2.1. Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelelektrophorese der ZP
Für die Gelelektrophorese musste zunächst eine Probenaufarbeitung erfolgen. Die in Aqua bidest., pH 8,0 eingestellt mit Natronlauge, vorliegenden Zonae pellucidae (ZP) wurden in einem Heizblock für zwei Stunden bei 72°C solubilisiert. Anschließend zentrifugiert man das Gemisch für 10 min bei 15.000 xg scharf ab, um nicht gelöste Anteile abzutrennen.
Der Überstand konnte für die Analysen verwendet werden.
Die Proteinkonzentration wurde bei einer nicht genau definierten Anzahl an Zonae pellucidae, beispielsweise wenn sie durch die Massenaufarbeitung gewonnen wurden, mittels Messung der Optischen Dichte (OD) ermittelt und dafür die Extinktion bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmt.
Nach folgender Formel wurde dann die Kozentration der ZP-Lösung bestimmt:
gemessene OD bei 280 nm Konzentration der ZP-Lösung = ____________________________________
1,17 (1 mg/ml ZP ≈ 1,17 OD)
Die eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophrese (1D-PAGE) wurde in modifizierter Form mit der nach LAEMMLI (1970) beschriebenen Methode durchgeführt.
Hierbei wurden die Proteine gemäß ihrer Netto-Ladung, Größe und Gestalt durch das Anlegen eines elektrischen Feldes getrennt. Durch die Einstellung der Porengröße des sehr stark vernetzte Polyacrylamidgels, welches als trennende Matrix fungiert, kann die Wanderungsstrecke eine optimale Trennung der Proteine in einem bestimmten Molekulargewichtsbereich ermöglichen. Anhand eines mitlaufenden Standards können die Molekulargewichte neuer, unbekannter Proteine ermittelt werden.
Es wurden selbsthergestellte, 0,75 mm starke, 10%ige (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) und 6 x 8,3 cm große Polyacrylamidgele verwendet. Diese wurden nach Polymerisierung mit einem 4,5%igem Sammelgel überschichtet, in dem durch den Einsatz eines Kunststoffkammes jeweils zehn Taschen zur Probenaufnahme ausgeformt wurden.
Die Proben zur Analyse wurden im Verhältnis 1:2 mit Laemmli-Auftragspuffer (s.
Rezeptverzeichnis in J Anhang) verdünnt, fünf Minuten bei 95°C erhitzt und eine Minute bei 13.000 xg zentrifugiert. Ebenso wurde mit dem Standard LMW (Low Molecular Weight Proteinstandard, 161-0304; BioRad, München) verfahren. Sollten im Anschluss an die 1D-PAGE die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert werden, so wurde ein biotinylierter LMW Standard (161-0306; BioRad, München) verwendet.
Die Trennung der Proteinproben erfolgte in einer Elektrophoresekammer (Mini-Protean II;
BioRad, München), welche mit Laufpuffer (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) gefüllt wurde.
Während der Passage der Proben des Sammelgeles (Marker: Bromphenolblau) startet man den Elektrophoreselauf mit 100 V, im Trenngel wird auf 200 V erhöht. Der Lauf wurde mit dem Auslaufen des Frontmarkers am unteren Rand beendet.
Die aufgetrennten Polypeptide wurden nun für weitere Analysen auf eine PVDF-Blotmembran transferiert oder wurden direkt auf dem Gel angefärbt Coomassie-Färbung detektiert.
Dazu wurden die Gele für ca. 30 min bei Raumtemperatur in der Färbelösung (0,25%
Coomassie Brilliant Blue R (Nr. 35051; Serva, Heidelberg); 40% Methanol; 10% Eisessig) leicht geschwenkt. Zur Entfärbung des Hintergrundes wurden die Gele unter leichtem Schütteln in einer Entfärbelösung (20% Methanol; 10% Eisessig), welche mehrmals
gewechselt wurde, gewaschen. Das Gel wurde zwischen zwei Cellophanseiten (Gel Drying Film; Promega, Madison) getrocknet.
Anhand der 1D-PAGE wurden die Zona pellucida-Proben auf ihre Reinheit überprüft und die molekularen Massen ihrer Polypeptide ermittelt.
2.2. Zweidimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der ZP
Bei der zweidimensionalen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) werden die Proteine nicht nur nach der molekularen Masse, sondern auch nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt. Die beiden Auftrennungskriterien stehen im Gel senkrecht zueinander, so dass ein zweidimensionales Trennungsbild entsteht. In einem Gel mit linearem pH-Gradienten wandern die geladenen Substanzen nach Anlegung einer elektrischen Spannung an eine Position, die ihrem isoelektrischen Punkt entspricht. Der isoelektrische Punkt (IP) ist der pH-Wert einer Lösung, bei dem die Dissoziation der basischen und sauren Gruppen eines amphoteren Stoffes gleich stark und folglich die Summe der Ladungen gleich Null ist.
Die isoelektrische Fokussierung (IEF) der ersten Dimension wurde mittels des Multiphor II Systems (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Dazu wurden immobilisierte pH-Gradienten-Gele (IPG) mit einem linearen pH-Gradienten von pH 3 bis pH 10 mit einer Länge von 7 cm (Immobiline DryStrips; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) verwendet.
Die zu untersuchende Zona pellucida-Probe wurde nach der Solubilisierung im SpeedVacPlus (Sc 110 A; Servant, Incorporated, New York, USA) auf 15 µl eingeengt, welche anschließend mit Rehydrationslösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) auf 125 µl aufgefüllt wurde.
Diese Lösung gibt man in einem der Länge des IPG-Strips entsprechenden IPGphor Strip Holder (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Der aufgetaute IPG-Strip wurde vorsichtig aufgelegt und mit ca. 250 µl Mineralöl überschichtet.
Die Fokussierung wurde bei 20°C durchgeführt und nach einem ausgearbeitetem Programm (15 h Rehydration bei 50 V, 1 h bei 150 V, 1 h bei 500 V, 1 h bei 1000 V und in der letzten Stufe bei 4000 V bis zum Erreichen von 20.000 Vh) gestartet.
Am Tag nach der Fokussierung (Dauer ca. 24 h) ist es möglich, die Streifen mit den fokussierten Proteinen bei –80°C einzufrieren. Bei den beschriebenen Versuchen wurde jedoch darauf verzichtet und die zweite Dimension gleich angeschlossen.
Für die zweite Dimension, die PAGE, muss der IPG-Strip erst in einer Lösung bei Raumtemperatur unter Schütteln äquilibriert werden. Für die ersten 15 Minuten gibt man DTT und für die nächsten 15 Minuten Jodacetamid zu der Äquilibrierlösung (s.
Rezeptverzeichnis in J Anhang). Um eine Reduktion und die damit verbundene Aufspaltung von Proteinen zu vermeiden, wurde nach einigen Versuchen auf den Zusatz von DTT verzichtet.
Die Gele und die Vorbereitung des Proteinstandards für die 2D-PAGE entsprachen denen der 1D-PAGE, lediglich wurde für die Formung der Taschen ein anderer Kunststoffkamm verwendet, so dass eine Tasche für den Standard und eine sieben cm lange Tasche für den IPG-Strip geschaffen wurde. Der äquilibrierte Gelstreifen wurde mittels Laemmli-Auftragspuffer so in die Geltasche eingeschoben, dass die Anode (pH 3) an der Seite mit den Molekulargewichtsstandardproteinen positioniert wurde. Der Streifen wurde abschließend mit erhitzter flüssigen 0,3%igen Agarose überschichtet.
Der Elektrophoreselauf wurde mit 100 V gestartet und mit Erreichen der Front des Trenngels auf 200 V erhöht.
Die doppelt aufgetrennten Proteine wurden entweder auf eine Blotmembran übertragen, oder mit einer Silberfärbung, welche sensitiver als die Coomassie-Färbung ist, angefärbt.
Bei der Silberfärbung wurde eine modifizierte Methode nach HEUKESHOVEN (1988) angewendet. Zunächst wurden die Gele über Nacht in 12,5% Trichloressigsäure fixiert.
Anschließend wurden sie viermal für 10 Minuten mit Aqua bidest. auf einer Schüttelbank gewaschen und für 60 Minuten in der Inkubationslösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) geschwenkt. Nach erneuter Waschung (6 x 10 min in Aqua bidest.) schloss sich der 30minütige Färbevorgang (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) an. Die Gele wurden nun nach kurzem Schwenken in Aqua bidest. in der Entwicklerlösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) bis zum gewünschten Ergebnis (sec-min) gefärbt. Die Farbreaktion wurde durch eine Stopplösung (0,05 M Glycin) beendet. Nach 5-10 min konnten die Gele in Wasser gelagert und anschließend getrocknet werden.