Charakterisierung mechanosensitiver Neurone im submukösen Plexus des porcinen Colons

(1)

Tierärztliche Hochschule Hannover

Charakterisierung mechanosensitiver Neurone im submukösen Plexus des porcinen Colons

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Anna Katharina Filzmayer Speyer

Hannover 2020

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Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Gemma Mazzuoli-Weber, PhD Institut für Physiologie und Zellbiologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

1. Gutachter: Prof. Dr. Gemma Mazzuoli-Weber, PhD Institut für Physiologie und Zellbiologie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

2. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Beineke Institut für Pathologie

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2020

Diese Studie wurde durch die National Institutes of Health (NIH) des US-amerikanischen Gesundheitsministeriums gefördert (1OT2OD024899).

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Meiner Familie in Liebe und Dankbarkeit

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A. Filzmayer, K. Elfers, G. Mazzuoli-Weber (2019)

Are submucosal neurons in porcine proximal colon mechanosensitive?

Vortrag, 26. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurogastroenterologie und Motilität

22.–24. März 2019 in Berlin

Neuroimaging of submucosal neurons from porcine colon

Abstract und Poster, ISAN 2019: 11^th Congress of the International Society for Autonomic Neuroscience

25.–27. Juli 2019 in Los Angeles, USA

Submucosal neurons of the porcine colon respond to different mechanical stimuli

Vortrag, 27. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurogastroenterologie und Motilität

28. Februar–01. März 2020 in Freising

(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1 Definition und Entdeckung des enterischen Nervensystems ... 3

2.2 Aufbau des enterischen Nervensystems ... 4

2.3 Klassifizierungen der Nervenzellen im enterischen Nervensystem ... 7

2.3.1 Morphologische Klassifizierung ... 7

2.3.2 Elektrophysiologische Klassifizierung ... 8

2.3.3 Funktionelle Klassifizierung ... 9

2.3.4 Neurochemische Klassifizierung ... 12

2.4 Mechanosensitivität im Darm ... 14

2.5 Expression nikotinerger Acetylcholin-Rezeptoren im enterischen Nervensystem ... 17

2.6 Physikalische Grundlagen ... 18

2.7 Neuroimaging im enterischen Nervensystem ... 19

2.7.1 Spannungssensitive Farbstoffe ... 20

3 Material und Methoden ... 22

3.1 Verwendete Lösungen und Puffer ... 22

3.2 Versuchstiere und Entnahmestellen ... 24

3.3 Gewebepräparation ... 26

3.4 Versuchsaufbau des Neuroimaging-Setups ... 27

3.5 Voltage Sensitive Dye Imaging ... 32

3.6 Versuchsprotokoll ... 33

3.6.1 Test auf Vitalität ... 33

(6)

3.6.2 Mechanische Stimulation ... 35

3.6.2.1 Test auf Reproduzierbarkeit ... 36

3.7 Immunhistologische Untersuchung ... 37

3.7.1 Färbeprotokoll ... 37

3.7.2 Verwendete Antikörper ... 38

3.7.3 Betrachtung ... 39

3.8 Statistische Auswertung ... 41

4 Ergebnisse ... 43

4.1 Etablierung der Präparationstechnik ... 43

4.2 Submuköse Neurone lassen sich mit Di-8-ANEPPS anfärben ... 43

4.3 Spontanaktivität ... 44

4.4 Submuköse Neurone antworten auf elektrische Stimulation ... 45

4.5 Neuronale Eigenschaften im Colon ascendens ... 46

4.5.1 Submuköse Neurone im porcinen Colon ascendens antworten auf Nikotin ... 46

4.5.1.1 Reproduzierbarkeit ... 47

4.5.2 Submuköse Neurone im porcinen Colon ascendens sind sensitiv gegenüber intraganglionärer Volumeninjektion ... 49

4.5.3 Submuköse Neurone im porcinen Colon ascendens sind sensitiv gegenüber bidirektionaler Dehnung ... 52

4.5.4 Einfluss des Alters... 55

4.5.4.1 Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation ... 55

4.5.4.2 Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion ... 55

4.5.4.3 Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung .. 56

(7)

Inhaltsverzeichnis

4.5.5 Einfluss des Geschlechts ... 57

4.5.5.1 Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation 57 4.5.5.2 Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion ... 57

4.5.5.3 Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung ... 58

4.5.6 Flächenänderung auf Neuronenebene... 59

4.6 Neuronale Eigenschaften im Colon transversum ... 63

4.6.1 Submuköse Neurone im porcinen Colon transversum antworten auf Nikotin ... 63

4.6.2 Submuköse Neurone im porcinen Colon transversum sind sensitiv gegenüber intraganglionärer Volumeninjektion ... 65

4.6.3 Submuköse Neurone im porcinen Colon transversum sind sensitiv gegenüber bidirektionaler Dehnung ... 67

4.6.4 Einfluss des Alters... 69

4.6.4.1 Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation ... 69

4.6.4.2 Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion ... 69

4.6.4.3 Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung .. 70

4.6.5 Einfluss des Geschlechts ... 71

4.6.5.1 Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation 71 4.6.5.2 Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion ... 71

4.6.5.3 Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung ... 72

4.6.6 Flächenänderung auf Neuronenebene... 73

(8)

4.7 Vergleich der beiden untersuchten Stimuli ... 75

4.8 Untersuchungen zur neurochemischen Codierung ... 77

4.8.1 Anteil NOS-positiver Neurone an der Gesamtneuronenzahl im porcinen inneren submukösen Plexus ... 78

4.8.2 Neurochemische Codierung kompressionssensitiver Neurone ... 80

4.8.3 Neurochemische Codierung dehnungssensitiver Neurone ... 81

5 Diskussion ... 82

5.1 Beurteilung der eingesetzten Untersuchungsmethoden ... 82

5.1.1 Versuchstiere, Gewebeentnahme und Präparation ... 82

5.1.2 Di-8-ANEPPS in Kombination mit MSORT ... 83

5.1.3 Vitalitätstests ... 85

5.1.4 Protokolle zur mechanischen Stimulation ... 86

5.1.5 Immunhistochemie ... 88

5.2 Untersuchungen zur Spontanaktivität ... 89

5.3 Untersuchungen zur Nikotin-Applikation ... 90

5.4 Untersuchungen zu mechanischen Stimuli ... 91

5.4.1 Intraganglionäre Volumeninjektion ... 91

5.4.2 Bidirektionale Dehnung ... 93

5.4.2.1 Untersuchung zur Flächenänderung auf Neuronenebene ... 94

5.4.3 Untersuchungen zum Einfluss des Alters und Geschlechts ... 95

5.5 Untersuchungen zur neurochemischen Codierung ... 96

5.6 Abschließende Bewertung und Ausblick ... 100

6 Zusammenfassung ... 102

7 Summary ... 104

8 Literaturverzeichnis ... 106

(9)

Inhaltsverzeichnis

9 Anhang ... 127

10 Danksagung ... 139

(10)

Abkürzungsverzeichnis

% Prozent

& Et-Zeichen

∆ Delta

® Eingetragene Handelsmarke

°C Grad Celsius

µA Mikroampere

µl Mikroliter

µm Mikrometer

µM Mikromolar

µs Mikrosekunden

5-HT 5-Hydroxytryptamin

A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

ACh Acetylcholin

AG Altersgruppe

AH Nach-Hyperpolarisierung (afterspike hyperpolarization)

AI Adaptation Index

ANEP Aminonaphthylethenylpyridinium

ATP Adenosintriphosphat

Aufl. Auflage

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CaCl2 2H2O Calciumchlorid (Dihydrat)

CB Calbindin

ChAT Cholinacetyltransferase

cm Zentimeter

CMOS Komplementäre Metalloxid-Halbleitertechnologie (complementary metal oxide semiconductor)

CO2 Kohlenstoffdioxid

Di-8-ANEPPS 1-(3-sulfanato-propyl-4-[β-[2-(di-n-octylamino)-6- naphthyl]vinyl]pyridinium betaine

DMSO Dimethylsulfoxid

ENS Enterisches Nervensystem

EPSP Exzitatorisches postsynaptisches Potential

fEPSP Schnelles exzitatorisches postsynaptisches Potential (fast excitatory postsynaptic potential)

g Gramm

h Stunde

H3PO4 Phosphorsäure

Hz Hertz

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Abkürzungsverzeichnis

IFAN Intestinofugales Neuron (intestinofugal afferent neuron) IHC Immunhistochemie (immunohistochemistry)

IPAN Intrinsisches primär afferentes Neuron

ISP Innerer submuköser Plexus (inner submucous plexus)

KCl Kaliumchlorid

kg Kilogramm

kHz Kilohertz

l Liter

LED Licht emittierende Diode

M Molar (mol/l)

Max. maximal

MEN Mechanosensitives enterisches Neuron (mechanosensitive enteric neuron)

MgCl2 6H2O Magnesiumchlorid (Hexahydrat)

min Minuten

ml Milliliter

mM Millimolar

mm Millimeter

mmol Millimol

MP Myenterischer Plexus

ms Millisekunden

MSORT Multi-site Optical Recording-Technik

mV Millivolt

n. s. nicht signifikant

Na2HPO4 7H2O Dinatriumhydrogenphoshphat (Heptahydrat) nAChR Nikotinerger Acetylcholin-Rezeptor

NaCl Natriumchlorid

NaH2PO4 H2O Natriumdihydrogenphosphat (Monohydrat) NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat

NaN3 Natriumazid

NaOH Natriumhydroxid

nl Nanoliter

nm Nanometer

nNOS Neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase

NO Stickstoffmonoxid

NOS Stickstoffmonoxid-Synthase

Nr. Nummer

O2 Sauerstoff

OSP Äußerer submuköser Plexus (outer submucous plexus) PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

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RAMEN Schnell adaptierendes mechanosensitives enterisches Neuron (rapidly adapting MEN)

S synaptisch

s Sekunden

s. siehe

SAMEN Langsam adaptierendes mechanosensitives enterisches Neuron (slowly adapting MEN)

SAP Summenaktionspotential

SMP Submuköser Plexus

SPARC Stimulating Peripheral Activity to Relieve Conditions

TTX Tetrodotoxin

USAMEN Ultra-langsam adaptierendes menchanosensitives Neuron (ultra-slowly adapting MEN)

VIP Vasoaktives intestinales Peptid

VSD spannungssensitiver Farbstoff (voltage sensitive dye)

x̃ Median

x̅ Arithmetisches Mittel

ZNS Zentrales Nervensystem

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Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Aufbau der Darmwand (modifiziert nach COSTA et al. 2005) ... 6

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Neurone im ENS (modifiziert nach BROWN u. TIMMERMANS 2004) ... 12

Abbildung 3: Molekülstruktur des spannungssensitiven Farbstoffes Di-8- ANEPPS (modifiziert nach ROBINSON et al. 2011) ... 21

Abbildung 4: Schematische Darstellung des porcinen Gastrointestinaltraktes (modifiziert nach KÖNIG u. LIEBICH 2005) ... 26

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Versuchskammer ... 28

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Neuroimaging-Apparatur ... 31

Abbildung 7: Ganglien des ISP im porcinen Colon ascendens ... 33

Abbildung 8: Signalspur eines fEPSPs ... 34

Abbildung 9: Bestandteile des bidirektionalen Stretching Tool ... 36

Abbildung 10: Signalspur einer spontan aktiven enterischen Nervenzelle ... 45

Abbildung 11: Signalspuren nach Nikotin-Applikation ... 46

Abbildung 12: Anzahl antwortender Neurone pro Ganglion, prozentualer Anteil antwortender Neurone pro Ganglion und Burst-Frequenz im Colon ascendens nach Nikotin-Applikation (AG 1) ... 48

Abbildung 13: Signalspuren nach intraganglionärer Volumeninjektion ... 49

Abbildung 14: Anzahl antwortender Neurone pro Ganglion, prozentualer Anteil antwortender Neurone pro Ganglion und Burst-Frequenz im Colon ascendens nach intraganglionärer Volumeninjektion (AG 1) ... 51

Abbildung 15: Signalspuren nach bidirektionaler Dehnung... 52

Abbildung 16: Anzahl antwortender Neurone pro Ganglion, prozentualer Anteil antwortender Neurone pro Ganglion und Burst-Frequenz im Colon ascendens nach bidirektionaler Dehnung (AG 1) ... 54

Abbildung 17: Abhängigkeit der Anzahl an Aktionspotentialen vom Dehnungsindex im Colon ascendens ... 62

(14)

Abbildung 18: Anzahl antwortender Neurone pro Ganglion, prozentualer Anteil antwortender Neurone pro Ganglion und Burst-Frequenz im Colon

transversum nach Nikotin-Applikation (AG 1) ... 64 Abbildung 19: Anzahl antwortender Neurone pro Ganglion, prozentualer Anteil

antwortender Neurone pro Ganglion und Burst-Frequenz im Colon

transversum nach intraganglionärer Volumeninjektion (AG 1) ... 66 Abbildung 20: Anzahl antwortender Neurone pro Ganglion, prozentualer Anteil

antwortender Neurone pro Ganglion und Burst-Frequenz im Colon

transversum nach bidirektionaler Dehnung (AG 1) ... 68 Abbildung 21: Abhängigkeit der Anzahl an Aktionspotentialen vom

Dehnungsindex im Colon transversum ... 75 Abbildung 22: Immunhistochemisch gefärbtes Ganglion des ISP im Colon

ascendens ... 77 Abbildung 23: Immunhistochemisch gefärbtes Ganglion des ISP im Colon

transversum ... 78 Abbildung 24: Anteil NOS-positiver Neurone pro Ganglion ... 79 Abbildung 25: Neurochemische Codierung kompressionssensitiver Neurone im

porcinen Colon ... 80 Abbildung 26: Neurochemische Codierung dehnungssensitiver Neurone im

porcinen Colon ... 81

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Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Wichtige Eigenschaften der von A. S. Dogiel beschriebenen

Neuronentypen (modifiziert nach BREHMER et al. 1999) ... 8

Tabelle 2: Krebslösung für Präparationen... 22

Tabelle 3: Krebslösung für Versuche ... 22

Tabelle 4: 4 %ige Paraformaldehyd-Lösung „Fix“ ... 23

Tabelle 5: Phosphat-Puffer (0,1 M) ... 23

Tabelle 6: Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ... 23

Tabelle 7: PBS/NaN3-Puffer ... 23

Tabelle 8: Blocking-Serum ... 23

Tabelle 9: Eindeckmedium... 24

Tabelle 10: Liste der verwendeten Primärantikörper ... 38

Tabelle 11: Liste der verwendeten Sekundärantikörper ... 39

Tabelle 12: Filterblöcke für die Fluorophore des Fluoreszenzmikroskops ... 40

Tabelle 13: Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation im Colon ascendens ... 55

Tabelle 14: Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion im Colon ascendens ... 56

Tabelle 15: Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung im Colon ascendens ... 56

Tabelle 16: Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation im Colon ascendens ... 57

Tabelle 17: Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion im Colon ascendens ... 58

Tabelle 18: Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung im Colon ascendens ... 59

(16)

Tabelle 19: Prozentuale Flächenänderung auf Neuronenebene (Dehnungsindex),

bedingt durch bidirektionale Dehnung im Colon ascendens ... 61

Tabelle 20: Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation im Colon transversum ... 69

Tabelle 21: Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion im Colon transversum ... 70

Tabelle 22: Einfluss des Alters auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung im Colon transversum ... 70

Tabelle 23: Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der Nikotin-Applikation im Colon transversum ... 71

Tabelle 24: Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der intraganglionären Volumeninjektion im Colon transversum ... 72

Tabelle 25: Einfluss des Geschlechts auf die Ergebnisse der bidirektionalen Dehnung im Colon transversum ... 72

Tabelle 26: Prozentuale Flächenänderung auf Neuronenebene (Dehnungsindex), bedingt durch bidirektionale Dehnung im Colon transversum ... 74

Tabelle 27: Vergleich der durchgeführten mechanischen Stimuli im Colon ascendens ... 76

Tabelle 28: Vergleich der durchgeführten mechanischen Stimuli im Colon transversum ... 76

Tabelle 29: Bestimmung der Öffnung der verwendeten Mikropipetten ... 130

Tabelle 30: Di-8-ANEPPS bei 0,5 bar ... 131

Tabelle 31: Krebslösung bei 0,5 bar ... 131

Tabelle 32: Krebslösung bei 1 bar ... 131

Tabelle 33: Bestimmung der zurückgelegten Strecke des Stretching Tool ... 132

Tabelle 34: Bestimmung der Dehnung von MEN im Colon ascendens ... 133

Tabelle 35: Bestimmung der Dehnung von MEN im Colon transversum ... 134

(17)

Tabellenverzeichnis

Tabelle 36: Bestimmung des Anteils NOS-positiver Zellen an der

Gesamtneuronenzahl im Colon ascendens ... 135 Tabelle 37: Bestimmung des Anteils NOS-positiver Zellen an der

Gesamtneuronenzahl im Colon transversum ... 136 Tabelle 38: Bestimmung der neurochemischen Codierung der MEN im Colon

ascendens ... 137 Tabelle 39: Bestimmung der neurochemischen Codierung der MEN im Colon

transversum ... 138

(18)

(19)

Einleitung

1

1 Einleitung

Der Magen-Darm-Trakt ist in der Lage, unabhängig von zentralen Einflüssen Reflexaktivität zu generieren. Verantwortlich hierfür ist sein enterisches Nervensystem (ENS), welches in die Wand des Gastrointestinaltraktes vom Ösophagus bis zum analen Sphinkter integriert ist. WOOD (1981) verlieh dem ENS deshalb in den 1980er Jahren den Namen „Darmhirn“ (Englisch: enteric/little brain), GERSHON (1999) ergänzte 18 Jahre später den Namen „zweites Gehirn“ (Englisch: second brain). Das ENS ist in zwei komplexen neuronalen Netzwerken organisiert, welche als submuköser Plexus (SMP) und myenterischer Plexus (MP) bezeichnet werden (MEISSNER 1857; AUERBACH 1862). Neben dieser anatomischen Zweiteilung existiert auch eine entsprechende funktionelle Unterscheidung. Der SMP kontrolliert vorwiegend die Sekretion und Resorption des mukosalen Epithels. Außerdem ist er für den gastrointestinalen Blutfluss verantwortlich und beteiligt sich an der Vermittlung von Immunfunktionen. Der MP hingegen steuert primär die Aktivität der Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur.

Während durch verschiedene Studien bereits umfassende Kenntnisse über die intrinsische (enterische) Innervation des Colons beim Kleinsäuger, insbesondere beim Meerschweinchen, vorhanden sind (FURNESS et al. 1995a; SCHULZKE et al. 1995), fehlen sie in diesem Umfang noch für Großtierspezies. Dies hebt den Stellenwert der vorliegenden Arbeit hervor, da das Schwein, basierend auf strukturellen, biochemischen und physiologischen Gemeinsamkeiten bezüglich des Gastrointestinaltraktes, immer wieder als relevantes Modelltier für den Menschen diskutiert wird (BROWN u. TIMMERMANS 2004; PATTERSON et al. 2008; LITTEN- BROWN et al. 2010).

Erkrankungen des Darms sind häufig durch gestörte Motilitätsmuster und veränderte neuronale Funktionen bzw. Aktivitäten gekennzeichnet, die oft auch den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Darmabschnitt, das Colon, betreffen (GLIA et al.

2004; CAMILLERI et al. 2008). Das Bestreben neuronale Schaltkreise in diesem

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2

Darmsegment besser zu verstehen, um in Zukunft pathophysiologische Mechanismen gezielter untersuchen zu können, führt zur Fragestellung dieser Studie.

Bei der vorliegenden Studie handelt es sich um ein Teilprojekt eines internationalen Verbundprojektes (SPARC-Programm „Comprehensive Structural and Functional Mapping of Colonic Nervous System“ der National Institutes of Health (NIH), USA, Projekt-Nummer: 1OT2OD024899). Ziel der vorliegenden Dissertation war es, grundlegende Kenntnisse über die Neurone des SMP im porcinen Colon, insbesondere in Bezug auf ihre Mechanosensitivität, zu erlangen. Dazu wurde mithilfe der Ultrafast-Neuroimaging-Technik die Reaktion enterischer Neurone auf die in dieser Arbeit durchgeführten mechanischen Stimuli Kompression und Dehnung untersucht.

Als bereits etablierter Kompressionsstimulus wurde der Effekt intraganglionärer Volumeninjektionen einer geringen Menge Versuchskrebslösung auf die neuronale Aktivität untersucht (MAZZUOLI u. SCHEMANN 2009, 2012; KREUTZ 2019). Um Dehnungsreize auf komplette Ganglien des SMP ausüben zu können, wurde die Methodik der bidirektionalen Dehnung etabliert. Die neuronale Aktivität, die als Antwort auf die mechanischen Stimuli erfolgte, sollte charakterisiert werden. Die zuvor ermittelten mechanosensitiven Neurone (Englisch: mechanosensitive enteric neurons, MEN) wurden außerdem mittels Immunhistochemie (Englisch: immunohistochemistry, IHC) auf ihre neurochemische Codierung hin untersucht.

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Literaturübersicht

3

2 Literaturübersicht

2.1 Definition und Entdeckung des enterischen Nervensystems

Der Magen-Darm-Trakt unterscheidet sich durch sein umfangreiches intrinsisches Nervensystem von allen anderen Organen. Dieses Netzwerk von Nervenzellen, das sich direkt in der Wand des Magen-Darm-Traktes befindet, wird als enterisches Nervensystem (ENS) bezeichnet (FURNESS 2012). Es ermöglicht dem ENS eine vom zentralen Nervensystem (ZNS) unabhängige Steuerung gewisser Motilitätsmuster und intestinaler Ionentransporte (BAYLISS u. STARLING 1899; TRENDELENBURG 1917;

GERSHON 1999). Die genaue Anzahl an Nervenzellen, die das ENS gesamtheitlich umfasst, ist jedoch noch unklar. Während GOYAL u. HIRANO (1996) von 100 Millionen enterischen Nervenzellen ausgehen, spricht FURNESS (2006) sogar von 500 Millionen Nervenzellen im ENS.

Ende des 19. Jahrhunderts entdeckten BAYLISS u. STARLING (1899) Funktionen des ENS. Indem sie Darm isolierten und anschließend den intraluminalen Druck erhöhten, konnten sie Muskelbewegungen dieses zuvor isolierten Darmabschnitts, die einer Vorwärtsbewegung des Darminhalts in die anale Richtung entsprachen, erzeugen. Sie nannten diese Erkenntnis, die heute als peristaltischer Reflex bezeichnet wird, „law of the intestine“. Nachdem die extrinsische Innervation des Darmstücks unterbrochen wurde, war es BAYLISS u. STARLING (1899) noch immer möglich, dort Reflexe auszulösen. Dies ließ den Rückschluss zu, dass sämtliche für die Auslösung eines Reflexes notwendigen neuronalen Strukturen im Darm selbst vorhanden sein müssen.

LANGLEY (1921) führte aufgrund dieser Unabhängigkeit des Darmnervensystems vom ZNS den Begriff des ENS als eine weitere autonome Einheit ein. Ungefähr 50 Jahre früher wurde bereits eine anatomische Beschreibung des ENS vorgenommen, die jedoch noch keine funktionellen Erkenntnisse enthielt. Der deutsche Wissenschaftler MEISSNER (1857) beschrieb zu diesem Zeitpunkt nämlich erstmals den submukösen Plexus (SMP). Er entdeckte eine neuronale Struktur direkt unterhalb der Mukosa. Eine weitere neuronale Struktur, die sich zwischen der Zirkulär- und der Longitudinalmuskulatur des Darms befindet, fügte AUERBACH (1862) wenige

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4

Jahre später hinzu. Diese bekam den Namen myenterischer Plexus (MP).

TRENDELENBURG (1917) ging 55 Jahre später noch einen Schritt weiter. Nachdem er Teile des Darms vom Meerschweinchen isoliert und diese in ein Organbad verbracht hatte, konnte er peristaltische Reflexe erkennen. Er bewies damit, dass einzelne Darmabschnitte in der Lage sind ganze Reflexketten zu generieren. Sie können also Dehnung wahrnehmen, Informationen verarbeiten und im Anschluss ihre Effektorsysteme (in diesem Fall die Muskulatur der Darmwand) aktivieren.

2.2 Aufbau des enterischen Nervensystems

Die Mehrzahl der Erkenntnisse über das ENS stammt von Studien mit Meerschweinchengewebe (FRIELING et al. 1991; Z. M. SONG et al. 1991; FURNESS et al. 1995a; FURNESS et al. 2003). Der Aufbau des ENS ist prinzipiell jedoch tierartübergreifend vergleichbar (BALEMBA et al. 1999; HANSEN 2003; FURNESS 2012). Ebenso hat das ENS aller Säugetiere mehr oder weniger die gleichen Funktionen mit den gleichen funktionell definierten Neuronengruppen.

Die Wand des Magen-Darm-Traktes setzt sich von luminal nach serosal aus den folgenden Gewebeschichten zusammen: Mukosa mit ihrer Lamina muscularis mucosae, Submukosa, innere Zirkulärmuskulatur und äußere Longitudinalmuskulatur sowie Serosa bzw. Adventitia (CETIN 2010). In diese Wand eingebettet liegt, bestehend aus einer Vielzahl von Ganglien variabler Größe, das ENS. Die Ganglien des ENS sind über ein dichtes Netzwerk von interganglionären Nervensträngen miteinander und mit ihren Effektorsystemen verbunden, lassen sich jedoch weitgehend zwei großen Ansammlungen zuordnen (FURNESS 2006). Dies ist zum einen der MP, der sich zwischen der inneren Zirkulärmuskulatur und der äußeren Longitudinalmuskulatur befindet und zum anderen der SMP, der entsprechend seines Namens in der Submukosa lokalisiert ist (MEISSNER 1857; AUERBACH 1862).

Es ist jedoch anzuführen, dass der SMP tierartliche Unterschiede aufweist. Während er beim Meerschweinchen und anderen Kleinsäugern nur einschichtig vorliegt (BROOKES 2001a; FURNESS 2006), besteht er bei größeren Säugetieren aus zwei

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Literaturübersicht

5

Anteilen, die miteinander über interganglionäre Nervenstränge in Verbindung stehen (GUNN 1968). Diese werden entsprechend ihrer Lokalisation in der Darmwand als innerer submuköser Plexus (Englisch: inner submucous plexus, ISP) und äußerer submuköser Plexus (Englisch: outer submucous plexus, OSP) bezeichnet (MANNL et al. 1986; SCHEUERMANN et al. 1987a, b; SCHEUERMANN et al. 1989). Der ISP ist dabei dicht an der Lamina muscularis mucosae lokalisiert, wohingegen sich der OSP an der luminalen Seite der inneren Zirkulärmuskulatur befindet (MANNL et al. 1986).

Während die in das mukosale Epithel projizierenden Neurone beim Meerschweinchen jeweils zur Hälfte im MP und SMP vorkommen, sind die dorthin projizierenden Neurone im Dünndarm des Schweins mit einem prozentualen Anteil von 78 % hauptsächlich im ISP und nur in geringem Anteil im OSP (10 %) und MP (12 %) vorhanden (Z. M. SONG et al. 1991; HENS et al. 2000). PETTO et al. (2015) untersuchten diese Projektionen im SMP des Colon ascendens (Englisch: proximal colon) von Schweinen und fanden neuronale Projektionen, die vom ISP in die Mukosa reichten. Sie identifizierten in ihren Untersuchungen aber nicht eine einzige Projektion, die vom OSP in das mukosale Epithel reichte.

Der humane Darm verfügt neben dem ISP und OSP außerdem über einen dritten Anteil des submukösen Netzwerkes. Zwischen den beiden zuvor genannten submukösen Plexusanteilen befindet sich ein zusätzlicher intermediärer Plexus (HOYLE u. BURNSTOCK 1989; DHATT u. BUCHAN 1994; IBBA-MANNESCHI et al.

1995).

Der MP erstreckt sich bei allen Tierarten über den gesamten Magen-Darm-Trakt, beginnend im oberen Ösophagus bis hin zum Musculus sphincter ani internus, dem inneren Schließmuskel des Analkanals. Der SMP hingegen ist nur im Dünn- und Dickdarm lokalisiert, wenngleich auch in der Submukosa von Ösophagus und Magen vereinzelt Ganglien zu finden sind (MEISSNER 1857; AUERBACH 1862; IRWIN 1931;

FURNESS et al. 1991; FURNESS 2006). Dort bilden sie jedoch kein mit dem Darm vergleichbares submuköses Gangliengeflecht (FURNESS 2006). Die beiden Plexus unterscheiden sich demnach in ihrer Ausdehnung, aber auch in der Größe ihrer Ganglien. So sind die Ganglien im SMP gewöhnlich kleiner und ihre interganglionären

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6

Nervenstränge feiner als im MP (GONIAEW 1875; SCHABADASCH 1930; GABELLA u. TRIGG 1984). Unterschiede sind außerdem zwischen dem ISP und dem OSP größerer Säugetierspezies festzustellen. Verglichen mit dem ISP weist der OSP im proximalen Colon des Schweins ein weiteres Netzwerk an Ganglien auf, die zudem kleiner sind und in geringerer Zahl vorliegen (PETTO et al. 2015). Während PETTO et al. (2015) im ISP des porcinen Colons 1380 ± 131 Ganglien pro cm² und 122 ± 12 Neurone in einem Ganglion beschreiben, sind es im OSP hingegen nur 215 ± 33 Ganglien pro cm² und 57 ± 3 Neurone pro Ganglion.

Der Vollständigkeit halber ist an dieser Stelle eine weitere anatomische Struktur zu nennen, die sich als integraler Bestandteil in direkter Nachbarschaft zu den Nervenzellen im ENS befindet. Es handelt sich dabei um enterische Gliazellen, deren Name sich von dem griechischen Wort „glue“ für Leim oder Kitt ableitet (RUHL 2005).

Er ergibt sich aus der Halte- und Stützfunktion, die der Entdecker, der deutsche Abbildung 1: Aufbau der Darmwand (modifiziert nach COSTA et al. 2005)

Zwei Plexus sind in der Wand des Gastrointestinaltraktes lokalisiert: der Plexus myentericus (MP, Synonym: Auerbach-Plexus) und der Plexus submucosus (SMP, Synonym: Meissner- Plexus).

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Literaturübersicht

7

Pathologe R. Virchow in der Mitte des 19. Jahrhunderts vermutete (VIRCHOW 1846).

Nach heutigen Erkenntnissen spielen die enterischen Gliazellen außerdem eine wichtige Rolle für die Erhaltung der Darmintegrität und übernehmen eine Ernährungsfunktion für die enterischen Neurone (RUHL 2005; YU u. LI 2014). Die enterischen Gliazellen übertreffen die im ENS befindlichen Nervenzellen in ihrer Anzahl erheblich (GABELLA 1981; RUHL 2005).

2.3 Klassifizierungen der Nervenzellen im enterischen Nervensystem

Die Nervenpopulationen des ENS werden anhand ihrer morphologischen, elektrophysiologischen, funktionellen und neurochemischen Eigenschaften klassifiziert.

2.3.1 Morphologische Klassifizierung

Der russische Histologe DOGIEL (1895, 1896, 1899) charakterisierte Ende des 19. Jahrhunderts erstmals die enterischen Neurone, die er im SMP und MP verschiedener Säugetierspezies vorfand, anhand ihrer unterschiedlichen Mikroarchitektur. Er fertigte detaillierte Zeichnungen an und beschrieb daraufhin drei Neuronentypen, die seitdem als Dogiel Typ I-, Dogiel Typ II- und Dogiel Typ III- Neurone bezeichnet werden. Für die Definition der Nervenzellen zog er die Länge und die Morphologie ihrer Fortsätze heran. Künftig wurden Nervenzellen, die einen flachen, sternförmigen bis eckigen Zellkörper besitzen sowie nur ein einzelnes Axon und 4 – 20 lamellenartige Dendriten haben, als Dogiel Typ I-Neurone bezeichnet. Dogiel Typ II-Neurone hingegen weisen einen großen runden bis ovalen Zellkörper mit weniger Fortsätzen auf. Die Fortsätze der Dogiel Typ II-Neurone sind charakteristisch glatt. Während A. S. Dogiel noch von einem einzelnen Axon ausging (DOGIEL 1899), ist man heute der Meinung, dass Dogiel Typ II-Neurone multiaxonal sind (STACH 1981). Dogiel Typ III-Neurone verfügen über zwei bis zehn dendritische Fortsätze, die verglichen mit Dogiel Typ II-Neuronen aber relativ kurz ausgeprägt sind und sich an den Enden verjüngen (DOGIEL 1895, 1899).

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8

In Tabelle 1 sind grundlegende Charakteristika der einzelnen Neuronentypen dargestellt.

Tabelle 1: Wichtige Eigenschaften der von A. S. Dogiel beschriebenen Neuronentypen (modifiziert nach BREHMER et al. 1999)

Typ Fortsätze Dendriten Projektion des Axons

I 4–20 Dendriten 1 Axon

enden und verzweigen sich innerhalb des

ursprünglichen Ganglions, lamellenförmige Enden

durch benachbarte Ganglien, mit Nebenästen

II 1–16 Dendriten 1 Axon

(heute: multiaxonal)

länger als Dogiel Typ I- Dendriten, lange, dünne, gleichmäßige Äste

zu anderen Ganglien

III 2–10 oder mehr Dendriten 1 Axon

enden und verzweigen sich innerhalb des

ursprünglichen Ganglions, ihre Enden verjüngen sich

durch andere

Ganglien, über weite Strecke verfolgbar

Inzwischen ist eine noch differenziertere morphologische Unterteilung in Dogiel Typ I- bis Dogiel Typ VII-Neurone innerhalb des ENS möglich (STACH 1985, 1989).

2.3.2 Elektrophysiologische Klassifizierung

Elektrophysiologisch können Nervenzellen in AH-Neurone und S-Neurone unterteilt werden. Dabei stellt „AH“ die Abkürzung für afterspike hyperpolarization dar, während

„S“ für synaptic steht und den schnellen synaptischen Input beschreibt (HIRST et al.

1974). AH-Neurone zeigen eine Nachhyperpolarisierung nach einer Depolarisation, die bis zu 10 s andauern kann. Außerdem weisen sie verglichen mit den S-Neuronen eine größere Amplitude und eine längere Dauer ihrer Aktionspotentiale auf.

Charakteristisch ist zudem ein Hügel (Englisch: hump) auf der absteigenden Flanke des Aktionspotentials, der auf einen Ca²⁺-Einstrom durch N-Typ-Ca²⁺-Kanäle zurückzuführen ist (HIRST et al. 1974). Die Depolarisierungsphase der AH-Neurone kommt vor allem durch Tetrodotoxin (TTX)-sensitive Na⁺-Kanäle und TTX-insensitive Ca²⁺-Kanäle zustande (NORTH 1973; HIRST et al. 1985). AH-Neurone zeigen in der Regel keine schnell erregenden postsynaptischen Potentiale (Englisch: fast excitatory postsynaptic potentials, fEPSPs), dafür aber langsam erregende postsynaptische

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Literaturübersicht

9

Potentiale (Englisch: slow EPSPs) (KUNZE et al. 1993). Morphologisch betrachtet verfügen AH-Neurone über große Zellkörper mit mehreren Fortsätzen und stellen sich im MP des Ileums bei Meerschweinchen somit als Dogiel Typ II-Neurone dar (FURNESS 2006).

Im Gegensatz dazu haben S-Neurone in der Regel die Morphologie von Dogiel Typ I- Neuronen (HIRST et al. 1974). Sie feuern kurze Aktionspotentiale, denen eine kurze Phase der Nachhyperpolarisierung, die nur 20 – 100 ms andauert, folgt (FURNESS 2006). S-Neurone sind in der Lage fEPSPs zu empfangen (KUNZE et al. 1993). Ihre Aktionspotentiale sind TTX-sensitiv (FURNESS 2006).

2.3.3 Funktionelle Klassifizierung

Funktionell werden die Nervenzellen des ENS in intestinofugale Neurone, sensorische Neurone, Interneurone und Motoneurone eingeteilt (FURNESS 2000; HANSEN 2003).

Intestinofugale Nervenzellen (Englisch: intestinofugal afferent neurons, IFANs) befinden sich zwar mit ihren Zellkörpern im ENS, projizieren jedoch zu sympathischen Ganglien (CROWCROFT et al. 1971). Während sie bei Kleinsäugern nur im MP vorkommen, wurden sie bei größeren Säugetieren auch im SMP identifiziert. Dabei nimmt die Dichte der IFANs entlang der Darmwand von oral nach aboral kontinuierlich zu (KURAMOTO u. FURNESS 1989; BROOKES 2001b). Morphologisch werden sie überwiegend den Dogiel Typ I-Neuronen zugeordnet, elektrophysiologisch gehören sie zu den S-Neuronen (SHARKEY et al. 1998; LOMAX et al. 2000).

Sensorische Neurone wurden im ENS historisch als intrinsische primär afferente Neurone (IPANs) definiert (FURNESS et al. 1998). Für ihre Identifizierung nutzte eine Vielzahl von Forschern deren Immunoreaktivität für Calbindin (CB) und konnte so spezies- sowie regionspezifische Verteilungsmuster der IPANs aufdecken (SANG u.

YOUNG 1998; LOMAX et al. 1999; NEUNLIST et al. 1999a; FURNESS 2000;

CHIOCCHETTI et al. 2006). Elektrophysiologisch war es möglich, diese CB-positiven Nervenzellen als AH-Neurone zu charakterisieren, welche zudem über eine Dogiel Typ II-Morphologie verfügen (IYER et al. 1988; FURNESS 2000). Sowohl in Ganglien des SMP (PAN u. GERSHON 2000) als auch in Ganglien des MP (FURNESS

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10

et al. 1998) konnten IPANs identifiziert werden. Im SMP der Meerschweinchen werden ungefähr 11 % der Nervenzellen der Klasse der IPANs zugeordnet (FURNESS 2000).

Submuköse IPANs sind in der Lage mechanische Deformationen der Mukosa wahrzunehmen, wohingegen myenterische IPANs auf Deformationen ihrer Nervenendigungen in den äußeren Muskelschichten reagieren (FURNESS et al.

2004). Auch intraluminale chemische Stimuli können sensorische Neurone aktivieren (KUNZE et al. 1995; BERTRAND et al. 1997; FURNESS 2000). Als Neurotransmitter nutzen IPANs neben Acetylcholin (ACh) primär das Neuropeptid Substanz P (SP) (HANSEN 2003; FURNESS et al. 2004). Die Bezeichnung „sensorisch“ sollte für IPANs mittlerweile vermieden werden, da ihre Aktivierung keine klassische Empfindung nach sich zieht. Hinzu kommt, dass die ersten Nervenzellen eines neuronalen Schaltkreises nicht zwangsläufig direkt durch einen Stimulus, sondern auch durch andere Zellen aktiviert werden können. Hier sind beispielsweise die enterochromaffinen Zellen des Verdauungstraktes zu nennen (FURNESS et al. 2004).

Interneurone befinden sich in allen Darmabschnitten, kommen jedoch nur im MP vor.

Im Dünndarm des Meerschweinchens, in dem 16 % der myenterischen Nervenzellen zu den Interneuronen zählen, wird ein Typ aufsteigender von drei Typen absteigender Interneurone unterschieden (FURNESS 2000, 2006). Der aufsteigende Typ ist gekennzeichnet durch seine Dogiel Typ II-Morphologie sowie seine Immunoreaktivität für Cholinacetyltransferase (ChAT) und Calretinin. Die absteigenden Interneurone sind ebenso wie die aufsteigenden immunoreaktiv für ChAT. Ihre Einteilung in drei Klassen ergibt sich aus ihren zusätzlichen Immunoreaktivitäten (Co-Transmittern). Die erste Klasse, die neben ChAT auch Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS) und vasoaktives intestinales Peptid (VIP) exprimiert, ist hauptsächlich für lokale Motilitätsreflexe zuständig. Die zweite Klasse, die ChAT und Somatostatin (SOM) exprimiert, steht in funktionellem Zusammenhang mit dem migrierenden motorischen Komplex des Dünndarms. Die dritte Klasse ist neben ChAT auch immunoreaktiv für 5-Hydroxytryptamin (5-HT, Synonym: Serotonin) und beteiligt sich am Sekretomotoreflex (POMPOLO u. FURNESS 1998; FURNESS 2000; HANSEN 2003).

Elektrophysiologisch können die Interneurone sowohl den AH- als auch den S- Neuronen zugeordnet werden (HANSEN 2003).

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Literaturübersicht

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Die Motoneurone stellen die Effektoren im ENS dar. Sie werden in Muskelmotoneurone und Sekretomotoneurone unterteilt. Dabei befinden sich die Muskelmotoneurone im MP und innervieren exzitatorisch und inhibitorisch die Zirkulär- und Longitudinalmuskulatur sowie die Lamina muscularis mucosae des Magen-Darm- Traktes. 55 % der Neurone im MP des Dünndarms von Meerschweinchen zählen zu dieser Gruppe (FURNESS 2000). Den primären exzitatorischen Transmitter stellt hier ACh dar, welches an muscarinerge ACh-Rezeptoren der glatten Muskulatur bindet (FURNESS 2000). Daneben bilden Tachykinine weitere wichtige exzitatorische Transmitter, wobei vor allem SP sowie die Neuropeptide K und γ zu nennen sind (LIPPI et al. 1998). Der primäre Transmitter der inhibitorischen Muskelmotoneurone ist neben VIP vor allem Stickstoffmonoxid (NO) (BROOKES 1993; FURNESS 2006). Die Sekretomotoneurone sind ausschließlich im SMP lokalisiert und machen im Dünndarm von Meerschweinchen 89 % der Neurone aus (FURNESS 2000). Sie regulieren die Sekretion des mukosalen Epithels und außerdem den lokalen Blutfluss. Eine Unterteilung in cholinerge und nicht-cholinerge Sekretomotoneurone ist möglich.

Cholinerge Sekretomotoneurone vermitteln neben sekretorischen auch vasodilatatorische Reaktionen. ACh, welches von cholinergen Neuronen ausgeschüttet wird, bindet an muscarinerge Rezeptoren des mukosalen Epithels und stimuliert auf diese Weise die Sekretion von Mukus. Nicht-cholinerge Sekretomotoneurone nutzen VIP als primären Transmitter und haben ebenfalls einen vasodilatatorischen Effekt (HANSEN 2003; FURNESS 2006). Elektrophysiologisch sind die Motoneurone den S-Neuronen zuzuordnen. Zudem weisen sie eine Dogiel Typ I-Morphologie auf (HANSEN 2003).

In Abbildung 2 sind die Neurone des ENS anhand ihrer funktionellen Klassifizierung schematisch dargestellt.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung der Neurone im ENS (modifiziert nach BROWN u.

TIMMERMANS 2004)

LM: Longitudinalmuskulatur, MP: Plexus myentericus, CM: Zirkulärmuskulatur, SUB:

Submukosa, OSP: äußerer Plexus submucosus, ISP: innerer Plexus submucosus, MUC:

Mukosa; farbliche und numerische Kennzeichnung der Neurone: IPANs in rot-1, Motoneurone in blau-2, Sekretomotoneurone in grün-3, Interneurone in orange-4 und viszerofugale Neurone in gelb-5

Die strikte, klassische funktionelle Unterteilung der Nervenzellen des ENS kann seit der Entdeckung der mechanosensitiven enterischen Neurone (Englisch:

mechanosensitive enteric neurons, MEN) so nicht mehr als vollständig betrachtet werden (s. Kapitel 2.4).

2.3.4 Neurochemische Klassifizierung

Die Nervenzellen des ENS synthetisieren über 25 verschiedene Neurotransmitter, um zum einen miteinander zu kommunizieren und zum anderen Einfluss auf ihre Effektorsysteme auszuüben (MCCONALOGUE u. FURNESS 1994; FURNESS 2000).

Die Mehrzahl dieser Neurotransmitter konnte auch im ZNS nachgewiesen werden

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Literaturübersicht

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(NEZAMI u. SRINIVASAN 2010). Submuköse Neurone sind in der Lage eine Mischung aus unterschiedlichen inhibitorischen und exzitatorischen Neurotransmittern auszuschütten. Auf diese Weise beeinflussen sie die intestinale Sekretion der mukosalen Zellen (FURNESS et al. 1995b; PFANNKUCHE et al. 2012). Entsprechend der verschiedenen funktionellen Klassen, in die die Nervenzellen des ENS unterteilt werden können, werden die Neurotransmitter in verschiedenen Kombinationen exprimiert (COSTA et al. 1996; BROOKES 2001a). Deshalb wird diese Form der Charakterisierung auch als neurochemische Codierung bezeichnet.

Als FURNESS et al. (1984) den SMP des Ileums von Meerschweinchen hinsichtlich seiner neurochemischen Codierung untersuchten, detektierten sie mit einem prozentualen Anteil von 45 % eine Vielzahl VIP-positiver Neurone. Eine Immunoreaktivität für ChAT fanden die Autoren sogar bei 54 % der untersuchten Neurone. Darüber hinaus existierte eine Subpopulation an Neuronen, die neben ChAT auch Cholecystokinin (CCK), Neuropeptid Y (NPY) und SOM (CCK / SOM / NPY / ChAT) exprimierte. In einer weiteren Subpopulation kamen die Neurotransmitter ChAT und SP (ChAT / SP) gemeinsam vor. Zehn Jahre später interessierten sich FURNESS et al. (1994) darüber hinaus für die Häufigkeit und Verteilung NOS-positiver Neurone im ENS der Meerschweinchen. Sie entdeckten im MP des gesamten Gastrointestinaltraktes NOS-positive Neurone, die mindestens 12 % (im Duodenum) und maximal 54 % (im Ösophagus) der myenterischen Nervenzellen ausmachten. Die Autoren fanden hingegen keine submukösen Nervenzellen, die NOS exprimieren, sondern lediglich NOS-positive Nervenfasern im SMP von Ileum und Dickdarm. NEUNLIST et al. (1998) untersuchten basierend auf der Studie von FURNESS et al. (1984) den SMP im proximalen Colon von Meerschweinchen hinsichtlich seiner VIP- und ChAT-positiven Neurone. Dabei detektierten die Autoren bei 53 % der Nervenzellen eine Immunoreaktivität für VIP und bei 47 % der Nervenzellen eine Immunoreaktivität für ChAT.

Im ISP des proximalen Colons beim Schwein exprimieren die Nervenzellen mit einem prozentualen Anteil von 42 % hauptsächlich ChAT, wovon wiederum 66 % mit SP colokalisiert vorliegen (PETTO et al. 2015). Nur 0,85 % der von den Autoren untersuchten Nervenzellen erwiesen sich als SOM-positiv. Eine noch kleinere

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Subpopulation (< 0,25 % der Nervenzellen) exprimiert VIP oder neuronale Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS). Die Autoren konnten zudem nachweisen, dass die neurochemische Codierung des OSP beim Schwein weitaus komplexer ist und einige Ähnlichkeiten mit der neurochemischen Codierung des porcinen MP aufweist.

Neben den vorwiegend zu findenden ChAT- und SP- positiven Subpopulationen (32 % der Nervenzellen), exprimieren die Neurone des OSP mit einem prozentualen Anteil von 31 % hauptsächlich nNOS. Der Neurotransmitter VIP wird nur von 6 % aller Nervenzellen des OSP beim Schwein exprimiert (PETTO et al. 2015).

2.4 Mechanosensitivität im Darm

Bedingt durch Muskelbewegungen im Magen-Darm-Trakt wirken dort mechanische Kräfte, denen die Neurone des ENS ständig ausgesetzt sind. Verantwortlich hierfür sind sowohl die Zirkulär- als auch die Longitudinalmuskulatur des Darms (GABELLA u. TRIGG 1984; MAZZUOLI u. SCHEMANN 2009). Während die Zirkulärmuskulatur durch ihre Kontraktion den Durchmesser des kontrahierten Segments verringert, sorgt die Longitudinalmuskulatur durch ihre Kontraktion für eine Verkürzung des entsprechenden Darmsegments (BAYLISS u. STARLING 1899). Des Weiteren werden die Kontraktionen der glatten Muskulatur des Darms in eine phasische und eine tonische Form unterteilt (SCRATCHERD u. GRUNDY 1984; GOLENHOFEN u.

MANDREK 1991). Phasische Kontraktionen bilden kurz andauernde Kontraktionen von wenigen Sekunden, bei denen es zu einem schnellen Druckanstieg kommt.

Dagegen versteht man unter tonischen Kontraktionen anhaltende Kontraktionen der glatten Muskulatur, die bei langsamem Anstieg des Drucks für wenigen Sekunden bis Minuten bestehen bleiben (SCRATCHERD u. GRUNDY 1984).

MAZZUOLI u. SCHEMANN (2009) konnten bereits nachweisen, dass myenterische Ganglien einer durch Muskelaktivität bedingten Deformation unterliegen. Dabei werden sowohl die neuronalen Zellkörper als auch die interganglionären Nervenstränge deformiert (GABELLA u. TRIGG 1984; MAZZUOLI u. SCHEMANN 2009). Lange wurde davon ausgegangen, dass nur eine spezialisierte Gruppe

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Literaturübersicht

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enterischer Neurone, die als IPANs bezeichnet werden (s. Kapitel 2.3.3), sensorische Funktionen im Darm übernimmt (FURNESS et al. 2004). Ihre Mechanosensitivität wurde durch Aktionspotentialentladungen als Antwort auf zirkuläre Dehnung und Muskelkontraktion gezeigt (KUNZE u. FURNESS 1999). Mittlerweile ist jedoch bekannt, dass nicht nur diese Gruppe von Nervenzellen mechanosensitive Eigenschaften aufweist. Auch andere enterische Neurone, wie beispielsweise die Interneurone und Motoneurone, können im Ileum des Meerschweinchens mechanisch aktiviert werden (MAZZUOLI u. SCHEMANN 2009). Sie erfüllen somit mehrere Funktionen. Daraus ergibt sich ein Konzept von multifunktionellen sensorischen Neuronen (SMITH et al. 2007; MAZZUOLI u. SCHEMANN 2009, 2012).

Anhand des MP im Ileum von Meerschweinchen, in welchem MEN nachgewiesen werden konnten, wurden MEN in verschiedene funktionelle Klassen unterteilt (MAZZUOLI u. SCHEMANN 2009). Die Autoren ordneten 31 % der enterischen Interneurone und 47 % der Motoneurone den sich schnell adaptierenden mechanosensitiven enterischen Neuronen (Englisch: rapidly adapting MEN, RAMEN) zu. Drei Jahre später wurden RAMEN außerdem im MP des Dünn- und Dickdarms von Mäusen nachgewiesen (MAZZUOLI u. SCHEMANN 2012). Nachfolgend wurden RAMEN durch langsam adaptierende mechanosensitive Neurone (Englisch: slowly adapting MEN, SAMEN), die im Gegensatz zu RAMEN über die initiale dynamische Phase der Deformation hinaus Aktionspotentiale feuern, und ultra-langsam adaptierende mechanosensitive Neurone (Englisch: ultra-slowly adapting MEN, USAMEN) ergänzt (MAZZUOLI u. SCHEMANN 2012; KUGLER et al. 2015). Um MEN noch genauer charakterisieren zu können, wurde der Adaptation Index (AI) eingeführt, welcher das Aktionspotential-Verhaltensmuster einzelner Nervenzellen eines Ganglions beschreibt (KUGLER et al. 2015). Der AI teilt folglich in RAMEN, SAMEN und USAMEN ein, basiert jedoch auf einer mathematischen Gleichung, welche die Aktionspotential-Frequenz in den ersten 500 ms einer Aufnahme und die Aktionspotential-Frequenz, die nach den ersten 500 ms bis zum Ende der Aufnahme folgt, berücksichtigt. Das Auftreten und die Verteilung von RAMEN, SAMEN und USAMEN im ENS unterscheidet sich in den einzelnen Darmabschnitten (KUGLER et al. 2015; MAZZUOLI-WEBER u. SCHEMANN 2015a, b).

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Darüber hinaus ist davon auszugehen, dass mindestens zwei unterschiedliche Arten von Mechanorezeptoren auf MEN existieren (MAZZUOLI-WEBER u. SCHEMANN 2015b). Im Magen des Meerscheinchens antworteten nämlich 29 % der myenterischen Nervenzellen auf den mechanischen Stimulus Kompression und 22 % der Nervenzellen auf einen Dehnungsstimulus (MAZZUOLI-WEBER u. SCHEMANN 2015a). MAZZUOLI-WEBER u. SCHEMANN (2015a) konnten im Rahmen ihrer Experimente außerdem multimodale Neurone detektieren, die auf beide mechanische Stimuli reagierten.

Mechanosensitivitäten im Magen-Darm-Trakt wurden weitgehend an Nervenzellen des MP erforscht (KUNZE et al. 1998; SPENCER u. SMITH 2004; FURNESS 2006;

MAZZUOLI u. SCHEMANN 2009, 2012; KUGLER et al. 2015; MAZZUOLI-WEBER u.

SCHEMANN 2015a; KUGLER et al. 2018). Es existieren allerdings bereits einige Studien, die ebenfalls MEN im SMP belegen. In Ussing-Kammer Versuchen, in denen die Submukosa bzw. Mukosa gedehnt wurde, konnte erstmals in den 1990er Jahren eine nerval vermittelte Sekretion von Chlorid festgestellt werden (DIENER u. RUMMEL 1990; FRIELING et al. 1992; SCHULZKE et al. 1995; WEBER et al. 2001). KREUTZ (2019) identifizierte zudem mithilfe der Ultrafast-Neuroimaging-Technik MEN im SMP von Meerschweinchen. 24 % der vom Autor untersuchten submukösen Neurone pro Ganglion erwiesen sich im Colon descendens (Englisch: distal colon) als kompressionssensitiv, 11 % der untersuchten Neurone pro Ganglion waren sensitiv gegenüber dem durchgeführten unidirektionalen Dehnungsstimulus.

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Literaturübersicht

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2.5 Expression nikotinerger Acetylcholin-Rezeptoren im enterischen Nervensystem

Neben den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (Englisch: G-protein coupled receptors, GPCRs) kommen im ENS als weiterer Rezeptortyp hauptsächlich ligandengesteuerte Ionenkanäle vor. Zu diesem Rezeptortyp zählen die nikotinergen Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs), welche von nahezu allen Neuronen im SMP und MP exprimiert werden (CORNELISSEN et al. 2001; ZHOU et al. 2002; SARGENT 2014). Sie werden durch den im ENS vorherrschenden exzitatorischen Neurotransmitter ACh, aber auch durch den Agonisten Nikotin, einem Alkaloid aus der Tabakpflanze, erregt (ABOU-DONIA 2015). Die ionotropen nAChRs sind in der Lage, Informationen durch das Auslösen von fEPSPs schnell zu übermitteln (GLUSHAKOV et al. 2004). Durch den Einsatz von nikotinergen Rezeptorblockern, denen beispielsweise Hexamethonium oder Curare zugeordnet werden, werden die fEPSPs in ihrer Amplitude reduziert oder sogar gänzlich blockiert (NISHI u. NORTH 1973;

HIRST u. MCKIRDY 1975; SURPRENANT 1984). Funktionell geht dies mit einem Ausfall des peristaltischen Reflexes einher.

nAChRs stellen sich als heterogene Kationenkanäle dar (FIEBER u. ADAMS 1991).

Für die Öffnung der Kanäle sind der endogene Ligand ACh oder exogene Liganden verantwortlich. nAChRs setzen sich aus diversen Untereinheiten zusammen, die in variablen Kombinationsmöglichkeiten vorkommen. Im SMP von Meerschweinchen konnten die Untereinheiten α3, α5, β2, β4 sowie α7 nachgewiesen werden (KIRCHGESSNER u. LIU 1998; OBAID et al. 1999; GLUSHAKOV et al. 2004; OBAID et al. 2005).

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2.6 Physikalische Grundlagen

Dieses Kapitel dient der kurzen Erläuterung physikalischer Grundlagen, die in Zusammenhang mit Mechanosensitivität stehen und hilfreich sind, um die im Magen- Darm-Trakt wirkenden mechanischen Kräfte zu verstehen.

Die auf eine Körperoberfläche A wirkende Kraft F wird mechanische Spannung genannt und mit der Maßeinheit [N m^-2] beschrieben (PELTE 2005). Zur genaueren Beschreibung der Spannungsformen werden zusätzlich zwei Kraftkomponenten der Kraft F unterschieden:

Die senkrecht auf eine Körperoberfläche wirkende Kraftkomponente ist als Normalkraft Fn definiert (PELTE 2005). Sie erzeugt die sogenannte Normalspannung σ:

𝜎 =

^𝐹^𝑛

𝐴.

Die Normalspannung stellt eine Zug- oder eine Druckbelastung dar. Ist die Normalspannung in eine Raumrichtung positiv, wird in dieser Raumrichtung von einem Zug ausgegangen. Bei Druckspannungen wird entsprechend eine Normalspannungskomponente in die negative Richtung angenommen.

Die tangential auf eine Körperoberfläche wirkende Kraftkomponente wird hingegen als Tangentialkraft Ft bezeichnet und erzeugt die Tangentialspannung

𝜏

:

𝜏 =

^𝐹^𝑡

𝐴.

Die Tangentialspannung stellt eine Scherbelastung dar (PELTE 2005; TIPLER u.

MOSCA 2015).

KUGLER et al. (2018) fanden jedoch heraus, dass Scherbelastungen nur bei 5,6 % der primär kultivierten Nervenzellen zu Aktionspotentialentladungen führten und die Nervenzellen darüber hinaus nur mit einer sehr geringen Aktionspotentialfrequenz von 0,0 [0,0 / 0,6] Hz antworteten. Die Autoren schlussfolgerten deshalb, dass

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Literaturübersicht

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Scherbelastungen, die durch die Tangentialkraft Ft verursacht werden, im ENS eine untergeordnete Rolle spielen.

Ein Körper ändert seine Form, sobald eine Kraft auf ihn wirkt (TIPLER u. MOSCA 2015). Das bedeutet, dass er durch eine Zugspannung gedehnt und durch eine Druckspannung komprimiert wird (LECHNER et al. 2003). Diese relative Änderung ε der Gestalt wird durch die Längenänderung Δl und die originäre Länge ldefiniert

𝜀 =

^Δ𝑙

𝑙 .

Eine positive Längenänderung wird Dehnung oder Streckung genannt, wohingegen eine negative Längenänderung als negative Dehnung oder Kompression bezeichnet wird.

2.7 Neuroimaging im enterischen Nervensystem

Zur Untersuchung elektrophysiologischer, synaptischer oder auch neuropharmakologischer Eigenschaften enterischer Nervenzellen konnten bis zur Entwicklung optischer Methoden zur Messung der neuronalen Aktivität nur intrazelluläre Ableitungen herangezogen werden (NISHI u. NORTH 1973; HIRST et al.

1974; WOOD u. MAYER 1978; BORNSTEIN et al. 1994). Als klassische Messmethode auf Zellebene ist hier beispielhaft die Patch-Clamp-Technik zu nennen, die von NEHER u. SAKMANN (1976) erstmals beschrieben wurde und bei der mittels zweier Mikroelektroden Ströme durch einzelne Ionenkanäle gemessen werden können.

Mithilfe immunhistochemischer Untersuchungen konnten zudem neurochemische Codierungen verschiedener Subpopulationen von Neuronen im ENS entschlüsselt werden (NEUNLIST et al. 1999c).

Vorangegangene Studien etablierten bereits ein optisches Bildgebungsverfahren, das die vorhandenen Untersuchungsmöglichkeiten seither ergänzt (OBAID et al. 1992;

NEUNLIST et al. 1999b; OBAID et al. 1999). Dieses Verfahren wird als Ultrafast-

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20

Neuroimaging-Methode bezeichnet. Während es zuvor ausschließlich möglich war, die Aktivität einzelner Neurone wahrzunehmen, erlaubt es diese Methode seither mithilfe spannungssensitiver Farbstoffe schnelle Veränderungen im Membranpotential an mehreren enterischen Nervenzellen gleichzeitig zu erfassen (NEUNLIST et al. 1999b).

Die Entwicklung dieses auch als Multi-site Optical Recording-Technik (MSORT) bezeichneten Verfahrens eröffnete die Möglichkeit der Erforschung komplexer neuronaler Schaltkreise und nimmt außerdem weder Einfluss auf die Ionenkonzentration noch auf die Integrität der Zellmembran von Nervenzellen (SCHEMANN et al. 2002). Der Umstand, dass es sich bei der Ultrafast-Neuroimaging- Methode um eine extrazelluläre Methode handelt, hat weiterhin den Vorteil, dass sie bedeutend weniger invasiv als vorangegangene intrazelluläre Aufnahmetechniken ist und dass Nervenzellen unabhängig von ihrer Größe untersucht werden können (NEUNLIST et al. 1999b).

2.7.1 Spannungssensitive Farbstoffe

Spannungssensitive Farbstoffe (Englisch: voltage sensitive dye, VSD) der Aminonaphthylethenylpyridinium (ANEP)-Familie wurden seit den 1980er Jahren von einer Forschergruppe um L. Loew entwickelt (LOEW et al. 1978; FLUHLER et al.

1985). Diese Farbstoffe sind in der Lage, sich einseitig in die Zellmembran einer Nervenzelle einzulagern, wo sich in Abhängigkeit von Änderungen des Membranpotentials ihr Absorptions- und Emissionsspektrum verändert (ROBINSON et al. 2011). Diese Fluoreszenzänderungen (ΔF/F) im chromophoren Teil des Farbstoffs treten binnen weniger Nanosekunden auf und erfordern deshalb eine hohe zeitliche Auflösung der Kamera, mit der diese Signale aufgenommen werden.

Verwendet man eine Kamera mit komplementärer Metalloxid-Halbleitertechnologie (Englisch: complementary metal oxide semiconductor, CMOS), kann mit der erforderlichen hohen Geschwindigkeit (> 1 kHz) aufgenommen werden.

Spannungssensitive Farbstoffe können somit in Experimenten verwendet werden, um Änderungen des Membranpotentials einer erregbaren Nervenzelle in eine optische Antwort umzuwandeln. Umliegende, nicht neuronale Komponenten des ENS, wie Gliazellen oder Immunzellen, werden hingegen nicht detektiert. Die Bildung von freien

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Literaturübersicht

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Radikalen und damit verbunden mögliche fototoxische Effekte des spannungssensitiven Farbstoffs, die bei langer Belichtungszeit auftreten können, sind als negativer Aspekt dieser Methodik anzuführen (SCHAFFER et al. 1994; OBAID et al. 1999; NIENHAUS u. NIENHAUS 2013). Einen weiteren Nachteil spannungssensitiver Farbstoffe stellt das Ausbleichen der Nervenzellen dar (NIENHAUS u. NIENHAUS 2013). Gemeint ist damit ein dynamischer Prozess, der die abnehmende Intensität der Fluoreszenzfarbstoffe bis hin zum permanenten Verlust der Fluoreszenz beschreibt. Ursächlich hierfür ist die fotochemische Zerstörung der Fluorophor-Moleküle (L. SONG et al. 1995). Zudem ist es bei zu geringem Signal- Rausch-Verhältnis nicht möglich, kleine Änderungen des Membranpotentials mit ausreichender Genauigkeit zu erfassen. Dies ist besonders bei exzitatorischen postsynaptischen Potentialen (EPSPs) von Bedeutung (NEUNLIST et al. 1999b).

Abbildung 3 zeigt die Molekülstruktur des in dieser Arbeit verwendeten spannungssensitiven Farbstoffes Di-8-ANEPPS.

Abbildung 3: Molekülstruktur des spannungssensitiven Farbstoffes Di-8-ANEPPS (modifiziert nach ROBINSON et al. 2011)

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3 Material und Methoden

3.1 Verwendete Lösungen und Puffer

Wenn nicht anders gekennzeichnet, wurden für die folgenden Lösungen ausschließlich Substanzen der Firma Carl Roth GmbH & Co. KG verwendet.

Für die Präparationen und die Versuche wurde Krebslösung in den folgenden Konzentrationen verwendet:

Sowohl während der Gewebegewinnung als auch während der Präparation betrug der pH-Wert bei 4 °C konstant 7,4.

Der pH-Wert der Krebslösung, der bei der Durchführung der Versuche verwendet wurde, betrug bei einer Temperatur von 37 °C konstant 7,4.

Zudem wurden im Rahmen der immunhistologischen Untersuchungen folgende Lösungen verwendet:

Substanz mmol/l

MgCl2.6H2O 1,2

CaCl2.2H2O 2,5

Na H2 PO4 1,2

NaCl 117

NaHCO3 25

Glucose 11

KCl 4,7

Substanz mmol/l

MgCl2.6H2O 1,2

CaCl2.2H2O 2,5

Na H2 PO4 1,2

NaCl 117

NaHCO3 20

Glucose 11

KCl 4,7

Tabelle 2: Krebslösung für Präparationen

Tabelle 3: Krebslösung für Versuche

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Material und Methoden

23 Tabelle 4: 4 %ige Paraformaldehyd-Lösung „Fix“

Tabelle 5: Phosphat-Puffer (0,1 M)

Substanz Menge

A. dest. 800 ml

Na H2 PO4 H2O 3,0 g

Na2 HPO4 7H2O 32,68 g

NaOH (1 M) und H3PO4 (1 M) wurden verwendet, um den pH-Wert des Phosphat- Puffers auf 7,4 einzustellen. Zusätzlich wurde durch die Zugabe von A. dest. ein Gesamtvolumen von 1 l erreicht.

Tabelle 6: Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)

A. dest. 800 ml

NaCl 8,8 g

Phosphat-Puffer 116 ml

Nachdem NaCl und Phosphat-Puffer vermengt wurden, wurde durch die Zugabe von A. dest. das Gesamtvolumen auf 1 l erhöht.

Tabelle 7: PBS/NaN3-Puffer

NaN3 1 g

PBS 1 l

Tabelle 8: Blocking-Serum

PBS/NaN3 48 ml

Horse Serum Triton X-100

2 ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH 250 µl Sigma-Aldrich Chemie GmbH

Phosphat-Puffer (0,1 M) 50 ml

Paraformaldehyd 2 g Sigma-Aldrich Chemie GmbH

Pikrinsäure (1,2 %) 100 µl Sigma-Aldrich Chemie GmbH

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24 Tabelle 9: Eindeckmedium

PBS/NaN3 40 ml

Glycerol 160 ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH

3.2 Versuchstiere und Entnahmestellen

Die Studie wurde mit Hybridschweinen (Deutsche Landrasse x Deutsches Edelschwein x Pietrain) durchgeführt. Dabei wurde abhängig vom Alter der Tiere in zwei Gruppen eingeteilt:

Altersgruppe 1 (AG 1) bildeten Schlachthoftiere im Alter von sechs bis sieben Monaten, deren Gewicht zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme ca. 120 kg betrug.

Diese Tiere stammten aus verschiedenen regionalen Mastbetrieben und wurden unter standardisierten Bedingungen durch Elektrobetäubung mit anschließender Entblutung mittels Kehlschnitt in einem institutsnahen Schlachthof getötet.

Der Altersgruppe 2 (AG 2) wurden sieben bis zwölf Wochen alte Schweine zugeordnet, die dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, entstammten und zum Zeitpunkt der Tötung 31,20 ± 10,28 kg wogen. Diese Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen mittels Bolzenschuss betäubt und im Anschluss ebenfalls durch einen Kehlschnitt entblutet.

Im weiteren Verlauf der Probenentnahme wurde bei beiden Altersgruppen die Bauchhöhle eröffnet und der Gastrointestinaltrakt im Ganzen entnommen und separiert. Die zu untersuchenden Gewebeproben aus dem Colon ascendens und Colon transversum wurden innerhalb der ersten 30 min nach der Tötung entnommen.

Die Gewebegewinnung erfolgte dabei stets auf gleiche Weise.

Um die Entnahmestelle aus dem Colon ascendens aufzufinden, diente zunächst die anatomische Struktur Plica ileocaecalis als Orientierung, die sich zwischen Ileum und Caecum aufspannt (NICKEL et al. 2004). Sowohl das Caecum als auch die Darmabschnitte Jejunum und Colon konnten anschließend eindeutig identifiziert werden. Das Colon ascendens wurde entlang seiner Gyri centripetales in aboraler

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Richtung bis zur Entnahmestelle verfolgt, welche sich ca. 10 cm von der Übergangsstelle des Caecums in das Colon entfernt befand.

Um eine Gewebeprobe aus dem Colon transversum zu entnehmen, wurde der Darm von seinem Anorektum ausgehend ca. 30 cm in oraler Richtung bis zur Entnahmestelle verfolgt.

Mithilfe einer chirurgischen Schere (14130-17, Fine Science Tools GmbH) und einer schmalen Pinzette (11002-25, Fine Science Tools GmbH) wurde ein ca. 10 cm langes Teilstück des entsprechenden Colonsegments reseziert und entlang seines Mesenterialansatzes längs aufgeschnitten. Unmittelbar nach Eröffnung des Teilstückes wurde dieses zwei Mal in eisgekühlter 0,9 %iger NaCl-Lösung (Carl Roth GmbH & Co. KG) gewaschen, um den Darminhalt vollständig zu entfernen.

Für den Transport in das Institut für Physiologie und Zellbiologie wurden die Gewebeproben in eisgekühlte, zuvor mit Carbogen (Gasgemisch aus 95 % O2 und 5 % CO2, Linde AG, Geschäftsbereich Linde Gas) begaste Krebslösung (s. Tabelle 2) verbracht.

Die zuvor beschriebenen Entnahmestellen aus dem Colon ascendens und Colon transversum sind in Abbildung 4 schematisch dargestellt.

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Abbildung 4: Schematische Darstellung des porcinen Gastrointestinaltraktes (modifiziert nach KÖNIG u. LIEBICH 2005)

Die Entnahmestelle aus dem Colon ascendens befand sich ca. 10 cm distal des Übergangs von Caecum in Colon. Die Gewebeproben aus dem Colon transversum wurden ca. 30 cm proximal des Anorektums entnommen.

3.3 Gewebepräparation

Die Gewebepräparation wurde unter einem Stereomikroskop (Stemi 305, Carl Zeiss Microscopy GmbH) durchgeführt. Sie fand unter konstanter Perfusion mit eiskalter Krebslösung (s. Tabelle 2) statt, die ständig mit Carbogen begast wurde.

Aus der entnommenen Gewebeprobe (s. Kapitel 3.2) wurde ein ca. 3 x 2 cm großes Teilstück herausgeschnitten, in eine mit Sylgard® (Sylgard® 184, World Precision Instruments, im Folgenden nur als „Sylgard“ bezeichnet) beschichtete Petrischale (Steriplan 100 x 15 mm, Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG) überführt und dort mit der mukosalen Seite nach oben aufgespannt. Hierfür wurden Minutiennadeln (B12b, 0,2 x 12 mm, Bioform Dr. J. Schmidl e.K.) verwendet, die in einem möglichst flachen Winkel zur Sylgard-Oberfläche eingestochen wurden. Anschließend wurde die

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Mukosa möglichst vorsichtig entfernt, um den SMP, der sich in der darunterliegenden Submukosa befindet, nicht zu verletzen. Als Präparationsinstrument diente eine abgerundete Pinzette (Dumont #7, Fine Science Tools GmbH). Nachdem das Gewebe gewendet wurde, erfolgte ein erneutes Aufspannen mithilfe der Minutiennadeln (B12b, Bioform Dr. J. Schmidl e.K.), sodass die serosale Seite des Gewebes nach oben zeigte. Es wurden Serosa, longitudinale Muskulatur, MP und zirkuläre Muskulatur mit einer feinen Pinzette (Dumont #5, Fine Science Tools GmbH) und einer Schere (15370-52, Fine Science Tools GmbH) entfernt. Es folgte das Abtragen des OSP, der in große Mengen Fettgewebe eingelagert war. Im Anschluss wurden im Rahmen der Feinpräparation noch verbliebenes Fettgewebe, Blutgefäße und Reste von Bindegewebe vorsichtig entfernt. Zuletzt wurde der nun freiliegende ISP erneut gewendet und mit der mukosalen Seite nach oben auf die rechteckige Öffnung (2 x 1 cm) eines speziell aus Sylgard hergestellten Rings gespannt. Hierfür wurden auf eine Länge von 2 – 3 mm gekürzte Minutiennadeln (B12c, 0,1 x 12 mm, Bioform Dr. J.

Schmidl e.K.) verwendet.

Für Gewebeproben des Colon transversum erwies sich aufgrund des hohen Fettanteils und der Dicke der Longitudinal- und Zirkulärmuskulatur eine geringfügig modifizierte Präparationsweise als geeignet. Hierbei wurde das Gewebe zunächst mit der serosalen Seite nach oben aufgespannt und die Serosa sowie die beiden Muskelschichten (inklusive MP) entfernt. Erst im Anschluss wurde nach Wenden des Gewebepräparates die Mukosa abgetragen und wie oben beschrieben weiter vorgegangen.

3.4 Versuchsaufbau des Neuroimaging-Setups

Für die Ultrafast-Neuroimaging-Versuche wurde der Sylgard-Ring, auf den das Gewebe zuvor mittels Minutiennadeln gespannt wurde (s. Kapitel 3.3), zunächst mit der mukosalen Seite nach unten in eine Versuchskammer gesetzt. Diese selbstgefertigte Kammer besteht aus Acrylglas und hat ein Kammervolumen von ca. 8 ml. Am Boden ist sie mit einem 130 µm dicken und 40 mm im Durchmesser