Die Erforschungen molekularer Vorgänge innerhalb dieser Arbeit gehören zum Bereich der Grundlagenforschung. Diese sind auf dem Gebiet der Gameteninteraktionen notwendig, um physiologische Prozesse besser zu verstehen. Erst dann sind Eingriffe zur Behebung von physiologischen Fehlleistungen und Optimierungen von In-vitro-Systemen möglich.
Es konnte gezeigt werden, dass bei der In-vitro-Maturation bereits Veränderungen an der ZP ablaufen. Diese treten in Erscheinung als vermehrte Acidität der Glykoproteine innerhalb der isoelektrischen Fokussierung. Weiterhin ist die ZP von gereiften Oozyten in der Lage, die Akrosomreaktion an homologen Spermien schneller zu induzieren als die der ungereiften. In der lektinologischen Analyse konnten keine Hinweise erhoben werden, dass der pI-Shift durch veränderte Kohlenhydratstrukturen oder vermehrte Sialylierung hervor gerufen wird.
In anschließenden Versuchen sollte daher besonders der Grad der Sulfatierung der ZP von Oozyten unterschiedlichen Reifungstatus im Vordergrund stehen. Vergleichende Untersuchungen von nativer und desulfatierter ZP, sowohl ungereifter als auch gereifter
Oozyten, sollten durchgeführt werden. Analysen mittels 2D-PAGE und funktionelle Bindungstest zur Induktion der Akrosomreaktion könnten dazu beitragen, die Rolle der Sulfatreste bezüglich der ZP-Reifung und der Gameteninteraktionen aufzuklären. Aufgrund der beschriebenen Unterschiede zwischen der ZP von in vitro und in vivo gereiften Oozyten wären auch Untersuchungen zu diesen Differenzen interessant. Die in vivo gereiften Oozyten lassen sich wiederum nochmals unterteilen, nämlich in aus antralen Follikeln aspirierten und aus Eileitern gespülten Oozyten.
In dieser Arbeit wird die Komplexität und enorme Vielfalt bezüglich der Fertilitätsvorgänge deutlich. Es kommt stets auf das Zusammenspiel unterschiedlichster Faktoren an, die bei den einzelnen Tierarten auch recht unterschiedlich sein können. Dennoch ist das Schwein als Modelltier mit Hinblick auf die Humanmedizin von großer Bedeutung. Es steht dem Menschen entwicklungsgeschichtlich näher als z.B. die Maus, welche auch bezogen auf die Morphologie der ZP größere Differenzen zur humanen ZP als die porcine ZP aufweist. Die geschilderten Studien und deren weiterführende Untersuchungen am Modelltier Schwein sind sinnvoll, um Methoden zu etablieren und Tendenzen zu erfassen, die dann auf den Menschen übertragen werden können. Dort besteht ein großer Bedarf daran, Antworten auf bisher ungeklärte Infertilitäten, Optimierungsansätzen von In-vitro-Techniken und neue Möglichkeiten zur Kontrazeption zu erhalten.
F Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war es, die porcine Zona pellucida (ZP) näher zu charakterisieren, mit besonderem Blick auf mögliche biochemische und funktionelle Veränderungen während der In-vitro-Maturation.
Als Untersuchungsmaterial standen Ovarien zahlreicher frisch geschlachteter Jungsauen zur Verfügung. Nach der Gewinnung der Oozyten wurde entweder die ZP direkt isoliert oder die Oozyten wurden zunächst einer In-vitro-Maturation unterzogen.
Die drei Glykoproteine der porcinen Zona pellucida wurden mittels ein- und zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophrose (1D- u. 2D-PAGE) aufgetrennt. Es folgte eine immunologische und lektinologische Analyse der durch die PAGE separierten Glykoproteine der ZP. Diese Studien wurden sowohl mit ZP ungereifter als auch gereifter Oozyten durchgeführt. Weiterhin wurde ebenfalls mittels Lektinen die Verteilung der Kohlenhydratketten über die Oberfläche der ZP in rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von intakten Oozyten untersucht.
Zur Klärung funktioneller Aspekte innerhalb der Veränderungen der ZP während der In-vitro-Maturation wurde ein Spermien-ZP-Bindungstest entwickelt. Mit diesem konnte die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion vergleichend von ZP ungereifter und gereifter Oozyten untersucht werden. Der akrosomale Status der Spermien wurde mit dem Lektin PNA, das an einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt war, ermittelt. Für die Bindungstests wurden Frischejakulate eines institutseigenen Ebers und kryokonservierte Nebenhodenspermien einer Charge verwendet.
Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
In der 2D-PAGE wurde bei der ZP von gereiften Oozyten im Vergleich zur Auftrennung von ungereiften ein pI-Shift von ca. einer pI-Einheit festgestellt. Diese Zunahme der Acidität stellt sich mit einer Differenz von ca. zwei pI-Einheiten innerhalb der lektinologischen Analyse noch deutlicher dar.
Im Lektinblot konnte gezeigt werden, dass mannosehaltige Strukturen innerhalb von diantennären Seitenketten ausgeprägt im Glykoprotein ZPA vorliegen und bei ZPB/ZPC durch Con A nicht erkannt werden.
Mit SNA, MAA II und ACA wurde unterschiedlich verknüpfte Sialsäure nachgewiesen.
Durch das Lektin AAA konnte der für das Schwein typische hohe Fukosylierungsgrad der ZP nachvollzogen werden.
Ein negatives Ergebnis in der lektinologischen Untersuchung erhielt man nur für den Nachweis von terminaler Galaktose (PNA u. GS I).
Das ermittelte Lektinbindungsverhalten wies keine Unterschiede bei ungereifter und gereifter ZP auf.
Innerhalb der rasterelektronenmikroskopischen Analysen konnte das Mengenverhältnis von Con A und AAA positiven Strukturen aus dem Lektinblot bestätigt werden.
Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die ZP während der In-vitro-Maturation Prozessen unterliegt, die eine Funktionsänderung hervorrufen.
Die In-vitro-Reifung bewirkte statistisch signifikant eine beschleunigte Induktion der Akrosomreaktion durch die ZP. Dies wurde für die ersten zehn Minuten nach der Bindung der Spermien an die ZP gezeigt. Nach weiteren zehn Minuten erfolgte eine Angleichung an die Verhältnisse bei der ungereiften ZP.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die ZP schon während der Maturation und nicht erst nach der Fertilisation nachweisbaren Veränderungen unterliegt. Bezüglich des pI-Shifts konnten keine Hinweise erhoben werden, dass dieser durch veränderte Kohlenhydratstrukturen oder eine vermehrte Sialylierung bewirkt wird. Die erhöhte Acidität der ZP Glykoproteine von gereiften Oozyten könnte durch eine gesteigerte Sulfatierung hervorgerufen werden. Dies ist in weiterführenden Untersuchungen abzuklären. Weiterhin muss überprüft werden, inwiefern sich diese Ergebnisse vom In-vitro-Modell auf die Verhältnisse in vivo übertragen lassen und ob dort noch umfangreichere Veränderungen auftreten.
G Summary
Silja Ebeling:
Characterization of the porcine zona pellucida and the changes during in vitro maturation.
The aim of this study was to characterize the porcine zona pellucida (ZP) with a special view of potential biochemical and functional changes during in vitro maturation.
Ovaries from many freshly slaughtered young sows were available as research-material. After winning the oocytes either the ZP was isolated directly or first the oocytes were subjected to in vitro maturation.
The three glycoproteins of the porcine zona pellucida were divided by one- and twodimensional polyacrylamid-gelelectrophoresis (1D- and 2D-PAGE). An immunologic and lectinologic analysis of the separated ZP glycoproteins was followed. This studies were carried out as well with ZP of immatured as with matured oocytes. Further the distribution of carbohydrates chains over the ZP surface was investigated by lectins in a scanning electron microscopy assay with entire oocytes.
A spermatozoa-ZP-binding test was developed to find out functional aspects within the changes of ZP during in vitro maturation. Using this test it was possible to investigate comparatively the inducing of acrosome reaction by ZP from immatured and matured oocytes.
The acrosome status was determined with lectin PNA, which was conjugated with a fluorescence dye. For the binding tests fresh ejakulated spermatozoa of an institute own boar and kryoconserved epididymal spermatozoa of one population were used.
Following results were achieved:
A pI-shift of about one pI unit was found out in comparsion from separated ZP proteins of immatured to matured oocytes by 2D-PAGE. This increased acidic was expressed with a more distinct difference of about two pI units within the lectionologic analysis.
The lectinblot with Con A has shown, that structures including mannose in diantennary chains exist in glycoprotein ZPA and were not recognized in ZPB/ZPC.
Using SNA, MAA II and ACA differently connected sialic acid was proved.
The typical high fucosed degree of pig ZP was shown by the lectin AAA.
In the lectinologic examination a negativ result was got only for terminal galactose (PNA and GS I).
Within scanning electron microscopy analysis the quantitative distribution of Con A to AAA positive structures was confirmed with the results of the lectinblot.
Further it could be shown, that the ZP undergoes proceedings during in vitro maturation, which caused an altered function.
Maturation results in a statistical significantly accelerated induction of acrosome reaction by ZP. This was shown for the first ten minutes after sperm binding at the ZP. After further ten minutes there was following an adjustment on the relations of the matured ZP.
This results showed, that the ZP already undergoes demonstrable changes during maturation not only after fertilization. No information were found relating to the pI-shift, that it was caused by changed carbohydrate structures or multiply sialylation. The increased acidic of ZP glycoproteins from matured oocytes could be produced by an additional sulfation. This case has to be cleared by continued examinations. Further it must be checked in what way the results of an in vitro model could be transfer on in vivo relations and if there would be found more extensive alterations.
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Structural characterization of the N-linked carbohydrate chains of the zona pellucida glycoproteins from bovine ovarian and fertilized eggs.
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