Zur Untersuchung des funktionellen Einflusses des Reifungsgrades der Zona pellucida wurde ein Spermien-ZP-Bindungstest entwickelt. Mit diesem Assay konnte die Fähigkeit der ZP, die Akrosomreaktion zu induzieren, beurteilt werden. Als Spermienpopulationen wurden ejakuliertes Frischsperma und kryokonserviertes Nebenhodensperma einer Charge verwendet.
5.1. Aufbereitung der Spermien
Frischsperma:
Es wurde die spermienreiche Phase eines Institutsebers gewonnen und Volumen, Aussehen, Dichte, Motilität, Morphologie, Vitalität und Akrosomstatus bestimmt. Zur Selektion der motilen Spermien und Entfernung des größten Teils an Seminalplasma wurde ein Swim-up durchgeführt. Dazu wurden acht Zentrifugenröhrchen (20ml mit rundem Boden; Sarstedt, Niembrecht) mit 10 ml vorgewärmten Androhep-Puffer (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) mit je einem ml der spermienreichen Phase unterschichtet und für 45 Minuten bei 37°C in einem Wasserbad (Typ 1012, Gesellschaft für Labortechnik, Burwedel) inkubiert. Nach dem Swim-up wurde die motile Spermienfraktion aus dem oberen Drittel der Röhrchen entnommen und zur Konzentration zentrifugiert (5 min bei 550 xg; Megafuge 2.0 R, Haraeus,
Hanau). Das Spermienpellet wurde mit modifizierter Tyrodelösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) aufgeschwemmt. Mittels Zählkammer nach Thoma wurde die Dichte auf 107 Spermien pro ml eingestellt.
Tiefgefriersperma:
Als Tiefgefrier-(TG)-Sperma wurden freundlicher Weise 0,25 ml Pailletten (Minitüb GmbH, Landshut) mit je 50 Millionen Nebenhodenspermien von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. D. Rath (Forschungsanstalt für Landwirtschaft, Mariensee) zur Verfügung gestellt. Die in flüssigem Stickstoff gelagerten Pailletten wurden für 30 sec in einem 37°C warmen Wasserbad aufgetaut. Zur Entfernung des TG-Verdünners wurde jeweils der Inhalt von zwei Pailletten in 10 ml Androhep-Puffer bei 550 xg für fünf Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in modifizierter Tyrodelösung resuspendiert und die Dichte ebenfalls auf 107/ml eingestellt.
5.2. Spermatologische Untersuchung
Die Frischsamenproben wurden nach Gewinnung untersucht auf Aussehen, Motilität, Dichte, Morphologie, Vitalität und Akrosomstatus. Nach der Resuspendierung, Dichteeinstellung und folgender 15minütigen Äquilibrierung im Brutschrank (Nuaire US Autoflow; Zapf, Langenhagen) bei 38,5°C und 5% CO2 wurden die Spermien erneut auf Motilität und Vitalität untersucht und der akrosomale Status bestimmt. Die Untersuchungen des TG-Spermas erfolgten analog.
Die primären Analysen (alle Punkte bis auf Vitalität und Akrosomstatus) wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop (Zeiss 1697, Jena) durchgeführt. Die verwendeten Deckgläser, Objektträger und Pasteurpipetten wurden auf einem Heiztisch (Minitüb GmbH, Landshut) bei 38°C vorgewärmt. Ebenso war die Wärmeplatte des Mikroskops angewärmt.
- Makroskopische Beurteilung
Die Ejakulate wurden nach ihrer Farbe (grau bis weiß) und ihrer augenscheinlichen Dichte (wässrig-molkig, molkig-milchig, und milchig-rahmig) eingestuft.
- Motilitätsbestimmung
Im nativen Ejakulat und in den Inkubationsmedien wurde der Prozentsatz der motilen Spermien geschätzt. Als motil galten sowohl die vorwärts- als auch die ortsbeweglichen
Spermien. Jeweils ein 5 µl Tropfen wurde unter dem Mikroskop bei 160facher Vergrößerung beurteilt.
- Dichtebestimmung
Die Bestimmung erfolgte mittels einer Zählkammer nach Thoma. In 10 ml 0,9%iger NaCl-Lösung wurden 25 µl (natives Ejakulat) bzw. 50 µl Spermasuspension verdünnt. Die Spermien in der Kammer wurden ausgezählt und die Dichte der Ursprungssuspension errechnet.
- Morphologie
Für die Bestimmung der abweichenden Spermienformen wurden 50 µl Spermiensuspension in 300 µl Formolzitrat-Lösung (37%ige Formaldehydlösung u. 29%ige Natriumzitratlösung im Verhältnis 1:24) fixiert. Die Beurteilung der morphologischen Abweichungen erfolgte bei 1000facher Vergrößerung (mit Ölimmersion) nach den von KRAUSE (1966) aufgestellten Kriterien.
-Vitalität
Die Impermeabilität der intakten Zellmembran für den Fluoreszenzfarbstoff Propidiumjodid (PI) erlaubt eine Unterscheidung der lebenden und toten Spermien. Die Zellen mit beschädigter Kopfmembran (zu meist tote) stellen sich bei Betrachtung durch einen 560 nm Filter leuchtend rot dar. Membranintakte Spermien weisen keine Fluoreszenz auf.
Der Farbstoff Propidiumjodid (Sigma Aldrich, Deisenhoffen) wurde vorbereitend in Aqua bidest. mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml gelöst und in 1 ml Aliquoten bei –18°C in Dunkelheit gelagert (HARRISON u. WICKERS 1990). Kurz vor Gebrauch wurde die Lösung aufgetaut und im Dunklen gehalten. Für die PI-Färbung wurde die jeweilige Spermiensuspension 50:1 mit der aufgetauten Färbelösung versetzt und fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss inkubiert. Die Auswertung mit einer Zählung von mindestens 100 Spermien erfolgte unter einem Fluoreszenzmikroskop (Axiovert; Zeiss, Jena) mit dem entsprechenden Filtereinsatz.
- Bestimmung des akrosomalen Status
Für den Nachweis der Akrosomreaktion wurde das Lektin Peanut agglutinin (PNA), welches an den Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) gekoppelt war, eingesetzt (CROSS u. MEIZEL 1989). Im Gegensatz zu den humanen Spermatozoen, bei denen die Zielstruktur von PNA die äußere akrosomale Membran ist, bindet PNA beim Eber an die
Glykoproteine in der akrosomalen Matrix, wenn die äußere Membran permeabel ist. In diesem Fall leuchtet der akrosomale Inhalt grün-gelb bei der Betrachtung durch einen Filter mit einem Exzitationsmaximum bei 365 nm.
PNA-FITC (Vektor über Alexis Deutschland, Grünberg) wurde in einer Konzentration von 10 µg/ml in 1 ml Portionen bei –20°C eingefroren und am Versuchstag unter Lichtausschluss aufgetaut. Zu 9 Teilen Spermiensusspension wurde 1 Teil Lektinlösung gegeben (Endkonzentration 1 µg/ml). Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die Auszählung unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Die PI-Anfärbung wurde gleichzeitig mit der PNA-FITC-Anfärbung in der jeweils selben Suspension durchgeführt.
5.3. Induktion der Akrosomreaktion durch die Zona pellucida
Um die funktionellen Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien der Zona pellucida zu untersuchen, wurde ein Spermatozoon-Zona pellucida-Bindungstest durchgeführt, der den Verlauf des akrosomalen Zustandes der gebundenen Spermien darzustellen erlaubt.
Die in hyperosmolarer Salzlösung gelagerten Oozyten wurden nach mehrfachem Waschen durch PBS/PVA 2% Tropfen mit einer dünn ausgezogenen Pipette eröffnet und die Zonae pellucidae isoliert. Diese wurden dann bis zum Versuchsanfang in PBS/PVA 2% gelagert.
Die folgenden Versuche wurden vergleichend mit Oozyten im GV I und Metaphase II Stadium durchgeführt.
Die zwei Populationen von Spermien (Frischsperma u. TG-Sperma) wurden wie beschrieben aufbereitet und untersucht. Nach Einstellung der Dichte auf 107 Mio/ml in modifizieter Tyrodelösung wurden die Spermien für 15 Minuten im Brutschrank (38,5°C, 5%CO2) äquilibriert.
Genauso wurde mit den Zonae pellucidae verfahren, nachdem 30 Stück in eine der vier Abteilungen einer Gewebekulturschale (Greiner GmbH, Frickenhausen) in je 50 µl modifizierter Tyrodelösung platziert worden waren.
Nun wurden zu den Zonae pellucidae in die entsprechende Abteilung 5 µl der Spermiensuspension gegeben (ca. 50.000 Spermien) und im Brutschrank koinkubiert. Nach 1
Minute wurden alle Zonae pellucidae mehrmals in PBS/PVA 2% gewaschen und 10 Zonae zur Fixation entnommen. Weitere 10 wurden jeweils für 10 und 20 min ab Beginn weiter koinkubiert, dann jeweils wieder gewaschen und fixiert. Parallel zu diesen Zeitpunkten wurden die Spermien, die zur Kontrolle ohne Zona pellucida weiter im Brutschrank inkubiert wurden, auf Motilität, Vitalität und Akrosomreaktion untersucht.
Die Zona pellucida wurde mit den gebundenen Spermien für 10 Minuten in 2,5 % Glutardialdehyd fixiert. Nach kurzem Waschen in 0,1 M Glycinlösung wurden die einzelnen Zonae pellucidae nochmals fünfmal durch PBS/PVA 2% Tropfen gewaschen. Zum Anfärben der gebundenen Spermien wurden die ZP in 50 µl PBS/PVA 2% mit PI- und PNA-FITC-Färbelösung entsprechend der Spermienanfärbung gesetzt. Diese wurden dann für fünf Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert.
Die PI-Anfärbung dient hier als reine Zählfärbung (vgl. FLESCH et al. 2001), da die äußere Spermienmembran in jedem Fall durch die Fixierung beschädigt wurde.
Nach Färbung der koinkubierten Zonae pellucidae wurden diese auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gesetzt. Die gebundenen Spermien wurden nun unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 400facher und 1000facher (mit Ölimmersion) Vergrößerung ausgewertet. Es wurde die Gesamtanzahl der gebundenen Spermien, die PI-positiven Spermien, die PNA- und PI-positiven Spermien, die Menge der isolierten abgelösten Akrosome und die der PI positiven Spermien mit abgelöstem Akrosom bestimmt.
Die Dokumentation erfolgte mittels einer angeschlossenen Fotoeinrichtung.
5.4. Statistische Auswertung
Zum Vergleich der ungereiften und der gereiften Zona pellucida in ihrer Wirkung auf die jeweiligen Spermienpopulationen wurde eine statistische Auswertung vorgenommen.
Mit Hilfe der deskriptiven Statistik wurden jeweils für die Zonae pelucidae mit gleichem Reifungsstatus, Beobachtungszeitpunkt und Spermienart dieselben Parameter erfasst.
Mit der zur Verfügung stehenden Prozedur MEANS des Statikstik-Paketes SAS® (Statistical Analysis System Institute Ltd, Version 6.02) wurden Mittelwerte, Standardabweichung, Minimum und Maximum berechnet.
Mit Hilfe der multifaktoriellen Varianzanalyse wurden die Werte der PNA-FITC positiven Spermien an der ZP im Rahmen der GLM(General Linear Models)-Prozedur in Abhängigkeit von Reifungsstatus der ZP, Zeitpunkt, Spermienpopulation und der jeweiligen Wechselwirkungen dieser Faktoren untereinander untersucht.
Das zugrundeliegende Modell wird folgender Maßen beschrieben (GOGOLOK et al. 1992;
SCHUEMER et al. 1992):
Yijkl = µ + αi + βj + γk + αβij + αγik + βγjk + αβγijk + εijkl wobei
Yijk der Messwert der abhängigen Variablen Y für die l-te Beobachtung unter der Stufe j, i bzw. k von dem jeweiligen Einflussfaktor ist, µ der Gesamtmittelwert ist,
αi, βj, γk die Mittelwerte für die Effekte von Einflussfaktoren A, B und C sind, αβij, αγik, βγjk, αβγijk die Wechselwirkungseffekte für die jeweilige Stufe von
A, B und C sind und εijkl ein Fehler ist.
Aufgrund der sich bei der dreifaktoriellen Varianzanalyse ergebenen signifikanten Einflüsse wurde zur Bestimmung einzelner Zusammenhänge die Parameter dieser Analysenform weiterführend untersucht. Es wurden nach Reifungsstadium der ZP, Spermienpopulation und Beobachtungszeitpunkt Gruppen gebildet und diese entsprechend dem erläuterten Modell in einer zwei- bzw. einfaktoriellen Varianzanalyse beschrieben.
Für eine optimierte Darstellung des Zeiteinflusses wurde die Steigung der Geraden ermittelt, die in einem Zeitdiagramm mit den PNA-FITC positiven Werten entsteht. Für die Beschreibung der Geraden wurde folgende Formel angewendet:
y = ax + b mit a = Steigung; b = y-Achsenabschnitt;
x = Wert der x-Achse; y= Wert der y-Achse
Die Wahrscheinlichkeitswerte p≤0,001 wurden als statistisch hoch signifikant, die Werte p≤0,05 als statistisch signifikant und die Werte p≤0,1 als statistisch auffallend betrachtet.