Nach den vorangegangenen Untersuchungen sollte nun der Einfluss der beobachteten Veränderungen der Zona pellucida während der In-vitro-Reifung in funktioneller Hinsicht untersucht werden. Eine Aufgabe der ZP unter physiologischen In-vivo-Bedingungen ist es, die Akrosomreaktion des gebundenen (first binding) Spermiums zu induzieren. Daher wurde diese Funktion unter In-vitro-Bedingungen vergleichend zwischen isolierter ZP von Oozyten im GV I und M II Stadium untersucht. Dazu wurden ejakulierte Frischspermien bzw.
kryokonservierte epididymale Spermien (TG-Sperma) nach 15minütiger Vorkapazitation mit den ZP für eine Minute koinkubiert und dann der ungebundene Anteil entfernt. Die Auswertung der Anzahl der gebundenen Spermien erfolgte nach einer, zehn und zwanzig Minuten. In Akrosomreaktion befindliche Spermien stellten sich als PNA-FITC-positiv dar (s.
Abb. 11). Schon der optische Vergleich der Bilder innerhalb eines Reifungsstadiums zu den verschiedenen Beobachtungszeitpunkten lässt eine Zunahme der sich in Akrosomreaktion befindlichen Spermatozoen erkennen (s. Abb. 12).
Abb. 11: Spermienanfärbung mit PI und PNA-FITC
1.: isoliertes Spermium der Suspension, in Akrosomreaktion befindlich 2.: Spermien an der ZP, fixiert und somit permeabilisiert für PI
auch wenn Akrosom intakt ( )
a : Fluoreszenzlicht; b: Hellfeld; a u. b : 1000fache Vergrößerung, Ölimmersion 1.b
2.b 1.a
2.a
Abb. 12: Spermien, gebunden an ZP, in Propidiumjodid (PI) und PNA-FITC Anfärbung Die Bilder wurden von ZP ungereifter
Oozyten mit ejakulierten Frischspermien angefertigt, aufgrund der Fixation sind die Membranen aller Spermien durchlässig für PI.
a : Beobachtungszeitpunkt 1min b : Beobachtungszeitpunkt 10 min c : Beobachtungszeitpunkt 20 min
a b
c
Die deskriptive Statistik der erhobenen Parameter, sowohl an der ZP als auch bei den Spermien in der Kontrollsuspension ohne ZP, sind unter 2. in J Anhang tabellarisch aufgelistet. Die Werte des untersuchten nativen Frischspermas und der Kontrollsuspension von Frisch- und TG-Sperma befanden sich in physiologischer Norm, so dass die beurteilten Spermienfraktionen zum Versuchseinsatz kommen konnten. Der erhöhte Anteil der Plasmatropfen (ca. 25 %) bei den epididymalen TG-Spermien ist auf die noch nicht abgeschlossene Abschnürung dieses Tropfens im Nebenhoden zurückzuführen (vgl. 2.1.
Aufbau u. Entwicklung des Spermiums unter B Literaturübersicht).
Die folgende Analyse bezieht sich vornehmlich auf die erhobenen Werte für den Anteil der PNA-FITC positiven Spermien als Maß der Akrosomreaktion. Die Auswertung der beschreibenden Statistik dieses Beobachtungsparameters sind in Tabelle 8 aufgeführt.
Tab. 8: Deskriptive Statistik der PNA-FITC positiven an ZP gebundenen Spermien
a. ejakulierte Frischspermien
b. epididymale TG-Spermien
Die Ausgangswerte der PNA-FITC positiven Spermien beim Zeitpunkt von 1 min bewegten sich sowohl bei ungereifter und gereifter ZP innerhalb derselben Spermienpopulationen jeweils im gleichen Wertebereich. Der höhere Ausgangswert der aufgetauten Spermien war u.a. durch die aufgrund der Ein- und Auftauprozesse hervorgerufene geringere Stabilität der Spermatozoenmembran zu begründen.
Bei den Versuchen mit Frischsperma fällt auf, dass sich die Mittelwerte des Anteils der akrosomreagierenden Spermien 20 min nach Versuchsbeginn bei den ZP unterschiedlichen Reifungsgrades wieder in etwa angleichen. Auffällig ist die Entwicklung dazwischen zum Beobachtungszeitpunkt von 10 min. Der Anteil der akrosomreagierenden Spermien bei der ZP ungereifter Eizellen verläuft über die gesamte beobachtete Zeitspanne von 20 min annähernd linear. Bei den gereiften Eizellen hingegen wird schon nach 10 min so gut wie der Endwert bei 20 min erreicht.
Betrachtet man die Auswertung für die Versuche mit den aufgetauten Nebenhodenspermien, so ist diese schnellere Zunahme des Anteils der PNA-FITC positiven Spermatozoen bei der ZP in M II im Vergleich zur ZP im GV I zur Zeit von 10 min noch rasanter. Bemerkenswert ist die geringe Induktion der Akrosomreaktion durch die ungereifte ZP. Der Endwert bei 20 min ist sowohl im Vergleich zu dem bei der GV I-ZP mit Frischsperma als auch bei der M II-ZP mit ebenfalls aufgetautem Sperma deutlich niedriger (ca. 9 Prozentpunkte).
a. Verwendung von ejakuliertem Frischsperma
Anteil der PNA-FITC pos. Spermien (%)
GV I
Anteil der PNA-FITC pos. Spermien (%)
GV I M II
Abb. 13: Darstellung des Anteils der in Akrosomreaktion befindlichen Spermien, die an die ZP gebunden sind, in Abhängigkeit vom Beobachtungszeitpunkt
Zur Untersuchung der Einwirkungen der einzelnen Parameter zum Anteil der akrosomreagierenden Spermien wurde eine multifaktorielle Varianzanalyse durchgeführt. Es wurde zwischen drei-, zwei- und einfaktorieller Analyse unterschieden.
Alle erhobenen Wahrscheinlichkeitswerte (p, für die gilt: p≤0,001 = statistisch hoch signifikant; p≤0,05 = statistisch signifikant; p≤0,1 = statistisch auffallend) und das Bestimmheitsmaß (R2) sind unter 2. in J Anhang aufgeführt.
Dreifaktorielle Varinazanalyse:
Die verwendeten Spermienpopulationen, der Reifungsstatus der ZP und der Zeitpunkt hatten einen statistisch signifikanten Einfluss auf den Anteil der PNA-FITC positiven Spermien. Das gleiche galt für die Wechselwirkungen der Parameter Reifungsstatus mit Zeitpunkt und Spermienpopulation mit Zeitpunkt. Die Kombination von Spermienpopulation und Reifungszustand der ZP und die Dreifachwechselwirkung von Spermienpopulation, Reifungszustand und Zeitpunkt hatten jedoch keinen statistisch signifikanten Einfluss.
Zweifaktorielle Varianzanalyse:
Hierbei wurden die Versuche aufgrund der nachgewiesenen Einflüsse und Wechselwirkungen in der dreifaktoriellen Analyse nach Spermienpopulation getrennt ausgewertet.
Innerhalb der Gruppe mit den ejakulierten Frischspermien stieg der Anteil der akrosomreagierenden Spermien mit der Zeit statistisch hoch signifikant an und die Wechselwirkung von Reifungsstatus der ZP mit dem Beobachtugnszeitpunkt war statistisch signifikant. Der Anteil der PNA-FITC positiven Spermien bei der ZP von GV I Eizellen unterschied sich nicht statistisch signifikant von dem bei der ZP von M II Eizellen.
Bei der Gruppe, in der TG-Sperma eingesetzt wurde, hingegen hatte der Reifungsstatus der eingesetzten ZP einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Induktion der Akrosomreaktion. Der Zeiteinfluss wurde als statistisch auffallend eingestuft und die Wechselwirkungen zwischen Reifungsstatus und Zeit spielten hier keine statistisch signifikante Rolle.
Ebenfalls mit der zweifaktoriellen Varianzanalyse wurden Gruppen untersucht, die nach dem Reifungsstatus der ZP eingeteilt worden waren.
Die Werte der PNA-FITC positiven Spermatozoen unterschieden sich bei der ungereiften ZP statistisch nicht signifikant nach der verwendeten Spermienart. Einen statistisch hoch signifikanten Einfluss wiesen aber sowohl der Beobachtungszeitpunkt als auch die Wechselwirkungen von diesem mit der Spermienpopulation auf.
Innerhalb der Gruppe der gereiften ZP von Oozyten im M II Stadium erhöhte die Nutzung von TG-Sperma den Anteil der akrosomreagierenden Spermien statistisch hoch signifikant.
Gleiches galt für den zeitlichen Verlauf. Den Wechselwirkungen von Spermienpopulation und Zeitpunkt kam eine statistisch auffällige Rolle zu (0,05<p≤0,1).
Einfaktorielle Varianzanalyse:
Aufgrund der sich ergebenen Abhängigkeiten und Wechselwirkungen der drei- und zweifaktoriellen Varianzanalyse wurden noch diverse einfaktorielle Analysen erstellt. So konnten die Zusammenhänge einzelner Parameter genau beschrieben werden. Für die Bildung einer Untersuchungsgruppe wurden zwei Variablen fest geschrieben und der Einfluss einer dritten innerhalb dieser Gruppe auf die Induktion der Akrosomreaktion untersucht.
Bei der Verwendung von Frischsperma hatte der Reifungsstatus nur zum Zeitpunkt von 10 min einen statistisch signifikanten Einfluss auf den Anteil der PNA-FITC positiven gebundenen Spermien.
Betrachtet man hingegen die Verhältnisse beim Einsatz des TG-Spermas, so wurde die Induktion der Akrosomreaktion durch die gereifte ZP gegenüber der ungereiften sowohl beim Beobachtungszeitpunkt von 10 min als auch bei 20 min statistisch signifikant verstärkt.
Neben dem Einfluss des Reifungsstadiums der ZP wurde auch die Abhängigkeit vom Zeitfaktor überprüft.
Der Zeitfaktor hatte beim Gebrauch von Frischsperma mit ungereifter ZP und auch mit gereifter ZP einen statistisch hoch signifikanten Einfluss auf den Anteil der PNA-FITC positiven Spermien. Bei Zona pellucida von GV I Oozyten unter Einsatz von aufgetauten Nebenhodenspermien war dies nicht der Fall, aber bei der gleichen Spermienpopulation mit Verwendung von gereifter ZP war eine statistische Auffälligkeit nachzuweisen.
Zur Kontrolle des Einwirkens der ZP wurden zu denselben Zeitpunkten wie die Spermien an der ZP Spermien in Suspension untersucht (alle Angaben siehe unter 2. in J Anhang). Der Anteil der PNA-FITC positiven Spermien in Suspension unterschied sich statistisch hoch signifikant von dem der an die ZP gebundenen. Die Zona pellucida hatte folglich in dem beschriebenen Versuchsaufbau die Fähigkeit zur Induktion der Akrosomreaktion.
Im Vordergrund dieser Untersuchung stand vor allem die Charakterisierung des Einflusses des Reifungsgrades der ZP auf die Spermatozoen bezüglich der Induktion der Akrosomreaktion. Aus der bisherigen Darstellung der statistischen Ergebnisse wird deutlich, dass die größte Unterscheidung im Zeitabschnitt von einer Minute gegenüber zehn Minuten
vorlag. Zur konkreteren Auswertung wurde daher in Modellen die Steigung der Geraden durch die entsprechenden Grafikpunkte bei 1min, 10 min und 20 min ermittelt
(siehe Abb.14). Anteil PNA-FITC pos. Spermien an ZP (%)
GV I; ejak. Frischsp.
M II; ejak. Frischsp.
GV I; aufget. Nh-Sp.
M II; aufget. Nh-Sp.
Abb. 14: Darstellung von Geraden durch die ermittelten Diagrammpunkte des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien in Abhängigkeit vom Beobachtungszeitpunkt
(ejak. Frischsp.= ejakulierte Frischspermien; aufget. Nh-Sp.= aufgetaute Nebenhodenspermien)
Die Gerade verlief bei der Verwendung von ungereifter ZP und ejakulierten Frischspermien annähernd linear mit einer Steigung von 1,26. Bei der gleichen Zonaart mit kryokonservierten Nebenhodenspermien ist anzumerken, dass die Zeit keinen statistisch signifikanten Einfluss besaß und somit die Steigung auch sehr gering (0,12) war.
In der grafischen Darstellung des Versuchsansatzes mit gereifter ZP fiel der zweiphasige Verlauf mit unterschiedlicher Steigung auf. Dieser Effekt war beim ejakuliertem Frischsperma besonders ausgeprägt. Für beide Grafen wurden also die Steigung der Geraden durch die Grafikpunkte bei 1 min bis 10 min und 10 min bis 20 min getrennt berechnet. Bei den ejakulierten Frischspermien ergab sich im ersten Zeitabschnitt eine Steigung von 2,44, im
zweiten von 0,01 (keine statistisch signifikante Unterscheidung des Zeiteinflusses von 10 min gegenüber 20 min) und für den ganzen Grafen 1,13. Nach 10 Minuten war bereits eine Art Sättigung erreicht. Der beschriebene biphasische Verlauf war unter Verwendung von kryokonserviertem Nebenhodensperma schwächer ausgeprägt. Die Steigung beläuft sich für den Bereich von 1 min bis 10 min auf 0,94, für den Bereich von 10 min bis 20 min auf 0,29 und insgesamt auf 0,58.
Die Steigung ist als Maß für die Geschwindigkeit der Induktion der Akrosomreaktion anzusehen. Diese war unter Verwendung von ejakuliertem Frischsperma innerhalb der ersten 10 Minuten bei den Versuchen mit gereifter ZP ca. doppelt so groß gegenüber denen mit ungereifter ZP. Bei Einsatz von aufgetauten epididymalen Spermien war die Anfangsgeschwindigkeit gegenüber von Frischsperma bei gereifter ZP geringer als die Hälfte.
Dennoch war der Anstieg des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien auch beim TG-Sperma in den ersten 10 Minuten wesentlich stärker bei der gereiften ZP als bei der ungereiften. Dies war vor allem durch die nur minimale Erhöhung des akrosomreagierenden Anteils der Nebenhodenspermien an der ungereiften ZP begründet.
Zum besseren Vergleich des Einflusses der beiden verwendeten Spermienpopulationen mussten zunächst beider Ausgangswerte in Suspension betrachtet werden. Schon dort lagen Spermien vor, die PNA-FITC positiv reagierten. Dies war als sogenannte spontane Akrosomreaktion, ein Zeichen des Zellverfalls, zu werten. Es war allerdings anzunehmen, dass die Spermien, die in der kurzen Koinkubationszeit von 1 min an die ZP binden, aus der vitalen akrosomintakten Teilmenge der Gesamtsuspension stammten. Der Anteil der PNA-FITC positiven Spermien zu Beginn des Bindungsversuches in Suspension betrugt beim Frischsperma ca. 8 % und beim TG-Sperma ca. 25 %. Die Ausgangswerte wurden jeweils aufgrund des möglichen Einflusses der ursprünglichen Spermiensuspension von denen an der ZP ausgezählten und prozentual dargestellten Werten abgezogen (siehe Abb.15).
Es ergaben sich dabei für alle Versuchsansätze ähnliche Ausgangswerte der PNA-FITC positiven Spermien an der ZP. Die Reaktionskinetiken blieben unverändert, da die Darstellungen in Abbildung 15 im Vergleich zu Abbildung 14 nur um die jeweiligen Ausgangswerte in der Suspension in Richtung x-Achse verschoben wurden.
Die statistisch signifikanten Einflüsse, die in den beschriebenen Varianzanalysen ermittelt wurden, blieben fast unverändert. Es änderte sich lediglich das Einwirken der Spermien. In der zweifaktoriellen Varianzanalyse innerhalb der Gruppe der ungereiften ZP waren die Durchschnittswerte der PNA-FITC positiven Spermien der aufgetauten Nebenhodenspermien im Vergleich zum Frischsperma jetzt statistisch signifikant niedriger.
0 Anteil PNA-FITC pos. Spermien an ZP (%)
GV I; ejak. Frischsp.
M II; ejak. Frischsp.
GV I; aufget. Nh-Sp.
M II; aufget. Nh-Sp.
Abb.15: Darstellung von Geraden durch die ermittelten Diagrammpunkte des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien in Abhängigkeit vom Beobachtungszeitpunkt nach Abzug der Ausgangswerte der jeweiligen Spermiensuspension
(ejak. Frischsp.= ejakulierte Frischspermien; aufget. Nh-Sp.= aufgetaute Nebenhodenspermien)
Die bisher beschriebenen Ansätze waren vor allem geeignet, die unterschiedlichen Einflüsse des Reifungsgrades der ZP herauszuarbeiten. Durch die ähnlichen Werte beim Zeitpunkt von einer Minute wurde belegt, dass der Reifungsgrad der ZP die Selektion der Spermien aus der Suspension nicht beeinflusst. Spermienpopulation abhängige Einwirkungen waren innerhalb einer Beobachtungsgruppe mit gleichen verwendeten Spermien bei ungereifter und gereifter ZP einheitlich. Für Aussagen über die Induktion der Akrosomreaktion durch die jeweilige ZP musste auch die Entwicklung des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien in der Kontrollsuspension berücksichtig werden.
Unter der Annahme, dass alle sich in der Suspension befindlichen Spermien die gleiche Chance hatten, in der Koinkubationszeit von einer Minute an die ZP zu binden, wurden folgendermaßen Daten erhoben. Von den jeweiligen Prozentwerten der PNA-FITC positiven Spermien, die an die ZP gebunden hatten, wurden die entsprechenden Werte der Spermien in der Kontrollsuspension zum selben Zeitpunkt abgezogen. Man erhielt so einen Wert, der als Maß der Induktion der Akrosomreaktion durch die ZP angesprochen werden konnte.
-5 0 5 10 15 20 25 30 35
1 10 20
Zeitpunkt (min) Anteil der PNA-FITC positiven Spermien an der ZP (%)
GV I;ejak. Frischsp.
M II; ejak. Frischsp.
GV I; aufget. Nh-Sp.
M II; aufget. Nh-Sp.
Abb. 16: Induktion der Akrosomreaktion durch die ZP; Differenzen des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien an der ZP und in Kontrollsuspension in Abhängigkeit von der Zeit (ejak. Frischsp.= ejakulierte Frischspermien; aufget. Nh-Sp.= aufgetaute
Nebenhodenspermien)
Aus der Abbildung 16 im Vergleich zu den Abbildungen 14 und 15 war zu entnehmen, dass der große Einfluss der gereiften ZP innerhalb der ersten 10 Minuten auf die Induktion der Akrosomreaktion bei den ejakulierten Frischspermien durch die Differenzbildung mit den Kontrollwerten noch verstärkt wurde. Der schwächere Einfluss der ungereiften ZP auf die Frischspermien war jedoch noch stärker ausgeprägt als der der gereiften ZP auf die aufgetauten Nebenhodenspermien. Beim epididymalen TG-Sperma fiel wieder der biphasische Verlauf des Grafen bei gereifter ZP auf. Im Zeitabschnitt von 1 min zu 10 min
wurde durch die gereifte ZP die Akrosomreaktion wesentlich stärker induziert als in den folgenden 10 Minuten. Die Fähigkeit der ungereiften ZP, bei den gebundenen Nebenhodenspermien gegenüber denen in der Kontrollsuspension die Akrosomreaktion hervorzurufen, wurde mit fortschreitender Zeit immer geringer. Zum Zeitpunkt von 20 min war kein Unterschied mehr festzustellen.
Weitere bei der Auswertung der an die ZP gebundenen Spermien erhobene Parameter waren der Anteil der Spermien mit abgelöstem Akrosom und der der isolierten Kopfkappen (genaue Werte siehe unter 2. in J Anhang).
Spermien mit abgelöstem Akrosom wurden relativ selten beobachtet. Unabhängig von der Spermienpopulation und dem Reifestatus der ZP wurden bei einer Minute etwa 1,5 %, bei 10 Minuten ca. 2,4 % und bei 20 Minuten ca. 3,0 % Spermien ohne Kopfkappe beobachtet. Fast alle der PNA-FITC negativen Spermien besaßen also noch ihr Akrosom.
Die vom Spermatozoon isolierten PNA-FITC positiven Kappen wurden vergleichsweise in einem höheren Maße gefunden. Sie sind also nicht als abgelöste Akrosome noch an die ZP gebundener Spermien zu betrachten. Sie konnten auch nicht vermehrt in der Nähe von den wenigen Spermien ohne Kopfkappe lokalisiert werden. In der Spermiensuspension wurden allerdings keine isolierten Kappen gefunden, so dass diese als Reste ehemals gebundener, durch die Waschvorgänge abgelöster Spermien anzusehen sind. Relevant für die Versuchsauswertung war, dass keine Unterschiede zwischen dem Einsatz von ungereiften und gereifter ZP hinsichtlich des Anteils an abgelösten Akrosomen bestand.
Bei ejakuliertem Sperma bewegten sich die Werte für die isolierten Kappen an der ZP in etwa von 5 % zum Zeitpunkt von einer Minute über ca. 15 % bei 10 min bis ca. 20 % bei 20 min.
Der Einsatz von aufgetautem Nebenhodensperma rief Daten von ca. 18 % bei 1 min, 22 % bei 10 min und 30 % bei 20 min hervor.
E Diskussion
1. Verhalten der porcinen Zona pellucida in der PAGE
Die biochemische Analyse der ZP begann mit der Auftrennung der Glykoproteine mittels Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE). In der eindimensionalen PAGE (1D-PAGE) wurde eine Bande um ca. 90 kDa und eine breite, nicht scharf begrenzte Bande mit einem relativen Molekulargewicht von 45-60 kDa ermittelt. Diese Ergebnisse stimmen mit denen von YUREWICZ et al. (1983) in etwa überein. Diese Arbeitsgruppe erhielt zwei Banden mit 77-97 kDa und 46-70 kDa. Die höher molekulare Bande entspricht ZPA und die andere dem Gemisch von ZPB/ZPC. Durch den hohen Glykosylierungsgrad der einzelnen Proteine erstreckt sich diese Bande über einen großen Molekulargewichtsbereich. Diese Heterogenität wird durch posttranslationale Strukturierungsprozesse, wie dem Einbau von Kohlenhydrat-strukturen, Sulfatierung und Sialylierung, hervorgerufen. Bei ZPA beträgt der Proteinanteil ca. 85 % und bei ZPB/ZPC ca. 78 % des Gesamtgewichtes der jeweiligen Glykoproteine (HEDRIK u. WARDRIP 1986).
Analog zu den entsprechenden Literaturstellen wurden keine Unterschiede in den PAGE von ZP von Eizellen aus frischen oder tiefgefrorenen Oozyten beobachtet (DUNBAR et al. 1980;
HEDRIK u. WARDRIP 1986). Die Gewinnungsart der ZP, entweder Punktion einzelner Follikel oder Massenaufarbeitung mit Siebtechnik, hatte ebenfalls keinen erkennbaren Einfluss auf die PAGE.
Die meisten beschriebenen 2D-PAGE der porcinen ZP Glykoproteine wurden unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. DUNBAR und RAYNOR (1980) hielten die Reduktion für das Erreichen der Dissoziation der einzelnen Makromoleküle für notwendig.
Die zweidimensionale Auftrennung zeigte so stets vier Spotbanden bei ca. 90, 65, 55 und 25 kDa. Es wurde nachgewiesen, dass die 65 kDa und 25 kDa Anteile Fragmente der 90 kDa Komponente von ZPA sind und nur durch die Spaltung von Disulfidbrücken entstehen (HEDRIK u. WADRIP 1987). Es existiert im porcinen ZPA eine vorgegebene Spaltstelle zwischen Ala168 und Asp169. In ovariellen Oozyten erfolgt eine partielle Aufspaltung des
Zweikettenmoleküls durch Reduktion der Disulfidbrücken in einen 65 kDa und einen 25 kDa Anteil (s. Abb. 17). Eine vollständige Spaltung dieser Prozessierungsstelle erfolgt erst nach der Befruchtung der Oozyte.
Abb. 17: Proteolytisches Processing porcinen ZPA (Schema)
ZP2 = 90 kDa, ZP1 = 65 kDa und ZP4 = 25 kDa Komponente von ZPA
Für die vorliegenden Arbeit sollten die Proteine der ZP so wenig wie möglich durch die Aufarbeitung für die PAGE verändert werden. Es wurde daher sowohl auf Reduktion als auch auf Enzymbehandlungen verzichtet, da im anschließenden Lektinblot die exponierten Zuckerstrukturen analysiert werden sollten. In der 2D-PAGE wurde die ZP entsprechend der 1D-PAGE in zwei separierte Spotbanden aufgetrennt. Diese verliefen ca. von 120-95 kDa bei pI 3,9-6,7 und von 60-55 kDa bei pI 3,0-7,8 (vgl. HEDRIK u. WARDRIP 1986: 2 Banden bei 101-73 kDa u. 73-46 kDa). Es wurden 10%ige Trenngele verwendet, da sich die Bandenbereiche unter nicht reduzierenden Bedingungen so am besten darstellen ließen. Diese wurden auch für die reduzierenden Ansätze verwendet, die zum Vergleich angefertigt wurden.
Nach Reduktion konnten so jedoch nur drei, nämlich die 90, 65 und 55 kDa Anteile der ZP Proteine dargestellt werden. Das 25 kDa Fragment von ZPA war nur bei höher
Ala168 Asp169
ZP4 ZP1
ZP4 ZP1
Verbindung des Zweikettenmoleküls (ZP2) durch Disuldfidbrücken
potentielle Spaltstelle
konzentrierteren Gelen zu finden. Zum besseren Vergleich wurde in der vorliegenden Arbeit die elektrophoretische Auftrennung gewählt, mit der sich die nicht reduzierte Form der ZP Proteine am optimalsten darstellen ließ. Das 25 kDa Fragment besteht auch nur aus 4 % des Proteinanteils der Zona pellucida (HEDRIK u. WARDRIP 1986).
Interessant bei der 2D-PAGE war der Vergleich von ungereifter und gereifter ZP. Während der Reifung, sowohl in vivo als auch in vitro, unterliegt die Oozyte bestimmten Veränderungen. Am eindeutigsten ist die Veränderung des Kernstatus darzustellen. Mit diversen Färbetechniken können die Chromatinstrukturen im Kern sichtbar und die Entwicklung vom Germinalvesikel I Stadium zur Metaphase II dargestellt werden. Das abgeschürte Polkörperchen in Metaphase II ist auch ohne Anfärbung mit einem Mikroskop auszumachen. Diese Untersuchungen gehören zur Routine bei der Beurteilung des Reifungsstatus bei Eizellen.
Während des Reifungsprozesses finden jedoch auch noch weitere Veränderungen an der
Während des Reifungsprozesses finden jedoch auch noch weitere Veränderungen an der