Die lektinologischen Untersuchungen der Glykoproteine der ZP haben noch keine eindeutigen Erklärungen für den pI-Shift in Richtung Anode nach der IVM gebracht. Es wurden auch keine zusätzlichen Hinweise für weitere Veränderungen während der Reifung gefunden. Aus diesem Grund wurde eine funktionelle Untersuchung angeschlossen, um die These über Veränderungen der ZP während der In-vitro-Reifung zu untermauern. Die Fähigkeit der ZP, die Akrosomreaktion bei kapazitierten Spermien auszulösen, wurde dazu als Untersuchungsparameter eingesetzt. Isolierte ZP wurde mit kapazitierten Spermien inkubiert und der Anteil der in Akrosomreaktion befindlichen Spermien ausgewertet. Parallel dazu wurde der Prozentsatz der akrosomreagierenden Spermien einer Kontrollsuspension bestimmt. Dieser Anteil wurde dann von dem im Bindungstest ermittelten subtrahiert und so erhielt man den Wert, der für die Induktion durch die ZP steht.
Die Fähigkeit der ZP, die Akrosomreaktion zu induzieren, wurde schon vielfältig in Untersuchungen als Hilfsmittel herangezogen. Beispielsweise kann so der Erhalt der Funktionalität von gelagerten Eizellen überprüft werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, die Akrosomreaktion einer bovinen Spermienpopulation durch ein synthetisches Peptid analog zu einer ZPC-Sequenz zu induzieren (HINSCH 1998).
Mit dem in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Spermien-ZP-Bindungstest konnte gezeigt werden, dass die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion durch die ZP abhängig vom Reifungsstatus der Oozyten ist. Dieser Unterschied kommt bei dem gewählten Beobachtungszeitraum von zwanzig Minuten besonders innerhalb der ersten zehn Minuten zum Ausdruck. Der Anteil der akrosomreagierenden Spermien, welche an die ZP gebunden hatten, war beim Vergleich der ZP verschiedenen Reifungsgrades zu Anfang und Ende des Versuches in etwa gleich. Die Übereinstimmung am Anfang weist darauf hin, dass die Reifungsstadien die Spermien der Populationen nicht unterschiedlich selektieren. Der Unterschied besteht darin, dass die Entwicklung sowohl bei den Frischspermien als auch bei den epididymalen TG-Spermien bei der ZP in M II zwischen einer und zehn Minuten wesentlich schneller abläuft. Besonders ausgeprägt ist dies beim Einsatz der ejakulierten Frischspermien. Innerhalb der ersten zehn Minuten wird bei diesen durch die gereifte ZP die
Akrosomreaktion ca. doppelt so schnell induziert wie bei der ungereiften ZP. Nach zehn Minuten hat der Anteil der PNA-FITC positiven Spermien schon fast seinen Endwert erreicht.
Um genauere Aussagen über die Funktionalität der ZP im Hinblick auf die Induktion der Akrosomreaktion machen zu können, muss noch die sogenannte spontane Akrosomreaktion berücksichtigt werden. YANAGIMACHI (1994) weist darauf hin, dass sich die wahre Akrosomreaktion, die bei lebenden, motilen Zellen stattfindet, von dem degenerativ an toten Zellen stattfindenden Vorgang zu unterscheiden ist. Unter der spontanen Akrosomreaktion versteht man Spermien, die ohne Einfluss von ZP oder bestimmten Substanzen (z.B. Lyso-Phosphatidylcholin, Heparin, Hyaluronsäure etc.) eine Auflösung der äußeren Membranen aufweisen. Die durch Agonisten induzierte Akrosomreaktion findet mit größter Effizienz an ZP derselben Spezies innerhalb weniger Minuten nach Erreichen des Kapazitationszustandes statt (YANAGIMACHI 1994). Die spontane Akrosomreaktion verläuft hingegen eher langsam. Ein Ansatzpunkt zur Unterscheidung dieser beiden Arten einer Akrosomreaktion ist, parallel zur Akrosomreaktion eine Vitalfärbung der Spermien einzusetzen.
Dies war aber in den hier beschriebenen Bindungstests nicht möglich. Die aufgrund des zügigen Ablaufs der ZP-induzierten Akrosomreaktion gewählten Beobachtungszeitpunkte von einer, zehn und zwanzig Minuten machten eine Konservierung des Spermienstatus nötig, da in den Zwischenzeiten die ZP mit den gebundenen Spermien nicht ausgewertet werden konnte. Durch die Fixierung (mit 2,5% Glutardialdehyd) kommen die Spermatozoen in einen avitalen Zustand, der sich in einer Propidiumjodid positiven Anfärbung darstellt. Diese Anfärbung konnte folglich innerhalb der Bindungstests nur als reine Zählfärbung eingesetzt werden (vgl. FLESCH et al. 2001). Die parallel untersuchte Spermienkontrollsuspension ohne ZP wurde nicht fixiert. Bei den gleichzeitig durchgeführten Färbungen mit Propidiumjodid und PNA-FITC wurden als Zeichen der spontanen Akrosomreaktion nur Spermien beobachtet, die, wenn sie PNA-FITC positiv waren, auch durch Propidiumjodid markiert wurden. Allerdings ist es auch schwierig, eine induzierte Akrosomreaktion (z.B. durch Lyso-Phosphatidylcholin) in Suspension nachzuweisen, da flowzytometrische Untersuchungen zeigten, dass der Zeitraum von der Induzierung der Akrosomreaktion bis zum Zelluntergang sehr kurz ist (ASCHWORTH et al. 1995). Eine Erfassung ist daher nur im
flowzytometrischen Diagramm und nicht in der Beurteilung von Spermienpräparaten aus Suspensionen möglich.
Zur Vermeidung von Bindungen avitaler Spermien und Spermienaggregationen an die ZP wurde mit einer Minute eine sehr kurze Koinkubationszeit gewählt. Es ist davon auszugehen, dass daher nur kapazitierte, akrosomintakte Spermatozoen an die jeweilige ZP gebunden haben. Trotzdem wurde in einem Rechenmodell bei allen drei Beboachtungszeitpunkten der Ausgangswert bei einer Minute der in spontaner Akrosomreaktion befindlichen Spermien innerhalb der Kontrollsuspension von dem Wert der PNA-FITC positiven gebundenen Spermien abgezogen. Um auch die Möglichkeit zu berücksichtigen, dass eben doch der gleiche Anteil der Spermien an der ZP, wie der in der Suspension, degenerativen Prozessen unterliegt, wurde noch eine weitere Rechnung aufgestellt. Den Anteilen der akrosomreagierenden Spermien an der ZP wurde der zu jedem Zeitpunkt entsprechende Anteil in der Kontrollsuspension abgezogen. Welches Modell nun den Tatsachen entsprechen mag, ist für den dargestellten Einfluss gereifter ZP nicht von größerer Bedeutung. Eine beschleunigte Akrosomreaktion an der gereiften ZP innerhalb der ersten zehn Minuten war in jedem Berechnungsmodell zu beobachten.
Somit konnte mit den Studien zur Induktion der Akrosomreaktion neben dem pI-Shift ein weiterer Hinweis für Veränderungen der Zona pellucida während der IVM erbracht werden.
Ansatzpunkte zur Erklärung der beschleunigten Induktion der Akrosomreaktion durch die Zona pellucida in vitro gereifter Oozyten
Für Aussagen über die Art der funktionellen Veränderungen der Zona pellucida während der In-vitro-Reifung muss die Vermittlung der Spermienbindung an die ZP betrachtet werden.
Am besten untersucht sind dabei die Vorgänge bei der Maus. ZPC wurde als primärer Spermienrezeptor identifiziert (BLEIL u. WASSARMAN 1980b) und α-Galaktosereste am nicht reduzierten Ende von O-glykosidischen Kohlenhydraten als Spermienrezeptoren proklamiert (BLEIL u. WASSARMAN 1988). In den folgenden Jahren wurden noch weitere Zucker der O-Glykane der ZPC auf ihre Interaktionen mit murinen Spermien untersucht.
NIXON et al. (2001) beschreiben so, dass mindestens vier unterschiedliche
Monosaccharidreste an der primären Spermienbindung beteiligt sind, nämlich α-Galaktose, β-N-Acetylglukosamin, Fucose und Mannose. Weiterhin bestehen Hinweise, dass auch bei der Maus Strukturen der N-glykosidischen Kohlenhydrate an der Gametenerkennung beteiligt sein können (YAMAGATA 1985), wie es beim Schwein der Fall ist (NAKANO u.
YONEZAWA 2001).
Zunächst wurde im porcinen Organismus den O-Glykanen von ZPB eine Rezeptoraktivität zugesprochen (YUREWICZ et al. 1992). In neueren Untersuchungen (NAKANO u.
YONEZAWA 2001) konnte jedoch gezeigt werden, dass die neutralen N-Glykane des gesamten ZPB/ZPC Komplexes eine Bindungsaffinität für Spermatozoen besitzen. Innerhalb der Kohlenhydratketten vom komplexem Typ wird den tri- und tetraantennären Ketten eine größere Bindungsaffinität als den diantennären Ketten attestiert. Dominierend scheinen dabei die Saccharide zu sein, die mit Asn220 in der N-terminalen Region von endo- β-Galaktosidase-gespaltenen ZPB verknüpft sind. Den Strukturen von ZPC kommt eher eine unterstützende Funktion zu.
Die beschriebenen Kohlenhydratketten sind für die primäre Bindung des Spermiums an die Zona pellucida zuständig. Eventuell finden an der ZP während des Reifungsprozesses Veränderungen statt, welche die Interaktion der Gameten optimiert. Die lektinologischen Analysen wiesen keine Unterschiede in der Verteilung der untersuchten Zuckerstrukturen auf.
Eine für die Spermien günstigere Präsentation der Rezeptoren auf der Oberfläche der intakten ZP wäre denkbar. Allerdings spricht die ähnliche Ausgangslage des Spermienstatus bei ungereifter und gereifter ZP zum Zeitpunkt von einer Minute im Bindungstest nicht unbedingt für eine veränderte Rezeptorpräsentation.
Es muss folglich der weitere Schritt, nämlich die Induktion der Akrosomreaktion und die dafür verantwortlichen Strukturen betrachtet werden.
Bei der Maus ist dafür wiederum ZPC verantwortlich (WASSARMAN u. LITSCHER 2001).
Durch die Verbindung von β(1-4)-Galaktosyltransferasen (GalT) auf der Spermienmembran durch ZPC wird ein pertussistoxin-sensitives G-Protein aktiviert. Dieses ist direkt mit der entsprechenden GalT-Domäne im Zytoplasma verbunden, welche die Akrosomreaktion auslöst (GONG et al. 1995). NIXON und Mitarbeiter (2001) sehen in Polymeren von N-Acetylglukosamin (GlcNAc) die für die Klusterbildung der GalT verantwortliche Struktur.
Bei anderen Tierarten, eventuell auch zusätzlich bei der Maus, scheint die Peptidstruktur vom
Glykoprotein ZPC für die Auslösung der Akrosomreaktion bedeutender zu sein als die Kohlenhydratstruktur. Der Nachweis der Induzierbarkeit der Akrosomreaktion durch synthetische Peptide basierend auf einer Aminosäurensequenz von ZPC bei bovinen Spermatozoen untermauert diese Vermutung (HINSCH 1998).
Für das Schwein fehlen noch genauere Angaben über die Auslösung der Akrosomreaktion.
Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass innerhalb der ZP während der IVM Vorgänge ablaufen, die das Vermittlungs- und Aktivierungssystem zur Induktion der Akrosomreaktion so konditioniert, dass diese Prozesse schneller und effektiver ablaufen können.