Charakterisierung von Chloridströmen
über das proximale Colon bei CftrTgH(neoim)1Hgu congenen Mäusen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Eva-Maria Bleich
aus Ahaus
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. G. Breves
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. G. Breves 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. A. Gruber
Tag der mündlichen Prüfung: 22. November 2004
Angefertigt im Rahmen des Graduiertenkollegs (GK 705) Charakterisierung pathophysiologischer Versuchstiermodelle
- funktionelle und genetische Analysen -
Gefördert durch Mittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 11
1.1 Zystische Fibrose beim Menschen 11
1.2 Das CFTR-Gen und die Proteinstruktur des CFTR-Kanals beim
Menschen 14
1.3 Mausmodelle für Zystische Fibrose 17
1.3.1 Die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu 19 1.3.1.1 Generierung des Mausmodells CftrTgH(neoim)1Hgu 19 1.3.1.2 Krankheitsbild im Mausmodell CftrTgH(neoim)1Hgu 20 1.4 Mechanismen des transepithelialen Chloridtransports 21
1.5 Alternative Chloridkanäle 23
1.5.1 Der Outwardly rectifying chloride channel (ORCC) 23 1.5.2 Die Calcium-aktivierbaren Chloridkanäle (CaCC) 25
1.5.2.1 Die CLCA-Familie 25
1.5.3 Die ClC-Familie 26
1.5.3.1 Der ClC-2 Kanal 27
1.5.3.2 Der ClC-4 Kanal 28
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit 29
2 MATERIAL UND METHODEN 30
2.1 Tiere 30
2.1.1 DBA/2J und DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu 30
2.1.2 BALB/cJ und BALB/cJ-Cftr 30
2.1.3 C57BL/6J und C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu 31 2.1.4 CF/1, CF/3 und die Filialgeneration F1 31
2.1.5 HsdOla:MF1 32
2.1.6 Haltung und Fütterung 33
2.1.7 Gesundheitsüberwachung 36
2.1.8 Genetische Überwachung 36
2.1.9 Tierdaten 37
2.2 Anatomie und Histologie 38
2.3 Präparation der Schleimhäute 39
2.4 Versuchsaufbau 40
2.5 Elektrophysiologische Messungen 42
2.5.1 Open Circuit-Verfahren 43
2.5.2 Short Circuit-Verfahren 43
2.6 Pharmaka und Protokoll 45
2.6.1 Lösung und Pharmaka 45
2.6.1.1 Krebs-Henseleit-Lösung 45 2.6.1.2 Pharmaka 46
2.6.2 Vorversuche und Protokolle 46
2.6.2.1 Vorversuche 47
2.6.2.2 Protokoll 1 47
2.6.2.3 Protokoll 2 49
2.6.2.4 Protokoll 3 50
2.7 Statistik 51
3 ERGEBNISSE 53
3.1 Vorversuche 53
3.2 Versuche mit Protokoll 1 56
3.2.1 Vergleichende Darstellung des Kurzschlußstroms (Isc) am
proximalen Colon von Wildtyp- und CF-Mäusen 56 3.2.2 Einfluß der Lokalisation des Epithels im proximalen Colon 57 3.2.3 Vergleich der Stämme BALB/c und BALB/c-CftrTgH(neoim)1Hgu 58 3.2.4 Vergleich der Stämme C57BL/6J und C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu 60 3.2.5 Vergleich der Stämme DBA/2J und DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu 62 3.2.6 Vergleich des Stammes HsdOla:MF1 jeweils mit den Stämmen
CF/1, CF/3 und den Filialgenerationen (CF/1xCF/3)F1 und
(CF/3xCF/1)F1 64
3.2.7 Vergleich der Wildtyp-Stämme 67
3.2.8 Vergleich der CF-Stämme und der Filialgenerationen 71
3.3 Versuche mit Protokoll 2 77
3.4 Versuche mit Protokoll 3 80
4 DISKUSSION 82
4.1 Vergleich der Protokolle für das murine proximale Colon mit dem
Protokoll für humanes Rectumgewebe 82
4.1.1 Das Protokoll für humanes Rectumgewebe 83 4.1.2 Vergleich des Protokolls für humanes Rectumgewebe mit den
Protokollen 1 und 2 für das murine proximale Colon -
Gemeinsamkeiten und Unterschiede 85
4.1.2.1 Indomethacin 85 4.1.2.2 Amilorid 86 4.1.2.3 TEA (Tetraethylammonium) und Barium 87 4.1.2.4 Carbachol 88 4.1.2.5 Forskolin 89 4.1.2.6 DIDS (4,4´-Diisothiocyanostilbene-2,2´-disulfonsäure) 90 4.1.2.7 NPPB (5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoat) 92 4.2 Signatur der Kurzschlußstrom- und Leitfähigkeitskurven 94 4.3 Vergleich der Wildtyp-Tiere mit Protokoll 1 95 4.4 Vergleich der CF-Tiere mit dem Protokoll 1 96
4.4.1 CF-Stämme 96
4.4.2 Vergleich des CF/1- und CF/3-Stammes mit den Filialgenerationen (CF/1xCF/3)F1 und (CF/3xCF/1)F1 sowie beider F1-Hybriden
untereinander 98 4.5 Protokoll 2 - Nachweis alternativer Chloridkanäle 99 4.6 Protokoll 3 - Wirkung von Carbachol in Anwesenheit von Forskolin 100
5 ZUSAMMENFASSUNG 103
6 SUMMARY 105
7 LITERATURVERZEICHNIS 107
8 ANHANG 130 8.1 Mittelwerte des Isc für alle 11 Gruppen, Werte in µEq.cm-2.h-1 130 8.2 Mittelwerte der Gt für alle 11 Gruppen, Werte in mS.cm-2 133 8.3 Vergleich der Epithelien hinsichtlich Lokalisation 136 8.4 Vergleich der Gruppen BALB/c und BALB/c-CftrTgH(neoim)1Hgu; C57BL/6J
und C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu; DBA/2J und DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu; HsdOla:MF1 und jeweils CF/1, CF/3, (CF/1xCF/3)F1 und
(CF/3xCF/1)F1 137
8.5 Vergleich der Wildtypen 139
8.6 Vergleich der CF-Tiere 140
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A Ampere
Å Ångström
ABC-Transporter ATP-binding-cassette-Transporter ATP Adenosintriphosphat
ADP Adenosindiphosphat
B6 Bezeichnung für den Mäusestamm C57BL/6J CaCC Calcium-abhängige Chloridkanäle
cAMP zyklisches (cyclo-) Adenosinmonophosphat
CF engl.: Cystic Fibrosis; dt.: Zystische Fibrose, Mukoviszidose CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (human) Cftr Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (murin) CF/1 Bezeichnung für den Mäusesubstamm CF/1Ztm
CF/3 Bezeichnung für den Mäusesubstamm CF/3Ztm cGMP zyklisches (cyclo-) Guanosinmonophosphat ClC spannungsabhängige Chloridkanäle
CLCA Calcium-aktivierte Chloridkanäle (human) Clca Calcium-aktivierte Chloridkanäle (murin)
cM centiMorgan
d Tag
DIDS 4,4‘-Disothiocyanostilbene-2,2‘-disulfonsäure DMSO Dimethylsulfoxid
EBP Ezrin-binding protein ENaC epithelialer Natriumkanal
Eq Ionenequivalent (1 µEq.h-1 entspricht für einwertige Ionen 26,8 µA)
ER Endoplasmatisches Retikulum ES-Zelle Embryonale Stammzelle
F1 Filialgeneration 1
FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations
Gt transepitheliale Leitfähigkeit in mS.cm-2 (Gt = 1/Rt)
GV-Solas Gesellschaft für Versuchstierkunde-Society for Laboratory Animal Science
HSD Honestly Significantly Different ICM Intestinal Current Measurement
I.E. Internationale Einheiten IVC Individually Ventilated Cages Isc Kurzschlußstrom in µEq.cm-2.h-1
kbp Kilobasenpaare
KGW Körpergewicht
LIS lateraler Interzellulärspalt, lateral intercellular space MF1 Bezeichnung für den Mäusestamm HsdOla:MF1 MHH Medizinische Hochschule Hannover
MJ Megajoule
MSD hydrophobe membranständige Domäne
muc mucosal
N Anzahl der Tiere n Anzahl der Epithelien
NKCC1 Natrium-Kalium-2Chlorid-Cotransporter NPPB 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoat NBD nukleotidbindende Domänen
ORCC Outwardly Rectifying Chloride Channel, vermutlich der ClC-3B, eine Splicingvariante des ClC-3
p Irrtumswahrscheinlichkeit Pd Potentialdifferenz
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
pS picoSiemens R-Domäne regulatorische Domäne ROMK Renal Outer Medullary K+-channel SD Standardabweichung
ser serosal
SPF spezifiziert pathogenfrei
TEA Tetraethylammonium
TgH(neoim)1Hgu transgenic, homologous recombination 1,MRC Human Genetics Unit
WT Wildtyp
Ztm internationales Haltersymbol des Zentralen Tierlaboratoriums, Medizinische Hochschule Hannover
DEFINITIONEN
apikal dem Darmlumen zugewandte Seite der Darmepithelzellen basolateral den Blutgefäßen zugewandte Seite der Darmepithelzellen elektrogen Transportvorgang, bei dem es zu einer
Nettoladungsverschiebung über das Epithel kommt
elektroneutral Co- oder Countertransport von Ionen, bei dem es zu einem Ladungsausgleich kommt
Kurzschlußstrom stellt bei elektrochemischem Gleichgewicht auf beiden Seiten des Epithels ein Maß für den elektrogenen transepithelialen Ionentransport dar
mucosal Synonym zu apikal serosal Synonym zu basolateral
1 Einleitung
1.1 Zystische Fibrose beim Menschen
Die zystische Fibrose (engl.: cystic fibrosis (CF)), oder auch Mukoviszidose, ist eine schwere monogene Humanerkrankung, die autosomal rezessiv vererbt wird. Man geht davon aus, daß weltweit mindestens 60.000 Menschen betroffen sind. Die Prävalenz für Mukoviszidose ist dabei in der kaukasischen Bevölkerung am höchsten (DORIN, 2002). Die durchschnittliche Lebenserwartung liegt heute, auf Grund von verbesserten Therapiemöglichkeiten, bei 30 Jahren (DAVIDSON und DORIN, 2001).
Die Krankheit wurde schon 1938 von Andersen beschrieben und nach der beobachteten zystischen Pankreasfibrose benannt (QUINTON, 1999).
Das betroffene Genprodukt, der Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), konnte 1989 von RIORDAN et al. als epithelialer Chloridkanal identifiziert werden und wird in vielen lebenswichtigen Organen exprimiert. Es sind heute mehr als 1300 verschiedene Mutationen im CFTR-Gen bekannt (KUNZELMANN, 2001), wobei die ∆F508 Mutation mit 66% weltweit am häufigsten vorkommt (CF GENETIC ANALYSIS CONSORTIUM, 1994). Bei der ∆F508 Mutation kommt es zu einer Deletion des Phenylalanins an der Position 508. Die verschiedenen Mutationen führen zu strukturellen Veränderungen auf Proteinebene mit der Folge, daß die Chloridsekretion in diesen Geweben stark eingeschränkt oder nicht vorhanden ist. Zusammen mit Umweltfaktoren und weiteren modifizierenden Genen führen die Mutationen zu einem breiten Spektrum der Krankheitsausprägung bei Mukoviszidosepatienten und zu variablen Schweregraden der klinischen Manifestation.
Pathologische Veränderungen treten in Organen auf, die den CFTR-Kanal exprimieren, wie Lunge, Pankreas, Leber, Darm, Schweißdrüsen und Reproduktionstrakt. Charakteristisch sind daher salziger Schweiß, Pankreasinsuffizienz, Darmverschluß, Unfruchtbarkeit bei Männern und schwere Veränderungen in den Luftwegen (RATJEN und DÖRING, 2003).
Kinder mit salzigem Schweiß sind schon aus historischen Aufzeichnungen aus dem Mittelalter bekannt. Überlieferungen zu Folge galten Kinder als verhext, die, wenn sie geküßt wurden, salzig schmeckten. Ihnen wurde ein früher Tod prophezeit (QUINTON, 1999). Auch heute wird die pathologisch erhöhte Chloridkonzentration (>
60 mmol/l) im Schweiß gemessen und damit die Diagnose „CF“ durch einen Schweißtest, den sogenannten Gibson-Cooke-Schweißtest, gestellt. Dieser stellt zusammen mit der Lungen- und Pankreaspathologie die „diagnostische Trias“ der klassischen CF dar (DAVIS und SANT´AGNESE, 1984). Zusätzlich gibt es aber auch atypische Formen der CF, die sich nur durch ein Kennzeichen der klassischen CF äußern. Die zur Diagnosestellung durchgeführten genotypischen Verfahren sind zur Zeit nicht in der Lage, auf Grund der Vielzahl der Mutationen, alle betroffenen Patienten auf Genträgerschaft oder Vorliegen einer Mukoviszidose zu identifizieren (TÜMMLER, 2003). Weitere Diagnosemöglichkeiten bestehen in der Messung der nasalen transepithelialen Potentialdifferenz (Pd > 35 mV) (RATJEN und DÖRING, 2003) oder im Intestinal Current Measurement (ICM), wobei der Chloridstrom über eine Rectumbiopsie gemessen wird (BRONSVELD et al., 2003).
Der pathogene Prozeß im Pankreas beginnt, vor allem bei Patienten mit ∆F508 Mutation, schon in utero und schreitet progressiv im ersten Lebensjahr fort. Durch Verlegung der Pankreasgänge, die herabgesetzte Flüssigkeitsmenge und die Reduzierung des Bicarbonats im Pankreassekret werden die Proenzyme des Pankreas aktiviert und es kommt zur Zerstörung und Atrophie des Gewebes, welches durch fibröses Gewebe ersetzt wird. Im Spätstadium treten Zysten und Kalzifikationen auf – daher der Name der Erkrankung: „Zystische Fibrose“.
Außerdem kann sich eine Pankreatitis entwickeln.
Durch diese Pankreasveränderungen kann es zu Folgeerkrankungen kommen. Zum einen können die Pankreasenzyme so weit reduziert sein, daß Fette und Proteine nur unvollständig verdaut werden können und es zur Mangelernährung kommt, zum anderen kann die fortschreitende Fibrose zu einem Diabetes mellitus führen. Die Substitution der Pankreasenzyme, oftmals sehr hoch dosiert, kann eine fibrosierende Colonopathie zur Folge haben.
Durch die fehlende Chloridsekretion im Darm kommt es bei 10-20% der Patienten in den ersten Lebenstagen zu einem Mekoniumileus. Das eingedickte Mekonium kann zum Drehpunkt für einen Volvolus werden, der wiederum zu Darmnekrosen, Perforation und Peritonitis führen kann. Geschieht dies im Uterus, so kommt es zu Komplikationen, wie intraabdominaler Kalzifikation, Microcolon oder ilealer Atresie.
Bei bis zu 20% der Jugendlichen und jungen Erwachsenen mit CF kann es ebenfalls zur Verstopfung, ähnlich dem Mekoniumileus, kommen. Dies wird dann „distales intestinales Obstruktionssyndrom“ genannt. Durch die Verstopfung im terminalen Ileum kommt es zu progressiven abdominalen Spannungen und zum Erbrechen von Galle (MILLA, 1998; GREGER, 2000).
Die fibrosierende Lungenerkrankung, die oftmals bei CF-Patienten im Vordergrund steht, ist charakterisiert durch eine gestörte mukoziliäre Clearance und eine chronische progressiv fortschreitende mikrobielle Besiedlung. Diese determiniert die Morbidität und Mortalität in den meisten CF Fällen, da viele Keime Resistenzen gegen die eingesetzten Antibiotika entwickelt haben. Dabei wird Pseudomonas aeruginosa am häufigsten isoliert, gefolgt von Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae und Stenotrophomonas maltophilia. Ebenso werden Isolate von Burkholderia cepacia gefunden (RATJEN und DÖRING, 2003; TÜMMLER und KIEWITZ, 1999).
Durch die fortschreitende respiratorische Erkrankung (husten, keuchen) und durch die medikamentelle Versorgung kann eine weitere Komplikation, der gastro- oesophageale Reflux, ausgelöst werden. Ursache hierfür ist eine transiente Relaxation des kaudalen Oesophagussphinkters (MILLA, 1998).
Die heute angewandten Therapien zielen darauf ab, die Symptome in der Lunge, im Gastrointestinaltrakt und im Pankreas zu lindern und somit die Lebenserwartung und Lebensqualität der Patienten zu steigern.
1.2 Das CFTR-Gen und die Proteinstruktur des CFTR-Kanals beim Menschen
1946 wurde die Zystische Fibrose erstmals von Anderson und Hodges auf eine genetische Ursache zurückgeführt (QUINTON, 1999). Die Identifizierung des 250 kbp großen und 27 Exone umfassenden Gens gelang 1989 durch ROMMENS et al., RIORDAN et al. und KEREM et al. Das Gen konnte auf dem Chromosom 7 in der Region q31 lokalisiert werden. Auf Grund der Primärstruktur des CFTR-Kanals konnte das Transportprotein in die Super-Familie der ATP-binding-cassette (ABC)- Transporter eingeordnet werden (HYDE et al.,1990). Es wurde danach schnell nachgewiesen, daß das CFTR-Protein ein Chloridkanal in der apikalen Zellmembran ist, der durch cAMP-Agonisten aktiviert wird (ANDERSON et al., 1991 b; BEAR et al., 1991).
Nach der Identifizierung der Aminosäuresequenz, bestehend aus 1480 Aminosäuren, schlugen RIORDAN et al. 1989 eine Struktur für den CFTR-Kanal vor, die sich als sehr genau herausstellte. Sie propagierten ein integrales Membranprotein mit 12 amphipathischen transmembranen Helices. In Abbildung 1.2.1 ist ein Modell dieser Struktur dargestellt. Es besteht aus fünf funktionellen Domänen: zwei hydrophoben membranständigen Domänen (MSD1, MSD2), welche jeweils aus sechs transmembranen Helices aufgebaut sind, zwei hydrophilen membranassoziierten Domänen, die die nukleotidbindenden Domänen (NBD1, NBD2) umfassen, und einer regulatorischen Domäne (R-Domäne), welche durch die Proteinkinasen A (PKA), C (PKC) und eine cGMP-abhängige Proteinkinase an verschiedenen Stellen phosphoryliert werden kann. Die R-Domäne mit ihren zahlreichen geladenen Aminosäureresten wird durch das Exon 13 kodiert. Die hoch konservierten NBDs werden auch als Walker A- und Walker B-Motive bezeichnet.
ADP ADP
N
C
NBD1 NBD2
DomäneR -
MSD1 MSD2
extrazellulär
intrazellulär
ATP ATP
+ +
PP PKA & ATP
PKC
Abb. 1.2.1: Strukturmodell des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) (nach SHEPPARD und WELSH, 1999)
Die MSDs tragen zur Formation der Cl--selektiven Pore bei (ANDERSON et al., 1991 b, MCDONOUGH et al., 1994), die NBDs hydrolysieren ATP, um den Fluß der Ionen durch den Kanal zu regulieren (ANDERSON et al., 1991 a, CARSON et al., 1995) und die Phosphorylierung der R-Domäne kontrolliert die Kanalaktivität (PICCIOTTO et al., 1992; RICH et al., 1993).
Durch die Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) findet eine Phosphorylierung von verschiedenen Serinresten in der R-Domäne statt (CHENG et al., 1991). Anschließend wird durch einen an den NBDs ablaufenden ATP- Hydrolysezyklus der Fluß der Ionen durch den Kanal reguliert. Durch Phosphatasen wird die R-Domäne wieder dephosphoryliert und der Kanal kehrt in seinen Ruhezustand zurück.
Cl--Ionen strömen passiv aus dem Zellinneren entlang des elektrochemischen Gradienten durch den Kanal ins Lumen. Das Öffnen und Schließen der Pore, und
damit die Kontrolle des Ionenflusses, ist eng an die Aktivität von Proteinkinasen, Phosphatasen und den intrazellulären ATP-Spiegel gebunden.
Die einzelnen CFTR-Kanäle haben eine Leitfähigkeit von 6-10 pS, dabei wurde eine selektive Permeabilität der Pore gegenüber verschiedenen Halogenen (I-(1,8) > Br- (1,3) > Cl-(1,0) > F-(0,17)) festgestellt (TABCHARANI et al., 1997). Ebenso wurde eine Permeabilität des CFTR-Kanals für HCO3- festgestellt (HUG et al., 2003; GRAY et al., 1990; LINSDELL et al., 1997). LINSDELL et al. (1997) ermittelten einen Porendurchmesser von ca. 5,3 Å und eine Querschnittsfläche von ca. 21-22 Å2.
Neben der Funktion als Chloridkanal, reguliert der CFTR-Kanal auch andere Kanäle und Transporter (SCHWIEBERT et al., 1999; KUNZELMANN und SCHREIBER, 1999). Der CFTR-Kanal inhibiert den Amilorid-sensitiven epithelialen Natriumkanal (ENaC) (GREGER, 2000). Daher kommt es auch bei Dysfunktion des CFTR-Kanals zur vermehrten Resorption von Natrium (STUTTS et al., 1995). Außerdem beeinflußt der CFTR-Kanal auswärts rektifizierende Cl--Kanäle (ORCCs) (EGAN et al., 1992), den Cl-/HCO3- Austauscher (LEE et al., 1999 a) und den ROMK (Renal Outer Medullary K+-Channel) (SCHWIEBERT et al., 1999).
Ob diese regulatorischen Funktionen des CFTR-Kanals durch direkte oder indirekte Interaktionen zustande kommen, ist noch nicht klar. Es ist aber bekannt, daß der CFTR-Kanal mit verschiedenen Proteinen direkt interagiert, wie zum Beispiel mit dem Syntaxin 1A, das die Kanalaktivität über Bindung an der zytoplasmatischen N- terminalen Domäne inhibiert, und mit dem ezrin-binding protein 50 (EBP 50). Das EBP 50 bindet an den C-Terminus und dient vermutlich der Verankerung des CFTR- Kanals im Cytoskelett sowie der Lokalisation in der apikalen Zellmembran (AKABAS, 2000). Die Synthese der Wildtyp-CFTR-Kanäle ist sehr ineffektiv. Nur 30% der neu synthetisierten Kanäle werden vom Endoplasmatischen Retikulum (ER) in den Golgi- Apparat transportiert. Viele Mutationen, die CF auslösen, wie zum Beispiel ∆F508, führen während der Reifung im ER zu fehlerhaft gefalteten CFTR-Kanälen, die nachfolgend sehr schnell (Halbwertszeit = 20-40 min.) degradiert werden (KOPITO, 1999).
1.3 Mausmodelle für Zystische Fibrose
Um die Zystische Fibrose hinsichtlich ihrer Genetik, Symptomatik und der Therapiemöglichkeiten zu untersuchen, wurden drei Jahre nach der Entdeckung des betroffenen Gens die ersten Mausmodelle durch gentechnische Veränderung entwickelt.
1991 wurde als Grundlage das murine Homolog des menschlichen CFTR-Gens durch TATA et al. und YORIFUJI et al. zentromernah (bei 3,1 cM) auf dem murinen Chromosom 6 kartiert, kloniert und sequenziert. Die für 1476 Aminosäuren (vgl.
Mensch 1480 Aminosäuren) kodierende cDNA ist über 6,3 kbp groß (vgl. Mensch 6,5 kbp). Die Homologie der Aminosäuresequenz zwischen den Spezies beträgt 78%, wobei sich die Sequenzen der transmembranen Domänen und der NBD in über 80%
gleichen (TATA et al., 1991; YORIFUJI et al., 1991).
Da das murine Cftr-Protein nur im Darm, in der Lunge, im Magen, in den Nieren und in den Speicheldrüsen exprimiert wird (KELLEY et al., 1992), und nicht wie beim Menschen auch im Pankreas und in der Leber, zeigen die Mausmodelle im Gegensatz zum Menschen nicht die typischen CF-Symptome einer Pankreasinsuffizienz.
Die einzelnen Modelle unterscheiden sich zum einen hinsichtlich ihrer Mutation, die sich in einem kompletten Ausfall der Cftr-Funktion oder in einer residualen Cftr- Funktion äußern, und es gibt Mausmodelle mit Mutationen, wie sie beim Menschen vorkommen. Hier ist die beim Menschen häufigste Mutation, die ∆F508 Mutation, zu erwähnen. Da dieser Bereich im Mausgenom mit dem des Menschen übereinstimmt, konnten Modelle mit einer Deletion des Phenylalanins an der Position 508 geschaffen werden.
Außerdem unterscheiden sich die Mausmodelle hinsichtlich der Schwere ihres Krankheitsgrades und damit hinsichtlich ihrer Überlebensdauer. Auch die verschiedenen Hintergrundstämme der einzelnen Modelle können unterschiedliche Phänotypen bewirken. Dies ist nachfolgend in Tabelle 1.3.1 dargestellt.
Tabelle 1.3.1: Übersicht einiger Mausmodelle (modifiziert nach SCHOLTE, 2001).
Alle Modelle zeigen eine deutlich verkürzte Lebensdauer, Wachstumshemmung, vermindertes Körpergewicht und kaum oder keine Lungenpathologie.
Stamm Mutation Genetischer Hintergrund
Pathologie Referenz
Cftrtm1Unc
Inframe Stopcodon in Exon 10 (Knockout)
C57BL/6;129 BALB/c;129
ungestörte Fertilität
überwiegend Darmpathologie (Ileus)
KGW-Reduktion: 10-50%
Überlebensdauer bis zur Geschlechtsreife: <5%
SNOUWAERT et al., 1992
Cftrtm1Kth
∆F508 (Homologe Rekombina -tion)
C57BL/6;129 KGW-Reduktion: 50%
Überlebensdauer bis zur Geschlechtsreife: 40%
ZEIHER et al., 1995
Cftrtm1G551D
G551D (Homologe Rekombina -tion)
CD1;129 ungestörte Fertilität Darmpathologie vglw. gering, entspricht G551D-Patienten Pharynx: submucöse Drüsen enthalten eosinophiles Material KGW-Reduktion: 30-50%
Überlebensdauer: 67% bis Tag 35
DELANEY et al., 1996
Cftrtm1Bay
Duplikation in Exon 3 (Knockin)
C57BL/6;129 überwiegend Darmpathologie (Ileus), Hyperplasie und
eosinophiles Material in den Krypten
KGW-Reduktion: 70%
Überlebensdauer: 40% bis Tag 7
O`NEAL et al., 1993
Diese Mausmodelle haben entscheidende Vorteile gegenüber Zellkulturen und Biopsien von betroffenen Patienten: Neue Therapieansätze, wie zum Beispiel die
Gentherapie, können sowohl auf Zellebene wie auch am gesamten lebenden Organismus über einen längeren Zeitraum überwacht und erprobt werden. Bei Untersuchungen an Organen stehen durch die Modelle organisierte Gewebeverbände zur Verfügung, welche die in vivo Verhältnisse beim Menschen, und damit auch die Eigenschaften der Gewebe, eher widerspiegeln als dies eine Zellkultur aus einer Zellart vermag. Biopsien von betroffenen Patienten stehen der Forschung nur sehr selten und in geringer Anzahl zur Verfügung und variieren stark hinsichtlich ihrer Genetik, Mutation und Lokalisation.
1.3.1 Die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu
1.3.1.1 Generierung des Mausmodells CftrTgH(neoim)1Hgu
Die Arbeitsgruppe um DORIN entwickelte 1992 ein Mausmodell, in dem das murine Cftr-Gen durch einen Vektor zertrennt wurde.
In einem pMC1neopolyA-Vector wurde das Hind III Fragment des Vektors durch ein 3,5 kbp großes Hind III Fragment des Cftr-Gens der Maus ersetzt. Dieses eingesetzte Cftr-Genfragment umfaßte einen Teil von Intron 9 und dehnte sich aus bis in Exon 10. Dieser Vektor wurde durch Elektroporation in embryonale Stammzellen der Linie E14 eingebracht, die dem Mausstamm 129/Sv entnommen wurden. Durch die gezielte Integration in die Stammzelle kam es in Intron 9 zu einer teilweisen Duplikation des Exon 10 und damit zu einer Unterbrechung des Cftr-Gens.
Durch Southern Blot Analyse läßt sich die Insertionsmutation im Genom bestätigen (DORIN et al., 1992 b).
Die Stammzellklone wurden anschließend in C57BL/6 Blastozysten injiziert und scheinschwangeren weiblichen Mäusen eingepflanzt, um chimäre Tiere zu züchten.
Bei den chimären Mäusen wurde anschließend überprüft, ob die Mutation auch in die Keimbahn übertragen wurde. Mit diesen Tieren wurde der Stamm weiter aufgebaut.
Um bessere Zuchtleistungen zu erzielen, wurde der HsdOla:MF1-Stamm mehrfach eingekreuzt (DORIN et al. 1992 a).
Im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) wurde diese Mutation zum einen durch Rückkreuzungen auf verschiedene definierte Hintergrundstämme (BALB/c, C57BL/6 und DBA/2J) gebracht, um den Einfluß des genetischen Hintergrundes auf den Phänotyp der die Mutation tragenden Tiere zu untersuchen, zum anderen wurden durch Bruder-Schwester-Verpaarungen die Stämme CF/1 bis CF/4 generiert.
1.3.1.2 Krankheitsbild im Mausmodell CftrTgH(neoim)1Hgu
Direkt nach der Erstellung des Mausmodells wurden an den ersten Mäusen elektrophysiologische Studien und histopathologische Untersuchungen durchgeführt.
In-vivo wurden gastrointestinale und nasale Potentialdifferenzen gemessen. Die Messungen im Rectum, Colon und Caecum der CF-Mäuse zeigten eine deutlich verminderte basale Potentialdifferenz gegenüber den Kontrollen, den HsdOla:MF1- Mäusen. Die nasale Potentialdifferenz war bei den homozygot mutierten Mäusen erhöht, wohingegen kein Unterschied in den tieferen Luftwegen gefunden werden konnte.
Bei den histologischen Untersuchungen konnte kein Unterschied zwischen den Wildtyp- und den heterozygoten Mäusen gefunden werden. Die für das Cftr-Gen homozygoten Mäuse wiesen histopathologische Veränderungen auf, die mit denen der Zystischen Fibrose beim Menschen übereinstimmen. Es konnte eine milde Colondilatation mit abnormer Mucusakkumulation und eine erhöhte Mucinmenge im Vas deferens einer Maus gefunden werden. Eine 30 Tage alte Maus zeigte eine milde fokale Atelektase in der Lunge. Im Pankreas der Tiere konnten keine Veränderungen festgestellt werden (DORIN et al., 1992 a).
In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, daß durch die partielle Duplikation, basierend auf dem eingefügten Vektor im Mausgenom, Exon skipping und aberantes Splicing möglich sind und daher von diesen Mäusen zusätzlich zur mutierten RNA auch normale Cftr-mRNA produziert wird. Dadurch wird die Schwere des intestinalen
Phänotyps gemildert. Dies führt zwar zu einer höheren Überlebensrate der Tiere, der Transportdefekt kann aber nicht komplett korrigiert werden (DORIN et al., 1994).
1.4 Mechanismen des transepithelialen Chloridtransports
Der gerichtete Chloridtransport wird dadurch ermöglicht, daß das intestinale Epithel funktionell polarisiert ist, was sich durch die spezifische Anordnung von bestimmten Membrantransportproteinen am apikalen bzw. basolateralen Pol der Zelle darstellt (BARRET und KEELY, 2000).
Von basolateral wird das Chlorid in eine sekretorische Zelle elektroneutral durch den Natrium-Kalium-2Chlorid-Cotransporter (NKCC1) aufgenommen. Die Energie dafür liefert der Natriumgradient, der über die Natrium-Kalium-Pumpe aufgebaut wird, daher spricht man von einem sekundär aktiven Cl--Transport. Das über den Cotransporter sowie die Pumpe aufgenommene Kalium verläßt die Zelle über apikale sowie basolaterale Kaliumkanäle, wodurch der Intrazellulärraum negativ gegenüber der Umgebung wird. Dieses negative Zellinnere bildet zusammen mit dem Gradienten für Chlorid die elektrochemische Triebkraft für den gerichteten Chloridausstrom aus der Zelle ins Lumen.
Chlorid verläßt die Zelle bei gesunden Individuen zum größten Teil über den cAMP- abhängigen CFTR-Kanal (BARRET und KEELY, 2000), ein geringerer Anteil wird über andere Chloridkanäle sezerniert. Dies sind zum Beispiel der ORCC-Kanal (outwardly rectifying chloride channel) und Mitglieder der CLCA-Kanal Familie (Ca2+
aktivierte Chloridkanäle), die auf der gegenüberliegenden Seite zum NKCC1 in der Zellmembran verankert sind. Durch die Chloridsekretion wird das transepitheliale Potential vergrößert (Lumen negativ). Diese Potentialdifferenz ist die Basis für die parazelluläre Bewegung der Natriumionen von serosal (ser) nach mucosal (muc).
Wasser folgt dem Ionentransport aus osmotischen Gründen nach.
In Abbildung 1.4.1 ist diese Chloridsekretion, wie sie zum Beispiel in Epithelien der Lunge und des Darms, aber auch im Pankreas vorkommt, dargestellt.
Cl- Cl-
CLCA ORCC
NKCC1
2K+
2K+
3Na+
3Na+ ATPase CFTR- Kanal , H2O
Na+
K+- Kanal
K+- Kanal
Cl- Cl-
K+
K+
2Cl Na
2Cl-
- Na+
+ K+
K+
-
+ -
+
Cl- Cl-
K+ K+
~
Abbildung 1.4.1: Zellmodell für die Chloridsekretion. Die serosale (Blut-) Seite wird von der mucosalen (Lumen-) Seite durch schematisch dargestellte Epithelzellen getrennt.
Bei CF-Patienten und Mäusen mit Mutationen im Cftr-Gen kann ein Chloridausstrom durch den CFTR-Kanal nicht oder nur eingeschränkt stattfinden. Dadurch ist die Natrium- und vor allen Dingen die parazelluläre Wassersekretion vermindert und das im Lumen der Organe befindliche Sekret wird zähflüssig. Dies äußert sich in den oben beschriebenen Symptomen.
Bei einigen CF-Patienten scheinen alternative Chloridkanäle den Chloridtransport in einem gewissen Maße zu übernehmen und mildern so die Schwere der Erkrankung.
In Messungen an Rectumbiopsien bei ∆F508-Patienten konnte ein Calcium- abhängiger Chloridstrom festgestellt werden (BRONSVELD et al., 2000). Auch im
mucosal
serosal
Nasenepithel eines Mausmodells konnte ein DIDS-sensitiver Calcium-abhängiger Kurzschlußstrom gemessen werden (FULLER und BENOS, 2000).
1.5 Alternative Chloridkanäle
Als erste propagierten CLARKE et al. (1994), daß bei Funktionsverlust von Cftr- Kanälen alternative Chloridkanäle die Chloridsekretion in bestimmten Geweben kompensieren könnten, wenn sie entsprechend in der apikalen Bürstensaummembran lokalisiert wären und unter physiologischen Bedingungen geöffnet werden könnten.
Zu den in der Literatur diskutierten alternativen Chloridkanälen, die die Funktion des CFTR bei einem Defekt zu einem gewissen Teil übernehmen könnten, zählen der Outwardly rectifying chloride channel (ORCC) (HRYCIW und GUGGINO, 2000), Calcium-abhängige Chloridkanäle (CaCC) (CLARKE et al., 1994) und einige Kanäle aus der Familie spannungsabhängiger Chloridkanäle (ClC) (JENTSCH et al., 2002;
MOHAMMAD-PANAH et al., 2002).
1.5.1 Der Outwardly rectifying chloride channel (ORCC)
Bis heute ist die molekulare Struktur des ORCCs unbekannt und auch die physiologische Rolle des Kanals ist unklar (JENTSCH et al., 2002). Zu Beginn der CF-Forschung wurde der ORCC für das CF-Genprodukt gehalten (SCHWIEBERT et al., 1999).
Es bestehen jedoch deutliche Unterschiede. Der ORCC besitzt eine große Leitfähigkeit von 30-70 pS (vgl. CFTR: 8-10 pS) und ist auswärts rektifizierend. Der Kanal wird durch DIDS blockiert (JOVOV et al., 1995) und kann durch Depolarisation aktiviert werden. Ebenso unterscheidet sich der ORCC in der Permeabilität der Halogene vom CFTR-Kanal, wobei die Permeabilität für Iodionen größer ist als für Chloridionen (I->Cl-, vgl. CFTR: Br-≥Cl->I->F) (SCHWIEBERT et al., 1995). In
Membranpatches von murinen Nasenepithelzellen wurde gezeigt, daß der ORCC durch die Proteinkinasen A und C in Anwesenheit des CFTR-Kanals reguliert wird, nicht aber bei defektem CFTR (GABRIEL et al., 1993). Durch die Einführung von Wildtyp-CFTR-Kanälen in eine CF-Zelle konnte die defekte Proteinkinase A Regulation des ORCCs korrigiert werden (EGAN et al., 1992).
Der CFTR-Kanal benötigt zur Modulation des ORCCs physiologische Konzentrationen an intrazellulärem ATP (SCHWIEBERT et al., 1995). Das ATP muß für die Stimulation des ORCCs, vermutlich an einen purinergen Rezeptor des ORCCs, aus dem Zytoplasma durch die Zellmembran in den Extrazellularraum gelangen. ATP verläßt die Zelle vermutlich nicht durch den CFTR-Kanal (LI et al., 1996; SCHWIEBERT, 1999).
Es konnte außerdem gezeigt werden, daß der ORCC für Bicarbonat permeabel ist, in einem Verhältnis von 1:2 (HCO3- zu Cl- Permeabilität) (CLARKE und HARLINE, 1998)
Da zur Zeit noch kein Gen gefunden worden ist, das für den ORCC codiert, wird nach potentiellen Kandidatengenen gesucht. HRYCIW und GUGGINO (2000) schlagen unter anderem den CLC-3 vor, ein Mitglied der kürzlich neu entdeckten CLC-Familie. OGURA et al. (2002) fanden eine splicing-Variante des ClC-3, den ClC-3B, die sie als Kandidat für den ORCC vorschlugen. Der größte Anteil an ClC-3B wurde in einer Zellinie aus der Milchdrüse der Maus (C127) intrazellulär gefunden. In C127 Zellen, die gleichzeitig EBP 50 (siehe Kapitel 1.2) exprimierten, konnte der ClC-3B in bestimmten Bereichen der Zellmembran lokalisiert werden. In Patch- Clamp Studien wies der ClC-3B die elektrophysiologischen Eigenschaften des ORCC auf. OGURA et al. (2002) vermuteten, das der ClC-3B ( = ORCC?) möglicherweise über Bindungsstellen des EBP 50 mit dem CFTR-Kanal in der Membran in Verbindung steht und so beeinflußt werden könnte. GENTZSCH und Mitarbeiter (2003) konnten den ClC-3B überwiegend im Golgi-Apparat lokalisieren und bestätigten damit das Ergebnis von OGURA et al. (2002). Sie schlossen nicht aus, daß ein kleiner Teil des ClC-3B in die Plasmamembran eingebaut wird und dort unter Umständen durch den CFTR-Kanal beeinflußt wird. Ihre Untersuchungen unterstützten allerdings nicht die These, daß Interaktionen mit EBP 50 stattfinden,
die die Lokalisation an der Zelloberfläche oder Verbindungen mit dem CFTR-Kanal bewirken.
1.5.2 Die Calcium-aktivierbaren Chloridkanäle (CaCC)
In elektrophysiologischen Studien wurden in verschiedenen Zelltypen Calcium- aktivierte Chloridkanäle nachgewiesen, die sich u.a. durch unterschiedliche Leitfähigkeiten differenzieren lassen. Allen Calcium-abhängigen Chloridkanälen ist gemeinsam, daß sie Calcium- und spannungsabhängig aktiviert werden und daß die Kanäle durch DIDS hemmbar sind. Bisher konnten die entsprechenden Gene nicht identifiziert werden. Möglicherweise bilden die Gene der CLCA-Familie zu einem gewissen Teil die molekulare Basis für die elektrophysiologisch erhobenen Daten.
1.5.2.1 Die CLCA-Familie
Alle identifizierten Mitglieder dieser Familie zeigen gemeinsame elektrophysiologische Eigenschaften, wie Calcium-abhängige Öffnung und DIDS- Sensitivität (FULLER und BENOS, 2000; GRUBER et al., 1999).
Das erste Mitglied dieser Kanal-Familie wurde aus der bovinen Trachea isoliert.
Neben bovinen, humanen, porcinen und Ratten-CLCAs wurden auch bei der Maus vier CLCA Kanäle (mCLCAs) gefunden.
Die Clca1-mRNA konnte nach ihrer Entdeckung 1998 (GANDHI et al., 1998) u.a. in den Enterozyten der Krypten in Dünn- und Dickdarm, in den Acini des Pankreas, im respiratorischen Epithel der Trachea und der Bronchien sowie in Schleimdrüsen der Lamina propria mucosae der murinen Trachea nachgewiesen werden. Durch das Verteilungsmuster könnte der mCLCA1 einen möglichen alternativen Chloridkanal darstellen (GRUBER et al., 1998).
Der mCLCA2 kommt als alternativer Chloridkanal für den Cftr-Kanal nicht in Frage, da die Clca2-mRNA vor allem in der sich zurückbildenden Milchdrüse der Maus gefunden wurde (LEE et al., 1999 b).
Der murine CLCA3 oder auch gob-5 wird in den Becherzellen des Magen-Darm- Trakts, der Trachea und des Uterus exprimiert. Durch das Expressionsmuster in intestinalen Becherzellen sind das murine Clca3 und das humane orthologe Clca1 vielversprechende Kandidatengene hinsichtlich der Pathophysiologie der Zystischen Fibrose (LEVERKOEHNE und GRUBER, 2002). Der CLCA3 konnte nur in Becherzellen nachgewiesen werden, die von den mitotisch aktiven Zellen zur luminalen Oberfläche wanderten, nicht aber in Becherzellen, die zur Kryptenbasis wanderten. In einer Studie von CHUNG et al. (2001) konnten signifikant höhere Gehalte an Clca3 mRNA bei BALB/c-Mäusen ohne Lungensymptomatik als bei C57BL/6-Mäusen mit schwerer Lungensymptomatik gefunden werden.
Der vierte bislang bekannte mCLCA, der mCLCA4, wurde v.a. in Geweben mit einem hohen Anteil an glatter Muskulatur gefunden (ELBLE et al., 2002). So wurde er in den glatten Muskelzellen der herznahen Gefäße, der Bronchiolen, des Magens und der Blase nachgewiesen. Ebenso wurde der mCLCA4 in Endothelzellen von Blutgefäßen gefunden. Im Darm wurde der Kanal jedoch nur in geringer Menge in den glatten Muskelzellen nachgewiesen. In der Darmmucosa wurde der mCLCA4 in großen Mengen identifiziert, allerdings nicht wie mCLCA1 und mCLCA3 in den tiefen Krypten oder den Gobletzellen sondern vor allem in den Villi. Aufgrund der Expressionsdaten wird vermutet, daß Calcium-aktivierte Chloridströme in glatten Muskelzellen durch den mCLCA4 erzeugt werden (ELBLE et al., 2002).
1.5.3 Die ClC-Familie
Viele, aber wahrscheinlich nicht alle Kanäle aus dieser Familie, öffnen spannungsabhängig. Alle ClC-Kanäle zeigen eine größere Chlorid- als Iodleitfähigkeit (Cl- > I-) (vgl. ORCC = ClC3B ? ;I- > Cl-), was aber nicht universell akzeptiert ist (JENTSCH et al., 2002).
Aus dieser Familie könnten die folgenden zwei Kanäle neben dem bereits oben erwähnten ClC-3B zum alternativen Chloridstrom beitragen.
1.5.3.1 Der ClC-2 Kanal
Der ClC-2 wird in vielen Geweben exprimiert, wobei im Gehirn, der Niere und im Darm große Mengen gefunden werden. Er kann durch Hyperpolarisation, Zellschwellung und extrazelluläre Ansäuerung aktiviert werden (JENTSCH et al., 2002). Der physiologische Stimulus, der ClC-2 aktiviert, ist aber nicht bekannt (GYÖMÖREY et al., 2000). Ein ClC-2 knockout Mausmodell zeigte eine Degeneration der Testes und der Retina. Dies könnte einen Hinweis auf eine mögliche Beteiligung am transepithelialen Transport darstellen (JENTSCH et al., 2002).
Der ClC-2 Chloridkanal wird beim Fetus in der apikalen Membran der Lunge gefunden, seine Präsenz wird aber nach der Geburt herunterreguliert (GYÖMÖREY et al., 2000; JENTSCH et al., 2002). GYÖMÖREY und Mitarbeiter (2000) konnten den ClC-2 in murinen Ileumzellen überwiegend an der apikalen Seite des Tight Junction Komplexes lokalisieren. In der Bürstensaummembran ließ sich der ClC-2 nur diffus nachweisen. In Ussingkammerstudien ließ sich ein Chloridstrom nachweisen, der durch den Austausch der ursprünglichen Pufferlösung gegen hypotone Lösung auf der mucosalen Seite ausgelöst werden konnte, durch NPPB hemmbar war und keine Sensitivität auf DIDS zeigte (GYÖMÖREY et al., 2000). Eine apikale Chloridleitfähigkeit mit den gleichen Eigenschaften wie von GYÖMÖREY et al. beschrieben, wurde ebenso für das Ileum der Ratte nachgewiesen. Bei der Ratte war diese Leitfähigkeit allerdings auf das Ileum beschränkt. Für das Jejunum der Ratte wurde, ebenfalls unter hypotonen Bedingungen, eine basolaterale Chloridleitfähigkeit gezeigt (DIENER et al., 1996). Im distalen Colon des Meerschweinchens konnte der ClC-2 Kanal nur in der basolateralen Membran der Colonzellen nachgewiesen werden, nicht aber in der apikalen Membran (CATALÁN et al., 2002), so daß eine Beteiligung an der basolateralen Chloridleitfähigkeit
postuliert wird. Auch im Colon der Maus konnte der ClC-2 nur in der basolateralen Membran nachgewiesen werden (GYÖMÖREY et al., 2000).
Die Präsenz des ClC-2 in Darmzellen, die Lokalisation an der apikalen Zellseite in Epithelien der Lunge und des Darms sowie die elektrophysiologischen Daten sprechen für eine Beteiligung des ClC-2 am transzellulären Chloridtransport.
In jüngster Zeit konnten zwei Mausmodelle erstellt werden, bei denen sowohl der Cftr-Kanal als auch der ClC-2-Kanal defekt war. Bei diesen Tieren ergab sich aber keine Verschlechterung des CF-Phänotyps, weder histologisch noch in Ussingkammer-Studien (ZDEBIK et al., 2004).
1.5.3.2 Der ClC-4 Kanal
Über den ClC-4 Kanal ist relativ wenig bekannt (JENTSCH et al., 2002). Der ClC-4 wird vornehmlich in der apikalen Bürstensaummembran und in Becherzellen, zumindest im intestinalen Epithel von Ratten, Mäusen und Menschen, exprimiert (MOHAMMAD-PANAH et al., 2002). Kleinere Mengen von ClC-4 befanden sich in subapikalen Endosomen. Patch-Clamp Studien an Caco-2 Zellen weisen darauf hin, daß der ClC-4 mit einem endogenen spannungsabhängigen Chloridstrom in Verbindung gebracht werden kann.
Der ClC-4 weist gleiche Verteilungsmuster im Darm auf wie der CFTR-Kanal und es wird vermutet, daß das Protein einen Anteil an der Chloridsekretion im Intestinum hat.
In einer weiteren Studie (MOHAMMAD-PANAH et al., 2003) ergab sich, daß der ClC- 4 zusammen mit dem ClC-5 am endosomalen Transport des Transferrinrezeptors in renalen und intestinalen Epithelzellen beteiligt ist.
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit
Im Rahmen des Graduiertenkollegs 705 (Charakterisierung pathophysiologischer Versuchstiermodelle - funktionelle und genetische Analysen) sollte eine phänotypische Charakterisierung der CF-Mäuse und der Wildtypen hinsichtlich der Chloridsekretion im proximalen Colon durchgeführt werden.
Die Inzuchtstämme (mit und ohne CftrTgH(neoim)1Hgu Mutation) variieren hinsichtlich ihrer Genetik und ihres Phänotyps, so daß es durch modifizierende genetische Faktoren des Hintergrundes auf das Cftr-Gen zu phänotypischen Unterschieden kommen kann.
In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb anhand für die Maus entwickelter Protokolle untersucht werden, ob
• die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu unterschiedliche Effekte auf die Chloridsekretion bei den verschiedenen Inzuchtstämmen zeigt, und ob
• einer dieser Stämme sich als besonders geeignet für die CF-Forschung darstellt.
Als Maß für die Chloridsekretion wurde mittels Ussing-Kammer-Technik der basale und stimulierte Kurzschlußstrom über dem Epithel gemessen. Dafür sollten den Anforderungen entsprechende Protokolle entworfen werden.
2 Material und Methoden 2.1 Tiere
Alle Mäuse, die mir für die Versuche freundlicherweise von Prof. H.J. Hedrich überlassen wurden, wurden im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) gezüchtet und gehalten.
Die wichtigsten Inzuchtstämme wurden zu Anfang des 20. Jahrhunderts etabliert.
Tiere folgender Stämme wurden für die Versuche eingesetzt:
2.1.1 DBA/2J und DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu
1909 sonderte Clarence Little, der spätere Begründer des Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, in seiner Zucht Mäuse ab, um mit diesen Tieren den ersten Inzuchtstamm aufzubauen. Aufgrund der Allele, die für die Fellfarbe der Tiere verantwortlich waren (dilute (d), brown (b), und non-aguti (a)), erhielt der Stamm den Namen DBA (STAATS, 1975). 1929/30 wurden durch Kreuzung von Substämmen verschiedene neue Substämme erzeugt, darunter der hier verwendete DBA/2JZtm (auch abgekürzt als D2). Das „J“ steht für The Jackson Laboratory.
Die Tiere dieses Stammes zeigen zum Teil eine schlechte Zuchtleistung und eine geringe Wurfgröße (FESTING, 1998).
In diesem Stamm konnte die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu im ZTL etabliert werden, wobei nur für die Mutation heterozygote Weibchen zur Zucht eingesetzt werden können.
2.1.2 BALB/cJ und BALB/cJ-Cftr
1913 erwarb Halsey Bagg die Albinozucht der BALB-Mäuse von einem Mäusehändler (mouse dealer) in Ohio. Georg Snell erhielt 1932 Zuchttiere von
diesem Stamm, dem er das /c (für albino) zum Namen hinzufügte. 1935 wechselte Snell mit der Zucht an das Jackson Laboratory (LES, 1990).
Der BALB/c-Stamm (auch abgekürzt als C) gehört mittlerweile zu den 2-3 am meisten in der Forschung eingesetzten Stämmen (FESTING, 1998). In der vorliegenden Arbeit wurde der BALB/cJZtm Substamm eingesetzt.
Auch auf diesen Stamm wurde die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu im ZTL der MHH übertragen.
2.1.3 C57BL/6J und C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu
Der Inzuchtstamm C57BL entstand 1921 ebenfalls durch Clarence Little an der Carnegie Institution in Cold Spring Harbor, New York, durch Verpaarung von Maus Nummer 57 (weiblich) mit Maus Nummer 52 (männlich). Das Ergebnis war eine schwarze Maus, die kurz darauf als C57 black bezeichnet wurde. Es wird vermutet, daß das „C“ im Namen dieses Stammes für das Nonalbino-Allel steht (ANONYMUS, 1989).
Der später entstandene Substamm C57BL/6 (auch abgekürzt B6) wird heute am häufigsten in Versuchen eingesetzt.
Die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu konnte in den vergangenen Jahren im ZTL auf den C57BL/6J-Stamm übertragen werden.
2.1.4 CF/1, CF/3 und die Filialgeneration F1
1994 kamen sechs Tiere als Nachkommen des Originalfoundertieres mit der Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu (DORIN et al., 1992 a) aus Edinburgh nach Hannover.
Diese befanden sich damals in der F4-Generation, so daß die Tiere noch einen stark segregierenden Hintergrund, bestehend aus Anteilen von 129/Sv (Ursprung der embryonalen Stammzellen), C57BL/6J (Blastozysten, in die die ES-Zellen injiziert wurden) und MF1 (siehe unten), hatten.
Ausgehend von diesen Tieren aus Edinburgh wurden im Zentralen Tierlaboratorium mehrere Linien etabliert und durch Inzuchtverpaarungen u.a. die Stämme CF/1 und CF/3 geschaffen. Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten Mäuse waren mehr als 20 Generationen ingezüchtet.
Im Jahr 2000 untersuchte die Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Tümmler, Klinische Forschergruppe, Abt. Pädiatrische Pneumologie und Neonatologie der MHH Hannover, die beiden Stämme bezüglich der Cftr-mRNA Expression. Dabei stellte sich heraus, daß die Tiere des CF/1-Stammes noch 10% der normalen Wildtyp Cftr- mRNA exprimierten, während die Tiere des CF/3-Stammes unter 1% der Wildtyp Cftr-mRNA exprimierten. Allerdings zeigten beide Stämme den gleichen Phänotyp, was darauf hindeutet, daß der Chloridtransport bei beiden Stämmen auf unterschiedliche Weise reguliert wird (CHARIZOPOULOU et al., 2001). Die Etablierung einer F1-Generation sollte zeigen, welche Symptome diese Tiere entwickeln und wie hoch die Wildtyp Cftr-mRNA Expression ist. Zusätzlich sollten auch diese Tiere durch die vorliegende Arbeit phänotypisch weiter charakterisiert werden.
2.1.5 HsdOla:MF1
Der als lebhaft geltende Stamm zeichnet sich durch eine gute Reproduktionsfähigkeit aus. Die Tiere sind gutmütig und leicht zu handhaben.
Ursprünglich wurde der Auszuchtstamm vor 1970 bei Olac aus einer Kreuzung zwischen LACA-Mäusen (ehemals CFW) aus dem Laboratory Animal Centre, Carshalton und CS1-Mäusen der Scientific Products Farm, Manston aufgebaut und seit 1970 als geschlossene Kolonie gehalten. 1992 kamen die Tiere zu Harlan Sprague Dawley, Inc. (persönliche Kommunikation R. Schröder, Harlan). Die Tiere wurden vom ZTL von der Firma Harlan Olac LTD, England bezogen. Generell besteht die Bezeichnung eines Auszuchtstammes aus der Angabe des Haltersymbols, in diesem Fall HsdOla, und der Stammbezeichnung, hier MF1, die durch einen Doppelpunkt getrennt werden.
Bei der Etablierung des Stammes mit der Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu 1992 in Edinburgh wurde der MF1-Stamm in der Anfangsphase mehrmals eingekreuzt, um die Zuchtleistung der CF-Tiere zu steigern. Untersuchungen mit Mikrosatelliten-Markern zu Beginn der Etablierung der CF/1- und CF/3-Stämme an der MHH zeigten einen hohen Anteil von MF1 im Genom. Daher wird er auch als Kontrollstamm für die CF/1- und CF/3-Tiere eingesetzt.
2.1.6 Haltung und Fütterung
Die C57BL/6J-, DBA/2J-, BALB/cJ- und die HsdOla:MF1-Mäuse wurden unter SPF- Bedingungen in Typ II Polycarbonatkäfigen, die CF/1-, CF/3- und F1-Tiere im Isolator unter SPF-Bedingungen und die C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu-, DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu- und BALB/c-CftrTgH(neoim)1Hgu-Tiere in individuell ventilierten Polycarbonatkäfigen (Individually ventilated cages, IVC-Regale; Fa. BioZone, England) des Typs 22 im Zentralen Tierlaboratorium der MHH auf Weichholzgranulat gehalten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Die Gruppengröße betrug in den Käfigen 2-5 Tiere. Die Haltung in klimatisierten Räumen erfolgte bei einer Raumtemperatur von 20°C ± 2°C und einer Luftfeuchtigkeit von 55% ± 5%. Die Beleuchtung erfolgte ausschließlich über Kunstlicht in der Zeit von 6.00 Uhr bis 18.00 Uhr MEZ. Die Tierräume wurden grundsätzlich mit Schutzkleidung, bestehend aus Kittel, Überschuhen, Haube, Mundschutz und Handschuhen, betreten. Die SPF- Haltung wurde nur nach vorherigem Duschen und mit entsprechender Schutzkleidung betreten. Allen Mäusen stand eine gleichbleibende definierte Standard-Nager-Diät als pelletiertes Alleinfutter ad libitum zur Verfügung. Die Mäuse der SPF-Haltung erhielten autoklaviertes ssniff R-Z Futter (ssniff Spezialdiäten GmbH, Deutschland), allen anderen Tiere Altromin 1314 (Altromin Gesellschaft für Tierernährung mbH, Deutschland). Die Zusammensetzung des Futters, konform mit den Empfehlungen der GV-Solas (Gesellschaft für Versuchstierkunde), ist in Tabelle 2.1.6.1 aufgeführt. Je nach Haltungssystem wurde das Wasser entweder gefiltert oder autoklaviert (Isolator) ad libitum zur Verfügung gestellt.
Tabelle 2.1.6.1: Chemische Zusammensetzung des eingesetzten Futters ssniff R-Z und Altromin 1314:
Nährstoffe %-Anteil in ssniff R-Z %-Anteil in Altromin 1314
Rohprotein 21,00 22,5 Rohfett 3,80 5,0 Rohfaser 4,40 4,5
Rohasche 6,7 6,5
Wasser 13,5
N-freie Extrakte 48,0
Mineralien %-Anteil in der Diät %-Anteil in der Diät Calcium 1,00 0,9 Phosphor 0,70 0,7
Magnesium 0,20 0,2
Natrium 0,25 0,2
Kalium 0,90 1,0
Aminosäuren %-Anteil in der Diät %-Anteil in der Diät
Lysin 1,20 1,20
Methionin 0,40 0,40
Cystin 0,30 0,30
Phenylalanin 1,00 1,00
Tyrosin 0,70 0,70
Arginin 1,40 1,40
Histidin 0,60 0,50
Tryptophan 0,30 0,20
Threonin 0,80 0,80 Isoleucin 0,80 1,00
Leucin 1,50 1,80
Valin 1,00 1,10
Spurenelemente mg/kg ppm
Mangan 90 45
Eisen 220 160
Kupfer 12 13
Zink 75 60
Iod 2 1
Fluor 15 Vitaminzusatz in 1kg Diät
Vitamin A 25.000 I.E.٭ 15.000 I.E.
Vitamin D3 1.000 I.E.٭ 600 I.E.
Vitamin E 120 mg٭ 75 mg
Vitamin K3 5 mg 3 mg
Vitamin B1 10 mg 18 mg
Vitamin B2 20 mg 12 mg
Vitamin B6 12 mg 9 mg
Vitamin B12 80 µg 24 µg
Niacin 36 mg
Pantothensäure 30 mg 21 mg
Biotin 400 mg 60 µg
Folsäure 4 mg 2 mg
Cholin 1600 mg 600 mg
Ascorbinsäure 36 mg
Umsetzbare Energie 12,8 MJ/kg 12,5 MJ/kg
Pelletgröße jeweils 10 mm
Die Vitaminangaben des Futters ssniff R-Z sind garantierte Mindestangaben, auch nach dem Autoklavieren des Futters.
2.1.7 Gesundheitsüberwachung
Die mikrobiologische Überwachung wurde entsprechend den Empfehlungen der FELASA (NICKLAS et al., 2002) am Zentralen Tierlaboratorium der MHH im Rahmen von vierteljährlichen Routineuntersuchungen durchgeführt. Alle eingesetzten Mausstämme aus dem SPF-Haltungsbereich waren, ebenso wie die Tiere aus den IVC-Regalen, frei von bakteriellen, viralen und parasitären Erregern gemäß der Empfehlungsliste der FELASA, mit Ausnahme von Helicobacter bilis, der bei den MF1-Tieren, den CF/1- und CF/3-Tieren, deren F1-Generation sowie den B6- CftrTgH(neoim)1Hgu
-Tieren nachgewiesen wurde.
2.1.8 Genetische Überwachung
Die Inzuchtstämme, C57BL/6J, BALB/cJ und DBA/2J, wurden regelmäßig einmal im Jahr hinsichtlich ihrer genetischen Authentizität überprüft, während der MF1-Stamm als Auszuchtstamm mit genetischer Variabilität nicht überprüft wurde.
Jedes Tier der congenen Stämme, C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu, BALB/cJ- CftrTgH(neoim)1Hgu und DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu, wurde während der Etablierung der Stämme auf das Vorhandensein der Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu durch Frau Charizopoulou im Labor der Klinischen Forschergruppe, Abt. Pädiatrische Pneumologie und Neonatologie der MHH Hannover, überprüft. Mittels Southern Blot Analyse wurde aus der Milz der entsprechenden Tiere DNA gewonnen und wie bei DORIN et al. (1992 b) beschrieben untersucht. Aus labortechnischen Gründen wurde die Methode geändert und die Homozygotie im Cftr-Gen der Tiere durch intragenische Genotypisierung mittels Mikrosatellitenmarker festgestellt (CHARIZOPOULOU et al., 2004). Dies wurde bis zur 10. Rückkreuzungsgeneration durchgeführt.
Gleiche Untersuchungen wurden mit den CF/1- und CF/3-Tieren durchgeführt. Diese Tiere sind mittlerweile weit über 20 Generationen ingezüchtet und werden von daher jetzt als Inzuchtstamm behandelt und dementsprechend überwacht.
Bei den DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu-Tieren wurde jedes Tier auf Homozygotie im Cftr- Gen überprüft, da mit für die Mutation heterozygoten Weibchen gezüchtet werden mußte.
2.1.9 Tierdaten
Die Daten der in den verschiedenen Versuchen verwendeten Tiere sind in den folgenden Tabellen dargestellt. Im Intestinum variiert die Wildtyp-Cftr-mRNA Expression bei den CftrTgH(neoim)1Hgu-Mäusen zwischen 2 und 74%, wobei der Durchschnittswert bei 21% liegt. Die absoluten Werte der Wildtyp- Cftr-mRNA der CftrTgH(neoim)1Hgu-Mäuse variieren mit dem Alter (LARBIG et al., 2002), wobei die Werte bis zum Alter von sechs Monaten relativ konstant bleiben.
Tabelle 2.1.9.1: Tierdaten der Tiere für Protokoll 1:
Geschlecht
Gruppe Stamm Anzahl
♂ ♀
Alter in d
Gewicht in g
1 HsdOla:MF1 10 6 4 132±27 38,85±4,25
2 BALB/c 16 16 72±12 22,52±2,47
3 BALB/c-
CftrTgH(neoim)1Hgu
13 13 77±18 35,28±3,93
4 C57BL/6J 11 11 98±1 21,79±1,46
5 C57BL/6J- CftrTgH(neoim)1Hgu
12 7 5 170±56
*
6 DBA/2J 12 12 133±61 25,22±1,96
7 DBA/2J-
CftrTgH(neoim)1Hgu
9 9 120±36 22,38±4,09
8 CF/1 14 5 9 88±6 26,83±2,78
9 CF/3 11 4 7 108±13 30,91±3,18
10 (CF/1xCF/3)F1 8 5 3 68±8 26,48±3,97
11 (CF/3xCF/1)F1 11 8 3 75±4 31,45±3,16
*
Das Gewicht der C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu-Tiere konnte aus institutsinternen Gründen nicht per Waage bestimmt werden. Ihr geschätztes Gewicht lag im oberen Drittel bezogen auf das Gewicht der anderen Tiere.Tabelle 2.1.9.2: Tierdaten der Tiere für Protokoll 2:
Geschlecht
Gruppe Stamm Anzahl
♂ ♀
Alter in d
Gewicht in g
I BALB/c -
CftrTgH(neoim)1Hgu
11 3 8 122±1 30,05±5,55
II BALB/c 5 5 107±2 19,85±2,54
Tabelle 2.1.9.3: Tierdaten der Tiere für Protokoll 3:
Geschlecht
Gruppe Stamm Anzahl
♂ ♀
Alter in d
Gewicht in g
11b (CF/3xCF/1)F1 4 4 81 27,21±1,27
2.2 Anatomie und Histologie
Die Gesamtlänge des Dickdarms (Colon und Rectum) beträgt bei erwachsenen Mäusen circa 14 cm. Das Colon besteht aus einem ascendierenden (im Folgenden proximales Colon genannt), einem transversen und einem descendierenden Teil, der ohne klare Trennung in das Rectum übergeht.
Charakteristisch für das proximale Colon sind prominente transverse Falten, die sich bei mesenterialer Eröffnung des proximalen Colons V-förmig darstellen. Sie
verstreichen im transversen Teil des Colons und werden zu Längsfalten im Colon descendens.
Das proximale Colon zeigt eine wenig entwickelte Muscularis mucosae, eine dünne Tela submucosa und Tunica muscularis, während im absteigenden Colon die Tela submucosa und Tunica muscularis stärker ausgeprägt sind.
Das Epithel des Colons besteht aus einer Zellschicht, die aus drei verschiedenen Zelltypen zusammengesetzt ist: Absorptive Zellen, Gobletzellen (Becherzellen) und Enteroendokrine Zellen (argentaffine Zellen) (SHACKELFORD und ELWELL, 1999).
2.3 Präparation der Schleimhäute
Alle Mäuse wurden einzeln mit CO2 im ZTL der Medizinischen Hochschule Hannover betäubt und getötet, ausgenommen hiervon waren die B6- und die B6-Cftr Gruppen, die auf Grund einer temporären hygienischen Maßnahmen im ZTL durch cervikale Dislokation getötet wurden.
Direkt im Anschluß an die Tötung und das Wiegen (Waage: Universal U3600P, Sartorius AG, Göttingen) eines Tieres erfolgte die circa zwei Minuten dauernde Entnahme des proximalen Colons. Dazu wurde die Bauchhöhle median eröffnet und das proximale Colon wurde großzügig nach Abtrennung vom Mesenterium entnommen. Das Colon wurde am Mesenteriumansatz mittels Knopfschere längs aufgetrennt und in eisgekühlter, mit Carbogen (95% O2 / 5% CO2) begaster, Krebs- Henseleit-Lösung (siehe Tab. 2.6.1.1.1) gereinigt und transportiert. Pro Versuchstag wurden nacheinander Darmabschnitte von 3-4 Tieren gewonnen. Für den circa 15-20 minütigen Transport in eisgekühlter Lösung zum Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden die Därme einzeln in durchnumerierte Gläser verbracht, so daß die Zuordnung des Colons zum Tier die ganze Zeit gewährleistet war.
Im Labor des Physiologischen Instituts wurden die Tunica serosa und Tunica muscularis von der Tunica mucosa unter ständiger Befeuchtung mit eiskalter Krebs-
Henseleit-Lösung abgetrennt. Dies wird als „strippen“ bezeichnet. Diese Art der Technik wurde von FRIZZELL et al. (1976) als partial mucosal strip beschrieben.
Dazu wurde das äußerste proximale Ende des Colons auf einem Strippbrett (Eigenbau des Physiologischen Instituts), einer PVC-Platte mit einer engen Reihe Präpariernadeln, festgesteckt. Auf das distale Ende des proximalen Colons wurde ein Objektträger aufgesetzt. Tunica serosa und muscularis wurden mit Hilfe eines Skalpells eingeritzt und mit feinen gewinkelten Pinzetten von der Tunica mucosa abgezogen.
Aus dem proximalen Colon einer Maus konnten zum großen Teil zwei Mucosastücke, ein proximales und ein distales Stück, gewonnen werden. Diese wurden unverzüglich in die Ussing-Kammern eingespannt. Während der weiteren Darstellung wird anstelle von Mucosa der Begriff Epithel verwendet, wie dies in der transportphysiologischen Literatur üblich ist.
2.4 Versuchsaufbau
Die Versuche wurden mit acht Ussing-Kammern (Eigenbau des Physiologischen Instituts), die an ein Gasliftsystem angeschlossen waren, durchgeführt. Über Agarbrücken und Ag/AgCl-Bezugselektroden (Mettler Toledo Prozessanalytik GmbH, Deutschland) waren die Kammern mit zwei mikrocomputergesteuerten Voltage/Current Clamps (Wissenschaftliche Geräte, Dipl.-Ing. K. Mußler, Aachen;
www.Kmsci.de) verbunden. Diese Inkubationstechnik geht im Prinzip auf die von USSING 1949 entwickelten Kammern zurück und ist eine Methode um den Transport von Ionen durch biologische Membranen zu erfassen.
Eine Ussing-Kammer bestand aus zwei Plexiglashälften, wobei auf der einen Kammerhälfte sechs Präpariernadeln kreisförmig um die 0,5 cm2 große Kammeröffnung angeordnet waren.
Auf die Kontaktfläche um die Kammeröffnungen beider Hälften herum wurde eine dünne Schicht Silikon (Baysilone-Paste, mittelviskös, BayerAG, Leverkusen) zur
Abdichtung und zur Vermeidung von Randdruckstellen (edge damage) am Epithel aufgetragen.
Direkt nach dem Strippen wurde das Epithel mit der serosalen Seite nach unten auf die sechs Präpariernadeln aufgespannt und die Kammer zusammengesetzt, so daß die linke Kammerhälfte die serosale (im Tier zum Blut gerichtete) Seite und die rechte Kammerhälfte die mucosale (im Tier zum Lumen gerichtete) Seite repräsentierte. Die jeweilige Ussing-Kammer wurde umgehend in die Versuchsapparatur eingesetzt, durch Schrauben fixiert und mit den Vorratsgefäßen, die beidseitig 10 ml Krebs-Henseleit-Lösung enthielten, verbunden (Abbildung 2.4.1).
Ein Vorratsgefäß bestand aus zwei doppelwandigen Glassäulen mit zwei Füssigkeitskreisläufen. Der äußere Kreislauf enthielt Aqua destillata, das über ein Wasserbad auf 38°C erwärmt und umgewälzt wurde, und diente als Wärmequelle für den inneren Kreislauf, der auf einer Temperatur von 37°C gehalten wurde. Der innere Kreislauf enthielt die Versuchslösung und wurde kontinuierlich mit Carbogen begast. Durch die Begasung wurde die Inkubationslösung umgewälzt, die Sauerstoffversorgung des Gewebes und ein konstanter pH-Wert der Lösung gewährleistet.
mucosales Kompartiment
serosales Kompartiment
Begasung und Zirkulation in beiden
Kompartimenten
computergesteuerte Clamp
Epithel
µEq mV
Abbildung 2.4.1: Schematische Darstellung der Versuchsapparatur
2.5 Elektrophysiologische Messungen
Vor dem eigentlichen Versuchsbeginn wurde eine Eichperiode vorgeschaltet, in der die Kammern die im Versuch eingesetzte Elektrolytlösung enthielten, aber noch kein Epithel. In dieser Phase wurden der Lösungswiderstand und die Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden ermittelt.
Für die elektrischen Messungen wurden die Ussing-Kammern mit eingespanntem Epithel mit der Clamp verbunden. Als elektrische Parameter für den Ionentransport des Colonepithels wurden der Kurzschlußstrom (Isc) und die Gewebeleitfähigkeit (Gt) protokolliert.
2.5.1 Open Circuit-Verfahren
Vor Beginn der eigentlichen Messungen wurden die Daten der Kammern im „Open Circuit“-Verfahren erfaßt. Dabei wurde die Potentialdifferenz, die spontan durch Ionentransport über dem Epithel aufgebaut wurde, direkt erfaßt. Die Potentialdifferenz wurde über gewebenahe Krebs-Henseleit-Agarbrücken, die mit den Silber-/ Silberchlorid-Bezugselektroden verbunden waren, gemessen.
Dies ist in Abbildung 2.5.2.1 a) dargestellt.
Durch den Computer erfolgte eine automatische Korrektur der gemessenen Potentialdifferenz um den in der Eichperiode ermittelten Wert.
2.5.2 Short Circuit-Verfahren
Die eigentlichen Messungen wurden mit dem „Short Circuit“-Verfahren durchgeführt.
Bei dieser Methode wurde über ein zweites Paar gewebeferne Silber-/
Silberchloridelektroden, die ebenfalls über Agarbrücken mit den Kammern verbunden waren, ein Strom appliziert. Diese Agarbrücken besaßen einen großen Durchmesser, wodurch zusammen mit der Entfernung eine gleichmäßige Stromapplikation über die gesamte Gewebefläche gewährleistet war.
Durch diesen von außen applizierten Strom wurde die Potentialdifferenz auf 0 mV gegengeregelt, „geklemmt“. (siehe Abbildung 2.5.2.1 b)) Die elektrogenen Ionenbewegungen, und somit der elektrische Gradient über dem Epithel, wurden durch diesen Strom kompensiert. Damit ist dieser Strom betragsmäßig der Summe aller aktiv und elektrogen transportierten Ionen gleichzusetzen. Der Isc erhält definitionsgemäß ein positives Vorzeichen, wenn ein positiver Ionenstrom von der mucosalen zur serosalen Seite des Epithels fließt. Dies entspricht einer Kationenresorption und / oder einer Anionensekretion.
Da sich auf beiden Seiten des Epithels die gleiche Pufferlösung sowie die gleichen Volumina befanden, bestand über dem Epithel kein chemischer und kein hydrostatischer Gradient. Wurde unter diesen Bedingungen ein von Null
verschiedener Nettotransport eines Ions über das Epithel gemessen, so konnte auf einen aktiven Transport dieses Ions geschlossen werden.
Der Isc wurde in Ionenäquivalent als Ladungstransfer pro Zeit und Gewebefläche Isc(µEq·h-1·cm-2) angegeben; dabei entspricht 1µEq·h-1 für einwertige Ionen 26,8 µA.
Um die Gt zu bestimmen, wurde unter Kurzschlußstrombedingungen alle 6 Sekunden ein bipolarer Stromimpuls von 100 µA über eine Dauer von 200 ms über das Epithel appliziert. Dies führte zu kurzfristigen Potentialänderungen (∆Pd). Die Leitfähigkeit ergab sich dann aus
Pd Gt I
∆
= ∆ .
Der Isc sowie die Gt wurden kontinuierlich mit Hilfe eines Computers aufgezeichnet.
Abbildung 2.5.2.1 a) und b): Durch aktive elektrogene Transportleistungen des Epithels entsteht eine Potentialdifferenz zwischen mucosaler und serosaler Seite, die als treibende Kraft für weitere passive Ionenbewegungen wirkt. Sie wird durch die Applikation eines externen Stroms aufgehoben.
a) Open Circuit: b) Short Circuit:
+ 4 mV
Cl- serosal mucosal
+ 0 mV
Cl- serosal mucosalI
2.6 Pharmaka und Protokoll
2.6.1 Lösung und Pharmaka
2.6.1.1 Krebs-Henseleit-Lösung
In den Versuchen wurde auf beiden Seiten des Epithels eine Krebs-Henseleit- Lösung mit folgender Zusammensetzung verwendet:
Tabelle 2.6.1.1.1: Zusammensetzung der Krebs-Henseleit-Lösung:
mmol/l A. dest. g/l A. dest.
NaCl 113,6 6,6388
KCl 5,4 0,4026
CaCl2·2H2O 1,2 0,1764
MgCl2·6H2O 1,2 0,2440
HCl (1n) 0,2 0,2 ml
NaH2PO4·H2O 0,6 0,0828
Na2HPO4·2H2O 2,4 0,4272
NaHCO3 21,0 1,7642
Glucose (wasserfrei) 10,0 1,802
Mannit 19,7 3,6
Die mit Carbogen begaste Lösung hatte einen pH-Wert von 7,4 bei einer Temperatur von 37°C und Begasung mit Carbogen. Die Osmolalität lag bei 300 mosm/l.
Zur Herstellung der Agarbrücken wurde Krebs-Henseleit-Lösung ohne Zusatz von Glucose und Mannit mit 270 mosm/l verwendet.
Die Chemikalien für die Krebs-Henseleit-Lösung wurden von der Fa. E. Merck, Darmstadt bezogen.
