Zur eindeutigen Identifizierung der ZP Glykoproteine wurden diese nach der elektrophoretischen Auftrennung auf PVDF-Membranen transferiert. Im Western Blot mit definierten Antikörpern gegen die einzelnen drei Proteine der ZP sollten diese näher analysiert werden. Es kamen dabei sowohl polyklonale Antikörper als auch monospezifische Peptidantikörper zum Einsatz. Die Unterscheidung der Bereiche von ZPA und ZPB/ZPC war bereits in der Gelanfärbung offensichtlich. Die große Bande von ZPB/ZPC sollte jedoch auch ihren einzelnen Bestandteilen zu geordnet werden können. Die Markierungen der Antikörper wurden durch ein Chemilumineszenzverfahren entwickelt. Die Kontrolle der Spezifität wurde durch den Einsatz von entsprechenden Präimmunseren überprüft.
Bei durch 1D-PAGE aufgetrennten Glykoproteinen der ZP konnte die 90 kDa Bande mit dem AK ZPA-20 als ZPA identifiziert werden. Die anderen drei verwendeten Antikörper (AK ZPB; AK ZPC; AK ZPC-5a) zeigten alle die gleiche Markierung über die gesamte 45-60 kDa Bande. Eine Unterscheidung von ZPB und ZPC war nicht möglich, sowohl bei ungereiften als auch bei gereiften Zonae pellucidae.
AK ZPA-20 markierte bei den Membranen mit Proteine nach 2D-PAGE Auftrennung das ZPA zugeordnete Bandenmuster analog der entsprechenden Silberfärbung oberhalb des breiten dominanten Bereichs von ZPB/ZPC. Dies galt sowohl für den Ansatz unter reduzierenden Bedingungen als auch für den unter nicht reduzierenden Konditionen.
Die Unterscheidung von ZPB und ZPC innerhalb der zweidimensional aufgetrennten ZP Proteine war wie bei der 1D-PAGE Auftrennung ebenfalls nicht eindeutig möglich, da sich
97,4 66,2
45,0 kDa
unterschiedliche Signalmuster, so dass eine Tendenz beschrieben werden kann. Diese galt für alle drei untersuchten ZP Gruppen, die ungereifte nicht reduzierte ZP, die ungereifte reduzierte ZP und die gereifte nicht reduzierte ZP. AK ZPC und AK ZPC-5a markierten vornehmlich verstärkt im sauren pI-Bereich und AK ZPB gleichmäßig über die gesamte Breite der Proteinbande um die 55 kDa. Die Signale von AK ZPC/AK ZPC-5a endeten auslaufend ca. 1,0-1,5 pI Einheiten vor dem Ende der Proteinsspots auf Seiten der Kathode verglichen mit der jeweiligen Silberfärbung.
Allgemein ist zu sagen, dass die reale Verteilung der einzelnen Proteinanteile wahrscheinlich etwas weiter in den basischen pI-Bereich hineinreichten. Dort wird die Proteinkonzentration im Vergleich zum sauren Abschnitt wesentlich geringer, so dass eine sichtbare Detektion auch nicht mehr durch verlängerte Belichtungszeiten erfolgen konnte. Der durch den AK ZPB markierte Bereich endete bis zu 0,5 pI-Einheiten vor dem basischen Ende der entsprechenden Silberfärbung.
Die Chemilumineszenz mit den Präimmunseren statt der Antiseren wies keine Signale auf.
Die beschriebenen Spotbanden sind folglich als spezifisch anzusehen.
AK ZPB AK ZPC
pI 3 4 5 6 7 8 pI 3 4 5 6 7 8
Abb. 7: Chemilumineszenz ungereifter nicht reduzierter ZP mit Antikörpern
(bei AK ZPB war Belichtungszeit verlängert, daher Standard intensiver und noch schwache Signale zu erkennen, bei AK ZPC ergaben längere Belichtungszeiten keine weiteren Signale)
kDa
66,2 97,4
45,0
4. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP
Alternativ zur immunologischen Charakterisierung wurden die durch die Elektrophorese aufgetrennten ZP Proteine mit Lektinen untersucht. Mittels Lektinen konnten definierte Kohlenhydratstrukturen der ZP näher analysiert werden. Zur Detektion kam ein Biotin/Streptavidin-System zum Einsatz und die Visualisierung erfolgte wiederum durch das Verfahren der Chemilumineszenz.
Alle Lektine wurden zunächst an Membranen mit Proteinen ungereifter ZP nach eindimensionaler elektrophoretischer Auftrennung (1D-Membranen) getestet. Nach einem positivem Signal in der Chemilumineszenz wurden die jeweiligen Lektine auch in der Analyse von zweidimensional elektrophoretisch separierten Proteinen (2D-Membranen) eingesetzt.
Die Spezifität der Lektinbindung wurde durch den Zusatz von Zuckern überprüft. Gemäß einer kompetitiven Hemmung wurden in Parallelansätzen während des Inkubationsschritts der Lektinlösung der jeweilige Bindungshemmzucker (Lektine mit Hemmzuckern siehe Tabelle 5 unter 3.2. in C Material und Methoden) zugesetzt. Wurden die Zucker in einer Konzentration von 0,2 M bei einer Lektinkonzentration von 5 µg/ml verwendet, so konnte eine deutliche Signalreduktion erzielt werden. Beim Einsatz einer 0,5 M Zuckerlösung wurde in der Chemilumineszenz keine Markierung der ZP Proteine durch die Lektine mehr nachgewiesen.
Die eingesetzten biotinylierten Standardproteine diente neben der Bestimmung des relativen Molekulargewichtes der ZP Glykoproteine zur Kontrolle eines korrekten Entwicklungssystems.
In Tabelle 6 sind die eingesetzten Lektine und die von ihnen markierten Bereiche der ZP Glykoproteine von ungereiften Eizellen auf dem Röntgenfilm dargestellt. Die ZP Erkennung wurde unterteilt nach Markierungen im Bereich des höher molekularen ZPA und des großflächigeren ZPB/ZPC Gebietes. Die Versuche mit 2D-PAGE Auftrennung der ZP wurden sowohl unter reduzierenden Bedingungen als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Für den jeweiligen Versuchsansatz ergaben sich keine Unterschiede; es wurden in beiden Fällen die gleichen Muster analog der Silberfärbung
erkannt. Entsprechend verhielten sich auch die Signale der 1D-Membranen. In der Besprechung der einzelne Muster wurde sich daher auf die der 2D-Membranen konzentriert.
Tab. 6: Ergebnisse der Chemilumineszenz zur Analyse der ungereiften ZP auf 1D- und 2D-Membranen mit Lektinen
(— = kein Signal; + = geringes Signal; + + = mittleres Signal; + + + = starkes Signal)
Signal im ZP Bereich Gruppe Lektin Spezifität
ZPA ZPB/ZPC I Gluc/Man Con A α-D-Man; α-D-GlcNAc + + + (+)
DSA [Gal-β(1-4)-GlcNAc]N + + + + + +
II
GlcNAc RCA I Gal-β(1-4)-GlcNAc + + + + +
GS I α-D-Gal, α-D-GalNAc — —
PNA Gal-β(1-3)-GalNAc; α/β-Gal — —
ECA α/β-Gal;
α/β-GalNAc; Gal-β(1-4)-GlcNAc + + + + + + III
GalNAc/
Gal
Jacalin Gal-β(1-3)-GalNAc + + + + +
IV L-Fuc AAA Fuc-α(1-6)-GlcNAc + + + + + +
MAA II NeuNAc-α(2-3)-Gal + + + +
ACA NeuNAc-α(2-3/6)-Gal-β(1-3)-GalNAc + + + + V
Neuramin-
säure SNA NeuNAc-α(2-6)-Gal;
NeuNAc-α(2-6)-GalNAc + +
Die Beurteilung der angegebenen Signalstärke erfolgte durch einen Vergleich der Schwärzungen auf den Röntgenfilmen innerhalb der Versuche in Intensität und Flächenausmaß.
Die Lektinbindungsmuster auf den erstellten Röntgenfilmen waren grob in vier Typen zu unterteilen (vgl. Abb. 8):
Typ I (ohne Signal)
Die Lektine GS I und PNA zeigten weder auf 1D-Membranen noch auf 2D-Membranen ein Signal. Sie binden beide spezifisch an terminale Galaktose, die folglich durch diese nicht nachgewiesen werden konnte.
Typ II (Signal nur im ZPA Bereich)
Dieses Muster war nur bei Con A zu finden, welches vornehmliche α-D-Mannose erkennt und schwächer an α-D-GlcNAc bindet. Bei allen beschriebenen Versuchsanordnungen, 1D- oder 2D-Membran, reduzierend oder nicht reduzierend, wurde von diesem Lektin nur der jeweilige ZPA Bereich erkannt, und zwar deutlich. Minimale Signale waren jedoch beim Lektinblot der nicht reduzierten 2D-Membran auch im ZPB/ZPC Bereich zu sehen (s. Abb. 8a+b).
Typ III (mittlere Signale bei ZPA und ZPB/ZPC)
Zu diesem Typ wurden die Lektine SNA, ACA und MAA II gezählt. Sie gehören alle zur Gruppe der Lektine , die Sialsäure in bestimmten Verknüpfungen erkennen. SNA und MAA II markieren diese Strukturen in N-Glykanen und ACA komplexe sialsäurehaltige Bereiche in O-Glykanen.
Bei SNA war auffällig, dass gerade zum sauren Bereich hin die Signale in beiden Proteinbereichen der ZP immer schwächer werden (s. Abb. 8d), obwohl die Glykoproteinkonzentration zur Anode größer wird. Dort haben die Lektine mit dem Signalmuster vom Typ IV und ACA ihre stärkste Markierung.
MAA II rief im Vergleich zum SNA stärkere Markierungen hervor. Sie umfassten beide Proteinbereiche, wiesen aber ähnlich dem SNA gerade am basischen Ende beider Spotbanden (ZPA und ZPB/ZPC) den intensivsten Signalbereich auf. Dies wurde bei reduzierten 2D-Membranen (s. Abb. 8c) mit aufgespaltenem ZPA und nicht reduzierten 2D-2D-Membranen mit einheitlichem ZPA Bereich deutlich.
ACA markierte zwar beide Spotbanden komplett (s. Abb. 8e), jedoch insgesamt schwächer als die Lektine mit Typ IV, so dass längere Belichtungszeiten (ca. 2-4fache) von Nöten waren.
Abb. 8: Chemilumineszenz von 2D-Membranen mit ungereifter ZP und Lektinen
(Banden der Molekulargewichtsstandardproteine auf den jeweils linken Seiten von oben nach unten: 97,4 kDa, 66,2 kDa und 45,0 kDa; red. = reduziert; Signalm. = Signalmuster)
a : Con A; red. ZP; Signalm. Typ II b : Con A; nicht red. ZP; Signalm. Typ II c : MAA II; red. ZP; Signalm. Typ III d : SNA; nicht red. ZP; Signalm. Typ III e . ACA; nicht red. ZP; Signalm. Typ III f : AAA; nicht red. ZP; Signalm. Typ IV
a b
c d
e f
pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7
pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7
pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7
Typ IV (starke Signale bei ZPA und ZPB/ZPC)
AAA, DSA, ECA, RCA I und Jacalin bewirkten sehr ähnliche starke Signale in beiden Spotbanden. Die Markierungen waren gleichmäßig stark über die Breiten der jeweiligen Banden verteilt (vgl. Abb. 8f). Im sauren Bereich waren die Signale dichter entsprechend der Proteinverteilung in der Silberfärbung. AAA, spezifisch für Fuc-α(1-6)-GlcNAc, war das Lektin mit den stärksten Signalen.
In der Silberfärbung der 2D-PAGE war ein auffälliger Shift der pI-Bereiche zur Anode im Vergleich zwischen ungereifter und gereifter ZP zu beobachten. Es finden folglich Veränderungen an der ZP während der In-vitro-Reifung auf biochemischer Ebene statt. Daher wurde auch die ZP von gereiften Oozyten mittels Lektinen untersucht. Es wurden nur einige der bei den ungereiften ZP eingesetzten Lektine verwendet, da die Materialbeschaffung mit einem großem Aufwand verbunden war. Die Oozyten mussten gereift werden und zur Vermeidung von unnötigen Materialverlusten wurde jede ZP einzeln isoliert und auf den Einsatz von Siebtechniken verzichtet. Die einzelnen Lektine untereinander wiesen auch in ihren Detektionsmustern auf den Röntgenfilmen meistens eine sehr ähnliche Verteilung auf.
Es wurde fast immer der gesamte Proteinbereich der entsprechenden Coomassie Blue-(1D) oder Silberfärbung (2D) markiert.
Bei der Analyse der gereiften ZP der Eizellen im M II Stadium wurden also vornehmlich Lektine mit unterschiedlichen Mustern eingesetzt. Die 2D-PAGE wurden mit den gereiften Eizellen für die Chemilumineszenz nur unter nicht reduzierenden Konditionen durchgeführt.
So wird die Aufspaltung der Disulfidbrücken des ZPA umgangen und die Proteinmenge des ZPA auf einen kleineren Bereich konzentriert. Daher konnte auch trotz geringer Glykoproteinmengen (120 ZP ~ 1,8 µg pro Membran) der Zuckeranteil des ZPA mittels beschriebener lektinologische Analyse dargestellt werden. Als Ausnahme wurde nur für die Untersuchung mit Con A auch ein 2D-Ansatzt mit DTT (reduzierend) durchgeführt, da die selektive Erkennung von Kohlenhydratstrukturen im ZPA Bereich durch das Con A eine Untersuchung unter Aufspaltung der 90 kDa Komponente von ZPA interessant machte.
Die Ergebnisse der lektinologischen Untersuchungen der gereiften ZP sind in Tabelle 7 zusammengefasst.
Tab. 7: Ergebnisse der Chemilumineszenz zur Analyse der gereiften ZP mittels Lektinen (— = kein Signal; + = geringes Signal; + + = mittleres Signal; + + + = starkes Signal;
2D red. = Auftrennung der ZP Proteine vor Transfer aus Membran durch 2D-PAGE unter reduzierenden Bedingungen; ohne Angabe = nicht reduzierende Bedingungen)
Signal im Bereich der ZP
Gruppe Lektin Spezifität Art der
PAGE ZPA ZPB/ZPC
Die bei gereiften ZP eingesetzten Lektine führten jeweils zu den gleichen Signalmustern wie diese bei ungereiften ZP. Bei Con A war dies folglich Typ II, bei SNA Typ III und bei AAA, ECA, RCA-I und DSA Typ IV (vgl. Abb. 9). Allerdings verliefen die Markierungen der Spotbanden entsprechend der Silberfärbung der gereiften ZP nicht so weit in den basischen pI-Bereich wie die bei den 2D-Membranen der ungereiften Eizellen. Über dies hinaus war der pI-Shift, wenn man nur die lektinologische Untersuchung betrachtet, noch größer als der in der Silberfärbung. Dort betrug der Unterschied etwas über eine pI-Einheit und bei der Analyse mit Lektinen ca. 2 pI-Einheiten (z.B. AAA: vgl. Abb. 8f mit Abb. 9a2). Diese Vergrößerung der Differenz beruht darauf, dass bei den 2D-Membranen mit ZP von M II Oozyten selbst die Lektine mit Signalmuster Typ IV nicht mehr den kompletten Bereich von ZPB/ZPC bis zum basischen Ende entsprechend der Silberfärbung sichtbar markierten, auch nicht bei erhöhten Konzentrationen und verlängerten Belichtungszeiten.
Abb. 9: Chemilumineszenz von 1D- und 2D-Membranen mit gereifter ZP und Lektinen (alle PAGE unter nicht reduzierenden Konditionen; die Banden der Molekulargewichts-standardproteine auf der jeweiligen linken Seite der Bilder entsprechen von oben nach unten einem relativen Molekulargewicht von 97,4 kDa, 66,2 kDa und 45,0 kDa)
a1 u. a2: ein und dieselbe 2D-Membran mit 120 ZP, erst mit Con A (a1), Signalmuster Typ II,
und nach „Strippen“ mit AAA (a2), Signalmuster Typ IV, inkubiert b1, b2 u. b3: b1 = Standardproteine; b2 u. b3 ein und dieselbe Proteinspur auf
derselben 1D-Membran mit 30 ZP, erst mit Con A (b2), Signalmuster Typ II, und nach „Strippen“ mit AAA (b3), Signalmuster Typ IV, inkubiert
c: 2D-Membran (265 ZP) mit DSA, Signalmuster Typ IV
a1 a2
b3 c b2
b1
pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7
pI 3 4 5 6 7