3.1. Chemilumineszenzverfahren
Nachweise von Proteinen mittels Antikörpern und von Kohlenhydratstrukturen durch Lektine sind sehr empfindliche Verfahren in der Biochemie, die eine Charakterisierung von sehr geringen Glykoproteinmengen erlauben.
Für die gewählte Versuchsanordnung mussten die Proteine von einem Gel nach elektrophoretischer Auftrennung auf eine Membran durch ein Blotting-Verfahren transferiert werden.
Die vorliegenden Versuche wurden nach der von TOWBIN et al. (1979) beschriebenen Methode durchgeführt. In einem Semidry-Apparatus (Biometra, Göttingen) wurde unter Wasserkühlung (1 l/min) auf PVDF-Membranen (Nr. 1722026; Boeringer Mannheim, Mannheim) geblottet. Die 6 x 8,3 cm große Membran wurde vor ihrer Verwendung für 30 sec in 100% Methanol geschwenkt, kurz in Aqua bidest. gewaschen und für 2-3 min in Blottingpuffer (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) äquilibriert.
Das Blotten erfolgte in einem Sandwichverfahren. Dieses „Sandwich“ bestand dabei von unten nach oben aus drei Lagen in Blottingpuffer getränktem Blotpapier (GB 003;
Schleicher&Schell, Dassel), der Membran, dem Gel und erneut drei Lagen getränktem Blotpapier. Nach der Positionierung dieses „Sandwiches“ zwischen den beiden mit Blottingpuffer angefeuchteten Graphitplatten des Semidry-Apparatus wurde bei konstantem Strom (1mA/cm2) für zwei Stunden bei Raumtemperatur geblottet.
Der Bloterfolg wurde durch eine Anfärbung mit Ponceau Rot (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) für fünf min und anschließender Entfärbung mit Aqua bidest. überprüft. Es handelt sich dabei um eine reversible Färbung, die die weiteren Reaktionen nicht beeinflusst.
Für die immunologischen und die lektinologischen Untersuchungen wurden die Membranen über Nacht in TBS/ Tween 1% (v/v) bei 4°C blockiert, um unspezifische Bindungen zu verhindern.
Am nächsten Tag wurden die Membranen mit Antikörpern bzw. biotinylierten Lektinen inkubiert (siehe 3.2 u. 3.3.) und die Reaktionen mittels einem Peroxidase-Chemilumineszenz-Verfahren detektiert.
Nach der Inkubation mit horse radish-peroxidase (HRPO) gekoppelten Reagenzien wurden die Membranen in eine durchsichtige Plastikfolie mit 3 ml working solution des Chemilumineszenz-Substrates (Super Signal West Pico; Pierce über KMF Laborchemie, St.
Augustin-Buisdorf) eingeschweißt und für fünf Minuten leicht geschwenkt. Danach wurde das Substrat aus der Folie ausgestrichen und diese erneut zugeschweißt. Die Membran wurde mit Klebefilm in einer Röntgenkassette befestigt.
In einer Dunkelkammer mit röntgenfilmgeeigneter Lichtquelle (Lampenfilter 6BX-2 Safe Light; Kodak GmbH, Stuttgart) wurde ein Röntgenfilm (XAR-5; Kodak GmbH, Stuttgart) belichtet, in dem er auf die Membran platziert wurde. Je nach Reaktionsintensität reichten im Durchschnitt 10-30 sec für die Belichtungszeit aus. Der Film wurde ca. 30 sec im Entwicklungsbad (G 150; Agfa Deutschland, Köln) geschwenkt, kurz in einem Stoppbad (Aqua bidest. mit einem Spritzer Essig) gewaschen, mindestens eine Minute im Fixierbad (G 350; Agfa Deutschland, Köln) fixiert und schließlich für fünf Minuten gewässert. Die Trocknung des Röntgenfilmes wurde hängend und lichtgeschützt vorgenommen.
Die Vorteile der Chemilumineszenz sind, dass man ein hochempfindliches Detektionssystem hat und durch veränderbare Belichtungszeiten unterschiedlich intensive Bilder von einer Membran erhält. Ferner kann man die Membran für andere Analysen weiter verwenden. Dazu wurde die Membran nach der Chemilumineszenz aus der Folie genommen und zweimal in TBS/Tween 1% (v/v) gewaschen und in 3 M Kaliumthiocyanatlösung (Merck, Darmstadt) zum „Abstrippen“ gegeben. Dies dauert bei Antikörpern 1-2 Tage, bei Lektinen erreicht man in diesem Zeitraum eine Reduktion/Eliminierung möglicher unspezifischer Hintergrundbindungen. Ein vollständiges „Abstrippen“ der Lektine ist nur bei einigen schwach bindenden nach ca. 5-7 Tagen möglich. Zur Kontrolle des „Striperfolges“ wurden die Membranen wieder gewaschen und blockiert. Anschließend folgte eine Inkubation mit Peroxidase gekoppeltem Streptavidin oder Peroxidase gekoppeltem Zweitantikörper. Die Chemilumineszenz wurde dann erneut wie beschrieben durchgeführt. Der biotinylierte Standard bietet dabei eine gute Systemkontrolle, da Streptavidin an das Biotin bindet.
3.2. Immunologische Identifizierung der Glykoproteine der ZP
Zur Charakterisierung der einzelnen Glykoproteine der Zona pellucida nach der Auftrennung durch die 1D- und 2D-PAGE wurden unterschiedliche Antikörper gegen die einzelnen Glykoproteine bzw. deren Sequenzausschnitte verwendet.
Zum Einsatz kamen zwei verschiedene polyklonale Antikörper, die gegen ZPB (pZP3α) und ZPC (pZP3β) gerichtet sind. Diese Antikörper werden hier im weiteren AK ZPB und AK ZPC genannt.
TÖPFER-PETERSEN et al. (1993) erhielten diese Antikörper, indem nach Solubilisierung, Auftrennung über HPLC-Chromatographie und Endo-β-Galactosidase-Spaltung porcines ZPB und ZPC isoliert werden konnten. Mit diesen beiden Proteinanteilen wurden Hühner immunisiert und aus den Eiern wurden die gebildeten Antikörper gewonnen.
Von Frau Prof. Dr. Elvira Hinsch, Zentrum für Dermatologie und Andrologie der Justus-Liebig-Universität Gießen, wurden freundlicher Weise Antikörper, die gegen synthetische Peptidsequenzen der Zona pellucida gerichtet sind, zur Verfügung gestellt. Es handelt sich dabei um Sequenzen, die homolog in verschiedenen Säugetieren vorhanden sind (vgl.
HARRIS et al. 1994). Die Antiseren wurden in Kaninchen hergestellt und werden hier als AK ZPA-20 (gegen Peptidsequenz D-P-N-I-K-L-V-L-D-D-C-W-A-T-S in ZPA) und AK ZPC-5a (gegen P-I-E-C-R-Y-P-R-Q-G-N-V-S-S in ZPC) bezeichnet.
Die immunologischen Versuche wurden mit auf PVDF-Membranen transferierten Proteinen von ungereiften und gereiften Zonae pellucidae sowohl nach 1D-PAGE, als auch nach 2D-PAGE Auftrennung durchgeführt.
Nach Blockierung der Membranen mit TBS/Tween 1% über Nacht bei 4°C wurden die Membranen eine Stunde mit den Antikörpern (Verdünnungsstufen siehe Tab. 3) inkubiert. In Folge des dreimaligen Waschens mit TBS/Tween 1% für jeweils 10 min wurden die Membranen mit dem entsprechenden Zweitantikörper, der HRPO-gekoppelt war, für eine weitere Stunde inkubiert. Anschließend wurde wieder 3 x 10 min gewaschen.
Zur Markierung des biotinylierten Molekulargewichtsstandards wurde die Membran noch mit HRPO-Streptavidin behandelt.
Die folgenden Waschprozesse und die Entwicklung per Chemilumineszenz entsprachen der schon beschriebenen Vorgehensweise (siehe 3.1.).
Tab. 3: Verwendete Antikörper
Erstantikörper Verdünnung in TBS/Tween 1% (v/v)
Zweitantikörper Verdünnung in TBS/Tween 1% (v/v)
AK ZPB 1 : 3.000
HRPO-AntiChicken
(Dianova, Hamburg) 1 : 10.000 AK ZPC 1 : 10.000
HRPO-AntiChicken
(Dianova, Hamburg) 1 : 10.000
AK ZPA-20 1 : 50
HRPO-AntiRabbit
(Dianova, Hamburg) 1 : 5.000 AK ZPC-5a 1 : 100
HRPO-AntiRabbit
(Dianova, Hamburg) 1 : 5.000
Zum Nachweis der Spezifität wurden auch Versuche mit den entsprechenden Präimmunseren statt der Antiseren durchgeführt.
3.3. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP
Die lektinologischen Untersuchungen der Glykoproteine der Zona pellucida wurden sowohl an 1D-PAGE- als auch an 2D-PAGE-Membranen durchgeführt. Dabei wurden zum einem ungereifte (GV I) und zum anderen in-vitro-gereifte (Metaphase II) Zonae pellucidae verwendet.
Nach der Blockierung der Membranen in TBS/Tween 1% über Nacht bei 4°C wurden die Membranen mit biotinylierten Lektine (Vektor über Alexis Deutschland, Grünberg), 5µg/ml in TBS/Tween 1%, unter leichtem Schwenken für 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden sie 3 x 10 min lang in TBS/Tween 1% (v/v) kräftig gewaschen, um die überschüssigen Lektinanteile zu entfernen. Anschließend wurde die Membran mit HRPO-Streptavidin (Horse radish peroxidase conj. HRPO-Streptavidin; Dianova, Hamburg), 1:20.000 verdünnt in TBS/Tween 1%, für 30 Minuten inkubiert und 6 x 5 min gewaschen. Dann wurde die beschriebene Chemilumineszenz durchgeführt.
Tab. 4: Nomenklatur und Spezifität der verwendeten Lektine (aggl. → agglutinin)
Gruppe Lektin Abk. Spezifität
I
Gluc/Man
Concanavalin A aggl. Con A α-D-Man; α-D-GlcNAc Datura stramonium aggl. DSA [Gal-β(1-4)-GlcNAc]N
II
GlcNAc Ricinus communis aggl. I RCA I Gal-β(1-4)-GlcNAc Griffonia simplicifolia aggl. I GS I α-D-Gal, α-D-GalNAc Peanut aggl. PNA Gal-β(1-3)-GalNAc; α/β-Gal Erythrina cristagalli aggl. ECA α/β-Gal;
α/β-GalNAc; Gal-β(1-4)-GlcNAc III
GalNAc/
Gal
Artocarpus integrifolia Aggl. Jacalin Gal-β(1-3)-GalNAc IV
L-Fuc
Anguilla Anguilla aggl. AAA Fuc-α(1-6)-GlcNAc Maackia amurensis aggl. II MAA II NeuNAc-α(2-3)-Gal
Amaranthus caudatus aggl. ACA NeuNAc-α(2-3/6)-Gal-β(1-3)-GalNAc V
Neuramin-
säure Sambucus nigra aggl. SNA NeuNAc-α(2-6)-Gal;
NeuNAc-α(2-6)-GalNAc
Zur Kontrolle der Spezifität der Lektinbindungen wurden in weiteren Versuchen den Lektinen gemäß einer kompetitiven Hemmung die entsprechenden Zucker während des ersten Inkubationsschritts mit der Membran zugesetzt.
Tab. 5: Lektine mit den verwendeten Hemmzuckern und ihrer eingesetzten Konzentration
Lektin Hemmzucker Konzentration
Con A α-Methylmannopyranosid 0,5 M
GS I; PNA; Jacalin Galaktose 0,5 M
ECA; RCA I; ACA Laktose 0,5 M
DSA Chitotriose 0,2 M
AAA α-L-Fukose 0,5 M
SNA; MAA II Sialyllaktose 0,2 M