Anionensekretion im Dünndarm von NKCC1 und CFTR Knockout-Mäusen und ihren gesunden Geschwistern

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Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Tübingen

Anionensekretion im Dünndarm von NKCC1 und CFTR Knockout-Mäusen und ihren gesunden Geschwistern

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Cornelia Weinhold

aus Stuttgart

Hannover 2005

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Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. B. Schröder

Prof. Dr. U. Seidler

1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher

Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2005

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Für meinen Vater

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 13

2 Literaturübersicht 14 2.1 Bedeutung der intestinalen Anionensekretion 14 2.2 Regulation der intestinalen Anionensekretion 15 2.2.1 Der epitheliale Ionentransport 15 2.2.2 Räumliche und funktionelle Trennung der Transportcharakteristika 16 2.2.3 Der Chloridsekretionsmechanismus 17

2.3 Die NKCC-Kotransporter 19

2.3.1 Eigenschaften der NKCC1- und NKCC2-Kotransporter 19 2.3.2 Funktionen der NKCC-Kotransporter 20 2.3.3 Molekularer Aufbau von NKCC1 und NKCC2 20 2.3.4 Regulation von NKCC1 22

2.4 Das CFTR-Protein 24

2.4.1 Zystische Fibrose 24

2.4.2 Funktion von CFTR 25

2.4.3 Molekularer Aufbau und Eigenschaften des CFTR-Proteins 26

2.4.4 Regulation von CFTR 28

2.4.5 Interaktion von CFTR mit anderen Ionen-Kanälen 29 2.5 Weitere für die Chlorid- und Bikarbonatsekretion wichtige

Transportproteine 31

2.5.1 Der Cl^-/HCO3-

-Austauscher 31 2.5.2 Der Na⁺/HCO3-

-Kotransporter 32

2.6 Das Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mäusen 32 2.6.1 Die NKCC und CFTR Knockout-Maus 32 2.6.2 Vergleich Phänotyp NKCC1 mit CFTR Knockout-Maus 33

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Inhaltsverzeichnis

3 Material und Methoden 35

3.1 Material 35

3.1.1 Chemikalien und Abkürzungen 35

3.1.2 Verwendete Geräte 37

3.1.3 Versuchstiere 37

3.2 Methoden 38

3.2.1 Genotypisierung der NKCC1 Knockout-Mäuse 38 3.2.2 Präparation des Jejunums 39 3.2.3 Das Kurzschlussstromexperiment 41

3.2.4 pH-stat-Titration 42

3.2.5 Aufbau des Ussingkammer-Setups 44 3.2.6 Transepitheliale Fluxmessungen 45 3.2.7 Verwendete Reagenzien 45

3.2.8 Versuchsschemata 47

3.2.8.1 Allgemeines Vorgehen 47 3.2.8.2 Hemmung einzelner Ionentransportmechanismen 48 3.2.8.2.1 Blockade des Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransports (NKCC) durch Bumetanid 48 3.2.8.2.2 Blockade des Na⁺/HCO3-

-Kotransports durch S0859 48 3.2.8.2.3 Hemmung der Karboanhydrase durch Azetazolamid 49 3.2.8.2.4 Blockade des Cl^-/HCO3-

-Austausches und des Na⁺/HCO3-

-

Kotransports durch SITS 49 3.2.8.2.5 Hemmung der Na⁺/K⁺-ATPase 50 3.2.8.3 Messung und Berechnung der radioaktiven H-Mannit- und Chlorid-

Fluxe 50

3.2.8.4 Berechnungsgrundlagen bei den verschiedenen Versuchsansätzen 52 3.2.9 Auswertung und Statistik 53

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Inhaltsverzeichnis

4 Ergebnisse 54 4.1 Aufzucht der NKCC1 und CFTR Knockout-Mäuse 54 4.2 Messungen des Kurzschlussstroms, des Gewebewiderstandes, der

Bikarbonatsekretion und der Potentialdifferenz 54 4.2.1 Verlauf des Kurzschlussstroms (Isc), des Gewebewiderstandes

(Resistance), der Bikarbonatsekretion (HCO3-

) und der Potential- differenz (PDt) nach Stimulation mit Forskolin und nachfolgender

Inhibition mit Bumetanid und Ouabain 55 4.2.2 Effekt von serosal appliziertem NBC-Inhibitor S0859 [100 µM] auf

die Stimulation mit Forskolin 62 4.2.3 Auswirkung der bilateralen Anwesenheit von Azetazolamid [1 mM]

auf die Stimulation mit Forskolin 68 4.2.4 Effekt von serosal appliziertem NBC-Inhibitor S0859 [100 µM] in

bilateraler Anwesenheit von Azetazolamid [1 mM] auf die Stimulation

mit Forskolin 74

4.2.5 Auswirkung der serosalen Anwesenheit von SITS [1 mM] auf die

Stimulation mit Forskolin 80 4.3 Radioaktive Fluxmessungen 86 4.3.1 Unidirektionale Cl^--Fluxe bei NKCC1 Knockout-Mäusen und ihren

gesunden Geschwistern 86

4.3.1.1 Unidirektionale Cl^--Fluxe: Stimulation mit Forskolin 86 4.3.1.2 Unidirektionale Cl^--Fluxe: Effekt von bilateral appliziertem

Azetazolamid und gleichzeitig serosal appliziertem NBC-Inhibitor

S0859 auf die Stimulation mit Forskolin 88 4.3.2 Bidirektionale Mannit-Fluxe bei CFTR Knockout-Mäusen und ihren

gesunden Geschwistern 91

4.3.2.1 Bidirektionale Mannit-Fluxe ohne Stimulation 91 4.3.2.2 Bidirektionale Mannit-Fluxe mit db-cAMP-Stimulation 93

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Inhaltsverzeichnis

4.3.3 Bidirektionale Cl^--Fluxe bei CFTR Knockout-Mäusen und ihren

gesunden Geschwistern vor und nach Stimulation mit db-cAMP 98

5 Diskussion 102 5.1 Ursachen der festgestellten Veränderungen bei den NKCC1 Knockout-

Mäusen 102

5.2 Durchgeführte Versuche Teil 1 102

5.2.1 Kontrollversuch 102

5.2.2 Alternative Mechanismen des basolateralen Chlorid-Imports und

verschiedene Wege der Bikarbonatbereitstellung 104 5.2.2.1 Inhibition des basolateralen Na⁺/HCO3-

-Kotransporters durch S0859 105 5.2.2.2 Hemmung der intrazellulären Karboanhydrase durch Azetazolamid 107 5.2.2.3 Gleichzeitige Hemmung des Na⁺/HCO3-

-Kotransporters durch S0859

und der intrazellulären Karboanhydrase durch Azetazolamid 109 5.2.2.4 Gleichzeitige Hemmung des Cl^-/HCO3-

-Austauschers und des Na⁺/HCO3-

-Kotransporters durch SITS 113 5.2.3 Existenz von weiteren, noch unbekannten basolateralen Anionen-

importmechanismen 114

5.3 Durchgeführte Versuche Teil 2 116 5.3.1 Fluxstudien für Chlorid bei NKCC1 (-/-) und (+/+) Mäusen unter

Kontrollbedingungen und in Anwesenheit von Azetazolamid und

NBC-Inhibitor S0859 116

5.3.2 Fluxstudien für Mannitol und Chlorid bei CFTR (-/-) und (+/+) Mäusen 119

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Inhaltsverzeichnis

6 Zusammenfassung 122

7 Summary 124

8 Literaturverzeichnis 126

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Abkürzungsverzeichnis

ABC ATP-Binding Cassette

AE Cl^-/HCO₃^--Austauscher (anion exchanger) Aqua bidest. Aqua bidestillata

ATP Adenosintriphosphat Br^- Bromidion

Ca²⁺ Calciumion

cAMP zyklisches Adenosin-3,-5´-monophosphat CA Karboanhydrase

CCC Kationen/Chlorid-Kotransporter

CIP Kationen/Chlorid-Kotransporter^_interacting protein CF Zystische Fibrose

CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator [Cl]i intrazelluläre Chloridkonzentration

Db-cAMP Dibutyryl-cAMP

DIDS 4,4`-Diisothiocyanostilben-2`,2`-Disulfonsäure DMSO Dimethylsulfoxid

DRA down regulated in adenoma ENaC epithelialer Natriumkanal E. coli Escherichia coli

F^- Fluoridion

G Gewebeleitfähigkeit = transepitheliale Leitfähigkeit [mS x cm^-2]

h Stunden

H⁺ Proton

HCO₃^- Bikarbonation I^- Iodidion

Isc Kurzschlussstrom [µmol x cm^-2 x h^-1] J_ms Flux von mukosal nach serosal

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Jsm Flux von serosal nach mukosal K⁺ Kaliumion

KCC K⁺/Cl^--Kotransporter kDa Kilodalton

Kir1.1/ROMK renaler sekretorischer K⁺-Kanal aus der Familie der „renal outer medullary potassium channels“

MDR multi drug resistance Mg²⁺ Magnesiumion min Minuten mM Millimolar µM Mikromolar

n Anzahl der Epithelien Na⁺ Natriumion

NaPyruvat Natrium-Pyruvat

NBD Nukleotid-bindende Domäne NBC Na⁺/HCO₃^--Kotransporter

NCC Na⁺/Cl^--Kotransporter NHE Na⁺/H⁺-Austauscher

NKCC1 Isoform 1 des Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporters NKCC2 Isoform 2 des Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporter ORCC outwardly rectifying chloride channel PDt transepitheliale Potentialdifferenz [mV]

PKA Proteinkinase A PKC Proteinkinase C

PP2A + PP2C Proteinphosphatase 2A und 2C pS Picosiemens

R (Resistance) Gewebewiderstand [Ω x cm^-2]

SGLT1 Natrium-Glukose-Kotransporter 1

SITS 4-Acetamino-4’-Isothiocyanostilben-2,2’-Disulfonat

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STa hitzestabiles Enterotoxin von E. coli tight junctions (TJs) zelluläre Schlussleisten

VIP vasoaktives intestinales Peptid

xAQP3 Aquaporin 3 in Oozyten von Xenopus laevis

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Einleitung 13

1 Einleitung

Die Isoform 1 des Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporters (NKCC1) wird seit vielen Jahren als der wesentliche Cl^--Aufnahmemechanismus im Darm angesehen. Cl^- stellt - neben HCO₃^- - den wichtigsten Bestandteil bei der intestinalen Anionensekretion dar und wird von der Darme- pithelzelle an der basolateralen Membran über den Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransport aus dem Blut aufgenommen.

Interessanterweise zeigen NKCC1 Knockout-Mäuse trotz dieser Tatsache eine erhebliche A- nionenrestsekretion. Diese Beobachtung führt zur Annahme, dass weitere, alternative Mög- lichkeiten der Cl^--Aufnahme existieren. In diesem Zusammenhang sollte in der vorliegenden Arbeit herausgefunden werden, welche am basolateralen Zellpol befindlichen alternativen Transportmechanismen im Jejunum der NKCC1 Knockout-Mäuse zur Verfügung stehen, um eine für die cAMP-stimulierte Anionensekretion ausreichende Chloridversorgung des Entero- zyten zu gewährleisten. Zudem war von Interesse, in welcher Beziehung sie zueinander stehen.

Eine andere mögliche Erklärung für die hohe Anionenrestsekretion im Dünndarm der NKCC1 Knockout-Mäuse ist die Substitution von Cl^- durch eine vermehrte HCO3-

-Sekretion. Daher sollte ermittelt werden, ob und in welchem Maße die Sekretion von Cl^- im Jejunum von NKCC1 Knockout-Mäusen zur cAMP-stimulierten Anionensekretion beiträgt.

Der Hauptteil der intestinalen Cloridsekretion findet über den apikal lokalisierten CFTR- Kanal (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) statt. Mutationen im Bereich des CFTR-Gens führen zum Krankheitsbild der Mukoviszidose. Aus diesem Grund weisen CFTR Knockout-Mäuse, bedingt durch eine mangelhafte Darmsekretion, schwerwiegende intestinale Störungen auf. Da aber trotz dieses Defekts viele der Tiere ein höheres Lebensalter erreichen, könnte ein Kompensationsmechanismus von Bedeutung sein. In diesem Zusammenhang wurde untersucht, ob das Jejunum von CFTR Knockout-Mäusen als Ausgleich für eine defi- ziente transzelluläre Anionensekretion eine erhöhte parazelluläre Permeabilität besitzt.

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Literaturübersicht 14

2 Literaturübersicht

2.1 Bedeutung der intestinalen Anionensekretion

Täglich wird das intestinale Epithel des Menschen mit durchschnittlich 9 l Flüssigkeit kon- frontiert, von denen 2 l mit der Nahrung aufgenommen werden und der Rest von der Darm- schleimhaut selbst und den assoziierten Organen gebildet wird (1). Im Stuhl werden jedoch nur ca. 100 ml Flüssigkeit ausgeschieden (2). Neben dieser enormen Resorptionskapazität hat das intestinale Epithel auch die Fähigkeit zur Sekretion, um ein wässriges Milieu im Darm aufrecht zu erhalten. Dies ist wichtig für die Durchmischung des Darminhalts, das Vordringen der Verdauungsenzyme zu ihren Substraten, die Diffusion der verdauten Nahrungsbestandtei- le zur resorptiven Oberfläche und eine normale Darmpassage (1, 3). Überdies erfüllen die intestinalen Sekretionsvorgänge weitere wichtige Aufgaben. So wird im Duodenum besonders viel Bikarbonat in das Dünndarmlumen abgegeben (4, 5); es dient dort der Neutralisation der Magensäure und leistet einen wesentlichen Beitrag zur Erhaltung des sogenannten Mikrokli- mas der Bürstensaummembran, welches die Schleimhaut des Magendarmtrakts vor der ag- gressiven Zusammensetzung der luminalen Flüssigkeit schützt (6, 7). Beispielweise entwi- ckeln Patienten mit zystischer Fibrose, deren Flüssigkeitssekretion im Darm gestört ist, häufig peptische Geschwüre, intestinale Obstruktionszustände und Malabsorption (8, 19, 10).

Eine weitere wichtige Funktion der intestinalen Sekretion ist die Verteidigung gegen exogene und endogene Noxen im Sinne einer Verdünnungsreaktion bzw. eines .„Wegspüleffekts“ (1, 3, 11). Zu erwähnen sei hierzu als Beispiel einer sekretorischen Diarrhoe die Cholerainfekti- on, bei welcher die Darmmukosa eine Flüssigkeitsproduktion von bis zu 20 l pro Tag zu erreichen vermag (12).

Versuche zeigten, dass auch eine mechanische Reizung der Darmschleimhaut zu einer massi- ven Sekretion führt, was insofern von Bedeutung ist, als dass die Schleimhautoberfläche gleit- fähig wird und somit bei der Nahrungspassage vor physikalischen Schäden geschützt ist (13, 14).

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Obwohl eine Sekretion von Bikarbonat und Kalium entlang des gesamten Darmes stattfindet, ist das die Flüssigkeitssekretion hauptsächlich hervorrufende Elektrolyt das Chlorid. Chlorid- sekretion wird durch die parazelluläre Bewegung von Natrium begleitet und die luminale Ak- kumulation von Natriumchlorid bewirkt die osmotische Basis für Wasserbewegungen (3).

2.2 Regulation der intestinalen Anionensekretion

2.2.1 Der epitheliale Ionentransport

Der Ionentransport im Darm (wie überall sonst im Organismus) kann auf transzellulärem und/oder parazellulärem Weg geschehen. Der transzelluläre Transport erfolgt mit Hilfe spezi- fischer Membrantransporter ins und aus dem Zytoplasma; es müssen die basolaterale (bzw.

apikale) Membran, das Zytoplasma und die apikale (bzw. basolaterale) Membran durchquert werden. Der gerichtete Transport der einzelnen Substanzen wird durch die asymmetrische Verteilung der Ionentransportmechanismen an den beiden Zellpolen ermöglicht (15). Dem- nach besitzt das Darmepithel eine funktionelle Polarität (1), was bedeutet, dass ein spezifi- sches Membrantransportprotein je nach seiner Funktion für die Zelle entweder an der apikalen oder an der basolateralen Membran angeordnet ist (3). Beispiele dafür sind der basolateral befindliche NKCC1-Kotransporter, welcher einer der wichtigsten Cl^--Aufnahmemechanismen des Enterozyten darstellt und der luminal gelegene CFTR-Kanal, welcher den Hauptteil der Chloridsekretion bewerkstelligt. Die beim transzellulären Transport beteiligten Proteine las- sen sich ihrer Funktion nach in verschiedene Gruppen unterteilen: Zum einen in die unmittelbar Energie verbrauchenden ATPasen z.B. Na⁺/K⁺-ATPase, welche die Triebkraft für andere Transportprozesse erzeugen können, in Austauscher z.B. Cl^-/HCO₃^--Austauscher und Kotransporter z.B. Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporter, bei denen in vielen Fällen der elektrochemi- sche Gradient eines Teilchens genutzt wird, um ein anderes zu transportieren, und in Proteine mit Kanalfunktion (CFTR-Kanal) (1).

Parazellulärer Elektrolyttransport erfolgt extrazellulär durch die Schlussleisten, die „tight junctions“. Die durch transzellulären Transport hergestellten elektroosmotischen Gradienten

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stellen die Triebkraft für parazelluläre Transportprozesse (Elektrolyte und Wasser) dar (16), die im Wesentlichen durch die Eigenschaften der Schlussleisten bestimmt werden (17). Somit tragen Dichte und Selektivität des parazellulären Weges maßgeblich zu den allgemeinen Transporteigenschaften des Epithels bei (18).

2.2.2 Räumliche und funktionelle Trennung der Transportcharakteristika

Im Rahmen eines normalen Verdauungsprozesses finden in allen Darmabschnitten gleichzeitig resorptive und sekretorische Ionentransportprozesse statt. Frühere Untersuchungen spra- chen dafür, dass die intestinale Sekretion in den Krypten und die Resorption in den Villus- bzw. Oberflächenzellen des Kolons stattfindet (19). In letzter Zeit mehren sich jedoch die Hinweise, dass auch Villuszellen sezernieren und Kryptenzellen absorbieren können (20, 21).

Unterschiede in den Expressionsniveaus von Transportproteinen für die Resorption und Sek- retion von Nährstoffen und Elektrolyten im Verlauf der Krypten-Villus-Achse im Dünndarm sprechen jedoch dafür, dass eine räumliche Trennung von Transportprozessen einer der Me- chanismen ist, mit denen das Darmepithel seine verschiedenen Funktionen organisiert (22).

So sind das Kanalprotein CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) und das Transportprotein NKCC1 (Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporter Isoform 1), welche eine tragende Rolle bei der Chloridsekretion besitzen, vorwiegend in den Krypten lokalisiert (3). Im Gegen- zug kommt es bei der Aufwärtsmigration der Zellen an den Zotten zu einer Verminderung der Expression dieser Proteine und zu einer vermehrten Expression der für die resorptive Funkti- on wichtigen Transportsysteme, beispielweise des apikalen Natrium-Protonenaustauschers NHE3 (23) und des Natrium-Glukose-Kotransporters SGLT1 (24).

Zusätzlich zur Krypten-Villus-Achse liegen auch funktionelle Unterschiede entlang der duo- deno-kolischen Achse vor. In den proximalen Abschnitten des Dünndarms ist der transepitheliale Widerstand gering und die parazelluläre Permeabilität hoch, große Salz- und Flüssig- keitsmengen werden gegen kleine Gradienten resorbiert, während im Kolon ein „dichtes“ Epi- thel mit hohem Gewebewiderstand vorliegt, das Na⁺ gegen einen starken Gradienten resor-

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biert (1). Das setzt natürlich unterschiedliche Transportmechanismen für die Natriumresorpti- on in den verschiedenen Darmabschnitten voraus. So wird beispielweise im proximalen Dar- mepithel ein wesentlicher Teil des Na⁺ durch Na⁺/Nährstoff-Kotransport (25) aufgenommen, während im distalen Dünndarm (26) und im proximalen Kolon der elektroneutrale Trans- portweg durch parallelen Na⁺/H⁺- und Cl^-/HCO3-

-Austausch überwiegt (27). Im distalen Ko- lon hingegen findet die Na⁺-Aufnahme hauptsächlich durch elektrogene Na⁺-Kanäle statt (28), wobei bei der Bevorzugung von elektrogener oder elektroneutraler Na⁺-Resorption auch der Mineralokortikoidstatus eine Rolle spielt (29). So steht beispielweise der Amilorid- sensitive elektrogene Na⁺-Kanal ENaC unter der Kontrolle von Aldosteron, welches eine Steigerung der Kanalaktivität auslösen kann (30).

2.2.3 Der Chloridsekretionsmechanismus

Um eine für die Anionensekretion benötigte Cl^--Versorgung des Enterozyten zu gewährleis- ten, besteht ein koordiniertes Zusammenspiel zwischen dem basolateral lokalisierten NKCC1- Kotransporter und anderen transmembranären Transportsystemen. Auf der Basis zahlreicher Studien konnte der Cl^--Sekretionsmechanismus im Magen-Darmtrakt mittlerweile genau charakterisiert werden (31). Die Sekretion von Chloridionen wird physiologischerweise durch neurohormonale Signale wie z.B. vasoaktives intestinales Peptid (VIP) aktiviert, dabei dienen zyklische Nukleotide wie cAMP als Second messenger (3, 11, 32). Chlorid wird über die basolaterale Membran auf elektroneutralem Weg (gleichzeitiger Import von 1 Na⁺:1 K⁺:2 Cl^-) via NKCC1 in die Zelle aufgenommen und kann sich dort akkumulieren. Der zelleinwärts gerichtete Ionentransport wird dabei hauptsächlich durch den niedrigen zytosolischen Na⁺- Gehalt bewirkt, der durch die Aktivität der ebenfalls basolateral gelegenen Na⁺/K⁺-ATPase aufrecht erhalten wird. NKCC1 führt also einen an die Na⁺/K⁺-ATPase gekoppelten sekundär aktiven Transport aus. Kalium, welches gleichzeitig mit Natrium und Chlorid über den Kotransporter in die Zelle gelangt, wird durch basolateral vorhandene K⁺-Kanäle recycled.

Dadurch entsteht eine starke Triebkraft für das Chlorid, welches sich oberhalb seines elektro-

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chemischen Equilibriums angesammelt hat, die Zelle wieder zu verlassen. Dies geschieht ü- berwiegend durch die cAMP-vermittelte Öffnung von apikalen CFTR Chlorid-Kanälen.

Durch den rheogenen K⁺-Ausstrom auf der serosalen Seite und die rheogene Cl^--Sekretion auf der mukosalen Seite entsteht ein lumen-negatives, transepitheliales elektrisches Potential, aufgrund dessen ein passiver Na⁺-Transport von der Serosa ins Darmlumen bewirkt wird (3, 32, 33, 34).

Um die Ionen-Zusammensetzung der Zelle und das Zellvolumen während der Chloridsekreti- on zu erhalten, muss die Menge an Chlorid, welche die Zelle apikal verlässt durch basolaterale Chloridaufnahme wieder ausgeglichen werden (35). Es wird angenommen, dass apikale Chloridkanäle die Hauptrolle bei der Regulation der transepithelialen Chloridsekretion spielen und tatsächlich ist das erste detektierbare Ereignis in einer mit cAMP stimulierten Zelle die Aktivierung von apikalen CFTR-Kanälen (11). Somit scheint dem basolateralen NKCC1- Kotransporter eine sekundäre Rolle zuzukommen, indem dieser als Antwort auf den apikalen Chloridverlust der Zelle mit einer erhöhten basolateralen Cl^--Aufnahme reagiert. Daraus wird offensichtlich, dass der Gesamtbetrag an dem für die Sekretion zur Verfügung gestellten Chlo- rid maßgeblich durch die basolaterale Aufnahme via NKCC1-Kotransport bestimmt wird (35, 36, 37). Der NKCC1-Kotansport stellt also einen wichtigen und limitierenden Regulations- mechanismus der transepithelialen Chloridsekretion dar.

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2.3 Die NKCC-Kotransporter

2.3.1 Eigenschaften der NKCC1- und NKCC2-Kotransporter

Die NKCC1-Isoform findet sich weitverbreitet in vielen Geweben sowohl in sezernierenden Epithelien insbesondere des Magen-Darmtrakts (38), der Luftwege (39) und der Speicheldrü- sen (40) als auch in nichtepithelialen Zelltypen wie beispielsweise Neuronen, Endothelzellen und in renalen Mesangialzellen (34). Dabei ist das Expressionsniveau des Kotransporters in sezerniernden Epithelzellen bis zu 30 fach höher als in nichtepithelialen Zellen (41). Northern Blot Analysen zeigten den höchsten Grad der Expression im Dickdarm, dem Magen und in der Niere (41, 42). Da NKCC1 in Epithelzellen nur in der basolateralen Membran exprimiert wird und zwar in einer ähnlichen Verteilung wie die Na⁺/K⁺-ATPase (43), wird dieser Kotransporter auch als „sekretorische“ Isoform bezeichnet (44). Die einzige Ausnahme stellt das Plexus choroideus-Epithel dar, in welchem NKCC1 ausnahmsweise nur apikal zu finden ist (45).

Im Gegensatz hierzu lässt sich der NKCC2-Kotransporter in Form von drei unterschiedlichen, am Exon 96-bp (46) gespliceten Varianten ausschließlich in der Niere nachweisen (34, 44).

Hier wird er in der apikalen Membran der Epithelzellen sowohl im kortikalen als auch medul- lären Bereich des dicken aufsteigenden Teils der Henleschen Schleife und außerdem der Ma- cula densa exprimiert (47) und somit als „absorptive“ Isoform bezeichnet. Es wird angenommen, dass NKCC2 die Niere bei ihrer wichtigen Aufgabe, die Hömeostase des Organismus zu erhalten, unterstützt, indem die Salz- und Wasserausscheidung kontrolliert und damit Volu- men und Osmolarität des Extrazellulärraums konstant gehalten werden (44). Durch die luminale Gabe von Furosemid, einem potentem NKCC2-Blocker, konnte beispielsweise das tubu- loglomeruläre Feedback (48) und die Reninsekretion (49), beides Aufgaben der Macula densa Zellen des juxtaglomerulären Apparates, gehemmt werden. Außerdem wurden Mutationen der NKCC2-Isoform mit einigen Ausprägungen des „Bartter-Syndroms“ in Verbindung ge- bracht, welches eine schwere Erbkrankheit beim Menschen darstellt, gekennzeichnet durch hypokalämische Alkalose einhergehend mit Hypercalcurie, was weitgehend der Dysfunktion des NKCC2 im dicken aufsteigenden Teil der Henleschen Schleife zugeschrieben wird (50).

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2.3.2 Funktionen der NKCC-Kotransporter

Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporter (NKCC) vermitteln den elektroneutralen Transport von Na, K und Cl durch die Zellmembran, wobei die Stöchiometrie überwiegend 1Na:1K:2Cl beträgt (35, 51, 52, 53). Obwohl die Richtung des Netto-Kotransports in die oder aus der Zelle erfolgen kann, was von der Summe der elektrochemischen Gradienten der transportierten Ionen abhängt (54), ist der Transport unter physiologischen Bedingungen in den meisten Zellen vom Extra- zellulärraum ins Zytoplasma gerichtet (34). Der NKCC-vermittelte Kotransport aller drei Io- nen kann allerdings nur dann erfolgen, wenn diese sich gleichzeitig auf derselben Seite der Zellmembran, der sogenannten Cis-Seite, befinden, von welcher aus die unidirektionale Translokation zur Trans-Seite erfolgt (55, 56, 57). Ein Charakteristikum des Na⁺/K⁺/2Cl^-- Kotransports ist seine Inhibierbarkeit durch 5-sulfamoylbenzoische Schleifendiuretika wie Furosemid, Bumetanid, Benzmetanid und Azosemid (4, 34, 44). Hierbei unterscheiden sich die einzelnen Substanzen deutlich in ihrer Wirksamkeit bei unterschiedlichen Gewebetypen und Zellen (51, 58, 59); der Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporter im Kolon wird beispielsweise besonders gut durch Azosemid gehemmt (60). Der Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransport wird durch Zell- schrumpfung aktiviert und besitzt aus diesem Grund, als wichtiger zellulärer Aufnahmeme- chanismus für NaCl, im Zusammenspiel mit anderen Transportsystemen eine tragende Rolle bei der Zellvolumenregulation (34). So lässt sich belegen, dass sekretorische Epithelzellen Salz und Wasser verlieren, wenn sie Bumetanid oder anderen Schleifendiuretika ausgesetzt sind (61, 62). In einigen Zellen soll die NKCC-Kotransporteraktivität sogar in den Wachs- tums- und Entwicklungszyklus der Zelle involviert sein (63, 64).

2.3.3 Molekularer Aufbau von NKCC1 und NKCC2

NKCC1 ist ein Mitglied der Kationen/Chlorid-Kotransporter-Familie (CCC) (52, 44, 65), welche sich bis zu diesem Zeitpunkt aus acht Mitgliedern (66) zusammensetzt. Dazu gehören die beiden Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporter-Isoformen NKCC1 und NKCC2, vier K⁺/Cl⁺-

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Kotransporter-Isoformen (KCC), ein Na⁺/Cl⁺-Kotransporter (NCC) (52, 44, 66) und ein CCC interacting protein (CIP) (66, 67).

Die NKCC1-Isoform besitzt 1200 Aminosäurenreste am NH2-terminalen Ende und hat eine Transkriptgröße von 7,4 kb, während die NKCC2-Isoform mit circa 100 Aminosäurenresten weniger eine Transkriptgröße von 5 kb besitzt (44). Zwischen beiden Isoformen besteht insgesamt eine Aminosäurenidentität von nur 58 %, was bedeutet, dass sie Endprodukte von zwei unterschiedlichen Genen sind (11). So zeigten Delpire et al. (68) in der Maus, dass das Gen für NKCC1 auf Chromosom 18 lokalisiert ist, während sich das für NKCC2 kodierende Gen auf Chromosom 2 befindet (69).

Das NKCC1-Molekül (Abbildung 1) wird in drei Hauptregionen unterteilt: in einen zentralen hydrophoben Bereich von 50 kDa, flankiert von einer amino- (20-30 kDa) und einer carboxyterminalen (50 kDa) Region, welche beide hydrophil sind. Es wird angenommen, dass der zentrale ca. 500 Aminosäurenreste aufweisende Bereich in Form von zwölf transmembranä- ren (TM1-TM12) Domänen angeordnet ist, die durch Schlaufen miteinander verbunden sind.

Dieser hydrophobe transmembranäre Komplex zeigt zwischen den beiden Isoformen NKCC1 und NKCC2 eine Homologie von 75-90% (44). Darüber hinaus soll an dieser aus 500 Amino- säurenresten bestehenden Region die Bindung sowohl der Ionen als auch des Bumetanids und der Transport stattfinden (70, 71, 72, 73). In der carboxyterminalen Domäne sind mehrere übereinstimmende Phosphorylierungsbereiche vorhanden und auch die aminoterminale Regi- on besitzt mindestens einen davon. Die extrazelluläre Schlaufe zwischen TM7 und TM8 weist zwei übereinstimmende N-Glykosilierungsbereiche auf und zeigt somit, dass neben Phospho- rylierungen auch Glykosilierungsvorgänge am Kotransportprotein stattfinden (44).

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Abbildung 1: Modell des der Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransport Isoform 1-Proteins basierend auf seinem hydropathischen Profil (44)

2.3.4 Regulation von NKCC1

Die Funktion des NKCC1-Kotransporters scheint durch mindestens drei Vorgänge geregelt zu werden: Proteinphosporylierung/-dephosphorylierung (74, 75, 76), spontane Änderungen in der Oberflächenexpression (11, 77) und langfristige Änderungen durch veränderte Ge- nexpression (3, 11).

Seitdem bekannt ist, dass die Ionentranslokation durch den NKCC1-Kotransport zytosolisches ATP und Mg²⁺ erfordert (44), wurden zahlreiche Studien hinsichtlich Phosphorylierungs- vorgängen am NKCC1-Protein durchgeführt. Die wichtigsten Stimulatoren für die Aktivie- rung von NKCC1 sind Zellschrumpfung (34, 78, 79) und der intrazelluläre Abfall von Cl^- (34, 75, 79, 80). Dies tritt auf, wenn der Sekretionsmechanismus der Epithelzelle durch einen adä- quaten Reiz in Gang gesetzt wird und ein apikaler Cl^--Ausstrom erfolgt. Lytle und Forbush (74, 81) bezeichneten diese Interaktion zwischen [Cl^-]_i und epithelialer Sekretion auch als die

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„[Cl^-]i-Kopplungshypothese“. Aus diesem Vorgang resultiert eine gesteigerte Serin-Threonin- Phosphorylierung des NKCC1-Proteins (11, 74) verbunden mit einer erhöhten Benzmetanid- bindungsfähigkeit (82). Diese Erkenntnis spricht für eine Konformationsänderung innerhalb des Proteins mit der Umwandlung von der inaktiven in die aktive Form, welche fähig ist, den Kotransport auszuführen (11). Trotz intensiver Nachforschungen konnte die Identität der in Frage kommenden Proteinkinase(n) bis heute noch nicht geklärt werden (3, 34, 44). Obwohl im NKCC1-Protein Aminosäuresequenzen mit übereinstimmenden Phosphorylierungsberei- chen für die Proteinkinase C, Casein Kinase 2, und Proteinkinase A (68, 42, 83, 84) gefunden wurden, ist es dennoch eher unwahrscheinlich, dass der Kotransporter von einer dieser be- kannten Kinasen direkt phosphoryliert wird (34). Vielmehr wird das Vorhandensein einer vo- lumen- (3, 85, 86) oder Cl^--sensitiven (3, 11, 82) Kinase diskutiert, was im Hinblick auf die oben bereits erwähnten Vorgänge sehr attraktiv erscheint. Neuere Studien zeigten, dass zu- sätzlich zu den Proteinkinasen wohl auch Proteinphosphatasen eine entscheidende Rolle bei der NKCC1-Regulation spielen, indem diese durch eine Dephosphorylierung des Kotranspor- ter-Proteins dessen Aktivität herabsetzen (34, 44). So konnten Behnke et al. (87) in der ami- noterminalen Domäne von NKCC1 die Aminosäurensequenz arg-val-asn-phe nachweisen, welche einen übereinstimmenden Bindungsbereich für die Typ 1 Proteinphosphatase darstellt.

Weiterhin ergaben kinetische Studien an Vogelerythrozyten, dass die Aktivierung von NKCC1 via cAMP nicht durch eine direkte Phosphorylierung des Proteins erfolgt, sondern vielmehr auf die durch eine Phosphorylierung bedingte Hemmung der Typ 1 Proteinphospha- tase zurückzuführen ist (85).

Außerdem scheint die Aktivität vieler Membranproteine durch dynamische Vorgänge in der Zellmembran geregelt zu werden. Beispielweise wird angenommen, dass unter der Membran gelegene endosomale Vesikel mit präformiertem Protein nach entsprechender Aktivierung zur Zellmembran gelangen, um mit dieser zu fusionieren. Dies führt in der Zellwand zu einer vermehrten Anzahl an Transportern und damit insgesamt zu einer größeren Leistung von NKCC1. Dementsprechend kann durch Endozytose eine Rückholung der Kotransporter aus der Zellmembran in das vesikuläre Kompartiment erfolgen und auf diesem Weg eine Aktivi- tätsverminderung von NKCC1 erzielt werden (36, 88).

(24)

Weiterhin wird vermutet, dass NKCC1 mit dem Zytoskelett und seinen akzessorischen Prote- inen (34, 44) in Wechselwirkung treten kann. Versuche mit zwei verschiedenen Zelllinien, Ehrlich Aszites Tumorzellen (89) und T84 Zellen (90), ergaben, dass eine Depolymerisation des Aktin-Zytoskeletts durch Cytochalasin D ebenfalls zu einer Aktivierung von NKCC1 führt. Im Falle einer Aktivitätsabnahme von NKCC1 scheint die Epsilon-Isoform der Protein- kinase C eine bedeutsame Rolle zu spielen, indem diese durch Phosphorylierung von Aktin- gebundenen Proteinen einen Abbau des Aktin-Zytoskeletts bewirkt; auf diese Weise wird die Zellmembran durch Verlust der sie stützenden Strukturen unstabil und neigt zur Bildung von Invaginationen, was letztendlich zur bereits beschriebenen Endozytose führt (91).

Eine Vielzahl exogener Stimuli scheint die NKCC1-Genexpression zu beeinflussen, um damit die epitheliale Chloridsekretion auf lange Sicht zu regeln (3, 11). Zu nennen sind die kurzket- tige Fettsäure Butyrat (22), proinflammatorische Zytokine wie Gamma-Interferon (92) und die Langzeit-Aktivierung von Proteinkinase C (93), welche allesamt zu einer Herabsetzung der NKCC1-Genexpression auf Translationsniveau führen. Im Gegensatz dazu bewirken Tu- mor Nekrose Faktor, Interleukin 1ß und Interleukin 6 eine erhöhte Expression des Kotransporters (94). Diese Erkenntnis ermöglicht es, NKCC1 als Ziel für therapeutische Maßnahmen bei Diarrhoe einzusetzen. Das mikrobielle Fermentationsprodukt Butyrat fand bereits Anwendung in der Behandlung von Diarrhoen bei Cholera, Diversionskolitis, entzünd- lichen Darmerkrankungen und Pouchitis (11).

2.4 Das CFTR-Protein

2.4.1 Zystische Fibrose

Die zystische Fibrose (CF) oder Mukoviszidose ist die häufigste autosomal rezessiv vererbte Stoffwechselkrankheit bei der weißen Bevölkerung Europas und der USA mit einer Erkran- kungshäufigkeit von 1 unter 2500 Geburten (95). Das 250 kb große cftr-Gen, welches für das CFTR-Protein (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) kodiert, befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 7 (96, 97, 98) und weist im Falle von CF unterschiedli-

(25)

che Mutationen auf, von denen am häufigsten die Mutation ∆F508 angetroffen wird. So weisen 70% aller CF-Patienten eine Deletion von drei Basenpaaren im Exon 10 auf, welche zum Verlust von Phenylalanin an Position 508 führt. Diese verursacht einen Defekt der posttrans- lationalen Glykosylierung des CFTR-Proteins und verhindert dadurch dessen Einbau in die Zellmembran. Die Krankheit manifestiert sich vor allem im Respirations- und Gastrointesti- naltrakt, wobei nur homozygote Genträger erkranken. Die pulmonale Symptomatik beruht auf einer fortschreitenden Obstruktion der peripheren Atemwege durch einen pathologisch zähen Schleim aufgrund mangelnder Sekretion. Folgen davon sind Atelektasen, Lungenemphysem und der Ansiedelung verschiedener bakterieller Erreger. Der gesamte Gastrointestinaltrakt weist pathologische Veränderungen auf: Als häufige klinische Manifestationen sind beispielsweise das Malabsorptionssyndrom, der Mekoniumileus und das distale Obstruktions- syndrom (Mekoniumileusäquivalent) in späteren Jahren anzutreffen. Die Obstruktion der kleinen Pankreasgänge mündet meist in eine exokrine Pankreasinsuffizienz. Als weitere durch die Erkrankung in Mitleidenschaft gezogene Organe sind die Leber (99), die Gallenblase (100) und der Urogenitaltrakt (101) zu nennen. Trotz heutzutage üblicher intensiver sympto- matischer Therapie besitzen die Patienten eine deutlich verkürzte Lebenserwartung. So be- trägt die mittlere Lebenserwartung ohne Gentherapie bei Frauen 25 und bei Männern 30 Jahre (95).

2.4.2 Funktion von CFTR

Das 1989 erstmals klonierte CFTR-Protein stellt den Haupttransportweg für die apikale Cl^-- (102, 103) und wahrscheinlich auch die elektrogene HCO3-

-Sekretion (104) dar und findet sich in sezernierenden Epithelien insbesondere des Magen-Darmtrakt, des Pankreas, der Lun- gen, der Schweißdrüsen und der Nieren (103). Der gesamte Intestinaltrakt weist mit Ausnah- me des Magens hohe CFTR-Expressionslevel auf, die im Duodenum am höchsten sind und im Verlauf der einzelnen Darmabschnitte nach distal hin abnehmen (105, 97). Die Lokalisation am luminalen Zellpol wurde im Darm mit Hilfe der Immunhistochemie nachgewiesen (106).

(26)

Die bedeutsame Rolle des CFTR für die intestinale apikale Cl^--Leitfähigkeit wurde bereits in vielen Experimenten bestätigt (102, 103, 107). Über seine Beteiligung an der intestinalen und besonders an der duodenalen Bikarbonatsekretion wurden einige Arbeiten veröffentlicht, nachdem mehrere Arbeitsgruppen den Kanal auf seine HCO3-

-Leitfähigkeit hin untersucht haben und diese bestätigen konnten (107, 108, 109). Die Angaben über das Verhältnis von HCO3-

- zur Cl^--Durchlässigkeit schwanken je nach Autor zwischen 1:8 (110) bis 1:4 (111, 112). Seidler et al. (104) haben anhand von ph-stat-Messungen in der Ussingkammer am Dünndarm von CFTR Knockout-Mäusen und deren gesunden Geschwistern gezeigt, dass ein funktionierendes CFTR-Protein in allen untersuchten Segmenten für eine normal hohe basale Bikarbonatsekretion und für die Agonisten-stimulierte elektrogene Bikarbonatsekretion über die drei Signaltransduktionswege, die cAMP, cGMP und Ca²⁺ als Second messenger beinhal- ten, unabdingbare Voraussetzung ist. Trotz dieser Fülle an Erkenntnissen gilt es jedoch immer noch nicht als vollständig geklärt, ob der CFTR-Kanal selbst als funktionell bedeutsamer Durchlass für die HCO₃^--Ionen dient oder nur in die Regulation der Bikarbonatsekretion involviert ist oder aber beides bewirkt (108).

2.4.3 Molekularer Aufbau und Eigenschaften des CFTR-Proteins

CFTR ist ein Mitglied der ABC-Membrantransporter-Genfamilie (ATP binding cassette), deren Mitglieder meist ATP-getriebene Transportproteine darstellen (103). Im Falle des CFTR- Proteins (Abbildung 2) handelt es sich um das einzige bekannte Kanalprotein dieser Familie.

Die das CFTR-Protein bildende Polypeptidkette besteht aus 1480 Aminosäuren und weist zwei gleichartige Hälften auf. Diese bestehen aus jeweils sechs transmembranären Domänen, die das eigentliche Kanalprotein bilden, zwei nukleotidbindenden (NBD1 und NBD2) und einer regulatorischen (R-) Domäne, welche die beiden Hälften miteinander verbindet und mehrere Phosphorylierungsstellen für die PKA, die PKC und die Ca²⁺-Calmodulin-Kinase aufweist (113, 114). Der Einzelkanal weist unter Anwesenheit von 150 mM Cl^- eine geringe Leitfähigkeit von 8-10 pS bei Raumtemperatur auf, besitzt eine lineare Strom-

(27)

Spannungskurve und die Leitfähigkeitsequenz Br->Cl->I->F- (102, 115). CFTR kann durch Arylaminobenzoate, wie z.B 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino) Benzoat (NPPB), gehemmt werden (102), während Distilbenederivate wie SITS und DIDS eine Blockade des Kanals nur von der zytoplasmatischen Seite aus bewirken (116).

Abbildung 2: Transmembranäre Topologie des CFTR-Proteins (103)

Im intestinalen Epithel ist CFTR vorwiegend in den Krypten und der Basis der Villi exprimiert, wobei jedoch auch in den oberflächennahen Villuszellen des Dünndarms einzelne Zel- len mit sehr hohen Expressionsraten zu finden sind, deren funktionelle Bedeutung aber noch unklar ist (117). Eine weitere Entdeckung basiert auf der Tatsache, dass CFTR in Endosomen vonnöten ist, um deren Ansäuerung sicherzustellen (118). Ein Defekt dieser Funktion führt möglicherweise zu einer Expression veränderter Oberflächenproteine, die wiederum eine hohe Bindungsaffinität zu pathogenen Keimen wie Pseudomonas aeruginosa aufweisen (119).

Weitere Studien stellen den Zusammenhang zwischen dem CFTR-Kanal und der Infektion mit Pseudomonas aeruginosa anders dar. CFTR ist demnach ein zellulärer Rezeptor, der Pseudomonas bindet, in die Zelle einschleust und auf diesem Weg das Bakterium aus der Lunge entfernt (120). Diese Ergebnisse wurden durch verbesserte Clearanceraten von Epi- thelzellen des Respirationstrakts von CF-Patienten nach erfolgreichem Gentransfer bestätigt (121). Salmonella s. typhi benötigt ebenfalls das membranständige CFTR-Protein, um die

(28)

Membran intestinaler Zellen zu penetrieren (122). Daher scheint die fehlende Expression von CFTR auf der Zelloberfläche ein präventiver Faktor hinsichtlich der Infektion mit Salmonella s. typhi zu sein. Weiterhin wurde postuliert, dass bakterielle Diarrhöen bei Heterozygotie für CF weniger schwer ausfallen und somit ein Selektionsvorteil besteht (123). Daten an Knock- out-Mäusen scheinen nahe zu legen, dass CF-Heterozygote eine geringere Reaktion gegen- über bakteriellen Toxinen zeigen (124).

2.4.4 Regulation von CFTR

Für das CFTR-Protein war anfangs wegen seiner Ähnlichkeit mit dem MDR-Protein (multi drug resistance protein), das ebenfalls der Genfamilie der ABC-Membrantransporter ange- hört, eine mögliche Funktion als ATP-getriebene Pumpe angenommen worden. In der aktuel- len Diskussion setzt sich jedoch die Annahme, dass es sich hierbei um einen durch die cAMP- abhängige Proteinkinase A regulierten Cl^--Kanal handelt, immer mehr durch (125, 126). Es wird angenommen, dass für die Kanalöffnung zum einen die PKA-abhängige Phosphorylie- rung der R-Domäne und zum anderen die Bindung und anschließende Hydrolyse von ATP an der nukleotidbindenden Domäne NBD1 notwendig ist (113). Dabei scheint eine Phosphory- lierung von CFTR durch die Proteinkinase C das initiale Ereignis als Voraussetzung für die beschriebenen Vorgänge darzustellen (115, 127). Die Kanalschließung wird durch die Akti- vierung von Proteinphosphatasen wie hauptsächlich PP2A und PP2C veranlasst (128, 129), verbunden mit der Hydrolyse von ATP an der nukleotidbindenden Domäne NBD2 (130). Ne- ben einer primären Regulation via PKA-vermittelte Phosphorylierung wird angenommen, dass ein cAMP-abhängiger Transport von präformiertem CFTR in subapikalen Vesikeln zum luminal gelegenen Zellpol stattfindet und durch eine Fusion mit der Zellmembran die Anzahl der Kopien in der Membran erhöht wird (131, 132). Greger et al. (133) hingegen konnten mittels Patch-clamp-Studien an Eizellen von chinesischen Hamstern zeigen, dass die Membran- kapazität nach cAMP-abhängiger Stimulation im Vergleich zu einem markanten Anstieg der Leitfähigkeit nur äußerst gering zunahm, was wiederum gegen diese Theorie spricht. Den-

(29)

noch kann die Exozytose/Endozytose-Hypothese hier nicht gänzlich ausgeschlossen werden (134), vielmehr könnte dieser Vorgang auch je nach Gewebe von unterschiedlicher Bedeu- tung sein (3).

2.4.5 Interaktion von CFTR mit anderen Ionen-Kanälen

Neben seiner Funktion als Cl^--Kanal ist CFTR als regulatorische Einheit für weitere Ionenka- näle tätig. Dazu gehören unter anderem der sogenannte ORCC (outwardly rectifying chloride channel) (115, 135, 136), der amiloridsensitive ENaC (epithelialer Natriumkanal) (133,137, 138), der Kir1.1/ROMK (renaler sekretorischer K⁺-Kanal aus der Familie der „renal outer medullary potassium channels“) (139, 140, 141) und Aquaporine (142).

Uneinigkeit herrscht über die Beziehung des CFTR Kanals zu dem epithelialen Chloridkanal ORCC. Von einigen Arbeitsgruppen wird postuliert, dass CFTR eine ATP-Ausschleusung aus der Zelle bewirkt und via eines Purin-Rezeptors den luminalen ORCC-Kanal öffnet (143, 144, 145). Andere Experimente zeigten, dass ATP entweder direkt via CFTR-Kanal die Zellmemb- ran passiert (146) oder dass CFTR-assoziierte Kanäle in diesen Prozess involviert sind (147).

Die Korrektur der bei CF ebenfalls gestörten Leitfähigkeit des ORCC gelang durch Insertion eines korrekten rekombinanten CFTR-Gens in bronchiale CF-Zellen (148). Greger et al. (149, 150) konnten diese Erkenntnis jedoch nicht nachvollziehen und gehen davon aus, dass der ORCC ein in Zellen, selbst nach Stimulation durch ATP, wenig exprimierter Kanal ist. Ande- re Arbeitsgruppen bestreiten die Fähigkeit des CFTR-Kanals, ATP zu exportieren (151, 152).

Die Identifizierung des für ORCC kodierenden Gens ist bislang noch nicht gelungen, wird aber angesichts der enormen Wichtigkeit des ORCC als alternativer Weg für die Chloridsek- retion als zukunftsweisender Schritt bei der Therapie von zystischer Fibrose angesehen (115).

Seit vielen Jahren ist bekannt, dass die transepitheliale Spannung und Leitfähigkeit des respiratorischen Epithels bei CF-Patienten erhöht ist. Diese Leitfähigkeit besitzt eine durch Amilo- rid hemmbare Komponente, nämlich den epithelialen Natriumkanal ENaC (153, 154). Der sehr visköse Schleim, der sich im Respirationsstrakt ansammelt, und die verminderte mukozi-

(30)

liäre Clearance werden daher durch die verminderte NaCl- und Wassersekretion und die er- höhte, durch Amilorid hemmbare, NaCl-Absorption erklärt (155, 156). Das CFTR-Protein spielt hierbei eine bedeutende Rolle, es wird in erster Linie für die Hemmung der Natriumre- sorption über eine Verminderung der Expression von ENaC in Zellen des respiratorischen Epithels verantwortlich gemacht (137, 157). Der Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen CFTR und ENaC sind derzeit noch nicht vollständig geklärt. Man vermutet, dass die Alpha-Untereinheit des Na⁺-Kanals und die Nukleotid-bindende-Domäne1 (NBD1) des CFTR-Proteins in diesem Zusammenhang von Bedeutung sind (158, 159). Eine herabgesetzte Amiloridantwort durch cAMP-aktiviertes CFTR konnte mittlerweile auch an intaktem Kolo- nepitehl von Maus, Ratte und Mensch gezeigt werden (160, 161), und in beidem, CF- Kolonmukosa und CF-Gewebe aus dem Respirationstrakt, ließ sich dementsprechend die E- NaC-Leitfähigkeit über cAMP-abhängige Agonisten nicht unterbinden (155, 160). So bein- haltet die Pathophysiologie von CF nicht nur eine schwerwiegende Hyposekretion sondern gleichzeitig auch eine stark erhöhte Absorption von Elektrolyten und H₂O, was die Konzent- rierung des Mukus weiter begünstigt (124, 162).

Aktuelle Forschungsergebnisse konnten weiterhin eine essentielle Bedeutung in der Koexis- tenz von CFTR mit EnaC und Kir1.1 (ROMK) in der apikalen Membran des Sammelrohrs in der Niere nachweisen. ENaC soll hier CFTR-abhängig eine koordinierte Hochregulierung von Kir1.1 (ROMK) während der Stimulation von EnaC durch Aldosteron oder antidiuretisches Hormon bewirken (139). Letztendlich ließ sich zeigen, dass CFTR auch an der Regulation von Wasserkanälen beteiligt ist. Xenopus Oozyten besitzen das endogene Aquaporin 3 (xAQP3), welches während einer Aktivierung von CFTR via cAMP ebenfalls aktiviert wird und somit eine erhöhte Wasserpermeabilität der Oozyten bewirkt (142). Das xAQP3 wurde auf molekularer Ebene identifiziert und sein Homolog in Säugetieren AQP3 konnte neben anderen Geweben in respiratorischen Epithelzellen nachgewiesen werden (163).

(31)

2.5 Weitere für die Chlorid- und Bikarbonatsekretion wichtige Transportproteine

2.5.1 Der Cl^-/HCO3-

-Austauscher

Anionenaustauscherproteine werden in allen Geweben exprimiert und sind an der Regulation von pH und Zellvolumen sowie an Sekretions- und Absorptionsvorgängen beteiligt. Der durch sie vermittelte Cl^-/HCO₃^--Austausch ist elektroneutral, Na-unabhängig und durch die Distilbenderivate SITS und DIDS inhibierbar. Es wurden mehrere Isoformen des Anionenaus- tauschers kloniert (anion exchanger AE1, AE2, AE3) (164), wobei AE1 in Erythrozyten und in den Nieren, AE2 in zahlreichen Organen und AE3 in exzitablen Geweben gefunden wird (165). Hohe AE2-Expressionen finden sich im Magen, wo er basolateral die apikale HCl- Sekretion ausgleicht, aber auch in Dick- und Dünndarm und in den Gallenwegen wird AE2 exprimiert (166). Im Kolon ist AE2, zusammen mit einem Na⁺/HCO3-

-Kotransporter, neben dem Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporter ein weiterer Transportweg für die basolaterale Cl^--Aufnahme während der Anionen- und Flüssigkeitssekretion (167).

Vor kurzem wurde ein als DRA bezeichnetes Protein näher charakterisiert, das vermutlich zusammen mit Na⁺/H⁺-Austausch an der apikalen Zellmembran die NaCl-Resorption bewerkstelligt. DRA steht für „down regulated in adenoma“, eine Bezeichnung, die auf die Expressi- on des Proteins im normalen Kolon, nicht aber in den meisten Adenokarzinomen begründet liegt (168). Expressionsstudien haben gezeigt, dass DRA einen Cl^-/HCO3-

-Austausch bewerk- stelligen kann (169). Mutationen im DRA-Gen wurden als Ursache für die kongenitale Chlo- rid-Diarrhoe identifiziert. DRA ist stark im Kolon und Zäkum (170) und im Dünndarm besonders im Duodenum exprimiert und ist in der apikalen Membran der Oberflächenzellen und der Zellen im oberen Kryptenanteil lokalisiert (171). DRA scheint somit das die apikale Cl^- /HCO₃^--Austauschaktivität vermittelnde Transportprotein zu sein.

(32)

2.5.2 Der Na⁺/HCO3-

-Kotransporter

Eine der Möglichkeiten zur basolateralen HCO3-

-Aufnahme ist der Na-gekoppelte Transport durch den Na⁺/HCO3-

-Kotransporter (NBC), dessen molekulare Struktur in den letzten Jahren aufgeklärt werden konnte (172). Bislang wurden drei NBC-Isoformen, NBC1, NBC2 und NBC3 oder auch NBCe (elektrogen), NBCn (elektroneutral) und NBC genannt, identifiziert (173, 174). Im Gastrointestinaltrakt wird besonders der NBC1 oder NBCe exprimiert. In den Schleimzellen des Magenepithels, den Villuszellen im Duodenum, den Krypten im Kolon, den Pankreasgangzellen und den Gallenblasenepithelien ist er in großem Umfang exprimiert (175). Im Gastrointestinaltrakt scheint die Kopplung von Na⁺ mit HCO₃^- 1:2 zu sein (176);

damit kann HCO₃^- unter Ruhemembranpotentialbedingungen in die Zelle transportiert werden. Alle oben genannten Zelltypen weisen besonders hohe HCO₃^--Sekretionsraten auf, mit Ausnahme der Kolonkrypten. Untersuchungen am Duodenal-, Pankreas und Gallenblasene- pithel zeigten, dass der Na⁺/HCO₃^--Kotransporter ein wesentlicher Mechanismus der HCO₃^-- Aufnahme für die epitheliale HCO₃^--Sekretion ist, und dass er im Rahmen der Sekretion aktiviert wird (176, 178, 179). Im Kolon, das wenig HCO₃^- sezerniert, scheint er, gekoppelt mit einem basolateralen Anionenaustauscher, einen alternativen Cl^--Aufnahmemechanismus zum NKCC1 darzustellen (167).

2.6 Das Arbeiten mit gentechnisch veränderten Mäusen

2.6.1 Die NKCC und CFTR Knockout-Maus

Der NKCC1-Kotransporter wird seit vielen Jahren als der wesentliche Cl^-- Aufnahmemechanismus im Darm angesehen. Da ein NKCC1-Defekt im Vergleich zu einer Mutation des CFTR-Proteins keine schwerwiegenden gesundheitlichen Folgen beim betref- fenden Individuum verursacht, muss man davon ausgehen, dass das Fehlen des wichtigsten Cl^--Aufnahmemechanismus der Zelle auf noch nicht geklärte Art und Weise kompensiert werden kann. In dieser Hinsicht bietet die NKCC1 Knockout-Maus ideale Voraussetzungen,

(33)

um nähere Erkenntnisse über alternative Anionenaufnahmewege der Zelle zu gewinnen (180).

Überdies scheint eine Herabsetzung der Genexpression von NKCC1, beziehungsweise die gezielte pharmakologische Beeinflussung dieses Transportproteins durch Inhibitoren, einen erfolgsversprechenden Therapieansatz bei der Behandlung von Diarrhoen darzustellen (11).

Die CFTR Knockout-Maus (CF-Maus) ist ein wichtiges Modell für das Verständnis der zysti- schen Fibrose. Neben der im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten Nullmutante ohne jede Expression des CFTR-Proteins (181), gibt es inzwischen eine Reihe von Knockout-Mäusen, welche die bei Patienten am häufigsten auftretenden Mutationen tragen und sogar unter deren häufigsten Symptomen leiden. Sie bieten sich daher als Modell für gentherapeutische Versu- che an (182).

2.6.2 Vergleich Phänotyp NKCC1 mit CFTR Knockout-Maus

NKCC1 Knockout-Mäuse zeigen bis zum 21. Tag nach ihrer Geburt eine starke Wachstums- verzögerung, legen nach dem Absetzen deutlich an Gewicht zu, bleiben aber zeitlebens klei- ner als ihre normalen Artgenossen und besitzen weniger Körperfett. Die (-/-) Tiere weisen starke Verhaltensauffälligkeiten auf, indem sie ständig im Kreis rennen („circeln“), häufig das Gleichgewicht verlieren und ihren Kopf nicht koordiniert bewegen können. Eine erhöhte Mortalitätsrate von ca. 30% besteht um den Zeitpunkt des Absetzens, die Tiere zeigten bei der Sektion Blutungen in das Darmlumen. Außerdem sind NKCC1 Knockout-Mäuse taub und die männlichen Tiere zeugungsunfähig (38, 183, 184, 185).

Der größte Teil der CFTR Knockout-Mäuse (ca. 80%) stirbt innerhalb der ersten fünf Tage nach der Geburt. Die Sektion der Tiere zeigte Mekoniumobstruktionen im Bereich des I- leums; Todesursache war im überwiegenden Teil der Fälle eine schwere Peritonitis, verursacht durch Darmdurchbruch. Ein zweiter Zeitraum mit hoher Mortalitätsrate zeigte sich 21 Tage nach der Geburt zum Zeitpunkt des Absetzens und die sezierten Tiere wiesen starke Obstruktionen vorwiegend im Dickdarm auf. Histopathologische Untersuchungen zeigten stark dilatierte mit übermäßig viel eingedicktem Schleim angefüllte Lieberkühnsche Krypten

(34)

und Kolonkrypten. Die überlebenden CFTR (-/-) Mäuse erreichen nur die Hälfte des Körper- gewichts ihrer Artgenossen, die männlichen Tiere sind ebenfalls steril (10, 124, 181, 186).

Somit zeigen NKCC1 Knockout-Mäuse im Verhältnis zu ihrem Gendefekt nur geringe intestinale Krankheitssymptome, während die Darmfunktion von CFTR Knockout-Mäusen stark beeinträchtigt ist. Daher war das Hauptziel der vorliegenden Arbeit, zu klären, welche Mechanismen - alternativ zum NKCC1-Kotransporter - im Dünndarm dazu beitragen, diesen Defekt auszugleichen.

(35)

Material und Methoden 35

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien und Abkürzungen

In Tabelle 1 sind in alphabetischer Reihenfolge die in den Experimenten angewandten chemischen Substanzen sowie deren Bezugsquellen und ihre in der vorliegenden Arbeit verwendeten Abkürzungen enthalten. Alle Substanzen sind von analytischer Reinheit bzw. dem höchs- ten erhältlichen Reinheitsgrad.

Tabelle 1: Verwendete Chemikalien, deren Abkürzung und jeweilige Bezugsquelle

Reagenz gelöst in Abkürzung Bezugsquelle

4-Acetamino-4’-

Isothiocyanostilben-2,2’- Disulfonat

Aqua bidest. SITS Sigma (Deisenho- fen)

Agarose Type III High EEO KCl [3M] Agarose Sigma (3-[Aminosulfonyl]-5-

[butylamino]-4- phenoxybenzoesäure)

DMSO Bumetanid Sigma

Azetazolamid Aqua bidest. Azetazolamid Sigma

Bariumdihydroxid- Octahydrat

Aqua bidest. Ba(OH)₂ x 8 H₂0 Merck (Darm- stadt)

(4ß,20[22]-Cardenolid- 1β,3β,5α,11α,14,19-hexol- 3[6-deoxy-α-L-

mannopyranosyl)]

DMSO Ouabain Sigma

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36Chlorid HCl 0.1M ³⁶Cl^- Amersham Phar-

macia (Freiburg) 1-[p-Chlorobenzoyl]-5-

methoxy-2-methylindol-3- Essigsäure

Na₂HPO₄ Indomethazin Sigma

D(+)-Glukose Aqua bidest. Dextrose Merck

Dibutyryl-cAMP Aqua bidest. Db-cAMP Sigma

Dimethylsulfoxyd DMSO Sigma

Forskolin DMSO Forskolin Sigma

Kaliumdihydrogenphosphat Aqua bidest. KH₂PO₄ Merck Kalziumchloriddihydrat Aqua bidest. CaCl₂x 2 H₂0 Merck

Laktulose Aqua bidest. Laktulose Sigma

Magnesiumsulfat- Heptahydrat

Aqua bidest. MgSO4 x 7 H2O Merck

Mannit Aqua bidest. Mannit Merck

3H-Mannit Ethanol ³H-Mannit NEN DuPont

(Bad Homburg)

Natriumchlorid Aqua bidest. NaCl Merck

Natriumpyruvat NaCl 0.9% Pyruvat Sigma

Natriumzitrat Aqua bidest. NaCitrat Merck

Natronlauge Aqua bidest. NaOH Merck

Salzsäure Aqua bidest. HCl Merck

100% Sauerstoff 100% O2 Linde (München)

95% O2/ 5% CO2

Carbogen AGA Gas GmbH Hamburg)

Quicksafe A Flüssigszintillator

Zinsser-Analytik

(Frankfurt)

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Tetrodotoxin NaCitrat 10 mM TTX Biotrend Chemi- kalien (Köln)

3.1.2 Verwendete Geräte

Tabelle 2: Auflistung der für die durchgeführten Experimente verwendeten Geräte

Geräte Hersteller

Autobürette Radiometer Copenhagen

Betacounter Wallac 1409

DVC-1000 Dual Voltage Clamp World Precision Instruments EVC-4000 World Precision Instruments Lichtquelle World Precision Instruments

PCR-Gerät Perkin Elmer

pH-Meter mit pH-Glaselektrode Radiometer Copenhagen

Photometer Beckmann Preamplifier World Precision Instruments

Stereomikroskop World Precision Instruments

Titrator Radiometer Copenhagen

Wärmeumwälzpumpe Haake

Osmometer Roebling

3.1.3 Versuchstiere

Die NKCC1 Knockout-Maus wurde im Labor von Gary E. Shull in Cincinnati erzeugt und charakterisiert. Die Inaktivierung des Na⁺/K⁺/2Cl^--Kotransporters erfolgt, indem der für das

(38)

NKCC1-Protein kodierende Sequenzbereich (Slc12a2) durch das Einfügen des Neomycin- Gens in Exon 6 unterbrochen wird (38).

Die CFTR Knockout-Maus wurde im Labor von R. Ratcliff, M.J. Evans und W.H. Colledge in Cambridge erzeugt und charakterisiert. Von den CF-Mäusen wird kein Wildtypprotein her- gestellt, da die Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) Kassette die für das CFTR- Protein kodierende Sequenz unterbricht und ein Stoppkodon einfügt. Keines der möglicher- weise aus der geschädigten Region entstehenden RNA-Transkripte kann für ein funktions- tüchtiges CFTR-Protein kodieren (181).

Die Aufzucht der Mäuse fand unter standardisierten Licht- und Klimakonditionen im Tierstall des Physiologischen Institutes in Tübingen statt.

Im Hinblick auf die CF-Mäuse ist zu erwähnen, dass alle Tiere einschließlich der CFTR (+/+) auf eine faserfreie Diät (Special Diet Services, Cambridge, UK) gesetzt, die Käfige mit

`Corncob` (Mucedola, Settimo Milanese, Italy) eingestreut und eine spezielle polyethylen- glykolhaltige Elektrolyt-Trinkflüssigkeit (Kleanprep, Norgine, Marburg, Germany) zur Ver- fügung gestellt wurde. Die NKCC1 (-/-) und (+/+) Mäuse dagegen erhielten die übliche, aus Sägespänen bestehende Einstreu und bekamen normales Futter und Wasser. Im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden Tiere beider Stämme mit einem Gewicht von ca. 18-20 g für die Ver- suche herangezogen.

Die (+/+) Geschwistertiere dienten jeweils als Kontrollpopulation.

Das Versuchsprotokoll wurde durch den Universitätstierarzt und das Regierungspräsidium Tübingen gemäss dem geltenden Tierschutzrecht genehmigt.

3.2 Methoden

3.2.1 Genotypisierung der NKCC1 Knockout-Mäuse

Die Genotypisierung zur Selektion der verwendeten Knockout-Mäuse NKCC1 und CFTR wurde ungefähr drei Wochen nach der Geburt durchgeführt. Die CFTR Knockout-Mäuse

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wurden bereits genotypisiert zur Verfügung gestellt; die Methode der Genotypisierung wurde von Seidler et al. (105) ausführlich beschrieben.

Zur Genotypisierung der NKCC1 Knockout-Mäuse wurde während einer kurzen Äthernarko- se eine Gewebeprobe für die DNA-Gewinnung aus dem Ohr gestanzt. Die Präparation der genomischen DNA erfolgte mit Hilfe des DNeasy Kits (Qiagen, Hilden) nach den Angaben des Herstellers. Circa 100 ng der chromosomalen DNA wurden als Template in einem 25µl PCR-Ansatz eingesetzt. Wildtyp- und mutiertes Allel wurden jeweils in getrennten Ansätzen amplifiziert. Primer für die Wildtyp-PCR waren die Oligonukleotide NKCC-6-5 (5`- GGAACATTCCATACTTATGATAGATG-3`) und NKCC-6-3 (5`-CTCACCTTTGCTTCC- CACTCCATTCC-3`). Sie führten zur Amplifikation eines 105 bp großen PCR-Produktes.

Das mutierte Allel wurde durch das Primerpaar NKCC-6-5 und NKCC-dNEOpolyA (5`- GACAATAGCAGGCATGCTGG-3`) amplifiziert, das PCR-Produkt hatte eine Größe von 156 Basenpaaren. Die Temperaturbedingungen waren für beide Reaktionen identisch: Dena- turierung 3 min bei 94°C, anschließend 40 Reaktionszyklen mit Denaturierung bei 94°C für 45 s, Annealing 58°C für 60 s und Synthese 72°C für 90 s. Zum Abschluss folgte ein 10- minütiger Syntheseschritt bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden auf ein 2,5% ethidiumbro- midhaltiges Agarose-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde unter UV-Beleuchtung fotografiert, danach konnte der Genotyp der Mäuse über die Länge der vor- handenen PCR-Produkte identifiziert werden.

3.2.2 Präparation des Jejunums

Die Mäuse waren mit CO2, das in eine geschlossene Glaskammer geleitet wurde, betäubt und anschließend durch zervikale Dislokation getötet worden. Daraufhin wurde das Abdomen eröffnet und der Dünndarm herausgenommen. Das Explantat wurde mit einer 4°C kalten, O2- gesättigten Ringerlösung durchgespült, um den Darminhalt zu entfernen und die Ischämieto- leranz zu erhöhen. Aus dem Bereich des Jejunums wurde anschließend ein ca. 2 cm langer Darmabschnitt entnommen, entlang des Mesenterialansatzes mit einer Schere in Längsrich-

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tung eröffnet und die mukosale Seite noch einmal mehrfach mit der kalten Ringer-Lösung zwecks Entfernung von Chymusresten abgespült. Als Präparationsvorrichtung diente eine Kunststoffschale, die bis auf halbe Höhe mit Paraffin ausgegossen war und in der Seite Lö- cher zwecks der Anbringung von fünf Glasfaserkabeln aufwies, die wiederum von einer Lichtquelle ausgingen. Die Paraffinoberfläche besaß eine Vertiefung, über die das Darmstück mit Hilfe von Stecknadeln straff, mit der serosalen Seite nach oben gerichtet, aufgespannt wurde; dies verhinderte ein Druckschädigung der empfindlichen Mukosa. Die Präparation fand in frischer voroxygenierter eiskalter und zuvor mit Indomethazin [50 µM] versetzter Ringer-Lösung statt. Unter einem Stereomikroskop wurden nun die Tunica serosa und die Tunica muscularis, Stratum longitudinale und circulare in dieser Reihenfolge mit Hilfe einer spitzen Pinzette abpräpariert. Auch die Tela submucosa wurde vorsichtig so weit wie möglich abgetragen, bis die Zottenstruktur der Tunica mucosa deutlich erkennbar war. Daraufhin konnte das präparierte Darmstück zwischen den beiden Hälften der in Abbildung 3 dargestell- ten Polyacrylkammer aufgespannt werden; diese Kammer wurde nun in die Haltevorrichtung des Ussingkammer-Aufbaus eingespannt, jeweils mit den beiden Perfusionskammern und den Elektroden verbunden und der Versuch unmittelbar daraufhin gestartet.

Da es zur Erhöhung der Ischämietoleranz und zur Verminderung von Autolyse wichtig war, das Gewebe nach Entnahme und während der Präparation auf 4°C herunter zu kühlen, und der in die Ussingkammer eingespannte Darm anderen Perfusionslösungen, die eine Temperatur von 37°C aufwiesen, ausgesetzt war, wurde dem Gewebestück vor Beginn des eigentlichen Versuches in der Ussingkammer eine Regenerationszeit von 60 min zugestanden. Im Verlauf dieses Zeitabschnittes sollten die zu messenden Parameter eine Stabilität erreicht haben, auf deren Grundlage mit der Durchführung des eigentlichen Versuchsschemas begonnen werden konnte. Gewebe, die nach dieser Zeit keine adäquaten Messparameter aufwiesen, wurden nicht zum Versuch herangezogen. Der in Kapitel 3.2.5 beschriebene Ussingkammer-Aufbau erlaubt sowohl die Bestimmung elektrophysiologischer Parameter als auch die Bikarbonatsek- retionsmessung mittels der pH-stat-Methode.

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3.2.3 Das Kurzschlussstromexperiment

Der dänische Physiologe Hans Peter Ussing etablierte in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts das nach ihm benannte Kurzschlussstromexperiment an Froschhautepithelien (187). Der Ver- suchsaufbau erlaubt es, experimentell die Formen des aktiven epithelialen Ionentransportes von denen des passiven abzugrenzen. Wenn alle äußeren Gradienten für passiven Io- nentransport ausgeschaltet werden, kann der danach verbleibende messbare Transport nur noch primärer, sekundärer oder tertiärer Natur sein.

Das interessierende Epithelstück wurde in eine Polyacrylkammer eingespannt, die es somit in 2 Kompartimente teilte. Auf beiden Seiten wurden nun identische Volumina isoosmolarer Elektrolytlösung in zwei 15 ml fassende Reservoire eingefüllt, somit wurden sowohl der hyd- rostatische Druckgradient als auch der Konzentrationsgradient ausgeschaltet.

Auch der elektrische Gradient für passive Ionenbewegungen kann beseitigt werden. Folgende Überlegungen sind hierfür wichtig: Unter der Vielzahl der aktiven epithelialen Io- nentransportmechanismen sind einige elektrogen, das heißt, sie erzeugen gemäß dem Ohm- schen Gesetz eine sich über das Epithel einstellende Potentialdifferenz bzw. Spannung. Ein Beispiel hierfür ist der Na⁺/Glukose-Kotransport. Die einseitige Bewegung von Kationen in die eine Richtung muss entweder den passiven Mittransport von Anionen in die gleiche Rich- tung und/oder von Kationen in die Gegenrichtung zur Folge haben. Der spezielle Ussing- kammer-Aufbau (siehe Abbildung 3) erlaubt es nun, von außen einen Strom auf das Epithel zu applizieren, der entgegengesetzt gerichtet und genau so eingeregelt wird, dass er gleich groß ist wie der durch den aktiven Transport erzeugte Strom. Der elektrische Gradient ist somit ausgeschaltet. Dieser sogenannte Kurzschlussstrom (short-circuit-current oder Isc) stellt ein Maß für den aktiven Ionentransport von einer Seite des Epithels auf die andere Seite dar.

Man kann an der Ussingkammer auch einen zweiten Messmodus, den des “open-circuit- current“, schaffen, der im Versuchsaufbau der vorliegenden Arbeit mit Ausnahme der radioaktiven Flux-Versuche zur Anwendung kam. Unter physiologischen Bedingungen stellt sich über das Epithel spontan eine charakteristische Potentialdifferenz ein, die in diesem Modus nicht ausgeglichen, sondern nur gemessen wird. Der transepitheliale elektrische Gradient