Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Molekulare Charakterisierung der porcinen Spermadhäsin Gene
INAUGURAL – DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
( Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Bianca Haase aus Osterode/Harz
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Tosso Leeb
1. Gutachter: Prof. Dr. Tosso Leeb 2. Gutachter: Prof. Bernd Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2005
Meinen Eltern in Dankbarkeit
Teile dieser Arbeit wurden bereits in folgenden Zeitschriften veröffentlicht:
Haase B, Schlötterer C, Ekhlasi-Hundrieser M, Kuiper H, Distl O, Töpfer-Petersen E, Leeb T.
(2005) Evolution of the spermadhesin gene family. Gene. 352:20-29.
Haase B, Mollenhauer J, Leeb T (2005)
Molecular characterization of the porcine deleted in malignant brain tumor 1 gene (DMBT1) Manuskript in Vorbereitung
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 2
2.1 Das Schweinegenomprojekt 2
2.2 Stand der Genomanalyse beim Schwein 2
2.3 Spermadhäsine 5
2.4 porcine Spermadhäsine 7
2.4.1 PSP I und PSP II 9
2.4.2 AWN 9
2.4.3 AQN I 10
2.4.4 AQN III 10
2.5 Fruchtbarkeit beim Schwein 10
3 Material 13
3.1 Bakterien und Plasmide 13
3.1.1 Bakterien 13
3.1.2 Plasmide 13
3.2 Enzyme, Oligonukleotide und Transposon 13
3.2.1 Enzyme 13
3.2.2 Oligonukleotide 14
3.2.3 Transposon 14
3.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 14
3.4 Laborgeräte 14
3.5 Verwendete Kits 16
4 Methoden 17
4.1 Vermehrung und Isolierung von Plasmid-DNA 17
4.1.1 Bakterienkultur 17
4.1.1.1 Flüssigkultur 17
4.1.1.2 Plattenkultur 17
4.1.2 Isolierung von Plasmid DNA aus Bakterien 18 4.1.2.1 Schnellaufschlüsse durch alkalische Lyse 18
4.1.2.2 Isolierung von Plasmid DNA
Inhaltsverzeichnis
mit dem Qiagen Midi Plasmid Kit 19
4.1.3 Transformation kompetenter E. coli 20
4.1.3.1 Transformation chemisch kompetenter E.coli XL1-blue 20 4.1.3.2 Transformation chemisch kompetenter
Top 10 One Shot Zellen 20
4.2 Enzymatische Manipulation und Analyse von DNA 21 4.2.1 Auftrennen von kleinen DNA-Fragmenten 21 4.2.2 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus
Agarosegelen Mittels QIAEX II-Kit 22 4.2.3 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus
Agarosegelen Mittels MiniElute Gel Exraction-Kit 22 4.2.4 Enzymatische Manipulation von DNA 23 4.2.4.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 23
4.2.4.2 Ligation von Plasmiden 23
4.2.4.3 Herstellung glatter Enden mit T4-DNA Polymerase 23 4.2.4.4 Ligation von Plasmiden mit Hilfe des
TOPO Cloning Systems 24
4.2.4.5 Ligation von PCR-Produkten mit dem
Qiagen PCR Cloning System 24
4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 25
4.3.1 Polymerase-Kettenreaktion Standardansatz 25 4.3.2 PCR mit der Platinum Pfx Polymerase 25
4.3.3 Real-Time PCR 26
4.4 DNA-Sequenzierung 27
4.4.1 Nichtradioaktive Sequenzierung doppelsträngiger DNA 27 4.4.2 Gelelektrophorese von Sequenzprodukten auf dem
Automatischen DNA Sequenzierer 27
4.4.3 DNA Sequenzierung mit dem MegaBACE 1000
Kapillarsequenzierer 28
4.5 Isolierung und Analyse von RNA 28
4.5.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus Gewebe 28 4.5.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Vollblut 29 4.5.3 Amplifikation von cDNA mit Hilfe des
FirstChoice RLM-RACE Kit 30
4.6 Isolierung von genomischer DNA 30
4.6.1 Isolierung von genomischer DNA aus Blut 30 4.6.2 Isolierung von genomischer DNA aus Sperma 31
Inhaltsverzeichnis
4.6.3 Isolierung von genomischer DNA aus Haarwurzeln
und Gewebe 31
4.7 Bioinformatik 32
4.7.1 Programme (lokal) 32
4.7.2 Internet 32
5 Ergebnisse 34
5.1 Ermittlung der cDNA-Sequenzen der porcinen Spermadhäsin Gene 34 5.2 Charakterisierung des porcinen Spermadhäsin Genclusters 36
5.3 Mutationsanalyse 39
5.4 Analyse der quantitativen Expression der Spermadhäsine im
männlichen und weiblichen Genitaltrakt 43 5.5 Ermittlung der cDNA-Sequenz des porcinen DMBT1 Gens 50
6 Diskussion 55
6.1 Interpretation der 5'-RLM-RACE Sequenzdaten 55
6.2 Diskussion der Mutationsanalyse 56
6.3 Diskussion der Expressionsstudie 56
6.4 Diskussion der porcinen DMBT1 Sequenzdaten 58
7 Zusammenfassung 60
8 Summary 62
9 Literaturverzeichnis 63
10 Anhang 71
Verwendete Oligonukleotide 71
Primer für die 5'-RLM –RACE 71
Primer für die Mutationsanalyse am MegaBACE 71 Primer für die Expressionsuntersuchung 73
Primer für das porcine DMBT1 Gen 73
Accession Nummern der verwendeten EST Daten 74
Verzeichnis der Abkürzungen
Verzeichnis der Abkürzungen
aa Aminosäuren (engl.: amino acid)
Abb. Abbildung
AFLP Erweiterter Fragment Längenpolymorphismus (engl.: amplified fragment length polymorphism)
amp Ampicillin
AQN I Alanin, Glutamin, Asparagin I (porc. Spermadhäsin) AQN II Alanin, Glutamin, Asparagin II (porc. Spermadhäsin) AWN Alanin, Tryptophan, Asparagin (porc. Spermadhäsin)
BAC künstliches Bakterienchromosom (engl.: bacterial artificial chromosom)
BHZP Bundes-Hybrid-Zuchtprogramm
BLUP lineare Tierbeurteilung (engl.: best linear unbiased prediction)
bp Basenpaare (engl.: base pairs)
bzw. beziehungsweise
caput epidid. Nebenhodenkopf (lat.: Caput epididymis) cauda epidid. Nebenhodenschwanz (lat.: Cauda epididymis)
cDNA komplementäre DNA
corpus epidid. Nebenhodenkörper (lat.: Corpus epididymis)
Ct-Wert Fluoreszenz Schwellenwert (engl.: Threshold Cycle)
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxyribonukleidtriphosphat
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraacetat
engl. englisch / aus dem Englischen et al. et alii (lat.: und andere)
GAPDH Glutaraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase Glandular ves. Samenblasendrüse (lat.: Glandular vesicularis)
kana Kanamycin
kb Kilobasen
kDa kiloDalton
mRNA Boten-RNA (engl.: messenger RNA) lat. lateinisch / aus dem Lateinischen NEB New England Biolabs
nt Nukleotide
OAc Acetat
Verzeichnis der Abkürzungen
PAC künstliches Bakterienchromosom von P1 abgeleitet (P1-derived artificial chromosome)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction)
PIGMaP Schweinegenom Kartierungs Projekt (engl.: pig gene mapping project)
Prostata Vorsteherdrüse
PSP I porcines Seminalplasmaprotein I PSP II porcines Seminalplasmaprotein II RACE Amplifikation von cDNA Enden
(engl.: rapid amplification of cDNA ends) Rete testis Hodennetz
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuclease
RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion SDS Natriumdodecylsulfat (engl.: sodium dodecylsulfate)
SNP Einzelbasenaustausch (engl.: single nucleotide polymorphism)
sog. sogenannt
TBE Tris-Borat-EDTA-Lösung
TE Tris-EDTA-Lösung
Testis Hoden
tet Tetracyclin
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
U Einheit (engl.: Unit) Upm Umdrehungen pro Minute
x g Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sec2) X-Gal 5-Chlor-4Brom-3-indolyl-ß-D-Galaktosid
Einleitung 1
1 Einleitung
Während der Passage durch den männlichen und weiblichen Genitaltrakt durchlaufen die Spermien eine Reihe von Reifungsprozessen, zu denen auch die Bindung verschiedener Seminalplasmaproteine an die Spermienoberfläche gehört. Eine wichtige Klasse der daran beteiligten Plasmaproteine stellen die Spermadhäsine dar. Spermadhäsine gehören zu den sekretorischen, zuckerbindenden Proteinen des männlichen Genitaltrakts, welche in den vergangenen Jahren im Seminalplasma von Schwein, Rind, Pferd und neuerdings auch beim Schaf identifiziert wurden. Beim Schwein sind 5 Mitglieder dieser Proteinfamillie bekannt und beschrieben. Die Nomenklatur dieser Proteine ist nicht einheitlich. Die Proteine AWN, AQN I und AQN III sind nach ihren ersten drei Aminosäuren benannt (AWN: A=Alanin W=Tryptophan und N=Asparagin; AQN : A=Alanin, Q=Glutamin und N=Asparagin I und II) und bei den beiden Proteinen PSP I und PSP II stehen die Abkürzungen für porcines Seminalplasmaprotein I und II (SANZ et al., 1991, 1992a, 1992b; KWOK et al., 1993;
CALVETE et al., 1997).
Aufgrund ihrer Liganden-Bindungseigenschaften und Struktur wird den Spermadhäsinen eine wesentliche Rolle für die Überlebensfähigkeit der Spermien im weiblichen Genitale, sowie für die Spermium – Eizellen Interaktion zugesprochen. Sie werden beim Schwein in verschiedenen Geweben des männlichen Genitales in erheblichen Mengen exprimiert und in das Seminalplasma sezerniert. Aus dem Seminalplasma assoziieren sie in unterschiedlicher Weise mit der Spermienkopfmembran. Während einige einen festen Verbund mit der Spermienmembran eingehen und für die Bindungen an Eileiter oder Eizelle verantwortlich sind, binden andere nur locker an die Spermienoberfläche und spielen eine größere Rolle bei der Modulation des Immunsystems im Uterus. Eine Reihe von Untersuchungen hat bereits den Einfluss der Spermadhäsine auf die Fruchtbarkeit beim Schwein gezeigt (TÖPFER-PETERSEN et al., 2002; ASSREUY et al., 2002; CALVETE et al., 1995;
YANG et al., 1998). Aufgrund dieser Daten sind die porcinen Spermadhäsin Gene viel versprechende Kandidatengene für die Fruchtbarkeit. Durch die genaue Charakterisierung eröffnen sich möglicherweise neue Perspektiven für die Selektion auf Fruchtbarkeit in der Schweineproduktion. In dieser Arbeit sollte die komplette cDNA-Sequenz der fünf porcinen Spermadhäsine ermittelt und über eine Mutationsanalyse versucht werden, weitere Rückschlüsse über die Bedeutung der Spermadhäsine für die Fruchtbarkeit zu erlangen.
Diese Ergebnisse sollten unterstützt werden durch die Untersuchung der Expression in den Geweben des männlichen und weiblichen Genitaltraktes.
Literaturübersicht 2
2 Literaturübersicht
2.1 Das Schweinegenomprojekt
Die Vervollständigung der humanen Genomsequenz lieferte wichtige Daten um die genetische Komplexität des Menschen zu verstehen und wie sich genetische Variationen auf Phänotypen und Krankheiten auswirken. Modell-Organismen waren bei der Entwicklung dieser Erkenntnisse von wesentlicher Bedeutung. Zweifellos stellt das Schwein einen wertvollen biomedizinischen Modell-Organismus dar, dessen Bedeutung in Zukunft noch zunehmen wird. Um diesen Modell-Organismus bestmöglich nutzen zu können und um weitere, auf den Menschen übertragbare Erkenntnisse zu erhalten, hat sich eine Internationale Arbeitsgemeinschaft gebildet. Diese Arbeitsgemeinschaft, setzt sich aus sechs internationalen Institutionen zusammen [INRA (l´institute national de la recherche agronomique), UIUC (University of Illinois at Urbana-Champaign), USDA-ARS (United States Department of Agriculture-Agriculture Research Service), Roslin Institute, BBSRC (Biotechnology and Biological Sciences Research Council), The Sanger Institute
]
.Innerhalb dieser Arbeitsgemeinschaft wurde eine porcine BAC Karte, die eine 20 fache Abdeckung hat, über BAC fingerprint Analysen erstellt. Die Klone wurden zusätzlich einer End-Sequenzierung unterzogen. Man geht davon aus, dass bestenfalls 25.000 BAC-Klone sequenziert werden müssen, um das ganze Genom abzudecken. Durch diese Methode soll eine 1-2 fache Abdeckung des gesamten Schweinegenoms erzielt werden. Eine zusätzliche 4-5 fache Abdeckung soll durch Sequenzierung von whole genom shotgun Sequenzen erzielt werden.
Unabhängig von dieser Arbeitsgemeinschaft arbeitet die dänisch-chinesische Arbeitsgruppe.
Diese Arbeitsgemeinschaft hat bereits 3,84 Millionen hoch qualitative Sequenzen von fünf verschiedenen Schweinerassen generiert. Anhand dieses Datenpools wurden erste Evolutionsanalysen durchgeführt, welche bestätigten, dass Schwein und Mensch genetisch ähnlicher sind als Mensch und Maus.
2.2 Stand der Genomanalyse beim Schwein
Bereits vor über 7000 Jahren wurde das Schwein domestiziert und stellt somit eines der ersten domestizierten Tiere dar, das auch als Lieferant für Fleisch eine entscheidende Rolle spielte. Heutzutage geht die Rolle des Schweins noch weiter. So dient es als ein wichtiges Modellsystem für die Humanmedizin, insbesondere in der Transplantationsmedizin. Erste Bemühungen, das Schweinegenom zu enträtseln, starteten bereits in den frühen 90er
Literaturübersicht 3
Jahren mit der Entstehung des Schweinegenom-Projekts (PiGMaP), welches in Europa, finanziell unterstützt durch die Europäische Union, ins Leben gerufen wurde. PiGMaP bezog 18 Europäische Laboratorien und weitere 7 in den USA, Japan und Australien mit ein.
In den USA begann um 1993 am USDA-ARS (US Department of Agriculture-Agricultural ResearchService) ein großes Genkartierungs-Projekt am Meat Animal Research Center in Clay Center, Nebraska und ein zweites Großprojekt unter der Leitung des USDA-CSREES (Cooperative State Research Education and Extension Service). Dieses Projekt wurde entwickelt, um die Förderung und die Mitarbeit am Genkartierungs-Projekt bei allen Spezies, inklusive des Schweins, voranzutreiben und zu koordinieren. Die Koordination wird von einem Technischen Komitee übernommen, das sich aus verschiedenen Wissenschaftlern zusammensetzt. Durch die Arbeit dieses Komitees wurden die amerikanischen Daten gemeinsam mit den Daten von Internationalen Projekten, wie dem PiGMaP, zusammengefasst, was zu einer schnelleren Erforschung des Schweinegenoms in den letzten Jahren geführt hat. Aufgrund dieser Bemühungen werden die Datenbanken laufend aktualisiert.
NCBI (National Center of Biotechnology Information) führt eine der vermutlich wichtigsten Datenbanken für das Schweinegenom weltweit. Zurzeit befinden sich hier 151.048 gss (Genomic survey sequences) Einträge, 439.984 EST (expressed sequence tags) Einträge, 446.454 mRNA-Sequenzen und 10.156 Proteinsequenzen beim Schwein. Insgesamt lassen sich im Trace Archive 5.158.676 Einträge für das Schwein finden (Stand: 07.07.2005).
Kopplungskarten
Momentan existieren zwei porcine Kopplungskarten. Eine wurde von einer schottischen Arbeitsgruppe entwickelt, die andere von einer US-amerikanischen (ARCHIBALD et al., 1995;
ROHRER et al., 1996). Ursprünglich enthielt diese Karte 1.200 Marker.
Neue genetische Marker, wie Mikrosatelliten, AFLPs (amplified fragment length polymorphisms) und Einzel-Basenaustausche (SNPs; single nucleotide polymorphisms), werden weiterhin charakterisiert und in die Kopplungskarte integriert. Durch weitere Bemühungen in der Forschung konnte diese Zahl auf momentan 1.283 ausgeweitet werden (http:/www.genome.iastate.edu/map/marcmap.html;http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/mapvier/map _search.cgi?taxid=9823).
Literaturübersicht 4
Daneben existiert noch eine sich in der Entwicklung befindliche AFLP Karte mit 2.300 registrierten AFLPs, die wahrscheinlich in die PiGMaP Karte integriert werden wird.
Insgesamt gibt es somit bereits 5.000 bekannte Marker (ROTHSCHILD, 2004).
RH-Karte
Die IMpRH-Karte der INRA und der Universität Minnesota ist die zurzeit einzige genomweite RH-Karte beim Schwein (HAWKEN et al., 1999). Sie basiert auf einem 7000 rad RH-(radiation hybrid) Panel, welches 118 Hybrid-Klone beinhaltet (YERLE et al., 1998). Diese Karte wird ständig erweitert. Momentan beinhaltet sie fast 4.000 Marker und über 2.000 neue ESTs, von denen viele ortholog zum Menschen sind und so eine vergleichende Kartierung möglich machen. Das bestehende RH-Panel wird durch ein neueres 12.000 rad RH-Panel ergänzt, wodurch eine feinere Kartierung möglich wird (YERLE et al., 2002; www.toulouse.inra.fr)
Physikalische Karte
Durch die Zusammenarbeit von vier Laboratorien (The Sanger Institute (Cambridge), Roslin Institute (Edinburgh), University of Illinois und INRA (Paris)) wurde eine physikalische Karte erstellt.
Für die Erstellung einer integrierten physikalischen Karte des gesamten Schweinegenoms wurden sowohl Fingerprint-Analysen, wie auch Sequenzierungen von BAC-Enden durchgeführt. Durch genomweite BAC-Contigs konnte eine 15,3 fache Abdeckung des 2.7 Gb großen Genoms erreicht werden. Zur Erstellung einer klonbasierten physikalischen Karte, wurden fünf BAC-Banken verwendet (CHORI-242, RPCI-44, PigE, INRA und KNP).
Im Augenblick sind 267.884 Fingerprints in 524 Contigs zusammengebaut (assembliert) (Stand: 23.08.2005). Die Contigs wurden aus überlappenden Klonen erstellt, wobei für die Assemblierung stringente Parameter verwendet wurden. Um weitere Contigs erstellen zu können sind die Assemblierungsparameter etwas gelockert worden und alle Daten aus RH-und genetischer Kartierung werden mit einbezogen. Geplant ist noch eine Zuordnung zu den Chromosomen.
(http:/ www.sanger.ac.uk/Projects/S_scrofa/mappingshtml)
Literaturübersicht 5
Cytogenetische Karte
Der porcine Karyotyp besteht aus 19 Chromosomen (2n=38 inklusive metazentrischer und akrozentrischer Chromosomen). Eine cytogenetische Karte des Schweins wurde von der INRA erstellt (YERLE et al., 1997; http:/www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/cyto/cyto.htm).
QTL-Datenbank
In der PigQTLdb (Pig Quantitative Trait Loci (QTL) database) wurden alle QTL Daten der letzten 10 Jahre gesammelt. Mit Hilfe dieser Datenbank kann man Genorte auf dem Schweinegenom finden, bestätigen oder vergleichen. Zurzeit befinden sich in dieser Datenbank 791 QTLs, die 219 verschiedene Merkmale repräsentieren (www.animalgenome.org/QTLdb). So wurden bereits große Anzahlen von QTLs für Wachstum, Fleischqualität, Krankheitsresistenzen, Fellfarbe und auch Reproduktion gefunden (BIDANEL et al., 2002).
2.3 Spermadhäsine
Spermien, die den Hoden verlassen sind hoch differenziert, haben aber noch nicht die Fähigkeit zur Befruchtung einer Eizelle erreicht (KIRCHHOFF U. IVELL, 1995; PIMBONI, 1997).
Diese Fähigkeit entwickeln die Spermien erst während ihrer Passage durch den Nebenhoden (COOPER, 1998; KIRCHHOFF, 1999).
Während der Ejakulation werden die Spermien mit dem Seminalplasma vermischt. Dabei handelt es sich um eine komplexe Mischung aus Sekreten des Nebenhodens und den akzessorischen Geschlechtsdrüsen. Das Seminalplasma dient einerseits als Trägermaterial für die Spermien und andererseits enthält es Faktoren, welche die Befruchtungsfähigkeit der Spermien beeinflussen. Die Haupt-Seminalplasmaproteine beim Schwein, welche die Oberfläche der Spermien ummanteln, sind die als Spermadhäsine bezeichneten Proteine, welche mit 90% die Hauptfraktion der Seminalplasmaproteine darstellen (CALVETE et al., 1996a; TÖPFER-PETERSEN et al., 1995; TÖPFER-PETERSEN et al., 1996).
Spermadhäsine sind sekretorische, zuckerbindende Proteine des männlichen Genitaltraktes mit einem Proteingewicht von 12–16 kD. Während beim Schwein bisher fünf Spermadhäsine (AWN, AQN I, AQN III, PSP I und PSP II) ermittelt wurden (SANZ et al., 1991; SANZ et al., 1992a, SANZ et al., 1992b, KWOK et al., 1993, EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2002), sind beim Rind lediglich zwei (aSFP, Z13) (WEMPE et al., 1992; TEDESCHI et al., 2000), beim Pferd nur
Literaturübersicht 6
ein Spermadhäsin (AWN-Homolog) (REINERT et al., 1996) und beim Schafbock ebenfalls nur ein Spermadhäsin (RSP-15 kDa) (BERGERON et al., 2005) nachgewiesen worden.
Interessanterweise konnte das Spermadhäsin AWN nicht nur im männlichen Genitaltrakt, sondern auch im weiblichen Genitaltrakt nachgewiesen werden (EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2002).
Beim Menschen konnten Seminalplasmaproteine gefunden werden, welche immunbiochemisch eine Ähnlichkeit mit AQN und AWN aufweisen. Man konnte 3 Formen mit Proteingewichten von 14, 16 und 18 kDa identifizieren, die mit Kaninchenantikörpern gegen AQN kreuzreagieren (KRAUS et al., 2005). Jedoch sind diese Proteine nicht an die Spermienkopfmembran, sondern an Halsstück und Spermienschwanz gebunden. Dieser Unterschied lässt vermuten, dass diese Proteine im humanen Seminalplasma andere Aufgaben zu erfüllen haben, als die Spermadhäsine beim Schwein (KRAUS et al., 2005). Bei der Maus konnten bisher keine Spermadhäsine im Seminalplasma identifiziert werden. Hier gab es ein durch Computer Sequenzanalyse prognostiziertes Gen für ein AWN-Homolog (NCBI Ref-Seq-Projekt, Accession XM_133869), welches allerdings inzwischen neu klassifiziert wurde und nicht mehr als AWN-Homolog bezeichnet wird.
Es scheint sich also bei den Spermadhäsinen um eine Gruppe von Genen zu handeln, die nur bei Paarhufern und in begrenztem Umfang bei Pferden exprimiert werden, während sie bei Primaten und Nagetieren fehlen, andere Funktionen erfüllen oder inaktiv sind.
Tabelle 1: Überblick über die Spermadhäsine bei den verschiedenen Spezies
Tierart Spermadhäsine
Schwein PSP I, PSP II, AWN, AQN I, AQN III Rind aSFP, Z 13 (syn.: SPADH1 und SPADH 2) Mensch hSA-14, hSA-16, hSA-18
Pferd AWN-Homolog
Maus keines bekannt
Schaf RSP-15kDa
Literaturübersicht 7
2.4 Porcine Spermadhäsine
Porcine Spermadhäsine zeichnen sich durch eine Palette von Ligandenbindungseigenschaften aus, die in den verschiedenen Vertretern der Familie unterschiedlich ausgeprägt sind und auf eine Reihe von Funktionen im Verlauf des Befruchtungsprozesses hinweisen. So besitzen sie die Fähigkeit, Serinproteinasen, sulfatierte Polysaccharide wie Heparin, und Oligosaccharide zu binden, wobei die letztgenannten wohl die bedeutendste Eigenschaft darstellt. Die Zuckerbindungseigenschaft lässt auf eine Beteiligung dieser Proteine an den kohlenhydratvermittelten Schritten der Befruchtung, der Gameteninteraktion, sowie auf die Fähigkeit zur Bildung eines Spermienreservoires im Ovidukt schließen (TÖPFER-PETERSEN, 2002).
Da es bereits gelungen ist, die dreidimensionale Struktur von drei Spermadhäsinen aufzuklären, konnte die angenommene ß-all-Struktur bestätigt und die Kohlenhydratbindungsdomäne (CUB-Domäne) näher charakterisiert werden (ROMERO et al., 1996; ROMERO et al., 1997). Solche CUB-Domänen konnten bereits in anderen regulatorisch aktiven Proteinen nachgewiesen werden (BORK & BECKMANN, 1993). Auch konnte durch Untersuchungen gezeigt werden, dass die Spermadhäsine nur in geringen Mengen als Monomere im Seminalplasma anzutreffen sind (JONAKOVA et al., 2000). Da sich die Aminosäuresequenz der Spermadhäsine keiner der bereits bekannten Lektingruppen zuordnen lässt, muss diese Familie als eine neuartige Lektinklasse angesehen werden (TÖPFER-PETERSEN, 1999).
Das Seminalplasma, oder auch akzessorisches Sekret, umfasst die Summe aller, nicht dem Hoden entstammenden Komponenten des Ejakulates, wobei insbesondere beim Schwein während der Ejakulation sehr stark gelierende Komponenten abgegeben werden, die nicht mehr dem flüssigen Seminalplasma zugeordnet werden können. Die abgesetzte Menge an akzessorischem Sekret beträgt beim Schwein zwischen 150-500 ml (MANN & LUTWAK-MANN, 1981; Kolb, 1984).
Noch vor einigen Jahren waren Wissenschaftler der Meinung, dass die einzige Aufgabe des Seminalplasmas eine Schutz und Nährfunktion sei (WILLIAMS-ASHMAN, 1988). Inzwischen ist die Zusammensetzung des flüssigen, spermienfreien Anteils des Ejakulates besser untersucht und es sind diverse neue Erkenntnisse hierzu gewonnen worden (Tabelle 2).
Literaturübersicht 8
Tabelle 2: Hauptgruppen von Stoffkomponenten, die hauptsächlich im Seminalplasma unterschieden werden können. (MANN & LUTWAK-MANN, 1981; TÖPFER-PETERSEN et al., 1998; DEPUYDT et al., 1998; TAMMI et al., 1994;
ALFONSO et al., 1996; CALVETE et al., 1995; KWOK et al., 1993).
Hauptgruppen Komponenten
Ionen und anorganische Bestandteile z.B. Natrium 580 mg/100ml, etc.
kleine organische Moleküle z.B. Fruktose, Milchsäure, etc.
Steroide und Prostaglandine z.B. Testosteron, Progesteron, etc.
proteinische Komponenten z.B. Fibronectin-Typ II, Spermadhäsine, etc.
enzymatische Komponenten z.B. ß-Galaktosidase, saure ATPase, etc.
Alle bekannten Spermadhäsine werden von sekretorischen Zellen entlang des Geschlechtstraktes gebildet. Insbesondere aus den akzessorischen Geschlechtsdrüsen werden große Mengen sezerniert. So stellen beispielsweise allein die beiden Spermadhäsine PSP I und PSP II einen Mengenanteil von über 50% des gesamten Seminalplasmaproteins dar (KWOK et al., 1993).
In ejakuliertem Sperma hat man eine Menge von 12-60 x 106 Molekülen Spermadhäsin auf jedem Spermium nachweisen können (CALVETE et al., 1997). Für das Spermadhäsin AWN konnte nachgewiesen werden, dass es im Rete testis gebildet wird und auf den Spermien des Nebenhodens bereits fest gebunden ist (SINOWATZ et al., 1995; DOSTALOVA et al., 1994).
Aufgrund eines Galactose-Erkennungsmechanismus ist AWN vermutlich an der Erkennung von Spermatozoon und Eizelle beteiligt. Im Gegensatz dazu wird das Spermadhäsin AQN I erst während der Ejakulation an die Spermienoberfläche assoziiert. Auf Grund seiner Fähigkeit zur Erkennung von Oligomannosylglycanen des Oviduktepithels, ist es an der Bindung des Spermiums an das Ovidukt von wesentlicher Bedeutung (TÖPFER-PETERSEN et al., 2002). Diese Spermium-Ovidukt-Bindung nimmt eine wichtige Rolle bei der Regulation der Spermatozoenfunktion und deren Synchronisation mit der Ovulation der Eizelle ein. Die beiden Spermadhäsine PSP I und PSP II bilden bei der Ejakulation lediglich eine lockere Schicht um das Spermium. Ihre Aufgabe besteht eher in der Immunregulation im Uterus und in allgemeinen Schutzaufgaben durch ihre gebundenen Serinproteinasen (ASSREUY et al., 2002; ASSREUY et al., 2003). Aufgrund dieser Eigenschaften kann man den Spermadhäsinen des Schweins wesentliche Aufgaben für das Überleben und die Funktionalität der Spermien im weiblichen Genitale zuordnen.
Literaturübersicht 9
2.4.1 PSP I und PSP II (porcines Seminalplasmaprotein I und II)
Die beiden porcinen Seminalplasmaproteine I und II (PSP I / PSP II) stellen mit über 50% der gesamten Plasmaproteine den Hauptbestandteil im porcinen Seminalplasma dar (ASSREUY
et al., 2002). Sowohl PSP I als auch PSP II zeigen eine immunmodulatorische Aktivität die durch unterschiedliche Mechanismen ausgelöst wird (YANG et al., 1998). Oligosaccharide, die mit NeuNAcα2-6GalNAcβ1-4GlcNAc-R ausgestattet sind, blockieren CD22 vermittelte Reaktionen, welche eine Rolle bei der Adhäsion von B-Lymphozyten an Monozyten und T-Lymphozyten spielen. Diese Kohlenhydrat-Seitenkette ist auch bei diesen beiden Spermadhäsinen zu finden (RIBEIRO et al., 1990). Während PSP I eine chemotaktische und eine direkte Wirkung auf Neutrophile Granulozyten hat und damit eine massive Invasion von polymorphkernigen Leukozyten in das Lumen des Uterus bewirkt, hat PSP II lediglich eine chemotaktische Wirkung (ASSREUY et al., 2002). Zum überwiegenden Teil kommen beide Spermadhäsine als ein nicht-kovalent gebundenes Heterodimer vor (CALVETE et al., 1995).
Dieses Heterodimer zeichnet sich insbesondere durch eine Zuckerbindungsstelle aus, die an die Glykoproteine der Zona pellucida bindet. Das Heterodimer kann eine Interaktion mit Makrophagen eingehen und bewirkt bei diesen die Freisetzung von chemotaktischen Faktoren, die wiederum die Migration von Neutrophilen Granulozyten in das Uteruslumen bewirken (ASSREUY et al., 2002; ASSREUY et al., 2003). Dieser Einstrom phagozytierender Zellen hat einen reinigenden Effekt auf das Uteruslumen. Vorhandene pathogene Keime werden eliminiert und der Uterus auf die Einnistung einer befruchteten Eizelle vorbereitet.
Sowohl PSP I als auch PSP II besitzt eine Heparin-Bindungsstelle, welche jedoch durch die Bildung des Heterodimeres verloren geht (CALVETE et al., 1995). Heparin bzw.
heparinähnliche Glykosaminoglykane, werden besonders während Follikel-Phasen im weiblichen Genitaltrakt gebildet. In mehreren Studien konnte gezeigt werden, dass Heparin oder heparinähnliche Glykosaminoglykane auf Spermien einen stimulierenden Effekt hinsichtlich der Kapazitation haben (HANDROW, 1982; LENZ et al., 1982, 1983).
2.4.2 AWN
Das Alanin-Tryptophan-Asparagin Seminalplasmaprotein (AWN) ist ein multifunkionales Protein mit einem Proteingewicht von 14 kDa und 133 Aminosäuren (SINOWATZ et al., 1995;
SANZ et al., 1992b). Neben AQN III ist es das Hauptprotein an der Spermienkopfmembran, welches mit der Zona pellucida der Eizelle über eine Phospholipidbindung interagiert. Es ist das einzige der Spermadhäsine, welches bereits im Nebenhoden an die Spermienkopfmembran gebunden wird (DOSTALOVA et al., 1994).
Literaturübersicht 10
Für AWN sind 2 Isoformen identifiziert worden: AWN-1 und AWN-2, wobei der Unterschied darin liegt, dass die beiden Isoformen unterschiedlich glykosiliert sind (CALVETE et al., 1993;
SANZ et al., 1992b; DOSTALOVA et al., 1994). Man konnte nachweisen, dass AWN als nicht-glykosilierte Form im Seminalplasma, auf Spermien im Nebenhoden und auf ejakulierten Spermien vorkommt, sowie als N-und O-glykosilierte Formen als Produkt der Glandula vesicularis (CALVETE et al., 1994). Nur die glykosilierten Formen sind in der Lage mit der Zona pellucida zu interagieren (CALVETE et al., 1994).
AWN-1 hat die Fähigkeit an O-gebundenes NeuAcα2-3/6Galβ1-3GalNAc, sowie an NeuAcα2-3/6Galβ1-4GlcNAc Sequenzstrukturen von Fetuin zu binden (DOSTALOVA et al., 1995).
2.4.3 AQN I
AQN I ist ein Protein mit einem Gewicht von 12 kDa. Strukturell und funktionell weist es sehr große Ähnlichkeiten mit den beiden Spermadhäsinen AWN und AQN III auf. Es besitzt genau wie die beiden anderen Proteine eine Kohlenhydrat- und Zona pellucida Bindungsaffinität (SANZ et al., 1992a). Eine der wesentlichen Aufgaben scheint die Bildung des Spermienreservoirs im Ovidukt zu sein (EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2005).
2.4.4 AQN III
AQN III ist gemeinsam mit AWN das Hauptprotein, welches an der Oberfläche der Spermienkopfmembran gebunden ist und über eine Phospholipidbindung mit der Zona pellucida interagiert (ENSSLIN et al., 2003; CALVETE et al., 1996b). Die Hauptbindungspartner von AQN III sind Glykoproteine mit linearen oder drei- und vierfach- verzweigten Kohlenhydratseitenketten (Calvete et al., 1996b).
2.5 Fruchtbarkeit beim Schwein
Die Schweineproduktion stellt in Deutschland einen bedeutenden Zweig der Fleischgewinnung dar. Eine Beurteilung der in der Schweineproduktion eingesetzten Sauen und Eber erfolgt zurzeit im Rahmen der Zuchtwertschätzung und der Zuchtleistungsprüfung.
Eine Zuchtwertschätzung erfolgt nach der BLUP-Methode (best linear unbiased prediction), wobei hierfür alle Basis- und Vermehrungsbetriebe einbezogen werden. Seit 1996 werden
Literaturübersicht 11
alle Jungsauen und Jungeber linear beschrieben. Im Rahmen der Zuchtwertschätzung erfolgt eine Prüfung auf Mastleistung und Schlachtkörperwert entweder als Feldprüfung, als Eigenleistungsprüfung oder als Geschwister- oder Nachkommenprüfung. Als Beurteilungskriterium für die Fruchtbarkeit wird bis jetzt lediglich die Anzahl der lebend geborenen Ferkel und die Anzahl aufgezogener Ferkel aufgenommen.
Eine Zuchtleistungsprüfung hat die Aufgabe, die im Zuchtziel enthaltenen Leistungseigenschaften direkt oder in Form möglichst eng korrelierter Hilfsmerkmale, an den Zuchttieren selbst und/oder an mit diesen verwandten Tieren zu erheben. In Deutschland ist seit 1926 die Zuchtleistungsprüfung für alle Herdbuchsauen obligatorisch. Für jeden Wurf einer in das Herdbuch eingetragenen Sau wird die Zahl der lebend und tot geborenen Ferkel, sowie die Zahl der am 21. Tag noch lebenden Ferkel als Anzahl aufgezogener Ferkel festgehalten. Zusätzlich werden das Alter beim ersten Abferkeln und Zwischenwurfzeiten festgestellt, so dass für jede Sau die Anzahl der Würfe pro Jahr berechnet werden kann.
Eine Ausnahme stellen die Hybridzuchtprogramme dar. Als ein eigenständiges Unternehmen wählen sie ihre Zuchttiere nach eigenen Kriterien aus. Diese Auswahlkriterien werden in der Regel nicht transparent gemacht. Für die Herdenfruchtbarkeit ist der Eber wesentlich verantwortlich. Außerdem beeinflusst er die Fruchtbarkeit seiner weiblichen Nachkommen.
Während die in der künstlichen Besamung eingesetzten Eber regelmäßig kontrolliert werden, erfolgt diese gezielte Untersuchung an im natürlichen Deckeinsatz befindlichen Ebern in der Regel beim Zukauf oder beim Auftreten von Herdenfruchtbarkeitsdefiziten. Auswertungen in Deckbetrieben haben gezeigt, dass der Eber in 50 bis 70% der Fälle für Fruchtbarkeitsstörungen verantwortlich gemacht werden kann (BUSCH W & ZEROBIN K, 1995). Auf Grund der betrieblichen Aspekte spielt die Fruchtbarkeit der Tiere eine wesentliche Rolle, denn nicht nur die Mast- und Schlachtleistungen sind von wirtschaftlichem Belang, sondern auch eine möglichst hohe Reproduktionsrate. Eine Selektion auf Fruchtbarkeit ist bis heute schwierig, da es keine Möglichkeit gibt, direkt darauf zu testen. In den aufgeführten Auswahlkriterien für Zuchttiere werden Hilfsmerkmale für die Fruchtbarkeit verwendet. Die Fruchtbarkeit wird jedoch von komplexen Faktoren beeinflusst, die sich aus maternalen, paternalen, embryonalen und umweltbedingten Komponenten zusammensetzen. Obwohl bereits züchterische Verbesserungen der Fruchtbarkeit erreicht wurden, würde eine frühzeitige Selektion auf Fruchtbarkeit einen zusätzlichen wichtigen ökonomischen Faktor für die Zuchtbetriebe darstellen. Seit einiger Zeit werden genetische Mechanismen untersucht, die zu phänotypischen Unterschieden in der männlichen Fruchtbarkeit führen. In einer ersten Untersuchung beim Pferd konnte eine hohe Variabilität der CRISP Gene aufgeklärt werden, die ebenfalls für Seminalplasmaproteine codieren (GIESE et al., 2002a; GIESE et al., 2002b). Eine möglichst genaue Charakterisierung der porcinen Spermadhäsingene erscheint sinnvoll, um die physiologischen Abläufe des
Literaturübersicht 12
Befruchtungsvorgangs beim Schwein besser verstehen zu können. Durch die Aufklärung der Genomstruktur und die Vervollständigung der cDNA-Sequenzen, können vielleicht erste Schlüsse auf mögliche regulatorische Elemente gewonnen werden und so ein Grundstein für die Aufklärung des Netzwerkes von Proteinen und ihrer Interaktionen bei der Regulierung der Fruchtbarkeit beim Schwein gelegt werden.
Zur Vorbereitung dieser Arbeit wurden bereits BAC und PAC-Klone mit den zu untersuchenden Spermadhäsin Genen aus Genbanken isoliert (HAASE et al., 2005) Die grobe physikalische Kartierung aller isolierten Klone zeigte, dass es durch die Auswahl der Klone BAC RP44-374013 und PAC A5E11 möglich war, mit nur zwei Klonen den gesamten genomischen Locus der Spermadhäsin Gene zu untersuchen. Alle fünf Spermadhäsine liegen unmittelbar benachbart auf diesem zusammenhängenden Contig. Da sich das DMBT1 Gen ebenfalls auf den für die Untersuchung der Spermadhäsine ausgewählten Klonen befand, wurde es im Rahmen dieser Arbeit mit untersucht.
Material 13
3 Material
3.1 Bakterien, Plasmide
3.1. Bakterien
Aus der Stammsammlung des Instituts für Tierzucht und Vererbungsforschung, Abteilung Molekulargenetik, wurde der Bakterienstamm E. coli XL1-Blue mit den genetischen Eigenschaften ∆(mcr A)183 ∆(mcrCB-hsd SMR-mrr)173, endA1, sup E44, thi-1 gyrA96, tellA1, lac [F´proAB, lacI Z ∆M15, Tn10(tet)] (Stratagene, Heidelberg) verwendet.
Weiterhin wurde der E. coli Stamm TOP 10 One Shot verwendet, welcher chemisch kompetent ist (Invitrogen; Groningen, Niederlande) und die genetischen Eigenschaften F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74deoR recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (Str ) endA1 nupG hat.
3.1.2 Plasmide
Es wurden die Plasmide pDrive Cloning Vector (QIAGEN, Hilden) und pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen, Groningen, Niederlande) eingesetzt.
3.2 Enzyme, Oligonukleotide und Transposon
3.2.1 Enzyme
Es wurden Enzyme der Firmen New England Biolabs (Schwalbach) und Amersham Biosciences (Freiburg) benutzt.
Material 14
3.2.2 Oligonukleotide
Für die Sequenzierung auf dem LICOR wurden folgende fluoreszenzmarkierte Standardprimer verwendet, die von der Firma MWG-Biotech GmbH (Ebersberg) synthetisiert wurden:
M13universal(-21), 18-mer: 5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3' M13reverse(-29), 18-mer: 5'- CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'
Für die Sequenzierung auf dem MegaBACE wurden unmarkierte Primer verwendet, die von der Firma Biomers GmbH (Ulm) synthetisiert wurden:
3.2.3 Transposon
Für die Sequenzierung des DMBT1 cDNA-Fragmentes auf dem LICOR, wurde mit dem Entransposon (CamR-3),1302 bp aus dem TGSTMII Kit von Finnzymes (Espoo, Finnland) gearbeitet.
SeqW, 20-mer 5'-GGT GGC TGG AGT TAG ACA TC-3' SeqE, 20-mer 5'-CGA CAC ACT CCA ATC TTT CC-3'
3.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterial
Eingesetzt Chemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden von den Firmen
Eppendorf Gerätebau (Hamburg), Greiner GmbH (Nürtingen), Falcon Becton Dickinson Labware (New Jersey), GibcoBRL Life Technologies (Heidelberg), Roth (Karlsruhe), Sigma Chemie (München), Amersham Biosciences AB (Dortmund).
3.4 Laborgeräte
• Applied Biosystems, Darmstadt 7300 Real-time PCR System
Material 15
• Biometra, Göttingen:
BioDocAnalyzer
• Bio-Rad Laboratories, München:
Agarosegel-Elekrophorese-Kammern
• Eppendorf Gerätebau, Hamburg:
BioPhotometer, Tischzentrifuge 5415 C und 5415 D
• GE Healthcare Biosciences, Freibung
MegaBACE 1000 Kapillar DNA-Sequenzierer
• Heraeus Instruments, Osterode:
Inkubator, Megafuge 1.0R (Rotor BS 4402/A), Biofuge Stratos (Rotor 3331)
• LI-CORE Bioscieces GmbH, Bad Homburg
LI-CORE DNA Analyser Gene Reader 4200 und 4300
• Millipore, Eschborn:
MilliQ biocell
• MWG-Biotech GmbH, Ebersberg:
LI-COR DNA Analyser Gene Reader
• MJ Research Inc, Watertown (USA):
PTC-100 Peltier Thermal Cycler
• Sartorius AG, Göttingen:
Waage BL 1500S
• Savant, München:
Speed Vac Plus SC110A
• Sigma, Osterode:
Sigma 4-15 (Rotor 09100)
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3.5 Verwendete Kits
Qiagen GMBH, Hilden Qiagen 96 Blood Kit
Qiagen RNeasy fibrous tissue Mini Kit QIAEX II Kit
Qiagen RNeasy 96 Universal Tissue Kit MiniElute Gel Extraction Kit
Ambion Inc., Huntingdon, England FirstChoice RLM Kit
Invitrogen, Karlsruhe
TOPO Shotgun Subcloning Kit
Finnzymes, Espoo, Finnland TGSTMII Kit
GE Healthcare Biosciences, Freiburg
DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing Kit Nucleon BACC2 Kit
Methoden 17
4 Methoden
4.1 Vermehrung und Isolierung von Plasmid-DNA
4.1.1 Bakterienkultur
4.1.1.1 Flüssigkultur
Autoklaviertes L-Broth Medium (LB-Medium) wurde, nach Zugabe der entsprechenden Antibiotika, mit Bakterien einer Plattenkultur angeimpft. Die beimpfte Flüssigkultur wurde anschließend 8-20 Stunden bei 37°C im Schüttler inkubiert.
LB-Medium: 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt 5 g NaCl ad 1000 ml H2O bidest
Die verwendeten Antibiotika wurden bei Bedarf in folgenden Endkonzentrationen dem Flüssigmedium zugesetzt: 50 µg/ml Ampicillin aus einer Stammlösung (50 mg/ml in H2O bidest, gelagert bei -20 °C), 12,5 µg/ml Tetracyclin aus einer Stammlösung (12,5 mg/ml in 70% Ethanol, gelagert bei -20°C), 25 µg/ml Kanamycin aus einer Stammlösung (50 mg/ml in H2O bidest, gelagert bei -20°C). Die Flüssigkultur wurde bei 4°C aufbewahrt.
4.1.1.2 Plattenkultur
LB-Agar wurde autoklaviert und auf ca. 50°C abgekühlt. Je nach Selektionsanforderung wurde der noch flüssige Agar mit Ampicillin (50 µg/ml), Tetracyclin (12,5 µg/ml) oder mit Kanamycin (25 µg/ml), sowie einer Endkonzentration von 40 µg/ml X-Gal (Stammlösung 40 mg/ml in N,N-Dimethylformamid (DMF)) versetzt und ca. 5 mm hoch in sterile Petrischalen gegossen. Nach dem Erstarren wurden die Platten noch 30 Minuten offen unter einer sterilen Laminarhaube getrocknet und danach steril verpackt.
Mit Hilfe einer sterilen Pipette wurden 150-250 µl Flüssigkultur auf eine Platte pipettiert und mit Hilfe einer sterilen Einmalimpfschlinge ausgestrichen. Die Platten wurden anschließend 16-24 Stunden bei 37°C inkubiert.
Methoden 18
LB-Agar: 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt 5 g NaCl
15 g Bacto-Agar
ad 1000 ml H2O bidest
Plattenkulturen wurden bei 4°C bis zu einem Monat aufbewahrt.
4.1.2 Isolierung von Plasmid DNA aus Bakterien
4.1.2 .1 Schnellaufschluss durch alkalische Lyse
Um kleinere Mengen Plasmid-DNA zu erhalten, wurden 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika mit einer einzelnen Kolonie angeimpft und bei 37°C 8-20 Stunden geschüttelt. Die Kultur wurde bei 4500 Upm 10 Minuten bei 4°C in der Megafuge 1.0R zentrifugiert. Das entstehende Pellet wurde in 150 µl Puffer P1 resuspendiert und in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Es wurden 150 µl Puffer P2 hinzu gegeben und ca. 5 Minuten bis zur vollständigen Lyse der Bakterien inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl Puffer P3, wurde der Ansatz gemischt und anschließend bei 20.000 Upm 15 Minuten bei 4°C in der Biofuge Stratos zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und mit 1 ml 100%igem Ethanol versetzt. Nach kurzem Mischen wurde wiederholt bei 20.000 Upm 15 Minuten bei 4°C in der Biofuge Stratos zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und anschließend in der SpeedVac ca. 10 Minuten getrocknet. Das trockene Pellet wurde in 50 µl 1x TE aufgenommen.
Puffer P1: 50 mM Tris-HCl pH 8,0
10 mM EDTA
100 µg/ml RNase A, gelagert bei 4°C
Methoden 19
RNase-Stammlösung: 10 mg/ml in H2O bidest, zur Inaktivierung von DNAsen 15 Minuten auf 100°C erwärmt, Lagerung bei -20°C
Puffer P2: 200 mM NaOH
1% SDS
Puffer P3: 3 M KOAc, pH 5,5
TE (10/1): 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM EDTA
4.1.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA mit dem QIAGEN Midi Plasmid Kit
Um größere Mengen reiner Plasmid-DNA zu isolieren, wurden QIAGEN Midi Plasmid Kits verwendet. Die Bakterien werden durch eine NaOH/SDS-Behandlung lysiert und die Proteine sowie assoziierte genomische DNA durch KOAc gefällt. Die weitere Aufreinigung der Plasmid-DNA erfolgt durch eine Ionenaustauschchromatographie.
50 ml Bakterienkultur wurden 10 Minuten bei 5000 Upm in der Megafuge 1.0R zentrifugiert.
Das Bakterienpellet wurde nach den Angaben des Herstellers in den entsprechenden Mengen Puffer P1 resuspendiert. Zur Lyse der Bakterien wurde das gleiche Volumen Puffer P2 zugegeben, vorsichtig gemischt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde das gleiche Volumen Puffer P3 zugegeben und einige Male geschwenkt. Nach einer Inkubation von 10 Minuten auf Eis, wurde 30 Minuten bei 6000 Upm zentrifugiert. Der klare Überstand auf eine mit QBT äquilibrierte Qiagensäule übertragen, mit Puffer QC gewaschen und die Plasmid-DNA mit dem Puffer QF eluiert. Zum Ausfällen der DNA wurde das 0.7 fache des Volumens an Isopropanol zugegeben und 60 Minuten bei 6000 Upm in der Megafuge 1.0R zentrifugiert. Das Pellet mit 3 ml -20°C kaltem 70%igem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die DNA wurde in einem entsprechenden Volumen TE-Puffer (10/1) gelöst und die Konzentration durch Messung der optischen Dichte bei 260 nm im Spektralphotometer bestimmt.
Puffer QBT: 750 mM NaCl 50 mM Na-MOPS pH 7,0 15% Ethanol
0,15% Triton X-100
Methoden 20
Puffer QC: 1 M NaCl
50 mM Na-MOPS pH 7,0 15% Ethanol
Puffer QF: 1,25 M NaCl
50 mM Na-MOPS pH 8,5 15% Ethanol
4.1.3 Transformation kompetenter E. coli
4.1.3.1 Transformation chemisch kompetenter E. coli XL1-blue
50 µl kompetente E. coli XL-Blue wurden auf Eis aufgetaut und zu 10 µl DNA-Lösung pipettiert, die ca. 50 ng Plasmid-DNA enthielt. Der Ansatz wurde 5-10 Minuten auf Eis inkubiert, dann 2 Minuten bei 42°C gehalten und für 2-3 Minuten auf Eis abgekühlt. Der Transformationsansatz wurde mit 250 µl 37°C warmen NZCYM-Medium versetzt und bei 37 C für 45 Minuten inkubiert. 150-250 µl dieses Ansatzes wurden auf LB/amp/tet/X-Gal-Platten ausplattiert.
NZCYM-Medium: 10 g NZ-Amine A 5 g Hefeextrakt 1 g Casaminoacids 5 g NaCl
2 g MgSO4 x 7 H2O ad 1000 ml H2O bidest
4.1.3.2 Transformation chemisch kompetenter TOP 10 One Shot Zellen
50 µl chemisch kompetente TOP10 One Shot Zellen wurden auf Eis aufgetaut und 2 µl DNA-Lösung dazu pipettiert. Der Ansatz wurde 15 Minuten auf Eis inkubiert, dann 45 Sekunden bei 42°C gehalten und wieder auf Eis abgekühlt. Der Transformationsansatz wurde mit 500 µl SOC-Medium versetzt und bei 37°C 60 Minuten mit 225 Upm inkubiert.
Methoden 21
50-150 µl dieses Ansatzes wurden auf LB/kana/X-Gal Platten ausplattiert und 20 Stunden bei 37°C inkubiert.
SOC-Medium: 20 g Trypton 5 g Hefeextrakt 0,5 g NaCl 2,5 mM KCl
20 mM Glucose
10 mM MgCl2
ad 1000 ml H2O bidest
4.2 Enzymatische Manipulation und Analyse von DNA
4.2.1 Auftrennen von kleinen DNA-Fragmenten
Zur Auftrennung von kleinen DNA-Fragmenten wurden horizontale Agarosegele mit einer Dicke von 6 mm und einer Länge von 10-25 cm verwendet. Je nach Größe der zu untersuchenden DNA-Fragmente wurden Agarose-Konzentrationen von 0,6-2,0% gewählt.
Die jeweilige Menge Agarose wurde in einen Erlenmeyer-Kolben eingewogen und im entsprechenden Volumen 1 x TBE-Laufpuffer aufgenommen. Die Suspension wurde in der Mikrowelle aufgekocht und solange gerührt, bis eine homogene Lösung entstand. Die Lösung wurde auf ca. 50-60°C abgekühlt und mit Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml in H2O bidest) auf eine Ethidiumbromidkonzentration von 0,4 µg/ml eingestellt. Die Lösung wurde in eine Gelform mit einem Kamm der erforderlichen Taschengröße gegossen und bis zum Erstarren der Agarose stehen gelassen. Der Kamm wurde vorsichtig gezogen und das Gel in einer Elektrophoresekammer mit 1 x TBE-Laufpuffer bedeckt. Die DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen 10x Auftragspuffer versetzt und in eine Tasche des Gels pipettiert. Die Elektrophorese erfolgt bei einer Feldstärke von 5-10 V/cm. Die DNA-Fragmente wurden durch Fluoreszenz des in die DNA interkalierten Ethidiumbromids unter UV-Licht bei 366 nm oder 312 nm sichtbar gemacht. Die Dokumentation erfolgte mit Hilfe des BioDoc Analyzers (Biometra).
Methoden 22
10x TBE-Laufpuffer: 121 g Tris
51,4 g Borsäure
3,72 g EDTA
ad 1000 ml H2O bidest
10x Auftragspuffer: 20% (w/v) Ficoll 0,1 M EDTA pH 8,0
0,2% (w/v) Bromphenolblau
0,2% (w/v) Xylencyanol
4.2.2 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mittels QIAEX II-Kit
Die zu isolierenden DNA-Fragmente wurden nach der elektrophoretischen Auftrennung auf einem UV-Schirm (366 nm) ausgeschnitten, abgewogen und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Es wurden 3 Volumen Puffer QX 1 zugegeben und 10 µl resuspendierte QIAEX II-Lösung zum Reaktionsansatz dazu pipettiert. Dieser wurde 10 Minuten bei 50°C inkubiert und dabei alle 2 Minuten durch starkes Schütteln gemischt.
Der Ansatz wurde 30 Sekunden bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge zentrifugiert und der Überstand sorgfältig entfernt. Das Pellet wurde in 500 µl QX 1 resuspendiert, 30 Sekunden bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge erneut zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Pellet wurde zweimal auf die gleiche Weise mit je 500 µl Puffer PE gewaschen und anschließend 15 Minuten luftgetrocknet. Um die DNA zu eluieren, wurde das Pellet mit 20 µl TE-Puffer (10/1) 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 30 Sekunden bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig in ein neues Reaktionsgefäß überführt.
4.2.3 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarose mittels MinEluteTM Gel Extraction Kit (Qiagen)
Die zu isolierenden DNA-Fragmente wurden nach der elektrophoretischen Auftrennung auf einem UV-Schirm (366 nm) ausgeschnitten, gewogen und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Es wurden 3 Volumen Puffer QG zugegeben. Der Ansatz wurde anschließend 10 Minuten bei 50°C inkubiert und dabei alle 2 Minuten durch starkes Schütteln gemischt.
Nachdem sich das Gelstück komplett gelöst hatte, wurde 1 Volumen Isopropanol zugegeben
Methoden 23
und der Ansatz mehrfach geschwenkt. Die Säule wurde in das Auffanggefäß gestellt, der komplette Ansatz auf die Membran pipettiert und 1 Minute bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. 500 µl Puffer QG wurden auf die Membran der Säule gegeben und für 1 Minute bei 13000 Upm zentrifugiert. Der Waschschritt wurde mit 750 µl Puffer PE wiederholt. Zum Eluieren der DNA wurde die Säule in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß gestellt, dann 10 µl Puffer EB direkt auf die Membran pipettiert, diese 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 1 Minute bei 13000 Upm zentrifugiert.
4.2.4 Enzymatische Manipulation von DNA
4.2.4.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Gereinigte DNA wurde mit kommerziell erhältlichen Restriktionsendonukleasen gespalten.
Die Reaktionsbedingungen wurden entsprechend den Herstellerangaben eingestellt. Die DNA wurde je nach Reinheitsgrad mit 1 bis 5 Units Enzym pro µg DNA für mindestens 1 Stunde bei 37°C inkubiert.
4.2.4.2 Ligation von Plasmiden
Um zwei DNA-Fragmente kovalent zu verbinden, müssen enzymatisch Phosphodiesterbindungen mit Hilfe der Ligase geknüpft werden. Für diese Verknüpfung ist mindestens ein DNA-Ende mit einer 5'-Phosphatgruppe erforderlich.
Reaktionsansatz: 50 ng Vektor-DNA
X ng Insert-DNA (molares Verhältnis Insert/Vektor 1:1) 3 µl 10x Reaktionspuffer des Herstellers
0.5 µl T4-DNA-Ligase (NEB; 400.000U/ml) ad 30 µl H2O bidest
Der Ansatz wurde für mindestens 2 Stunden bei 16°C inkubiert.
Methoden 24
4.2.4.3 Ligation von Plasmiden mit Hilfe des TOPO Cloning Systems
Das TOPO Cloning System basiert auf dem liniearisierten pCR4Blunt-TOPO Vektor, an dessen 3'-Enden die Vaccina Virus Topoisomerase I kovalent gebunden ist. Dies ermöglicht eine effiziente Ligation von DNA-Fragmenten mit glatten Enden.
Reaktionsansatz: 10 ng pCRR4Blunt-TOPOR Vektor-DNA 100 ng Insert-DNA mit glatten Enden
1 µl Salz-Puffer des Herstellers________
6 µl
Der Reaktionsansatz wurde durch leichtes Schwenken vorsichtig gemischt und 25 Minuten bei 37°C inkubiert.
4.2.4.4 Ligation von PCR-Produkten mit dem QIAGEN PCR Cloning System
Das QIAGEN PCR Cloning System nutzt den A-Überhang an den 3'-Enden von PCR-Produkten, welcher durch die Taq-DNA-Polymerase eingeführt wird. Der liniearisierte pDrive Cloning Vektor weist an beiden Enden einen U-Überhang auf, so dass eine Ligation von PCR-Produkten effizient erfolgen kann. Die Ligation wurde im Puffer des Herstellers durchgeführt, der alle Cofaktoren und Reagenzien für die Ligation beinhaltet.
Reaktionsansatz: 50 ng pDrive Cloning Vector 100 ng PCR-Produkt
5 µl Ligationspuffer des Herstellers___
10 µl
Der Ansatz wurde gemischt und anschließend 30 Minuten bei 16°C inkubiert.
Methoden 25
4.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (SAIKI et al., 1988)
4.3.1 Polymerase Kettenreaktion Standardansatz
Der Standardansatz enthielt: DNA Template 2 µl 10x Puffer (Molzym) 5,2 µl Enhancer (Molzym) 1,19 µl 5 mM dNTPs 2 µl Vorwärtsprimer (100 mM) 0,5 µl Rückwärtsprimer (100 mM) 0,5 µl H2O bidest 40,41 µl Mol-Taq (Molzym) (5U/µl) 0,2 µl__
52 µl
Die Komponenten des Ansatzes wurden auf Eis pipettiert, gemischt und die Reaktionsgefäße in einen auf 94°C vorgeheizten Thermocycler überführt. Nach einer initialen Denaturierungsphase von 5 Minuten bei 94°C wurden 35 Zyklen mit 45 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 45 Sekunden Annealing bei der jeweiligen Annealingtemperatur des Primerpaares und 60 Sekunden Polymerisation bei 72°C durchgeführt. Anschließend wurden die PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert.
4.3.2 PCR mit der Platinum Pfx Polymerase
Für die Amplifikation von langen und GC-reichen Produkten wurde die Platinum Pfx Polymerase (Invitrogen) verwendet. Folgender Ansatz wurde auf Eis zusammen pipettiert, gemischt und die Reaktionsgefäße in einen auf 94°C vorgeheizten Thermocycler überführt:
Der Ansatz enthielt: 2 µl DNA-Template
5 µl 10 x Platinum Pfx Puffer 3 µl 5 mM dNTPs
1 µl 50 mM MgSO4 0,4 µl F-Primer (100 pmol) 0,4 µl R-Primer (100 pmol)
0,5 µl Platinum Pfx Polymerase (2,5 U/µl)
37,7µl H2O bidest_____________________
50 µl
Methoden 26
Nach einer initialen Denaturierungsphase von 2 Minuten bei 94°C wurden 35 Zyklen mit 20 Sekunden Denaturierung bei 94°C, 20 Sekunden Annealing bei 58°C und 3 Minuten Polymerisation bei 72°C durchgeführt.
4.3.3 Real-time PCR
Für die Untersuchung der Expression der porcinen Spermadhäsingene im männlichen und weiblichen Genitaltrakt wurde, unter Verwendung des SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt) folgender Reaktionsansatz genommen:
Reagenzien Konzentration Endkonzentration µl pro Reaktion Stammlösung
2x SYBR Green Mastermix 2x 1x 10.00
Vorwärts Primer 10 µM 100 nM 0.20
Rückwärts Primer 10 µM 100 nM 0.20
Wasser 7.60
Matrizen DNA 2.00
Gesamtvolumen 20.00
SYBR-Green ist ein interkalierender Farbstoff der sich unspezifisch in Doppelstrang-DNA einlagert. Dadurch kommt es mit fortschreitender PCR-Reaktion zu einem Fluoreszenzanstieg. Eine Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produkten erfolgt mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse.
Der Reaktionsansatz wurde im 96-well Plattenformat in Duplikaten angesetzt und im 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems, Darmstadt) 10 Minuten bei 95°C aktiviert.
Es folgten 50 Zyklen mit 15 Sekunden bei 95°C, 60 Sekunden Annealing und Extension mit der Primer spezifischen Temperatur und einer anschließenden Schmelzpunktbestimmung des Produktes. Zur Normalisierung wurde auf jeder untersuchten Platte eine Standardreihe des untersuchten Spermadhäsin Gens (Verdünnungsreihe eines cDNA Plasmids), sowie eine Haushaltsgen Standardreihe (Glutaraldehyd-3-phosphatase-dehydrogenase, GAPDH) mitgeführt. Die Expression der Spermadhäsine (SPADH) und von GAPDH wurden in Duplikaten ermittelt. Die Mittelwerte der jeweiligen Spermadhäsin-Expression wurden normalisiert auf die dazugehörigen Mittelwerte der GAPDH-Expression [SPADH / GAPDH].
Methoden 27
4.4 DNA-Sequenzierung
4.4.1 Nichtradioaktive Sequenzierung doppelsträngiger DNA (LICOR)
Die Sequenzreaktionen wurden mit dem Thermo Sequenase Fluorescent Labelles Primer Cycle Sequencing Kit mit 7-Deaza-dGTP durchgeführt. Zu 200 fmol Plasmid-DNA (ca. 200 ng/kb) wurden 2 pmol IRD 800, 4 pmol IRD 700 markierte Primer, sowie 1µl Dimethylsulfoxid (DMSO) pipettiert und der ganze Ansatz mit H2O bidest auf 26 µl aufgefüllt. 6 µl dieses Ansatzes wurden zu 2 µl Terminatormix pipettiert und mit Mineralöl überschichtet. Die Sequenzreaktion wurde auf einem PTC-100TM Programmable Thermal Controller mit einer initialen Denaturierung von 3 Minuten bei 94°C und anschließenden 30 Zyklen mit 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden Annealing bei 57°C und 45 Sekunden Extension bei 70°C durchgeführt.
4.4.2 Gelelektrophorese von Sequenzprodukten auf einem automatischen DNA-Sequenzierer
Für die Auftrennung von Sequenzprodukten wurde das LICOR Modell 4200 und 4300 sowie die Steuerungssoftware BaseImageIR V 4.10 und e-Seq DNA Sequenzierungs und Analyse Software V 3.0 verwendet. Als Gelmatrix für die Auftrennung von bis zu max. 1000 bp wurde Sequagel XR mit einem Zusatz von 1% DMSO unter Verwendung von 41 cm langen Glasplatten benutzt. Die Auftrennung erfolgte bei 1500 V, 35 mA und 31 W für ca.
14 Stunden. Als Laufpuffer wurde 1 x TBE verwendet. Vor dem Auftragen wurden die Proben mit 5 µl Ladepuffer versetzt.
Ladepuffer: 97,5% deionisiertes Formamid 10 mM EDTA pH 8,0
0,1% Bromphenolblau
10 x TBE long run: 1,34 M Tris 450 mM Borsäure 25 mM EDTA
Methoden 28
4.4.3 Sequenzierung mit dem MegaBACE 1000 Kapillarsequenzierer
Bei der Sequenzierung auf dem MegaBACE wurden fluoreszenzmarkierte ddNTPs eingesetzt. Die Sequenzreaktion wird mit folgendem Ansatz in einer Mikrotiterplatte durchgeführt:
1,5 µl DNA (Plasmid oder PCR-Produkt) 2,0 µl Primer (5 pmol)
2,0 µl H2O bidest
1,5 µl ET-Mix (DYEnamicTMET Terminator Cycle Sequencing Kit) 0,5 µl Verdünnungspuffer (400 mM Tris/HCL, 10 mM MgCl2,pH 9)_____
7,5 µl
Aus Wasser, ET-Mix und Verdünnungspuffer wurde ein Mastermix erstellt und zu dem vorgelegten Primer und DNA Mix pipettiert. Der Ansatz wurde im Thermocycler 90 Sekunden bei 94°C denaturiert. Es folgten 35 Zyklen mit 20 Sekunden bei 94°C Denaturierung, 15 Sekunden bei 50°C Annealing und 2 Minuten bei 60°C Extension. Die Aufreinigung der Sequenzreaktion erfolgte über eine mit SephadexTM G50 gefüllte Sequenzaufreinigungsplatte nach den Angaben des Herstellers.
Am MegaBACE wurden 150 Minuten (8 kV Lauf-Spannung) und 180 Minuten (9 kV) lange Läufe durchgeführt. Injektionszeiten von 30, 45, 60 oder 90 Sekunden wurden bei einer Injektionsspannung von 1 kV gewählt.
Als “Basecaller” wurde Cimarron 3.12 Even Spacing eingesetzt.
4.5 Isolierung und Analyse von RNA
Beim Umgang mit RNA wurden zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen alle Lösungen neu angesetzt und soweit möglich steriles Einweg-Material verwendet.
4.5.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus Gewebe mit Hilfe des RNeasy 96 Universal Tissue Kit (QIAGEN)
Die RNA-Isolation mit dem RNeasy 96 Universal Tissue Kit erfolgt durch eine chromatographische Trennung über eine Silicagel-Membran.
Methoden 29
Ein ca. 10 mg schweres, RNAlater stabilisiertes Gewebestück wurde in 750 µl QIAzol Lysis Reagent mit dem TissueLyser (Qiagen) homogenisiert. Der Ansatz wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann für 1 Minute bei 6000 x g und 4°C zentrifugiert. Nach Zugabe von 150 µl Chloroform wurde die Platte für 15 Sekunden geschüttelt und weitere 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte 15 Minuten bei 4°C und 6.000 x g in der Megafuge 1.0 R zentrifugieren. Die obere wässrige Phase wurde in eine neue, vom Hersteller gelieferte 96-well Platte überführt und mit 1 Volumen 70%igem Ethanol versetzt. Der Ansatz wurde auf die Membransäule aufgetragen und mit dem vom Hersteller bereitgestellten Puffern RW1 und RPE gewaschen. Zum Eluieren der RNA wurde 45-70 µl RNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und dann in eine saubere Platte abzentrifugiert. Dieser Elutionsschritt wurde einmal wiederholt.
4.5.2 Isolierung von Gesamt-RNA aus Vollblut
Um RNA aus EDTA stabilisiertem Vollblut isolieren zu können, wurden 10 ml EDTA Blut in ein 50 ml Falkon Tube überführt und 10 Minuten bei 1800 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe abgenommen und das Pellet in 7 ml H2O resuspendiert. Nach der Zugabe von 7 ml einer 1,8%igen NaCl-Lösung wurde das Röhrchen geschwenkt und bei 1800 Upm 10 Minuten zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde so oft wiederholt, bis ein nahezu weißes Pellet entstanden war. Das Pellet wurde gewogen und TRIzol (Invitrogen) zur weiteren Isolierung zugegeben. Dabei wurde 1 ml TRIzol für 5-10 x 106 Zellen eingesetzt. Das Pellet wurde in TRIzol resuspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml Chloroform je eingesetztem 1 ml TRIzol, wurde das Reaktionsgefäß leicht geschwenkt und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde 15 Minuten bei 12.000 x g und 4°C zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde vorsichtig abgenommen und auf zwei Eppendorf-Reaktionsgefäße aufgeteilt.
Zu jedem Aliquot wurden 150 µl Isopropanol pipettiert, die Ansätze 10 Minuten bei 15-30°C inkubiert und danach 10 Minuten bei 4°C und 12.000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 75%igem Ethanol gewaschen und nach dem Trocknen in RNase-freiem Wasser aufgenommen.
Methoden 30
4.5.3 Amplifikation von cDNA mit Hilfe des FirstChoice RLM-RACE Kit
Um vollständige cDNA von Volllänge-mRNA zu amplifizieren, wurde das First Choice RLM-RACE (RNA-ligation mediated rapid amplification of cDNA ends) Kit von Ambion verwendet. Die Gesamt RNA wurde mit Kälberdarm Phosphatase dephosphoryliert und die Cap-Struktur der Volllänge-mRNA mit saurer Tabak-Pyrophosphatase entfernt.
Anschließend wurde ein Oligonukleotid-Adapter an das 5'-Ende der mRNA ligiert. Da nur Volllänge-mRNAs eine 5´Phosphatgruppe tragen, wurde so gewährleistet, dass der Adapter ausschließlich an die Volllänge-mRNA ligiert. Mit zwei verschränkten („nested“) genspezifischen und adapterspezifischen Primerpaaren wurde dann eine reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt, um das komplette 5´-Ende der cDNAs zu amplifizieren. Die Reaktionsansätze der einzelnen Schritte wurden nach den Angaben des Herstellers pipettiert und inkubiert. Die 5'-RACE Produkte wurden zur weiteren Analyse kloniert und sequenziert.
4.6 Isolierung von genomischer DNA
4.6.1 Isolierung von genomischer DNA aus Blut mit Hilfe des NucleonTM BACC2-Kit
Zur Isolierung von genomischer DNA aus EDTA stabilisiertem Blut wurde das NucleonTMBACC2-Kit (GE Healthcare) verwendet. Tiefgefrorene Proben wurden auf Zimmertemperatur gebracht und 500-1000 µl in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß pipettiert.
Nach Zugabe des 3 fachen Volumens von Reagens A (im Kit enthalten), wurde der Ansatz 5 Minuten bei Raumtemperatur gemischt, danach 5 Minuten bei 1300 x g zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Der Vorgang wurde einmal wiederholt und das entstehende Pellet in 340 µl Reagens B (im Kit enthalten) aufgenommen und 5 Minuten gemischt. Nach Zugabe von 100 µl Natrium-Perchloratlösung, wurde 20 Minuten bei 37°C, 20 Minuten bei 65°C inkubiert und dann 580 µl eisgekühltes Chloroform dazu pipettiert. Der Ansatz wurde 20 Minuten gemischt, 1 Minute bei 1300 x g zentrifugiert und mit 45 µl Silica-Lösung (im Kit enthalten) versetzt. Anschließend wurde 4 Minuten bei 4000 x g zentrifugiert und die obere Phase in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 800 µl Ethanol wurde kurz geschwenkt und bei 4000 x g 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen. Das getrocknete Pellet wurde in 1 x TE aufgenommen.
Methoden 31
4.6.2 Isolierung von genomischer DNA aus Sperma mit Hilfe des NucleonTM BACC2 Kit
(GE Healthcare)
Die Isolierung von DNA aus Sperma erfolgte nach der Anleitung des Herstellers. Hierbei wurden zuerst die gesamten Zellen lysiert. Anschließend erfolgte eine Deproteinisation durch Natrium-Perchlorat. Durch Zugabe von eisgekühltem Chloroform wurde die DNA zurück gewonnen, mit Ethanol gefällt und aufgereinigt.
4.6.3 Isolierung von DNA aus Haarwurzeln und Gewebeproben mit Hilfe des QIAamp 96 blood kit (Qiagen)
Möglichst kurz geschnittene Haarwurzeln (etwa 20 Stück) oder stecknadelkopfgroße Gewebestücke, wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 300 µl Puffer X1 über Nacht bei 55°C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden 200 µl des Puffers AL (aus dem QIAamp 96 blood kit) auf den Ansatz pipettiert und 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Dieser Ansatz wurde auf das Membransystem des QIAamp 96 blood kit pipettiert und nach den Angaben des Herstellers weiter behandelt.
Puffer X1 10 mM Tris-HCL pH 8.0 10 mM EDTA
100 mM NaCl 2% SDS
Direkt vor Gebrauch wurden zu 1 ml Puffer X1 folgende Reagenzien zugeben:
40 µl einer 1 M Stocklösung DTT (40 mM DTT)
14 µl einer 20 mg/ml Lösung Proteinase K (250 µg/ml Proteinase K)
Methoden 32
4.7 Bioinformatik
4.7.1 Programme (lokal)
4.7.1.1 LICOR Steuersoftware
Die LICOR Sequenzdaten wurden mit dem Base Image IRV 4.10 und der eSeq V 3.0 Software gesammelt und mit dem Programm e-Seq V 3.0 ausgewertet und in Standard Chromatogramm Format (SCF) Dateien umgewandelt.
4.7.1.2 Sequencher
Die ermittelten Sequenzen wurden mit dem Programm Sequencher 4.2 bearbeitet und zu Contigs zusammengesetzt.
4.7.1.3 DNASTAR Programmpaket
Mit dem Programm EditSeq wurden Nukleotidsequenzen bearbeitet und zu Proteinsequenzen übersetzt. Protein und Nukleotidsequenzen wurden mit Hilfe dieses Programms bearbeitet und für die Eingabe in Internetprogramme formatiert.
4.7.2 Internetseiten
4.7.2.1 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
Um homologe Sequenzabschnitte in Datenbanken zu ermitteln, wurde das Programm BLAST verwendet (Altschul et al., 1990).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Methoden 33
4.7.2.3 Repeatmasker 2
Da die in genomischen Sequenzen auftretenden repetitiven Sequenzabschnitte eine Datenbanksuche erschweren, wurden diese Abschnitte mit Hilfe des Programms Repeatmasker identifiziert und maskiert.
http://repeatmasker.genome.washington.edu/
4.7.2.4 PipMaker
Das Programm PipMaker wurde verwendet, um homologe Sequenzabschnitte zwischen zwei Sequenzen grafisch darzustellen. Das Programm ermöglichte außerdem die Darstellung von codierenden Bereichen, repetitiven Elementen und CpG-Islands (Schwartz et al., 2000).
http://bio.cse.psu.edu/pipmaker/
4.7.2.5 EBI Toolbox
Um Alignments von mehreren Sequenzen zu erstellen, wurde das Programm Clustal W verwendet.
http:/www.ebi.ac.uk/Tools/index.html
Ergebnisse 34
5 Ergebnisse
5.1 Ermittlung der cDNA Sequenz der porcinen Spermadhäsin Gene
Mit Hilfe eines modifizierten Protokolls für die schnelle Amplifikation von cDNA Enden (sog.
RLM-RACE) wurden Volllänge-cDNAs aller fünf porcinen Spermadhäsine aus Glandular vesiculärer Gesamt-RNA des Schweins synthetisiert. Diese Strategie ermöglicht die Isolation von kompletten cDNA 5'-Enden. Im Gegensatz hierzu verliert man bei konventionellen RACE Protokollen einige Nukleotide am 5'-Ende des Transkriptes während der cDNA Synthese. Da aufgrund ausreichender Datenbankeinträge der 3'-Bereich gut abgedeckt ist (Accession numbers im Anhang), wurde auf eine 3'-RACE verzichtet und die benötigten 5'-RACE-Rückwärtsprimer in diese Bereiche gelegt. Die entstandenen PCR-Produkte wurden kloniert und vollständig sequenziert. Volllänge cDNA Sequenzen wurden durch die Kombination der entsprechenden 3'-EST Daten mit den ermittelten 5'-RLM-RACE Sequenzen konstruiert, wie schon zuvor beschrieben (GIESE et al., 2002). Nach Assemblierung der erhaltenen Sequenzen mit den Datenbank ESTs zeigte sich, dass die Volllänge-cDNAs aller fünf Spermadhäsine am 5'-Ende zwischen 9 und 16 bp mehr aufwiesen als in den Datenbanken angegeben war.
5´RACE-Adapter
5´ 3´
genspezifischer Rückwärtsprimer
AQNI ...TC/ACTGCTGAGGCTGG… (+ 14/16 bp) AQNIII …ACTGCTGAGGCTG… (+ 13 bp) PSPI …ACTGCTGAGGCTGG… (+ 14 bp)
AWN …ACTGCTGAG… (+ 9 bp)
PSPII …ACTGCTGAGGCTA… (+ 13 bp)
Abbildung 1: Darstellung der durch die 5'-RLM-RACE erhaltenen zusätzlichen Sequenzen am 5'-Ende aller fünf Spermadhäsin Transkripte. Bei AQN I zeigte einer der sequenzierten Klone im 5'-Bereich zusätzliche 2 nt, die kursiv dargestellt wurden.
