gameteninteraktion
Die ersten Schritte der Gameteninteraktionen finden zwischen Spermium und Zona pellucida statt. Es werden folgende Stufen der Annäherung des Spermatozoons an die Eizelle unterschieden (WASSARMAN 1990):
1. Attachement: lockere, nicht speziesspezifische Kontaktaufnahme des Spermiums mit der ZP
2. primäre Bindung: Bindung von akrosomintakten, kapazitierten Spermien an die ZP 3. sekundäre Bindung: Bindung von akrosomreagierten Spermien an die ZP
4. Penetration: akrosomreagierte Spermien wandern durch die ZP.
Diese Prozesse werden über Protein-Kohlenhydrat-Erkennungsmechanismen vermittelt (MILLER u. AX 1990). Oberflächenassozierte Spermienproteine binden speziesspezifisch an Kohlenhydrate der Zona pellucida und als Folge wird die Akrosomreaktion induziert (MEIZEL 1985).
Akrosomreaktion:
Als Akrosomreaktion wird der exocytische Prozess beschrieben, durch den der akrosomale Inhalt mit seinen lytischen Enzymen (u.a. Akrosin) freigesetzt wird. Dies geschieht durch die Verschmelzung der äußeren akrosomalen Membran mit der darüber liegenden Plasmamembran (siehe Abb. 2). Für die Befruchtung ist dieser Vorgang essentiell, da erst eine partielle Hydrolyse der ZP dem Spermium die Penetration ermöglicht. Unterschiedliche Signalübertragungssysteme werden kaskadenartig aktiviert und als Hauptresultat entsteht ein massiver Kalziuminflux in das Zellinnere der Spermien (FRASER 1993). Durch die Bindung von Kalzium an Calmodulin erfolgen Phosphorylierungen verschiedener Membranproteine.
Abb. 2: Schematischer Ablauf der Akrosomreaktion beim Säugetier
(nach YANAGIMACHI 1994), AM: akrosomale Membran; PM: Plasmamembran
Mit der In-vitro-Induktion der Akrosomreaktion kann ein funktioneller Teilaspekt von Spermienpopulationen untersucht werden; sind die Spermien kapazitiert und sind sie in der Lage, auf den entsprechenden Reiz mit der Akrosomreaktion zu reagieren. Die Induktion der Akrosomreaktion ist möglich mit Lyso-Phosphatidylcholin (LPC) und Glukosaminoglykanen z.B. Heparin, Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat (KOPF u. GERTON 1991; VARNER et al. 1993).
Die anschließende sekundäre Bindung ist für die Verbindung der akrosomreagierten Spermien mit der ZP-Matrix verantwortlich. Sowohl durch die bei der Akrosomreaktion freigesetzten Enzyme als auch durch den eigenen motorischen Antrieb penetriert das Spermium die Zona pellucida. Das Spermium lagert sich nun tangential mit der ganzen Fläche seines Kopfes an die Plasmamembran der Eizelle an. Im seitlichen Bereich des Spermatozoons sind viele Proteine lokalisiert, die an der Fusion der Spermienmembran mit den Mikrovilli der Eizellmembran beteiligt sind. Nach der Verschmelzung der Plasmamembranen wird erst der Spermienkopf und dann das ganze Spermium in die Eizelle aufgenommen. Dabei entsteht der sogenannte Empfängnishügel (impregnation cone), da sich die Eizelle für die phagozytoseähnliche Inkorporation des Spermiums vorwölbt.
Im Gegensatz zur Bindung an die ZP ist die Fusion von Eizelle und Spermatozoon nicht speziesselektiv. Dieser Umstand wurde bei der Entwicklung von heterologen IVF-Tests genutzt. So kann die Fertilität von humanen Spermien mit Hamsteroocyten überprüft werden (ROGERS 1988), welches von großem Vorteil ist, da die Bereitstellung von humanen Eizellen aus ethischer Sicht sehr problematisch ist.
Nach Eintritt des Spermiums in die Eizelle wird diese aktiviert, die Meiose vollendet und die kortikale Reaktion ausgelöst. Dabei werden die proteolytischen Enzyme der kortikalen Granula von der Eizelle in den perivitellinen Spaltraum abgegeben. Die Enzyme sind nun in der Lage, die Zellmembranproteine der Oocyte so zu verändern, dass diese nicht mehr von den Spermien erkannt werden können. Weiterhin bewirken diese Enzyme eine partielle Proteolyse der ZP Glykoproteine, so dass dort kein weiteres Erkennen, Binden und Vordringen von Spermien möglich ist. Diese Reaktion wird als Zona-Reaktion angesprochen.
Eine weitere Umstrukturierung der Eizellmembran für die Verhinderung der Polyspermie erfolgt durch eine Depolarisationswelle, die unmittelbar nach der Verschmelzung der Gameten über die Plasmamembran der Oocyte hinweg läuft.
5. Die Zona pellucida
Die Zona pellucida (Glashaut) ist eine extrazelluläre Matrix, welche die Oocyte gelartig umgibt. Sie bildet sich in ihrer Struktur während der Follikulogenese aus und bleibt auch noch nach der Befruchtung der Eizelle eine gewisse Zeit zum Schutz der entstandenen Blastozyste bestehen. Die weiteren Aufgaben bestehen aus der speziesspezifischen Bindung von kapazitierten Spermien und nachfolgender Induktion der Akrosomreaktion mit anschließender Penetration des Spermiums durch die ZP. Weiterhin trägt die ZP durch ihre im Anschluss an die Befruchtung entstehenden Modifikationen zum Polyspermieblock mit bei (DUNBAR u.
WOLGEMUTH 1984).
5.1. Aufbau und Entwicklung
Die azelluläre ZP zeigt in ihrer Dicke größere Unterschiede im Vergleich von niederen und höher entwickelten Tieren. So beträgt ihre durchschnittliche Breite bei der Maus 5 µm, 13-16 µm bei Mensch und Schwein (DUNBAR u. WOLGEMUTH 1984; DUNBAR et al. 1991) und beim Rind 27µm (DUNBAR et al. 1994). Die Schweineeizelle besitzt mit der ZP einen Durchmesser von ca. 100 bis 150 µm und ist annähernd rund. Der Proteingehalt beträgt je nach Reifungszustand 15-30 ng/ZP (TÖFER-PETERSEN, persönliche Mitteilung). Die Proteine sind durch nicht-kovalente Bindungen in einem feinverküpften Netzwerk angeordnet (WASSARMAN 1988). Mittels Elektronenmikroskopie ist zu erkennen, dass die ZP eine zweischichtige Struktur aufweist. Die äußere Schicht besitzt größere Löcher, gleich einem Schweizer Käse, und der innere Bereich ist von amorpher Struktur. An Hand von Untersuchungen der bovinen ZP konnte gezeigt werden, dass nach der Befruchtung der Oozyte die ZP dünner wird und die Lochstrukturen verschwinden (SUZUKI et al 1994).
Die ZP der Säugetiere besteht aus drei Glykoproteinen, die posttranslationalen Umbauprozessen wie Glykosylierung und Sulfatierung unterliegen, so dass eine gewisse Heterogenität entsteht (WASSARMAN, 1988).
Die Nomenklatur der ZP-Glykoproteine ist teilweise recht missverständlich. Die Maus war die erste untersuchte Spezies, bei der die einzelnen Proteine mittels Gelelektrophorese isoliert werden konnten. Die drei erhaltenen Proteine wurden einfach nach absteigendem Molekulargewicht mit ZP1 (200 kDa), ZP2 (120 kDa) und ZP3 (83 kDa) bezeichnet (BLEIL u. WASSARMAN 1980a). Bei den ersten biochemischen Analysen der porcinen ZP konnten unter reduzierenden Konditionen bei der Elektrophorese (PAGE) vier Komponenten mit einem Molekulargewicht von 90, 65, 55, 25 kDa isoliert werden. Werden allerdings nicht reduzierende Bedingungen gewählt, so erscheinen nur eine 90 und eine 55 kDa Bande (HEDRIK u. WARDRIP 1980; SACCO et al. 1981).
In weiteren Untersuchungen von HEDRICK und WARDRIP konnte 1987 gezeigt werden, dass sich das porcine ZP1 (pZP1), die 90 kDa Bande der nicht reduzierenden PAGE, unter Reduktion durch Spaltung von Disulfidbrücken in die 65 kDa und 25 kDa Komponenten der reduzierenden PAGE auftrennt. Durch eine isoelektrische Fokussierung konnten HEDRICK und WARDRIP (1980) den Proteinanteil, welcher der breiten 55 kDa Bande der nicht
auftrennen. Später konnte nachgewiesen werden, dass es sich dabei nicht um zwei Proteinketten, sondern um zwei verschiedene Proteine handelt (TÖPFER-PETERSEN et al.
1993). Eine einheitliche speziesübergreifende Nomenklatur wurde durch die Identifizierung der kodierenden Gene für die einzelnen Glykoproteine ermöglicht (HARRIS et al. 1994). Die Bezeichnungen der ZPA-, ZPB- und ZPC-Genfamilien wurden etabliert. Die Einstufung wurde nach der Anzahl der Basenpaare vorgenommen, und zwar stellt dabei ZPA das größte und ZPC das kleinste Gen dar.
Tab. 1: Nomenklatur der Proteine der Zona pellucida
ZPA ZPB ZPC
Maus mZP2 mZP1 mZP3
Mensch hZP2 hZP1 hZP3
Schwein pZP1 (pZP2) pZP3α (pZP1) pZP3β (pZP3)
Bei jeder der drei Proteinfamilien konnte gezeigt werden, dass zu 50-98 % Homologien auf der Ebene der Nukleinsäure bestehen (EPIFANO u. DEAN 1994, MCLESKEY et al. 1998).
Die strukturelle Bedeutung der einzelnen Glykoproteine ist bisher nur bei der Maus geklärt.
Nach WASSARMAN und MORTILLO (1991) sind dort jeweils ZPA und ZPC zu Heterodimeren zusammengelagert. Diese Einheiten bilden lange Filamente, welche durch das ZPB an diversen Stellen verbunden werden.
Die ZP ist während der Follikulogenese ab dem Stadium des Sekundärfollikels zwischen Oolemn und den Granulosazellen nachweisbar (LEE u. DUNBAR 1993). Über den Syntheseort der ZP bestanden kontroverse Meinungen. Kern der Auseinandersetzungen war die Beteiligung der Granulosazellen neben der Oozyte und bei welcher Tierart welche Systeme vorherrschen. Bei der Maus wurde nachgewiesen, dass die ZP nur in der Eizelle selbst synthetisiert wird (WASSARMAN u. KINLOCH 1992; EPIFANO et al. 1995). Bei anderen Arten (Kaninchen, Schwein, Rind, Marmoseten und Mensch) konnte mRNA
und/oder Protein der ZP in den Granulosazellen nachgewiesen werden. GROOTENHUIS et al. (1996) konnte mittels Antikörpern gegen ZPC ZP Proteine in Granulosazellen markieren.
Mittels in situ Hybridisierung konnten KÖLLE et al. (1996 u. 1998) pZPB und bZPC in einer Entwicklungsstufenabhängigkeit in den Granulosazellen von Sekundärfollikeln nachweisen.
Dabei ist die bovine Oocyte während der gesamten Follikologenese in die ZP Synthese involviert, wenn auch bei den Tertiärfollikeln am meisten ZPC im Zytoplasma der Corona radiata Zellen nachgewiesen werden konnte.
Beim Schwein hingegen wird im Stadium des Tertiärfollikels die ZP nicht mehr von der Eizelle selbst synthetisiert. ZP bzw. die entsprechenden Transskripte konnten dann nur noch in den Granulosazellen detektiert werden. Untersuchungen an fetalen Ovarien haben gezeigt, dass Zona pellucida Proteine schon während der pränatalen Entwicklung von Follikelzellen synthetisiert werden. In bovinen Feten konnte ZPC bei Primordial- und Primärfollikeln in der Eizelle selbst und bei Sekundär- und Tertiärfollikeln zusätzlich noch in den Follikelzellen nachgewiesen werden (TOTZAUER et al. 1998).
5.2. Oligosacchridstrukturen der ZP
Der wichtigste Informationsträger der Zellen ist die Desoxyribonukleinsäure (DNA). Die Erbinformationen werden durch ihre Nukloetidsequenz kodiert, abgelesen, in Proteine übersetzt und durch diese werden dann die folgenden biologischen Prozesse induziert.
Eine weitere Struktur, die als Informationsträger fungiert und immer mehr in das Interesse verschiedener Forschungen rückt, sind die Kohlenhydrate (GABIUS et al. 1988; HURTLEY et al. 2001). Die Zuckerketten sind an Proteine und Lipide gebunden, so dass Glykokonjugate (Glykoproteine, Glykolipide, Proteoglykane) entstehen. Die Bildung der Polypeptidketten der Proteine wird genetisch durch den DNA-Code terminiert. Die Glykosylierung wird jedoch durch ein hochspezifisches Enzymsystem, es existiert für jeden Zucker und jede Verknüpfungsmöglichkeit ein spezielles Enzym, gesteuert und unterliegt so nur indirekt einer genetischen Kontrolle.
Zwischen den Kohlenhydraten gibt es viel mehr Verbindungsformen und –möglichkeiten als zwischen Aminosäuren und somit auch ein größeres Potential zur Übertragung von Informationen. Werden zwei Aminosäuren verknüpft, so gibt es nur eine Möglichkeit. Bei zwei Zuckern hingegen können aufgrund der vielfältigen möglichen Bindungsformen, α- oder β-Verknüpfung und verschiedene Konformationsmöglichkeiten (Wannen- oder Sesselform), bis zu 16 isoforme Strukturen entstehen (KOBATA 1992). Weiterhin bestehen zwei Möglichkeiten, die Zuckerkette an ein Proteingerüst zu binden. Bei der O-Glykosylierung werden die Kohlenhydrate an die OH-Gruppen der Aminosäuren Serin oder Threonin und sehr selten auch an Hydroxylysin geheftet. Die zweite Form der Anheftung ist die N- Glykosylierung über die Aminogruppe (NH2) der Aminosäure Asparagin. Nicht jedes Asparagin ist jedoch eine potentielle Glykosylierungsstelle, vielmehr sind sogenannte Signalsequenzen von Nöten. Die Signalsequenz besteht aus einer Asparagin-X-Serin oder Asparagin-X-Threonin Abfolge, in der X für jede Aminosäure exklusive Prolin steht.
Die Informationen, welche die Glykokonjugate festlegen, können durch geeignete Rezeptoren abgelesen werden (GABIUS u. GABIUS 1992). In den Zellmembranen kommen Glykoproteine vor, deren Zuckerketten weit in den interstiellen Raum hinausragen, und sind somit hervorragend für die interzelluläre Kommunikation geeignet. Sie agieren als Oberflächenrezeptoren und übertragen die extrazellulären Signale in das Zellinnere.
Lektine
Lektine sind Glykoproteine, die zunächst aus Pflanzen, in letzter Zeit aber auch aus tierischen Organismen, isoliert wurden, und gehören zur Klasse der zuckerbindenden Proteine. Sie zeichnen sich durch ihr substratspezifisches Verhalten gegenüber Kohlenhydraten (SCHUMACHER et al. 1990)und durch das Fehlen einer enzymatischen Aktivität aus und weisen auch keine Homologien zu Antikörpern auf (GABIUS u. GABIUS 1992).
Die ersten Berichte über Lektine erschienen schon 1888 von STILLMARK. Er fand heraus, dass der giftige Inhaltsstoff Ricin des Wunderbaumes Erythrozyten agglutiniert. Seitdem sind viele Arbeiten mit und über Lektine entstanden. Paul Ehrlich beispielsweise benutzte die Lektine um die Jahrhundertwende bei seinen Immunisierungsversuchen. Bei diesen Forschungen war die Zuckerspezifität eher nebensächlich, da toxische Lektine hier als hochwirksame Antigene zur Produktion von Antikörpern eingesetzt wurden. Die Fähigkeit
zur Hämagglutination rückte erst später wieder in den Blickpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Lektine können z.B. die einzelnen menschlichen Blutgruppen unterscheiden, in dem sie die unterschiedlichen Blutgruppenantigene anhand einzelner endständiger Zuckerreste erkennen (GABIUS et al. 1988). Das „auswählende“ Verhalten der Lektine veranlasste BOYD u. SHAPLEIGH 1954, ihnen den Namen Lektine zu geben (nach lateinisch legere → auswählen).
Die Bindungsfähigkeit der Lektine wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst. Sie ist abhängig von der Tertiärstruktur des Rezeptors, der Lage der umliegenden Zuckerstrukturen sowie von den Liganden des C3- und C4-Atoms des zu bindenden Zuckermoleküls. Lektine weisen zwei oder bis zu 18 Zuckerbindungsstellen pro Molekül auf, wobei die Bindungsaktivität durch das Vorhandensein von Schwermetallionen und dem pH-Wert beeinflusst wird (LEATHEM 1986).
Neben der weitverbreiteten Anwendung von Lektinen in der Histologie und Biochemie kommen die Lektine auch in der diagnostischen Medizin zur Anwendung. Zu erwähnen sind die Diagnosen von entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn, Colitis ulcrosa) und verschiedener Speicherkrankheiten. Weiterhin werden Lektine zur Identifizierung von speziellen Zellpopulationen und zur Erkennung von metastasierenden Mammakarzinomen verwendet (SCHUMACHER et al. 1990).
Zur Analyse der Kohlenhydratstrukturen der Zona pellucida wurden zunächst Lektine eingesetzt, da sie wie beschrieben mit hoher Spezifität ähnlich einem Schlüssel-Schloss- Prinzip an bestimmte Zuckerstrukturen binden. Verschiedene Autoren haben die ZP von unterschiedlichen Spezies mit Hilfe von Lektinen untersucht (AVILES et al. 1994;
MAYMON et al. 1994). So konnte mittels Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass die ZP in Schichten organisiert ist, in denen definierte Zuckerstrukturen eine bestimmte räumliche Verteilung aufweisen (SHALGI et al. 1991). In der murinen ZP befinden sich die GalNAc-β(1-4)-Gal-Strukturen vorwiegend in der inneren Region (AVILES et al. 1999).
Eine umfangreiche Studie an verschiedenen Arten wurde 1994 von SKUTELSKY et al.
durchgeführt. Die Lektinbindungsmuster weisen eine speziesbezogene Spezifität auf. Bei den Nagetieren konnten in strukturellen Untersuchungen mit Lektinen nur α-Galaktose und/oder β-N-Acetylgalaktosamin nachgewiesen werden. Bei der ZP von humanen, caninen, felinen
und porcinen Eizellen markierten die entsprechenden Lektine keine Zuckerstrukturen.
Allgemein ist zu sagen, dass die Unterschiedlichkeit der Lektinbindungsmuster mit wachsender phylogenetischer Distanz sich ebenfalls vergrößert (SHALGI u. RAZ 1997).
Neben diesen Unterschieden bestehen aber auch Gemeinsamkeiten. Bestimmte Zuckerreste, wie Mannose und N-Acetylglukosamine, sind bei allen untersuchten Spezies nachzuweisen, und zwar meistens in der Core-Region von N-glykosidisch gebundenen Kohlenhydraten (GEYER u. GEYER 1998).
Neben der Lektinologie wurden in den letzten Jahren die Kohlenhydrate der ZP mit Hilfe neuer Analysemöglichkeiten direkt untersucht. Die Zusammensetzung der Oligosaccharide der porcinen ZP (NOGUCHI u. NAKANO 1992; HOKKE et al. 1994; NAKANO u.
YONEZAWA 2001), der murinen ZPA und ZPC Proteine (NOGUCHI u. NAKANO 1993;
NAGDAS et. al. 1994) sowie der unfraktionierten bovinen ZP (KATSUMA et al. 1996) sind bereits veröffentlicht worden.
Soweit untersucht, besitzen alle ZP Glykoproteine sowohl N-glykosidisch als auch O- glykosidisch gebundene Seitenketten. N-glykosidisch verknüpfte Zuckerketten weisen im Allgemeinen eine höhere Komplexität und mehr Verzweigungen als O-glykosidisch verknüpfte Zuckerketten auf. Es werden mannosereiche (High-Mannose) Zuckerketten von komplexen unterschieden und die Mischformen als Hybridtyp bezeichnet. Diese Ketten kommen in di-, tri- und tetraantennärer Form vor.
Das ZPA des Schweins weist sechs potentielle N-Glykosylierungsstellen auf, die Anzahl der O-Glykosylierungen ist hingegen nicht bekannt. ZPB und ZPC besitzen jeweils drei N- glykosidisch verknüpfte und drei bzw. bei ZPC sechs O-glykosidisch verknüpfte Zuckerketten (YUREWICZ et al. 1991).
Die N-gebundenen Glykane der ZP bei Schwein, Rind und Maus besitzen die gleiche Grundstruktur. Sie gehören zum fukosylierten Komplex-Typ und sind verlängert mit unverzweigten N-Acetyllaktosamineinheiten. Bei sauren Glykanen sitzen am nicht reduzierten Ende Sialsäure- und/oder Sulfatreste an der C-6 Position der N- Acetylglukosamine der sich wiederholenden Laktosamineinheiten. Zusätzlich wurden beim Schwein auch Sulfatreste bei sich nicht wiederholenden Einheiten und an der C-3 Position der N-Acetylglukosaminreste am reduzierten Ende gefunden (MORI et al. 1998).
Das Verhältnis der di-, tri- und tetraantennären Ketten und der Grad der Sulfatierung und Sialylierung ist bei den einzelnen Arten zum Teil recht unterschiedlich. Die Glykoproteine der ZP von Maus und Rind bestehen aus sauren tri- und tetraantennären Ketten, die hauptsächlich Sialylreste tragen und nur wenig sulfatiert sind. Die Acidität der N-gebundenen sauren Zuckerketten beim Schwein hingegen wird vornehmlich durch das Vorhandensein von Sulfatresten hervorgerufen.
Die Struktur der neutralen N-Glykane gestaltet sich bei den angesprochenen Arten in unterschiedlicher Weise. Die Hauptstruktur der N-glykosidisch gebundenen neutralen Oligosaccharide bei der ZP des Rindes ist der High-Mannose-Typ, während beim Schwein unter den N-Glykanen die diantennären fukosylierten Glykane mit N-Acetyllaktosamin- Ketten vorherrschen.
Der Anteil der neutralen N-glykosylierten Zuckerketten an der Gesamtheit aller Kohlenhydrate der ZP beträgt bei Rind und Schwein circa 25% und bei der Maus hingegen weniger als 5%.
Ausgehend von einem Gal-β(1-3)-GalNAc Disaccharidkern besitzt die sulfatierte Polylaktosamingrundstruktur (β(2-3)-Verknüpfung) der O-glykosidisch verknüpften Zucker der porcinen ZP die gleiche Anordnung wie die N-glykosidisch verknüpften Zucker (HOKKE et al. 1993). Die Sialsäurereste können an das nicht reduzierte Ende der Zuckerkette und/oder an den proximalen N-Acetylgalaktosaminrest des Kerndisaccharides gebunden sein. Das nicht reduzierte Ende der Kohlenhydratkette endet mit neutralen Strukturen mit β-Galaktose- und β-N-Acetylglukosaminresten oder auch zu einem geringen Anteil mit α-Galaktose- und β-N- Acetylgalaktosaminresten (TÖPFER-PETERSEN 1999).
Mittels Oligosaccharid-Analyse von den N-Glykanen der porcinen ZP konnte gezeigt werden, dass an Asn203, Asn220 und Asn333 von ZPB neutrale diantennäre Zuckerketten N- glykosidisch konjugiert sind. An Asn220 sind zusätzlich noch tri- und tetraantennäre Ketten lokalisiert, welche sich bei ZPC an Asn271 befinden. An alle drei Glykosylierungsstellen des ZPC (Asn124, Asn146 und Asn271) sind auch wieder diantennäre Zuckerketten N- glykosidisch gebunden. Von den drei O-Glykosylierungsstellen des ZPB sind Ser293 und Thr303 bekannt. Die Lokalisationen Thr155, Thr161 und Thr162 des pZPC sind drei der potentiellen sechs O-Glykosylierungsstellen (NAKANO u. YONEZAWA 2001).
A O-glykosidische Zuckerkette
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-3)GalNAc
Beispiel für eine Zuckerstruktur bei einem O-Glykan der pZP
B Diantennäre Struktur eines komplexen Zuckers
Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6) Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3)
dominierende neutrale Oligosaccharidstruktur der N-Glykane der pZP
C Triantennäre Struktur eines komplexen Zuckers Gal(β1-4)GlcNAc(β1-6)Man(α1-6)
Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc Gal(β1-4)GlcNAc(β1-4)
Man(α1-3) Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)
Beispiel für eine triantennären Zuckerkette eines N-Glykans der pZPB, welches neben den tetraantennären in der Lage ist, die Bindung zwischen Spermatozoon und Eizelle zu inhibieren (KUDO et al. 1998).
D Mannosereicher Zucker Man(α1-6)
Man(α1-6) Man(α1-3)
Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc Man(α1-3)
Dominierende Struktur eines neutralen N-Glykans des „High-Mannose“-Typs, welches sich beim Rind durch inhibierende Wirkung(en) auf die Spermatozoon-Eizell-Bindung und die IVF auszeichnet (NAKANO u. YONEZAWA 1998).
Abb. 3: Schematische Darstellung von porcinen und bovinen biologisch aktiven Glykanen der ZP (nach TÖPFER-PETERSEN 1999)
Gal = Galaktose; Man = Mannose; Fuc = Fukose; GlcNAc = N-Acetylglukosamin
5.3. Spermien-Zona pellucida-Interaktionen
Zuckerstrukturen der ZP bei der Gameteninteraktion
Zahlreiche Untersuchungen belegen, dass die Oligosaccharidstrukturen der ZP bei der Gameteninteraktion eine maßgebliche Rolle spielen. Die genauen Prozesse sind jedoch noch sehr unzureichend erklärbar. Nur bei wenigen Arten ist bisher bekannt, welches Glykoprotein für die Spermienbindung zuständig ist. Bei der Maus und beim Hamster wird ZPC sowohl die Fähigkeit zur Erkennung des Spermiums als auch zur Induktion der Akrosomreaktion zugeordnet. Die Bindungsaktivität der ZP von Schwein und Kaninchen ist hingegen am ZPB lokalisiert (HEDRICK 1996; PRASAD et al. 1998). Zur Komplettierung der Speziesunterschiede ist anzumerken, dass bei Xenopus laevis (Krallenfrosch) der Spermienrezeptor (gp69/64) am ZPA liegt (TIAN et al. 1999). Beim Menschen wird wie bei der Maus ZPC die Rezeptoraktivität zugewiesen. Es fehlen jedoch die direkten Beweise für eine Bindungslokalisation, da bisher nur die Fähigkeit zur Induktion der Akrosomreaktion beim rekombinanten hZPC nachgewiesen werden konnte (BREWIS et al. 1996) und nicht die Bindungsfähigkeit direkt.
Sowohl bei der Maus als auch beim Schwein wurde die Spermienrezeptoraktivität hauptsächlich einer bestimmten Klasse von O-glykosidisch gebundenen Zuckern zugeordnet (FLORMAN u. WASSARMAN 1985; YUREWICZ et al. 1991). Im Gegensatz dazu postulieren in neuerer Zeit andere Autoren die Beteiligung von neutralen N-glykosidisch gebundenen Zuckern an der Gametenbindung (TÖPFER-PETERSEN et al. 1995; NAKANO u. YONEZAWA 2001). Bei beiden angesprochenen Arten scheint ein Zusammenspiel von diversen biologisch aktiven Oligosacchariden für eine ausreichend starke Bindung von Nöten zu sein. Bei der Maus kann die Rezeptoraktivität einer Region im C-terminalen 28kDa Peptid von mZPC zugeordnet werden (WASSARMAN u. LITSCHER 2001). JOHNSTON et al.
(1998) entwickelten bei der Maus ein komplexes Modell der Spermienerkennung. Demnach besitzen die Spermien Bindungsstellen, die eine hohe Affinität für α3-fukosylierte Oligosaccharide und eine niedrigere Affinität für α3-galaktosylhaltige und β-galaktosehaltige Strukturen zeigen. Der Grad der Sialylierung und Sulfatierung scheint keinen Effekt auf die Bioaktivität auszuüben (SHUR 1998).
YUREWICZ et al. konnten 1992 zeigen, dass die Poly-N-Acetyllaktosamineinheiten anscheinend keine Rolle bei der Spermienbindung im porcinen Organismus spielen. Nach einer Trypsinspaltung von isoliertem pZPB und pZPC wies nur der Anteil der O-Glykane von pZPB noch eine Rezeptoraktivität auf. Bei den O-Glykanen von pZPC ist dies nicht der Fall, so dass von einem unterschiedlichen O-Glykolysierungsmuster ausgegangen werden kann.
Im Gegensatz dazu konnte in aktuellen Ergebnissen gezeigt werden, dass die neutralen N- glykosidisch verknüpften Oligasaccharide vom porcinen ZPB/ZPC-Komplex eine Bindungsaffinität für Spermien besitzen (YONEZAWA et al. 1999; NAKANO u.
YONEZAWA 2001). Bei all diesen Zuckerketten vom komplexen Typ wird den tri-und tetraantennären Ketten eine größere Bindungsaktivität als den diantennären Ketten zugesprochen. Eine dominierende Rolle scheinen dabei die Zuckerstrukturen, die an Asn220 in der N-terminalen Region von endo-β-Galaktosidase gespaltenen ZPB geknüpft sind, einzunehmen. Den Strukturen von ZPC wird eine unterstützende Funktion zugeordnet.
Bei anderen Spezien werden interessanter Weise andere Kohlenhydrate als Spermienrezeptor angesprochen. Beim Rind konnte gezeigt werden, dass isoliertes bZPB mit seinen hauptsächlich neutralen N-Glykanen des High-Mannose-Typs in der Lage ist, die Spermien- Eizell-Bindung und die In-vitro-Fertilisation zu hemmen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Bindungskapazität nach der Befruchtung herabgesetzt ist, ein Indiz also für Veränderungen der ZP in Struktur und/oder Konformation während der Fertilisation (NAKANO et al. 1996; NAKANO u. YONEZAWA 1998).
Die Bindung von humanen Spermien an hZP kann durch diverse Zucker (Fukose, Mannose, Galaktose und N-Acetylglukosaminreste) gehemmt werden (MIRANDA et al. 1997).
Weiterhin zählen auch komplexe Glykokonjugate mit selektinartigen Liganden, wie Sialyl- Lewis und fukosylierte und sialylierte GalNAc-β(1-4)-GlcNAc (LacdiNAc)-Antennen der N- Glykane, zu den Inhibitoren. OEHNINGER et al. (2001) kommen daher zu der Erkenntnis, dass beim Menschen die Gametenerkennung und –bindung über einen selektinähnlichen Mechanismus vermittelt wird.
Alle diese Daten zeigen, dass es sich bei der Spermienerkennung und der Bindung an die ZP um ein sehr komplexes und spezifisches System handelt. Homologen ZP Proteinen können keineswegs die gleichen Funktionen zu geordnet werden. Die Gameteninteraktion scheint ein Ergebnis kooperierender multimerer Rezeptorsysteme darzustellen (SHUR 1998).
ZP bindende Proteine der Spermien
Diverse Zona pellucida bindende Proteine (ZBP) der Spermienmembran sind zur Zeit schon bekannt, aber von nur wenigen ist auch die Struktur und ihre biochemische Wirkungsweise detailliert erforscht. Bei den ZBP handelt es sich um kohlenhydratbindende Enzyme oder lektinähnliche Proteine, die jeweils spezifische Bindungsstellen für die ZP und ihre Zuckerstrukturen aufweisen.
Die β(1-4)-Galaktosyltransferase (GalTase) der Maus ist in die anfängliche Bindung des Spermiums an die ZP involviert. Sie hat nachweislich einen Anteil an der Aktivierung der G- Proteine der Spermatozoenmembran, welche Phosphorylierung und Induktion der Akrosomreaktion zur Folge hat. Allerdings sind GalTase defiziente Mäuse trotzdem ohne große Einschränkungen befruchtungsfähig. Dies untermauert die Vermutung, dass die GalTase die Gametenbindung in einem speziesspezifischen System von mehreren Rezeptoren lediglich unterstützt (TÖFPER-PETERSEN et al. 1995; SHUR 1998). Es erfolgt dabei eine nicht katalytische Bindung der GalTase an die N-Acetylgalaktosaminreste des mZPC (MILLER et al. 1992). Das murine sp56 ist im Gegensatz zum integralen Membranprotein GalTase ein peripheres Membranprotein der Spermien. Es erkennt die O-glykosidischen Zuckerketten des ZPC, welche für die Spermienrezeptoraktivität des ZPC unabdingbar sind (BLEIL u. WASSARMAN 1988). So kann auch dem sp56 eine Beteiligung an der primären Spermien-ZP-Bindung zugesprochen werden (CHENG et al. 1994).
Das sp17 des Kaninchens bindet über einen Kohlenhydrat-Sulfat-Erkennungsmechanismus an die ZP und es kann wahrscheinlich einer Untergruppe der Lektine, die spezifisch an Galaktose binden, zugeordnet werden (ABDULLAH et al. 1991; RICHARDSON et al. 1994).
Ein weiteres Protein der Spermienmembran, das an der Interaktion mit der ZP beteiligt ist, ist das PH-20. Es handelt sich hierbei um ein Glykoprotein testikulärer Abstammung, das über einen GPI-Anker an die Spermatozoenmembran gekoppelt ist. Mittels spezifischer Antikörper gegen PH-20 konnte die Kontaktaufnahme des PH-20 an die ZP gehemmt werden und somit die Bedeutung für den Bindungsvorgang nachgewiesen werden (PRIMAKOFF et al. 1988).
Weiterhin besitzt das angesprochene Protein auch eine Hyaluronidaseaktivität (HUNNICUTT et al. 1996). PH-20 wurde beim Meerschwein (PRIMAKOFF et al. 1997) und weiterhin beim Affen und Menschen (LIN et al. 1993) nachgewiesen.
