Charakterisierung der ZP durch Antikörper und Lektine

Durch die immunologische Untersuchung der einzelnen Glykoproteine der ZP im Western Blot nach zweidimensionaler Auftrennung konnte die Zuordnung der Spotbanden zu den einzelnen Glykoproteinen bestätigt werden. ZPA, welches sich vom relativen Molekulargewicht her mit um 90 kDa deutlich von dem Bereich um 55 kDa von ZPB/ZPC abhebt, wurde von dem entsprechenden Antikörper als solches erkannt. Eine genaue Abgrenzung des Bereiches von ZPB zu dem von ZPC war nicht möglich, da eine große Überlappung vorlag. Diese ist als reale Überschneidung zu werten und weniger als Kreuzreaktivitäten der Antikörper. Analog der Ergebnisse von BLASE und Mitarbeitern (1998) konnten jedoch Unterscheidungstendenzen bezüglich des pI-Bereiches festgestellt werden. ZPB erstreckt sich bis zum basischen Ende des Proteinbereiches und das ZPC konzentriert sich mehr in den sauren pI-Bereichen. BLASE et al. (1998) weisen ZPB im Vergleich zu ZPC eine etwas höhere Molekulargewichtsregion zu. Diese Ergebnisse konnten nicht nachvollzogen werden. Dieser Unterschied könnte darauf zurückzuführen sein, dass unsere entsprechenden Versuche unter nicht reduzierenden Bedingungen und nicht mit Reduktionsmittel durchführt wurden. Der Einsatz von Reduktionsmittel bewirkt nicht nur eine Aufspaltung von ZPA, sondern sicherlich auch einige noch nicht näher beschriebene Veränderungen innerhalb von ZPB/ZPC.

In den vergangenen Jahren mehrten sich die Erkenntnisse über die Bedeutung der Kohlenhydratstrukturen bei der Vermittlung von bestimmten Signalen und Prozessen im lebenden Organismus. Auf dem Gebiet der Forschungen um die Zona pellucida kamen Lektine als Erkennungsmarker von bestimmten Kohlenhydratstrukturen schon vielfältig zum Einsatz. Es kann mit Lektinen zum einem gezielt nach vermuteten Strukturen gesucht werden, zum anderen aber auch durch den Einsatz von verschiedenen Lektinen sich ein Überblick über beteiligte Oligosaccharide verschafft werden. Die Zona pellucida wurde in vielen Studien oft vor einer Inkubation mit Lektinen mit Glykosidasen behandelt aufgrund einer möglichen Maskierung von definerten Zuckerstrukturen durch terminale Kohlenhydrate und/oder Säurereste. Dies ist sinnvoll bei der Aufklärung der Gesamtheit aller in der ZP vorkommenden Strukturen. Beispielsweise können mittels Neuraminidase Sialsäurereste

abgespalten werden. Eine Desulfatierung und Deacetylierung sind ebenfalls möglich. Zur Auftrennung von ZPB und ZPC wird oft Endo-β-Galaktosidase eingesetzt, die durch Abspaltung von Laktosamineinheiten zur Verringerung der Heterogenität der Glykoproteine beiträgt und so die Separierung der beiden Proteine ermöglicht. Da die Kohlenhydratstrukturen der porcinen ZP (besonders von ZPB u. ZPC, zur Übersicht siehe NAKANO u. YONEZAWA 2001) weitestgehend bekannt sind, war es nicht das Ziel dieser Arbeit, durch die lektinologische Analysen bestimmte Oligosaccharide der ZP nachzuweisen.

Es sollten vielmehr durch möglichst wenige Manipulationen der Glykoproteine die für Lektine freizugänglichen Kohlenhydrate und mögliche Veränderungen durch die IVM dargestellt werden. Deshalb wurden die Versuche unter nicht reduzierenden Bedingungen und ohne Modifizierungen, wie z.B. durch Enzymspaltungen, durchgeführt.

Folgende Zuckerstrukturen der nativen mittels 2D-PAGE aufgetrennten ZP Glykoproteine konnten im Lektinblot ermittelt werden:

Das Lektin Con A detektiert Mannose (und/oder N-Acetylglukosamin), die typisch für das Trimannosyl-Core der N-Glykane ist (vgl. Abb. 18). Zu beachten ist weiterhin, dass Con A die Strukturen von diantennären Glykoproteinen, nicht aber von tri- und tetraantennären erkennt, da beim Schwein keine Zuckerverknüpfungen vom „High-Mannose“-Typ vorhanden sind. Auffällig war, dass stark positive Con A Signale auf den ZPA Bereich beschränkt waren. Dies galt gleichermaßen für ungereifte und gereifte ZP. Das Vorhandensein von mannosehaltigen, diantennären Kohlenhydratketten ist zwar auch für ZPB und ZPC belegt (NAKANO u. YONEZAWA 2001), diese scheinen aber maskiert oder in einem zu geringen Anteil vorzuliegen. Die Glykoproteinstrukturen von ZPA sind im Vergleich zu denen von ZPB und ZPC weniger untersucht. Mittels N-terminaler Sequenzierung konnte in unsere Arbeitsgruppe für über Con A Affinitätschromatographie isolierte diantennäre N-Glykane eine dominante Glykosylierungsstelle im porcinen ZPA an Asn268 gefunden werden (EKHLASI-HUNDRIESER et al., unveröffentlicht).

Bei den anderen eingesetzten Lektinen konnten keine Unterschiede innerhalb der einzelnen Glykoproteine beobachtet werden. Mit AAA (vgl. Abb. 18) konnte der für die porcine ZP typische hohe Fukosylierungsgrad dargestellt werden. ECA detektierte die Strukturen Acetylgalaktosamin, Acetyllaktosamin oder terminale Galaktose innerhalb neutraler

N-glykosidisch gebundener Ketten. Im Gegensatz zu HOKKE und Mitarbeitern (1993), die in porciner ZP nur (2-3)-verknüpfte Sialsäure fanden, konnte hier neben dieser Struktur mit MAA II auch (2-6)-verknüpfte Sialsäure mit SNA nachgewiesen werden. Auffällig war, dass beide Lektine, obwohl sie relativ saure Strukturen erkennen, im Bereich der Anode eher schwache Signale besaßen und ihr Signalmaximun mehr in der Mitte des Spotbandenbereiches der Glykoproteine lag. Jacalin und ACA erkennen beide Strukturen, die typischer Weise in O-Glykanen vorliegen (α-D-Gal-β(1-3)-GalNAc), wobei Jacalin die neutrale und ACA die saure sialylierte Form markiert (vgl. Abb. 18). Weitere positive Signale konnten mit DSA für repetierende N-Acetyllaktosamineinheiten nachgewiesen werden.

Die an terminale Galaktose bindenden Lektine PNA (β-D-Gal) und GS I (α-D-Gal) riefen keine Markierungssignale hervor. Dies stimmt mit den Ergebnissen andere Arbeitsgruppen überein. PARILLO et al. (2001) erhielten in der Histochemie von ZP von Wildschweinen bei PNA (β-D-Gal) erst ein Signal nach Einsatz von Neuraminidase und α–D-Gal konnte nur nach Desulfatierung nachgewiesen werden. Auch SKUTELSKY et al. (1994) erhielten bei feliner, caniner und porciner ZP, jeweils ohne enzymatische oder chemische Vorbehandlung, bei der Anwendung von PNA und GS I keine positive Detektion. Allerdings bei der ZP von niederen Tieren wie Maus, Ratte und Hamster ließ sich mit PNA β-D-Gal auch an der ZP im nativen Zustand nachweisen. Dies belegt, dass Sulfatierung und Sialylierung der ZP zu den höher entwickelten Tieren hin zunimmt. Bei der Maus ist bekannt, dass die terminale Galaktose als Erkennungsmerkmal für die Spermatozoen-Zona pellucida Bindung eine wichtige Rolle spielt (BLEIL u. WASSARMAN 1988). Diese ist nach den Lektinbindungsstudien auch gut zugänglich. Da dies u.a. bei der porcinen ZP nicht der Fall ist, spricht dies für differenziertere Bindungsvorgänge.

N-Glykane:

NeuAcα(2-3)Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2) Manα(1-6) Fucα(1-6) Manβ(1-4)GlcNAcβ(1-4)GlcNAc-Asn NeuAcα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2) Manα(1-3)

O-Glykane:

-Ser/Thr -Ser/Thr

Abb. 18: Lektine und die von ihnen erkannten Kohlenhydratstrukturen ( )

Abgesehen von der vermehrten Acidität zeigten die Lektinmuster im Vergleich von ZP von ungereiften und gereiften Oozyten keine Veränderungen. Die pI-Verschiebung stellte sich in der lektinologischen Analyse allerdings mit einer Differenz von ca. zwei pI-Einheiten zu dem in der Gelanfärbung mit Silberreagenz von ca. einer pI-Einheit noch ausgeprägter dar.

NeuAcα(2-3/6)Galβ(1-3)GalNAc Galβ(1-3)GalNAc

Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-6)

Manα(1-6) Fucα(1-6) Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2)

Manβ(1-4)GlcNAcβ(1-4)GlcNAc - Asn Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2)

Manα(1-3) [Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-3)]^N-Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-4)

MAA II Con A

SNA

DSA

AAA

ACA Jacalin

6 HSO4

potentielle Sulfatierungsstelle

am C-6-Atom von N-Acetylglukosamin

Bei der Interpretation von Lektinbindungsstudien muss einiges beachtet werden. Es besteht immer die Möglichkeit, dass bestimmte Strukturen nicht erkannt werden, da Oligosaccharide sehr komplexe Verbindungen sind. Das Bindungsverhalten der Lektine ist so substratspezifisch entsprechend dem von Enzymen. Es erfolgt aber eine Bindung über Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen wie bei einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Neben diesen molekularen Wechselwirkungen kann die Tertiärform der Molekülketten und die Anwesenheit von maskierenden Strukturen das Bindungsverhalten von Lektinen erheblich beeinflussen.

Daher werden oft Lektine, die gleiche oder ähnliche Kohlenhydrate erkennen, parallel eingesetzt, um falsch negative Ergebnisse möglichst zu vermeiden. So wurden von vielen Autoren als α-L-Fukose erkennendes Lektin UEA I (Ulex europaeus I) verwendet, welches in der Histochemie keine Strukturen innerhalb der ZP zu markieren scheint (z.B. SKUTELSKY et al. 1994; TREDE 1995). Bei den in dieser Arbeit beschriebenen Versuchen wurde statt UEA I das Lektin AAA eingesetzt, welches auch den durch moderne Zuckeranalysemethoden nachgewiesenen hohen Anteil an Fukose in der ZP des Schweins erkennen konnte.

Maskierungen von Sacchariden in der ZP sind z.B. durch andere Kohlenhydrate, Sulfate und Sialsäurereste möglich. Es handelt sich bei letzteren beiden um negativ geladene Strukturen, die u.a. für den sauren Charakter der ZP in der isoelektrischen Fokussierung verantwortlich gemacht werden können. Aufgrund dieser Acidität wären eine vermehrte Sialylierung und/oder Sulfatierung der Zona pellucida während der In-vitro-Maturation eine mögliche Ursache für den nachgewiesenen pI-Shift in der 2D-PAGE.

Bedeutung von Sialylierung und Sulfatierung der ZP

Studien bei diversen Tierarten haben gezeigt, dass die ZP reich an Sialsäureresten ist (AVILES et al. 1994; PARILLO et al. 1996). Die negative Sialsäure ist aufgrund ihrer Ladung in Bindungen und Transporte von positiv geladenen Teilchen involviert. Diese spielen eine Rolle bei der Hydratation der ZP. Zusätzlich tragen die Sialsäurereste dazu bei, dass dem Spermium die Penetration durch die ZP ermöglicht wird. Auf die Spermienbindung an die Zona pellucida scheint die Sialsäure einen differenzierten Einfluss zu besitzten. Bei der humanen ZP konnte gezeigt werden, dass die chemische Modifikation der terminalen Sialsäurereste eine deutliche Reduktion der Spermienbindungskapazität der ZP hervorruft

(OZGUR et al. 1998). Die Behandlung der ZP mit Neuraminidase bewirkt allerdings einen signifikanten Anstieg der Anzahl der an die ZP gebundenen Spermatozoen. Diese Ergebnisse lassen die Koexistenz von durch Sialsäure vermittelten Bindungen und durch Sialsäurereste maskierten Bindungsstellen vermuten.

Die Sialylierungen über α(2-3)-Verknüpfungen sind relativ starr, aber in Verbindung mit den besser frei drehbaren α(2-6)-Verknüpfungen erhält die ZP einen vikös-elastischen Charakter (PARILLO u. VERINI-SUPPLIZI 2001). Mit dem Lektin SNA konnte in der vorliegenden Arbeit der geringe, aber eindeutig vorhandene Anteil der α(2-6)-Verbindungen nachgewiesen werden.

Sialsäurereste spielen folglich eine bedeutende Rolle bei den Befruchtungsvorgängen. Die erbrachten lektinologischen Untersuchungen weisen jedoch nicht auf eine vermehrte Sialylierung durch die IVM hin. Die Intensität des Bindungsmusters von SNA bei gereifter ZP war nicht gesteigert im Vergleich zur ungereiften ZP.

Sulfate sind ebenfalls negativ geladene Strukturen, die zum sauren Charakter der ZP mit beitragen. Sulfatierte Oligosaccharide konnten bereits bei den Glykoproteinen der porcinen ZP nachgewiesen werden (MORI et al. 1998; PARILLO et al. 2000). Es ist bekannt, dass die Sulfatierung bei der Bioaktivität von Glykoproteinen eine Rolle spielt, jedoch inwieweit sie für die Prozesse innerhalb der Befruchtungsvorgänge relevant ist, muss noch diskutiert werden. So führen Antikörper gegen sulfatierte Glykoproteine der ZP zur Immuno-kontrazeption (PATERSON et al. 1996). JONES (1991) konnte zeigen, dass Oligosaccharide mit Sulfatresten Proacrosin binden und mit als sekundäre Rezeptoren innerhalb der Spermatozoon-Oozyten-Bindung agieren.

Mit der möglichen wichtigen funktionellen Rolle der Sulfatierung und Sialylierung befassten sich in Studien LIU et al. (1997). Dabei wurde gezeigt, dass die Acidität von mZPC u.a. von der Verknüpfung mit Sialsäureresten abhängt. Der pI-Wert stieg nach der Behandlung mit Neuraminidase von ca. 4,7 auf ca. 6,0. Weiterhin wurde unter In-vitro-Bedingungen die Fähigkeit von partiell deglykosylierten, desulfatierten oder desialylierten ZPC, Spermien zu binden und die Akrosomreaktion zu induzieren, geprüft. Allerdings schienen Sulfatierung, Sialylierung und der Grad der Glykosylierung bei der Bioaktivität von murinen ZPC keine Rolle zu spielen. Inwieweit diese Erkenntnisse über den anscheinend fehlenden Einfluss von Sulfatresten und Sialinsäureresten von der Maus auf höher entwickelte Tiere, wie dem

Schwein, übertragen werden können, ist fraglich. Wie schon beschrieben, ist zum einen der Aufbau der ZP bei Nagetieren wesentlich einfacher und zum anderen wird bei der Maus die Spermienbindung O-Glykanen des ZPC zugesprochen.

Bei der porcinen ZP sind N-Glykane von ZPB mit Unterstützung der N-Glykane von ZPC in die primäre Spermienbindung involviert. Während bei der Maus die Sialylierung ausgeprägter ist (NOGUCHI u. NAKANO 1993), ist der Sulfatanteil der porcinen ZP besonders hoch (NOGUCHI u. NAKANO 1992). Eine mögliche Sulfatierungstelle ist die Verknüpfung an der C-6 Position von Acetylglukosamin innerhalb einer Laktosamineinheit (s. Abb. 18). N-Acetyllaktosamineinheiten konnten hier durch das Lektin DSA nachgewiesen werden. Die Laktosamineinheiten kommen innerhalb der N-Glykane oft in unverzweigter sich mehrfach wiederholender Form vor, welches eine ausgeprägte Sulfatierung bewirken kann. Zusätzlich wurden beim Schwein auch Sulfatreste an sich nicht repetierenden Einheiten und an der C-3 Position der N-Acetylglukosaminreste am reduzierten Ende gefunden (MORI et al. 1998).

3. Ultrastrukturelle Untersuchung der Zona pellucida

Mit der Rasterelektronenmikroskopie der intakten Eizellen mit AAA und Con A konnte eine Mengenverteilung der exponierten Kohlenhydratstrukturen entsprechend der lektinologischen Analysen der auf PVDF-Membranen transferierten ZP Glykoproteine dargestellt werden. Die Markierung mit AAA zeigte sich fast flächendeckend und bestätigte somit wieder den hohen Fukosylierungsgrad der porcinen ZP. Die Kügelchen mit Con A waren mehr isoliert über die Oberfläche verteilt und weniger in den sich zentripedal verkleinernden Poren zu finden. Die Zuckerstrukturen α-D-Mannose und α-D-GlcNAc, die vorliegend in diantennären Ketten von Con A erkannt werden, sind an der Oberfläche der ZP folglich gut zugänglich. Die Muster von Con A positiven Strukturen wurden an der humanen ZP von MICHELMANN und Mitarbeitern (2001) untersucht. In dieser Studie konnten Verteilungen der Con A beladenen Mikrobeads analog zur Spermienverteilung dargestellt werden. Statt der Goldkopplung mit Silverenhancement, die die Goldpartikel auf ca. 250 nm wachsen lässt, wurden von ihm mit Con A beladene Microbeads verwendet. Deren Größe belief sich auf ca. 2,8 µm und entsprach

somit eher der Spermienkopfgröße, so dass die Microbeads als eine Art künstliches Spermium Bindungsstellen markierten. Für ein solches Vorhaben sicherlich gut geeignet sind die Microbeads allerdings zu groß für Untersuchungen, die sich mehr auf die Zuckerpräsentation im allgemeinen und nicht auf die Spermienverteilung beziehen. Aufgrund des größeren Durchmessers ist eine Markierung innerhalb der Poren der ZP nur schwer möglich.

Zur Zeit laufen noch Versuche mit gereiften Oozyten. Morphologisch bestehen bei der unbehandelten ZP im REM zwischen ungereifter und gereifter ZP keine Unterschiede (SCHWARTZ, persönliche Mitteilung). Die Wandlung des gitterartigen Netzwerkes der ZP ungereifter Eizellen zu einer glatten und kompakteren Struktur konnte erst nach der Fertilisation dargestellt werden. VANROOSE et al. (2000) wiesen dies für bovine ZP und FUNAHASHI et al. (2001) für porcine ZP nach. Letztere konnten auch zeigen, dass sich der Grad der fibrillären Aggregation von der ZP von in vivo erzeugten Zygoten von der ZP von in vitro erzeugten Zygoten unterscheidet. Das In-vivo-Produkt stellt sich kompakter dar.

Veränderungen der ZP innerhalb der IVM konnten mit normaler REM nicht dargestellt werden. Die lektinologischen Analysen der mittels 2D-PAGE separierten ZP Glykoproteine zeigten keine Unterschiede zwischen GV I und M II Stadien bei den Lektinmustern. Nur der pI-Shift, der auch in der Proteinanfärbung zusehen war, stellte eine Veränderung dar. Aus diesem Grund sind auch für die Lektinverteilungen über die ZP intakter Eizellen vergleichend zwischen ungereiften und gereiften kaum Unterschiede zu erwarten. In einer elektronenmikroskopischen Auswertung goldgekoppelter Lektine in der Zytochemie von muriner ZP konnte gezeigt werden, dass Veränderungen im Muster der Lektinmarkierungen nach der Befruchtung auftreten (AVILES et al. 1997). Die Markierungen durch MAA II, PNA und AAA waren nach der Fertilisation schwächer und die durch RCA I stärker. Diese Untersuchung gibt Hinweise auf Veränderungen der exponierten Kohlenhydratstrukturen im Rahmen von Befruchtung und Zona hardening. Bezüglich möglicher Veränderungen während der Reifung der Oozyte wurden keine Angaben erhoben.

4. Funktioneller Vergleich von ungereifter und gereifter ZP

Die lektinologischen Untersuchungen der Glykoproteine der ZP haben noch keine eindeutigen Erklärungen für den pI-Shift in Richtung Anode nach der IVM gebracht. Es wurden auch keine zusätzlichen Hinweise für weitere Veränderungen während der Reifung gefunden. Aus diesem Grund wurde eine funktionelle Untersuchung angeschlossen, um die These über Veränderungen der ZP während der In-vitro-Reifung zu untermauern. Die Fähigkeit der ZP, die Akrosomreaktion bei kapazitierten Spermien auszulösen, wurde dazu als Untersuchungsparameter eingesetzt. Isolierte ZP wurde mit kapazitierten Spermien inkubiert und der Anteil der in Akrosomreaktion befindlichen Spermien ausgewertet. Parallel dazu wurde der Prozentsatz der akrosomreagierenden Spermien einer Kontrollsuspension bestimmt. Dieser Anteil wurde dann von dem im Bindungstest ermittelten subtrahiert und so erhielt man den Wert, der für die Induktion durch die ZP steht.

Die Fähigkeit der ZP, die Akrosomreaktion zu induzieren, wurde schon vielfältig in Untersuchungen als Hilfsmittel herangezogen. Beispielsweise kann so der Erhalt der Funktionalität von gelagerten Eizellen überprüft werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, die Akrosomreaktion einer bovinen Spermienpopulation durch ein synthetisches Peptid analog zu einer ZPC-Sequenz zu induzieren (HINSCH 1998).

Mit dem in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Spermien-ZP-Bindungstest konnte gezeigt werden, dass die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion durch die ZP abhängig vom Reifungsstatus der Oozyten ist. Dieser Unterschied kommt bei dem gewählten Beobachtungszeitraum von zwanzig Minuten besonders innerhalb der ersten zehn Minuten zum Ausdruck. Der Anteil der akrosomreagierenden Spermien, welche an die ZP gebunden hatten, war beim Vergleich der ZP verschiedenen Reifungsgrades zu Anfang und Ende des Versuches in etwa gleich. Die Übereinstimmung am Anfang weist darauf hin, dass die Reifungsstadien die Spermien der Populationen nicht unterschiedlich selektieren. Der Unterschied besteht darin, dass die Entwicklung sowohl bei den Frischspermien als auch bei den epididymalen TG-Spermien bei der ZP in M II zwischen einer und zehn Minuten wesentlich schneller abläuft. Besonders ausgeprägt ist dies beim Einsatz der ejakulierten Frischspermien. Innerhalb der ersten zehn Minuten wird bei diesen durch die gereifte ZP die

Akrosomreaktion ca. doppelt so schnell induziert wie bei der ungereiften ZP. Nach zehn Minuten hat der Anteil der PNA-FITC positiven Spermien schon fast seinen Endwert erreicht.

Um genauere Aussagen über die Funktionalität der ZP im Hinblick auf die Induktion der Akrosomreaktion machen zu können, muss noch die sogenannte spontane Akrosomreaktion berücksichtigt werden. YANAGIMACHI (1994) weist darauf hin, dass sich die wahre Akrosomreaktion, die bei lebenden, motilen Zellen stattfindet, von dem degenerativ an toten Zellen stattfindenden Vorgang zu unterscheiden ist. Unter der spontanen Akrosomreaktion versteht man Spermien, die ohne Einfluss von ZP oder bestimmten Substanzen (z.B. Lyso-Phosphatidylcholin, Heparin, Hyaluronsäure etc.) eine Auflösung der äußeren Membranen aufweisen. Die durch Agonisten induzierte Akrosomreaktion findet mit größter Effizienz an ZP derselben Spezies innerhalb weniger Minuten nach Erreichen des Kapazitationszustandes statt (YANAGIMACHI 1994). Die spontane Akrosomreaktion verläuft hingegen eher langsam. Ein Ansatzpunkt zur Unterscheidung dieser beiden Arten einer Akrosomreaktion ist, parallel zur Akrosomreaktion eine Vitalfärbung der Spermien einzusetzen.

Dies war aber in den hier beschriebenen Bindungstests nicht möglich. Die aufgrund des zügigen Ablaufs der ZP-induzierten Akrosomreaktion gewählten Beobachtungszeitpunkte von einer, zehn und zwanzig Minuten machten eine Konservierung des Spermienstatus nötig, da in den Zwischenzeiten die ZP mit den gebundenen Spermien nicht ausgewertet werden konnte. Durch die Fixierung (mit 2,5% Glutardialdehyd) kommen die Spermatozoen in einen avitalen Zustand, der sich in einer Propidiumjodid positiven Anfärbung darstellt. Diese Anfärbung konnte folglich innerhalb der Bindungstests nur als reine Zählfärbung eingesetzt werden (vgl. FLESCH et al. 2001). Die parallel untersuchte Spermienkontrollsuspension ohne ZP wurde nicht fixiert. Bei den gleichzeitig durchgeführten Färbungen mit Propidiumjodid und PNA-FITC wurden als Zeichen der spontanen Akrosomreaktion nur Spermien beobachtet, die, wenn sie PNA-FITC positiv waren, auch durch Propidiumjodid markiert wurden. Allerdings ist es auch schwierig, eine induzierte Akrosomreaktion (z.B. durch Lyso-Phosphatidylcholin) in Suspension nachzuweisen, da flowzytometrische Untersuchungen zeigten, dass der Zeitraum von der Induzierung der Akrosomreaktion bis zum Zelluntergang sehr kurz ist (ASCHWORTH et al. 1995). Eine Erfassung ist daher nur im

flowzytometrischen Diagramm und nicht in der Beurteilung von Spermienpräparaten aus Suspensionen möglich.

Zur Vermeidung von Bindungen avitaler Spermien und Spermienaggregationen an die ZP wurde mit einer Minute eine sehr kurze Koinkubationszeit gewählt. Es ist davon auszugehen, dass daher nur kapazitierte, akrosomintakte Spermatozoen an die jeweilige ZP gebunden haben. Trotzdem wurde in einem Rechenmodell bei allen drei Beboachtungszeitpunkten der Ausgangswert bei einer Minute der in spontaner Akrosomreaktion befindlichen Spermien innerhalb der Kontrollsuspension von dem Wert der PNA-FITC positiven gebundenen Spermien abgezogen. Um auch die Möglichkeit zu berücksichtigen, dass eben doch der gleiche Anteil der Spermien an der ZP, wie der in der Suspension, degenerativen Prozessen unterliegt, wurde noch eine weitere Rechnung aufgestellt. Den Anteilen der

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