Alle Mäuse, die mir für die Versuche freundlicherweise von Prof. H.J. Hedrich überlassen wurden, wurden im Zentralen Tierlabor (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) gezüchtet und gehalten.
Die wichtigsten Inzuchtstämme wurden zu Anfang des 20. Jahrhunderts etabliert.
Tiere folgender Stämme wurden für die Versuche eingesetzt:
2.1.1 DBA/2J und DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu
1909 sonderte Clarence Little, der spätere Begründer des Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, in seiner Zucht Mäuse ab, um mit diesen Tieren den ersten Inzuchtstamm aufzubauen. Aufgrund der Allele, die für die Fellfarbe der Tiere verantwortlich waren (dilute (d), brown (b), und non-aguti (a)), erhielt der Stamm den Namen DBA (STAATS, 1975). 1929/30 wurden durch Kreuzung von Substämmen verschiedene neue Substämme erzeugt, darunter der hier verwendete DBA/2JZtm (auch abgekürzt als D2). Das „J“ steht für The Jackson Laboratory.
Die Tiere dieses Stammes zeigen zum Teil eine schlechte Zuchtleistung und eine geringe Wurfgröße (FESTING, 1998).
In diesem Stamm konnte die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu im ZTL etabliert werden, wobei nur für die Mutation heterozygote Weibchen zur Zucht eingesetzt werden können.
2.1.2 BALB/cJ und BALB/cJ-Cftr
1913 erwarb Halsey Bagg die Albinozucht der BALB-Mäuse von einem Mäusehändler (mouse dealer) in Ohio. Georg Snell erhielt 1932 Zuchttiere von
diesem Stamm, dem er das /c (für albino) zum Namen hinzufügte. 1935 wechselte Snell mit der Zucht an das Jackson Laboratory (LES, 1990).
Der BALB/c-Stamm (auch abgekürzt als C) gehört mittlerweile zu den 2-3 am meisten in der Forschung eingesetzten Stämmen (FESTING, 1998). In der vorliegenden Arbeit wurde der BALB/cJZtm Substamm eingesetzt.
Auch auf diesen Stamm wurde die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu im ZTL der MHH übertragen.
2.1.3 C57BL/6J und C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu
Der Inzuchtstamm C57BL entstand 1921 ebenfalls durch Clarence Little an der Carnegie Institution in Cold Spring Harbor, New York, durch Verpaarung von Maus Nummer 57 (weiblich) mit Maus Nummer 52 (männlich). Das Ergebnis war eine schwarze Maus, die kurz darauf als C57 black bezeichnet wurde. Es wird vermutet, daß das „C“ im Namen dieses Stammes für das Nonalbino-Allel steht (ANONYMUS, 1989).
Der später entstandene Substamm C57BL/6 (auch abgekürzt B6) wird heute am häufigsten in Versuchen eingesetzt.
Die Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu konnte in den vergangenen Jahren im ZTL auf den C57BL/6J-Stamm übertragen werden.
2.1.4 CF/1, CF/3 und die Filialgeneration F1
1994 kamen sechs Tiere als Nachkommen des Originalfoundertieres mit der Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu (DORIN et al., 1992 a) aus Edinburgh nach Hannover.
Diese befanden sich damals in der F4-Generation, so daß die Tiere noch einen stark segregierenden Hintergrund, bestehend aus Anteilen von 129/Sv (Ursprung der embryonalen Stammzellen), C57BL/6J (Blastozysten, in die die ES-Zellen injiziert wurden) und MF1 (siehe unten), hatten.
Ausgehend von diesen Tieren aus Edinburgh wurden im Zentralen Tierlaboratorium mehrere Linien etabliert und durch Inzuchtverpaarungen u.a. die Stämme CF/1 und CF/3 geschaffen. Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten Mäuse waren mehr als 20 Generationen ingezüchtet.
Im Jahr 2000 untersuchte die Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Tümmler, Klinische Forschergruppe, Abt. Pädiatrische Pneumologie und Neonatologie der MHH Hannover, die beiden Stämme bezüglich der Cftr-mRNA Expression. Dabei stellte sich heraus, daß die Tiere des CF/1-Stammes noch 10% der normalen Wildtyp Cftr-mRNA exprimierten, während die Tiere des CF/3-Stammes unter 1% der Wildtyp Cftr-mRNA exprimierten. Allerdings zeigten beide Stämme den gleichen Phänotyp, was darauf hindeutet, daß der Chloridtransport bei beiden Stämmen auf unterschiedliche Weise reguliert wird (CHARIZOPOULOU et al., 2001). Die Etablierung einer F1-Generation sollte zeigen, welche Symptome diese Tiere entwickeln und wie hoch die Wildtyp Cftr-mRNA Expression ist. Zusätzlich sollten auch diese Tiere durch die vorliegende Arbeit phänotypisch weiter charakterisiert werden.
2.1.5 HsdOla:MF1
Der als lebhaft geltende Stamm zeichnet sich durch eine gute Reproduktionsfähigkeit aus. Die Tiere sind gutmütig und leicht zu handhaben.
Ursprünglich wurde der Auszuchtstamm vor 1970 bei Olac aus einer Kreuzung zwischen LACA-Mäusen (ehemals CFW) aus dem Laboratory Animal Centre, Carshalton und CS1-Mäusen der Scientific Products Farm, Manston aufgebaut und seit 1970 als geschlossene Kolonie gehalten. 1992 kamen die Tiere zu Harlan Sprague Dawley, Inc. (persönliche Kommunikation R. Schröder, Harlan). Die Tiere wurden vom ZTL von der Firma Harlan Olac LTD, England bezogen. Generell besteht die Bezeichnung eines Auszuchtstammes aus der Angabe des Haltersymbols, in diesem Fall HsdOla, und der Stammbezeichnung, hier MF1, die durch einen Doppelpunkt getrennt werden.
Bei der Etablierung des Stammes mit der Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu 1992 in Edinburgh wurde der MF1-Stamm in der Anfangsphase mehrmals eingekreuzt, um die Zuchtleistung der CF-Tiere zu steigern. Untersuchungen mit Mikrosatelliten-Markern zu Beginn der Etablierung der CF/1- und CF/3-Stämme an der MHH zeigten einen hohen Anteil von MF1 im Genom. Daher wird er auch als Kontrollstamm für die CF/1- und CF/3-Tiere eingesetzt.
2.1.6 Haltung und Fütterung
Die C57BL/6J-, DBA/2J-, BALB/cJ- und die HsdOla:MF1-Mäuse wurden unter SPF-Bedingungen in Typ II Polycarbonatkäfigen, die CF/1-, CF/3- und F1-Tiere im Isolator unter SPF-Bedingungen und die C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu-, DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu- und BALB/c-CftrTgH(neoim)1Hgu-Tiere in individuell ventilierten Polycarbonatkäfigen (Individually ventilated cages, IVC-Regale; Fa. BioZone, England) des Typs 22 im Zentralen Tierlaboratorium der MHH auf Weichholzgranulat gehalten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Die Gruppengröße betrug in den Käfigen 2-5 Tiere. Die Haltung in klimatisierten Räumen erfolgte bei einer Raumtemperatur von 20°C ± 2°C und einer Luftfeuchtigkeit von 55% ± 5%. Die Beleuchtung erfolgte ausschließlich über Kunstlicht in der Zeit von 6.00 Uhr bis 18.00 Uhr MEZ. Die Tierräume wurden grundsätzlich mit Schutzkleidung, bestehend aus Kittel, Überschuhen, Haube, Mundschutz und Handschuhen, betreten. Die SPF-Haltung wurde nur nach vorherigem Duschen und mit entsprechender Schutzkleidung betreten. Allen Mäusen stand eine gleichbleibende definierte Standard-Nager-Diät als pelletiertes Alleinfutter ad libitum zur Verfügung. Die Mäuse der SPF-Haltung erhielten autoklaviertes ssniff R-Z Futter (ssniff Spezialdiäten GmbH, Deutschland), allen anderen Tiere Altromin 1314 (Altromin Gesellschaft für Tierernährung mbH, Deutschland). Die Zusammensetzung des Futters, konform mit den Empfehlungen der GV-Solas (Gesellschaft für Versuchstierkunde), ist in Tabelle 2.1.6.1 aufgeführt. Je nach Haltungssystem wurde das Wasser entweder gefiltert oder autoklaviert (Isolator) ad libitum zur Verfügung gestellt.
Tabelle 2.1.6.1: Chemische Zusammensetzung des eingesetzten Futters ssniff R-Z und Altromin 1314:
Nährstoffe %-Anteil in ssniff R-Z %-Anteil in Altromin 1314
Rohprotein 21,00 22,5 Rohfett 3,80 5,0 Rohfaser 4,40 4,5
Rohasche 6,7 6,5
Wasser 13,5
N-freie Extrakte 48,0
Mineralien %-Anteil in der Diät %-Anteil in der Diät Calcium 1,00 0,9 Phosphor 0,70 0,7
Magnesium 0,20 0,2
Natrium 0,25 0,2
Kalium 0,90 1,0
Aminosäuren %-Anteil in der Diät %-Anteil in der Diät
Lysin 1,20 1,20
Methionin 0,40 0,40
Cystin 0,30 0,30
Phenylalanin 1,00 1,00
Tyrosin 0,70 0,70
Arginin 1,40 1,40
Histidin 0,60 0,50
Tryptophan 0,30 0,20
Threonin 0,80 0,80 Isoleucin 0,80 1,00
Leucin 1,50 1,80
Valin 1,00 1,10
Spurenelemente mg/kg ppm
Mangan 90 45
Eisen 220 160
Kupfer 12 13
Zink 75 60
Iod 2 1
Fluor 15 Vitaminzusatz in 1kg Diät
Vitamin A 25.000 I.E.٭ 15.000 I.E.
Vitamin D3 1.000 I.E.٭ 600 I.E.
Vitamin E 120 mg٭ 75 mg
Vitamin K3 5 mg 3 mg
Vitamin B1 10 mg 18 mg
Vitamin B2 20 mg 12 mg
Vitamin B6 12 mg 9 mg
Vitamin B12 80 µg 24 µg
Niacin 36 mg
Pantothensäure 30 mg 21 mg
Biotin 400 mg 60 µg
Folsäure 4 mg 2 mg
Cholin 1600 mg 600 mg
Ascorbinsäure 36 mg
Umsetzbare Energie 12,8 MJ/kg 12,5 MJ/kg
Pelletgröße jeweils 10 mm
Die Vitaminangaben des Futters ssniff R-Z sind garantierte Mindestangaben, auch nach dem Autoklavieren des Futters.
2.1.7 Gesundheitsüberwachung
Die mikrobiologische Überwachung wurde entsprechend den Empfehlungen der FELASA (NICKLAS et al., 2002) am Zentralen Tierlaboratorium der MHH im Rahmen von vierteljährlichen Routineuntersuchungen durchgeführt. Alle eingesetzten Mausstämme aus dem SPF-Haltungsbereich waren, ebenso wie die Tiere aus den IVC-Regalen, frei von bakteriellen, viralen und parasitären Erregern gemäß der Empfehlungsliste der FELASA, mit Ausnahme von Helicobacter bilis, der bei den MF1-Tieren, den CF/1- und CF/3-Tieren, deren F1-Generation sowie den B6-CftrTgH(neoim)1Hgu
-Tieren nachgewiesen wurde.
2.1.8 Genetische Überwachung
Die Inzuchtstämme, C57BL/6J, BALB/cJ und DBA/2J, wurden regelmäßig einmal im Jahr hinsichtlich ihrer genetischen Authentizität überprüft, während der MF1-Stamm als Auszuchtstamm mit genetischer Variabilität nicht überprüft wurde.
Jedes Tier der congenen Stämme, C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu, BALB/cJ-CftrTgH(neoim)1Hgu und DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu, wurde während der Etablierung der Stämme auf das Vorhandensein der Mutation CftrTgH(neoim)1Hgu durch Frau Charizopoulou im Labor der Klinischen Forschergruppe, Abt. Pädiatrische Pneumologie und Neonatologie der MHH Hannover, überprüft. Mittels Southern Blot Analyse wurde aus der Milz der entsprechenden Tiere DNA gewonnen und wie bei DORIN et al. (1992 b) beschrieben untersucht. Aus labortechnischen Gründen wurde die Methode geändert und die Homozygotie im Cftr-Gen der Tiere durch intragenische Genotypisierung mittels Mikrosatellitenmarker festgestellt (CHARIZOPOULOU et al., 2004). Dies wurde bis zur 10. Rückkreuzungsgeneration durchgeführt.
Gleiche Untersuchungen wurden mit den CF/1- und CF/3-Tieren durchgeführt. Diese Tiere sind mittlerweile weit über 20 Generationen ingezüchtet und werden von daher jetzt als Inzuchtstamm behandelt und dementsprechend überwacht.
Bei den DBA/2J-CftrTgH(neoim)1Hgu-Tieren wurde jedes Tier auf Homozygotie im Cftr-Gen überprüft, da mit für die Mutation heterozygoten Weibchen gezüchtet werden mußte.
2.1.9 Tierdaten
Die Daten der in den verschiedenen Versuchen verwendeten Tiere sind in den folgenden Tabellen dargestellt. Im Intestinum variiert die Wildtyp-Cftr-mRNA Expression bei den CftrTgH(neoim)1Hgu-Mäusen zwischen 2 und 74%, wobei der Durchschnittswert bei 21% liegt. Die absoluten Werte der Wildtyp- Cftr-mRNA der CftrTgH(neoim)1Hgu-Mäuse variieren mit dem Alter (LARBIG et al., 2002), wobei die Werte bis zum Alter von sechs Monaten relativ konstant bleiben.
Tabelle 2.1.9.1: Tierdaten der Tiere für Protokoll 1:
Geschlecht
Gruppe Stamm Anzahl
♂ ♀
11 (CF/3xCF/1)F1 11 8 3 75±4 31,45±3,16
*
Das Gewicht der C57BL/6J-CftrTgH(neoim)1Hgu-Tiere konnte aus institutsinternen Gründen nicht per Waage bestimmt werden. Ihr geschätztes Gewicht lag im oberen Drittel bezogen auf das Gewicht der anderen Tiere.Tabelle 2.1.9.2: Tierdaten der Tiere für Protokoll 2:
Geschlecht
Gruppe Stamm Anzahl
♂ ♀
Tabelle 2.1.9.3: Tierdaten der Tiere für Protokoll 3:
Geschlecht
Gruppe Stamm Anzahl
♂ ♀
2.2 Anatomie und Histologie
Die Gesamtlänge des Dickdarms (Colon und Rectum) beträgt bei erwachsenen Mäusen circa 14 cm. Das Colon besteht aus einem ascendierenden (im Folgenden proximales Colon genannt), einem transversen und einem descendierenden Teil, der ohne klare Trennung in das Rectum übergeht.
Charakteristisch für das proximale Colon sind prominente transverse Falten, die sich bei mesenterialer Eröffnung des proximalen Colons V-förmig darstellen. Sie
verstreichen im transversen Teil des Colons und werden zu Längsfalten im Colon descendens.
Das proximale Colon zeigt eine wenig entwickelte Muscularis mucosae, eine dünne Tela submucosa und Tunica muscularis, während im absteigenden Colon die Tela submucosa und Tunica muscularis stärker ausgeprägt sind.
Das Epithel des Colons besteht aus einer Zellschicht, die aus drei verschiedenen Zelltypen zusammengesetzt ist: Absorptive Zellen, Gobletzellen (Becherzellen) und Enteroendokrine Zellen (argentaffine Zellen) (SHACKELFORD und ELWELL, 1999).
2.3 Präparation der Schleimhäute
Alle Mäuse wurden einzeln mit CO2 im ZTL der Medizinischen Hochschule Hannover betäubt und getötet, ausgenommen hiervon waren die B6- und die B6-Cftr Gruppen, die auf Grund einer temporären hygienischen Maßnahmen im ZTL durch cervikale Dislokation getötet wurden.
Direkt im Anschluß an die Tötung und das Wiegen (Waage: Universal U3600P, Sartorius AG, Göttingen) eines Tieres erfolgte die circa zwei Minuten dauernde Entnahme des proximalen Colons. Dazu wurde die Bauchhöhle median eröffnet und das proximale Colon wurde großzügig nach Abtrennung vom Mesenterium entnommen. Das Colon wurde am Mesenteriumansatz mittels Knopfschere längs aufgetrennt und in eisgekühlter, mit Carbogen (95% O2 / 5% CO2) begaster, Krebs-Henseleit-Lösung (siehe Tab. 2.6.1.1.1) gereinigt und transportiert. Pro Versuchstag wurden nacheinander Darmabschnitte von 3-4 Tieren gewonnen. Für den circa 15-20 minütigen Transport in eisgekühlter Lösung zum Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurden die Därme einzeln in durchnumerierte Gläser verbracht, so daß die Zuordnung des Colons zum Tier die ganze Zeit gewährleistet war.
Im Labor des Physiologischen Instituts wurden die Tunica serosa und Tunica muscularis von der Tunica mucosa unter ständiger Befeuchtung mit eiskalter
Krebs-Henseleit-Lösung abgetrennt. Dies wird als „strippen“ bezeichnet. Diese Art der Technik wurde von FRIZZELL et al. (1976) als partial mucosal strip beschrieben.
Dazu wurde das äußerste proximale Ende des Colons auf einem Strippbrett (Eigenbau des Physiologischen Instituts), einer PVC-Platte mit einer engen Reihe Präpariernadeln, festgesteckt. Auf das distale Ende des proximalen Colons wurde ein Objektträger aufgesetzt. Tunica serosa und muscularis wurden mit Hilfe eines Skalpells eingeritzt und mit feinen gewinkelten Pinzetten von der Tunica mucosa abgezogen.
Aus dem proximalen Colon einer Maus konnten zum großen Teil zwei Mucosastücke, ein proximales und ein distales Stück, gewonnen werden. Diese wurden unverzüglich in die Ussing-Kammern eingespannt. Während der weiteren Darstellung wird anstelle von Mucosa der Begriff Epithel verwendet, wie dies in der transportphysiologischen Literatur üblich ist.
2.4 Versuchsaufbau
Die Versuche wurden mit acht Ussing-Kammern (Eigenbau des Physiologischen Instituts), die an ein Gasliftsystem angeschlossen waren, durchgeführt. Über Agarbrücken und Ag/AgCl-Bezugselektroden (Mettler Toledo Prozessanalytik GmbH, Deutschland) waren die Kammern mit zwei mikrocomputergesteuerten Voltage/Current Clamps (Wissenschaftliche Geräte, Dipl.-Ing. K. Mußler, Aachen;
www.Kmsci.de) verbunden. Diese Inkubationstechnik geht im Prinzip auf die von USSING 1949 entwickelten Kammern zurück und ist eine Methode um den Transport von Ionen durch biologische Membranen zu erfassen.
Eine Ussing-Kammer bestand aus zwei Plexiglashälften, wobei auf der einen Kammerhälfte sechs Präpariernadeln kreisförmig um die 0,5 cm2 große Kammeröffnung angeordnet waren.
Auf die Kontaktfläche um die Kammeröffnungen beider Hälften herum wurde eine dünne Schicht Silikon (Baysilone-Paste, mittelviskös, BayerAG, Leverkusen) zur
Abdichtung und zur Vermeidung von Randdruckstellen (edge damage) am Epithel aufgetragen.
Direkt nach dem Strippen wurde das Epithel mit der serosalen Seite nach unten auf die sechs Präpariernadeln aufgespannt und die Kammer zusammengesetzt, so daß die linke Kammerhälfte die serosale (im Tier zum Blut gerichtete) Seite und die rechte Kammerhälfte die mucosale (im Tier zum Lumen gerichtete) Seite repräsentierte. Die jeweilige Ussing-Kammer wurde umgehend in die Versuchsapparatur eingesetzt, durch Schrauben fixiert und mit den Vorratsgefäßen, die beidseitig 10 ml Krebs-Henseleit-Lösung enthielten, verbunden (Abbildung 2.4.1).
Ein Vorratsgefäß bestand aus zwei doppelwandigen Glassäulen mit zwei Füssigkeitskreisläufen. Der äußere Kreislauf enthielt Aqua destillata, das über ein Wasserbad auf 38°C erwärmt und umgewälzt wurde, und diente als Wärmequelle für den inneren Kreislauf, der auf einer Temperatur von 37°C gehalten wurde. Der innere Kreislauf enthielt die Versuchslösung und wurde kontinuierlich mit Carbogen begast. Durch die Begasung wurde die Inkubationslösung umgewälzt, die Sauerstoffversorgung des Gewebes und ein konstanter pH-Wert der Lösung gewährleistet.
mucosales Kompartiment
serosales Kompartiment
Begasung und Zirkulation in beiden
Kompartimenten
computergesteuerte Clamp
Epithel
µEq mV
Abbildung 2.4.1: Schematische Darstellung der Versuchsapparatur
2.5 Elektrophysiologische Messungen
Vor dem eigentlichen Versuchsbeginn wurde eine Eichperiode vorgeschaltet, in der die Kammern die im Versuch eingesetzte Elektrolytlösung enthielten, aber noch kein Epithel. In dieser Phase wurden der Lösungswiderstand und die Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden ermittelt.
Für die elektrischen Messungen wurden die Ussing-Kammern mit eingespanntem Epithel mit der Clamp verbunden. Als elektrische Parameter für den Ionentransport des Colonepithels wurden der Kurzschlußstrom (Isc) und die Gewebeleitfähigkeit (Gt) protokolliert.
2.5.1 Open Circuit-Verfahren
Vor Beginn der eigentlichen Messungen wurden die Daten der Kammern im „Open Circuit“-Verfahren erfaßt. Dabei wurde die Potentialdifferenz, die spontan durch Ionentransport über dem Epithel aufgebaut wurde, direkt erfaßt. Die Potentialdifferenz wurde über gewebenahe Krebs-Henseleit-Agarbrücken, die mit den Silber-/ Silberchlorid-Bezugselektroden verbunden waren, gemessen.
Dies ist in Abbildung 2.5.2.1 a) dargestellt.
Durch den Computer erfolgte eine automatische Korrektur der gemessenen Potentialdifferenz um den in der Eichperiode ermittelten Wert.
2.5.2 Short Circuit-Verfahren
Die eigentlichen Messungen wurden mit dem „Short Circuit“-Verfahren durchgeführt.
Bei dieser Methode wurde über ein zweites Paar gewebeferne Silber-/
Silberchloridelektroden, die ebenfalls über Agarbrücken mit den Kammern verbunden waren, ein Strom appliziert. Diese Agarbrücken besaßen einen großen Durchmesser, wodurch zusammen mit der Entfernung eine gleichmäßige Stromapplikation über die gesamte Gewebefläche gewährleistet war.
Durch diesen von außen applizierten Strom wurde die Potentialdifferenz auf 0 mV gegengeregelt, „geklemmt“. (siehe Abbildung 2.5.2.1 b)) Die elektrogenen Ionenbewegungen, und somit der elektrische Gradient über dem Epithel, wurden durch diesen Strom kompensiert. Damit ist dieser Strom betragsmäßig der Summe aller aktiv und elektrogen transportierten Ionen gleichzusetzen. Der Isc erhält definitionsgemäß ein positives Vorzeichen, wenn ein positiver Ionenstrom von der mucosalen zur serosalen Seite des Epithels fließt. Dies entspricht einer Kationenresorption und / oder einer Anionensekretion.
Da sich auf beiden Seiten des Epithels die gleiche Pufferlösung sowie die gleichen Volumina befanden, bestand über dem Epithel kein chemischer und kein hydrostatischer Gradient. Wurde unter diesen Bedingungen ein von Null
verschiedener Nettotransport eines Ions über das Epithel gemessen, so konnte auf einen aktiven Transport dieses Ions geschlossen werden.
Der Isc wurde in Ionenäquivalent als Ladungstransfer pro Zeit und Gewebefläche Isc(µEq·h-1·cm-2) angegeben; dabei entspricht 1µEq·h-1 für einwertige Ionen 26,8 µA.
Um die Gt zu bestimmen, wurde unter Kurzschlußstrombedingungen alle 6 Sekunden ein bipolarer Stromimpuls von 100 µA über eine Dauer von 200 ms über das Epithel appliziert. Dies führte zu kurzfristigen Potentialänderungen (∆Pd). Die Leitfähigkeit ergab sich dann aus
Pd Gt I
∆
= ∆ .
Der Isc sowie die Gt wurden kontinuierlich mit Hilfe eines Computers aufgezeichnet.
Abbildung 2.5.2.1 a) und b): Durch aktive elektrogene Transportleistungen des Epithels entsteht eine Potentialdifferenz zwischen mucosaler und serosaler Seite, die als treibende Kraft für weitere passive Ionenbewegungen wirkt. Sie wird durch die Applikation eines externen Stroms aufgehoben.
a) Open Circuit: b) Short Circuit:
+ 4 mV
Cl -serosal mucosal
+ 0 mV
Cl -serosal mucosalI
2.6 Pharmaka und Protokoll
2.6.1 Lösung und Pharmaka
2.6.1.1 Krebs-Henseleit-Lösung
In den Versuchen wurde auf beiden Seiten des Epithels eine Krebs-Henseleit-Lösung mit folgender Zusammensetzung verwendet:
Tabelle 2.6.1.1.1: Zusammensetzung der Krebs-Henseleit-Lösung:
mmol/l A. dest. g/l A. dest.
NaCl 113,6 6,6388
KCl 5,4 0,4026
CaCl2·2H2O 1,2 0,1764
MgCl2·6H2O 1,2 0,2440
HCl (1n) 0,2 0,2 ml
NaH2PO4·H2O 0,6 0,0828
Na2HPO4·2H2O 2,4 0,4272
NaHCO3 21,0 1,7642
Glucose (wasserfrei) 10,0 1,802
Mannit 19,7 3,6
Die mit Carbogen begaste Lösung hatte einen pH-Wert von 7,4 bei einer Temperatur von 37°C und Begasung mit Carbogen. Die Osmolalität lag bei 300 mosm/l.
Zur Herstellung der Agarbrücken wurde Krebs-Henseleit-Lösung ohne Zusatz von Glucose und Mannit mit 270 mosm/l verwendet.
Die Chemikalien für die Krebs-Henseleit-Lösung wurden von der Fa. E. Merck, Darmstadt bezogen.
2.6.1.2 Pharmaka
Um eine Bildung von Prostaglandinen im Gewebe zu unterbinden, wurde der Krebs-Henseleit-Lösung der Zyklooxygenasehemmer Indomethacin in einer Konzentration von 10-5 mol/l zugesetzt.
Amilorid (Amiloride Hydrochloride), Tetraethylammonium (TEA), Barium (Bariumchlorid-Dihydrat) sowie Carbachol wurden als Stammlösungen in Aqua dest.
gelöst. Von Forskolin, DIDS (4,4´-Diisothiocyanostilbene-2,2´-disulfonsäure) und NPPB (5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoat) wurde eine Stammlösung in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) hergestellt. Es konnte kein Einfluß von DMSO in den verwendeten Konzentrationen auf die Versuche festgestellt werden. Von diesen Stammlösungen erfolgten die Zugaben in die Vorratsgefäße. Bis auf das Barium, das von der Fa. E. Merck, Darmstadt bezogen wurde, wurden alle anderen Zugaben sowie das DMSO von der Fa. Sigma Chemical Co., St. Louis, USA bezogen.
2.6.2 Vorversuche und Protokolle
Die Protokolle für das proximale Colon der Maus wurden in Anlehnung an ein Protokoll für humanes Rectumgewebe (BRONSVELD et al., 2000), auch Rotterdam protocol for ICM (BRONSVELD et al., 2003) genannt, entworfen. Ziel des humanen Protokolls war es, die Diagnose CF stellen zu können. In den abgewandelten Protokollen für das proximale Colon der Maus sollte dagegen die Höhe der Chloridsekretion gemessen werden.
Um zu überprüfen, ob der Transportstreß Einfluß auf die Tiere oder die Überlebensdauer der Epithelien während des Versuchs hatte und um die besten Versuchsbedingungen zu evaluieren, wurden drei Vorversuche durchgeführt, in denen das Protokoll 1 zur Anwendung kam.
2.6.2.1 Vorversuche
Die drei Vorversuche wurden unterteilt in d0 (d0I und d0II), d3 und d7 und mit jeweils 4 Tieren des Stammes BALB/c durchgeführt.
Bei dem Vorversuch d0 wurden die Tiere im ZTL der MHH, wie oben beschrieben, getötet und die Colonepithelien in eisgekühlter Krebs-Henseleit-Lösung zum Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule transportiert.
Für die Vorversuche d3 und d7 wurden Tiere aus dem ZTL der MHH in die Tierhaltung des Physiologischen Instituts bei gleichem Futter verbracht und dort 3 bzw. 7 Tage gehalten. Direkt vor Versuchsbeginn wurden die Tiere ebenfalls mit CO2
betäubt und getötet. Die Präparation der Epithelien erfolgte jeweils wie oben beschrieben.
2.6.2.2 Protokoll 1
Das Protokoll, das im ersten Teil der Untersuchungen angewendet wurde, gestaltete
Das Protokoll, das im ersten Teil der Untersuchungen angewendet wurde, gestaltete