3.1 Material
3.1.1 Chemikalien und Abkürzungen
In Tabelle 1 sind in alphabetischer Reihenfolge die in den Experimenten angewandten chemi-schen Substanzen sowie deren Bezugsquellen und ihre in der vorliegenden Arbeit verwende-ten Abkürzungen enthalverwende-ten. Alle Substanzen sind von analytischer Reinheit bzw. dem höchs-ten erhältlichen Reinheitsgrad.
Tabelle 1: Verwendete Chemikalien, deren Abkürzung und jeweilige Bezugsquelle
Reagenz gelöst in Abkürzung Bezugsquelle
4-Acetamino-4’- Isothiocyanostilben-2,2’-Disulfonat
Aqua bidest. SITS Sigma (Deisenho-fen)
Azetazolamid Aqua bidest. Azetazolamid Sigma
Material und Methoden 36
Na2HPO4 Indomethazin Sigma
D(+)-Glukose Aqua bidest. Dextrose Merck
Dibutyryl-cAMP Aqua bidest. Db-cAMP Sigma
Dimethylsulfoxyd DMSO Sigma
Forskolin DMSO Forskolin Sigma
Kaliumdihydrogenphosphat Aqua bidest. KH2PO4 Merck Kalziumchloriddihydrat Aqua bidest. CaCl2 x 2 H20 Merck
Laktulose Aqua bidest. Laktulose Sigma
Magnesiumsulfat-Heptahydrat
Aqua bidest. MgSO4 x 7 H2O Merck
Mannit Aqua bidest. Mannit Merck
3H-Mannit Ethanol 3H-Mannit NEN DuPont
(Bad Homburg)
Natriumchlorid Aqua bidest. NaCl Merck
Natriumpyruvat NaCl 0.9% Pyruvat Sigma
Natriumzitrat Aqua bidest. NaCitrat Merck
Natronlauge Aqua bidest. NaOH Merck
Salzsäure Aqua bidest. HCl Merck
Material und Methoden 37
Tetrodotoxin NaCitrat 10 mM TTX Biotrend Chemi-kalien (Köln)
3.1.2 Verwendete Geräte
Tabelle 2: Auflistung der für die durchgeführten Experimente verwendeten Geräte
Geräte Hersteller
Autobürette Radiometer Copenhagen
Betacounter Wallac 1409
DVC-1000 Dual Voltage Clamp World Precision Instruments EVC-4000 World Precision Instruments Lichtquelle World Precision Instruments
PCR-Gerät Perkin Elmer
pH-Meter mit pH-Glaselektrode Radiometer Copenhagen
Photometer Beckmann Preamplifier World Precision Instruments
Stereomikroskop World Precision Instruments
Titrator Radiometer Copenhagen
Wärmeumwälzpumpe Haake
Osmometer Roebling
3.1.3 Versuchstiere
Die NKCC1 Knockout-Maus wurde im Labor von Gary E. Shull in Cincinnati erzeugt und charakterisiert. Die Inaktivierung des Na+/K+/2Cl--Kotransporters erfolgt, indem der für das
Material und Methoden 38
NKCC1-Protein kodierende Sequenzbereich (Slc12a2) durch das Einfügen des Neomycin-Gens in Exon 6 unterbrochen wird (38).
Die CFTR Knockout-Maus wurde im Labor von R. Ratcliff, M.J. Evans und W.H. Colledge in Cambridge erzeugt und charakterisiert. Von den CF-Mäusen wird kein Wildtypprotein her-gestellt, da die Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) Kassette die für das CFTR-Protein kodierende Sequenz unterbricht und ein Stoppkodon einfügt. Keines der möglicher-weise aus der geschädigten Region entstehenden RNA-Transkripte kann für ein funktions-tüchtiges CFTR-Protein kodieren (181).
Die Aufzucht der Mäuse fand unter standardisierten Licht- und Klimakonditionen im Tierstall des Physiologischen Institutes in Tübingen statt.
Im Hinblick auf die CF-Mäuse ist zu erwähnen, dass alle Tiere einschließlich der CFTR (+/+) auf eine faserfreie Diät (Special Diet Services, Cambridge, UK) gesetzt, die Käfige mit
`Corncob` (Mucedola, Settimo Milanese, Italy) eingestreut und eine spezielle polyethylen-glykolhaltige Elektrolyt-Trinkflüssigkeit (Kleanprep, Norgine, Marburg, Germany) zur Ver-fügung gestellt wurde. Die NKCC1 (-/-) und (+/+) Mäuse dagegen erhielten die übliche, aus Sägespänen bestehende Einstreu und bekamen normales Futter und Wasser. Im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden Tiere beider Stämme mit einem Gewicht von ca. 18-20 g für die Ver-suche herangezogen.
Die (+/+) Geschwistertiere dienten jeweils als Kontrollpopulation.
Das Versuchsprotokoll wurde durch den Universitätstierarzt und das Regierungspräsidium Tübingen gemäss dem geltenden Tierschutzrecht genehmigt.
3.2 Methoden
3.2.1 Genotypisierung der NKCC1 Knockout-Mäuse
Die Genotypisierung zur Selektion der verwendeten Knockout-Mäuse NKCC1 und CFTR wurde ungefähr drei Wochen nach der Geburt durchgeführt. Die CFTR Knockout-Mäuse
Material und Methoden 39
wurden bereits genotypisiert zur Verfügung gestellt; die Methode der Genotypisierung wurde von Seidler et al. (105) ausführlich beschrieben.
Zur Genotypisierung der NKCC1 Knockout-Mäuse wurde während einer kurzen Äthernarko-se eine Gewebeprobe für die DNA-Gewinnung aus dem Ohr gestanzt. Die Präparation der genomischen DNA erfolgte mit Hilfe des DNeasy Kits (Qiagen, Hilden) nach den Angaben des Herstellers. Circa 100 ng der chromosomalen DNA wurden als Template in einem 25µl PCR-Ansatz eingesetzt. Wildtyp- und mutiertes Allel wurden jeweils in getrennten Ansätzen amplifiziert. Primer für die Wildtyp-PCR waren die Oligonukleotide NKCC-6-5 (5`-GGAACATTCCATACTTATGATAGATG-3`) und NKCC-6-3 (5`-CTCACCTTTGCTTCC-CACTCCATTCC-3`). Sie führten zur Amplifikation eines 105 bp großen PCR-Produktes.
Das mutierte Allel wurde durch das Primerpaar NKCC-6-5 und NKCC-dNEOpolyA (5`-GACAATAGCAGGCATGCTGG-3`) amplifiziert, das PCR-Produkt hatte eine Größe von 156 Basenpaaren. Die Temperaturbedingungen waren für beide Reaktionen identisch: Dena-turierung 3 min bei 94°C, anschließend 40 Reaktionszyklen mit DenaDena-turierung bei 94°C für 45 s, Annealing 58°C für 60 s und Synthese 72°C für 90 s. Zum Abschluss folgte ein 10-minütiger Syntheseschritt bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden auf ein 2,5% ethidiumbro-midhaltiges Agarose-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde unter UV-Beleuchtung fotografiert, danach konnte der Genotyp der Mäuse über die Länge der vor-handenen PCR-Produkte identifiziert werden.
3.2.2 Präparation des Jejunums
Die Mäuse waren mit CO2, das in eine geschlossene Glaskammer geleitet wurde, betäubt und anschließend durch zervikale Dislokation getötet worden. Daraufhin wurde das Abdomen eröffnet und der Dünndarm herausgenommen. Das Explantat wurde mit einer 4°C kalten, O2 -gesättigten Ringerlösung durchgespült, um den Darminhalt zu entfernen und die Ischämieto-leranz zu erhöhen. Aus dem Bereich des Jejunums wurde anschließend ein ca. 2 cm langer Darmabschnitt entnommen, entlang des Mesenterialansatzes mit einer Schere in
Längsrich-Material und Methoden 40
tung eröffnet und die mukosale Seite noch einmal mehrfach mit der kalten Ringer-Lösung zwecks Entfernung von Chymusresten abgespült. Als Präparationsvorrichtung diente eine Kunststoffschale, die bis auf halbe Höhe mit Paraffin ausgegossen war und in der Seite Lö-cher zwecks der Anbringung von fünf Glasfaserkabeln aufwies, die wiederum von einer Lichtquelle ausgingen. Die Paraffinoberfläche besaß eine Vertiefung, über die das Darmstück mit Hilfe von Stecknadeln straff, mit der serosalen Seite nach oben gerichtet, aufgespannt wurde; dies verhinderte ein Druckschädigung der empfindlichen Mukosa. Die Präparation fand in frischer voroxygenierter eiskalter und zuvor mit Indomethazin [50 µM] versetzter Ringer-Lösung statt. Unter einem Stereomikroskop wurden nun die Tunica serosa und die Tunica muscularis, Stratum longitudinale und circulare in dieser Reihenfolge mit Hilfe einer spitzen Pinzette abpräpariert. Auch die Tela submucosa wurde vorsichtig so weit wie möglich abgetragen, bis die Zottenstruktur der Tunica mucosa deutlich erkennbar war. Daraufhin konnte das präparierte Darmstück zwischen den beiden Hälften der in Abbildung 3 dargestell-ten Polyacrylkammer aufgespannt werden; diese Kammer wurde nun in die Haltevorrichtung des Ussingkammer-Aufbaus eingespannt, jeweils mit den beiden Perfusionskammern und den Elektroden verbunden und der Versuch unmittelbar daraufhin gestartet.
Da es zur Erhöhung der Ischämietoleranz und zur Verminderung von Autolyse wichtig war, das Gewebe nach Entnahme und während der Präparation auf 4°C herunter zu kühlen, und der in die Ussingkammer eingespannte Darm anderen Perfusionslösungen, die eine Temperatur von 37°C aufwiesen, ausgesetzt war, wurde dem Gewebestück vor Beginn des eigentlichen Versuches in der Ussingkammer eine Regenerationszeit von 60 min zugestanden. Im Verlauf dieses Zeitabschnittes sollten die zu messenden Parameter eine Stabilität erreicht haben, auf deren Grundlage mit der Durchführung des eigentlichen Versuchsschemas begonnen werden konnte. Gewebe, die nach dieser Zeit keine adäquaten Messparameter aufwiesen, wurden nicht zum Versuch herangezogen. Der in Kapitel 3.2.5 beschriebene Ussingkammer-Aufbau erlaubt sowohl die Bestimmung elektrophysiologischer Parameter als auch die Bikarbonatsek-retionsmessung mittels der pH-stat-Methode.
Material und Methoden 41
3.2.3 Das Kurzschlussstromexperiment
Der dänische Physiologe Hans Peter Ussing etablierte in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts das nach ihm benannte Kurzschlussstromexperiment an Froschhautepithelien (187). Der Ver-suchsaufbau erlaubt es, experimentell die Formen des aktiven epithelialen Ionentransportes von denen des passiven abzugrenzen. Wenn alle äußeren Gradienten für passiven Io-nentransport ausgeschaltet werden, kann der danach verbleibende messbare Transport nur noch primärer, sekundärer oder tertiärer Natur sein.
Das interessierende Epithelstück wurde in eine Polyacrylkammer eingespannt, die es somit in 2 Kompartimente teilte. Auf beiden Seiten wurden nun identische Volumina isoosmolarer Elektrolytlösung in zwei 15 ml fassende Reservoire eingefüllt, somit wurden sowohl der hyd-rostatische Druckgradient als auch der Konzentrationsgradient ausgeschaltet.
Auch der elektrische Gradient für passive Ionenbewegungen kann beseitigt werden. Folgende Überlegungen sind hierfür wichtig: Unter der Vielzahl der aktiven epithelialen Io-nentransportmechanismen sind einige elektrogen, das heißt, sie erzeugen gemäß dem Ohm-schen Gesetz eine sich über das Epithel einstellende Potentialdifferenz bzw. Spannung. Ein Beispiel hierfür ist der Na+/Glukose-Kotransport. Die einseitige Bewegung von Kationen in die eine Richtung muss entweder den passiven Mittransport von Anionen in die gleiche Rich-tung und/oder von Kationen in die GegenrichRich-tung zur Folge haben. Der spezielle Ussing-kammer-Aufbau (siehe Abbildung 3) erlaubt es nun, von außen einen Strom auf das Epithel zu applizieren, der entgegengesetzt gerichtet und genau so eingeregelt wird, dass er gleich groß ist wie der durch den aktiven Transport erzeugte Strom. Der elektrische Gradient ist so-mit ausgeschaltet. Dieser sogenannte Kurzschlussstrom (short-circuit-current oder Isc) stellt ein Maß für den aktiven Ionentransport von einer Seite des Epithels auf die andere Seite dar.
Man kann an der Ussingkammer auch einen zweiten Messmodus, den des “open-circuit-current“, schaffen, der im Versuchsaufbau der vorliegenden Arbeit mit Ausnahme der radio-aktiven Flux-Versuche zur Anwendung kam. Unter physiologischen Bedingungen stellt sich über das Epithel spontan eine charakteristische Potentialdifferenz ein, die in diesem Modus nicht ausgeglichen, sondern nur gemessen wird. Der transepitheliale elektrische Gradient
Material und Methoden 42
bleibt also erhalten. Eine in einem bestimmten zeitlichen Intervall erfolgende epithelferne Applikation eines geeigneten Stromstoßes führt zur Änderung der transepithelialen Potential-differenz ∆PDt. Dies ermöglicht die Berechnung des epithelialen Widerstandes (R) mit Hilfe des Ohmschen Gesetzes:
R = ∆PDt/∆I (1).
Die Gewebeleitfähigkeit (G) entspricht dem reziproken Wert des Gewebewiderstandes:
G = 1/R (2).
Der Kurzschlussstrom (Isc) wird ebenfalls nach dem Ohmschen Gesetz aus der vor dem Strompuls gemessenen PDt und der errechneten Gewebeleitfähigkeit ermittelt:
Isc = PDt/R (3).
Im vorliegenden Versuchsaufbau wurde die Potenzialdifferenz (PDt) über zwei epithelnah angebrachte Elektroden (3M KCl-Agar-Brücken) kontinuierlich aufgezeichnet und mit Hilfe eines Voltage clamp Gerätes alle 300 Sekunden ein Stromstoß von 40 µA/cm2 über die beiden epithelfernen Elektroden appliziert. Mit Hilfe der Formeln 1 und 2 wurde der Isc, der ein Maß für den vom Gewebe erzeugten elektrogenen Nettoionentransport darstellt, ausgerechnet.
3.2.4 pH-stat-Titration
Die Messung der jejunalen Bikarbonatsekretion (JHCO3
-) erfolgte mit der hierfür geeigneten Methode der pH-stat-Titration, deren Prinzip auf der kontinuierlichen Gegentitration der ins Lumen sezernierten Basen-Äquivalente mittels einer starken Säure beruht und somit der Auf-rechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes diente.
Die zwei in Abbildung 3 dargestellten jeweils 15 ml fassenden Reservoire, die einzeln begast werden können, waren für die Perfusion der das Epithel enthaltenden Kammer verantwortlich.
Die physiologische Temperatur von 37° C wurde mittels einer Wärmeumwälzpumpe erreicht,
Material und Methoden 43
die das erwärmte Wasser durch ein die beiden Reservoire zusätzliches ummantelndes Hohl-raumsystem pumpte.
Die gepufferte Nährlösung auf der serosalen Seite wurde mit Carbogen, die ungepufferte phy-siologische NaCl-Lösung (0,9% w/v) der mukosalen bzw. luminalen Seite mit 100% O2 be-gast.
Die gepufferte serosale Lösung wies einen pH-Wert von 7,4±0,03 bei 37°C auf, der pH-Wert von 7,4 des luminalen Perfusates wurde durch eine den gesamten Versuch bestehende pH-stat-Titration aufrechterhalten. Somit konnte ein pH-Gefälle zwischen den beiden Seiten und ein zunehmend unphysiologischer pH-Wert vermieden werden.
Das vom Jejunum kontinuierlich sezernierte Bikarbonat wurde mit HCl titriert. Es war nun möglich, die Menge an verbrauchter Säure mit der Bikarbonatsekretion gleichzusetzen, da das Reaktionsgleichgewicht der Reaktion HCO3
+ H+ ↔ H2O + CO2 überwiegend auf der rech-ten Seite liegt. Die Stärke der Säure wurde so eingestellt, dass ein optimaler Kompromiss zwischen Genauigkeit der Bikarbonatsekretionsmessung und möglichst geringer Volumenbe-lastung des luminalen Kompartimentes zustande kam; im vorliegenden Fall wurde eine Kon-zentration von 5 mmol/l gewählt. Die verbrauchte Menge an titrierter Säure wurde durch ein spezielles Computerprogramm, entwickelt von Georg Lamprecht aus der Arbeitsgruppe Seid-ler, registriert, über eine Zeiteinheit von 5 min gemittelt und in der Einheit µmol x cm-2 x h-1 angegeben.
Material und Methoden 44
3.2.5 Aufbau des Ussingkammer-Setups
Abbildung 3: Ussingkammer-Setup
Das Epithel (a) wird in eine Polyacrylkammer (b) mit einer offenen Fläche von 0,625 cm2 eingespannt. Im luminalen Kompartiment (c) erfolgt die stat-Titration mit Hilfe einer pH-Elektrode, einer Autobürette und eines Titrators. Die Begasung erfolgt hier mit 100% igem O2. Die Lösung im serosalen Kompartiment (d) wird mit Carbogen begast. Beide Komparti-mente sind zusätzlich durch ein Wasserreservoir (e) ummantelt, durch das Wasser mit einer Temperatur von 37°C zirkuliert. Dargestellt sind die beiden epithelfernen Elektroden (f) mit Stromquelle (g) und Ampèremeter (h), weiterhin die beiden epithelnahen Elektroden (i) mit Voltmeter (k), die der Messung der Potentialdifferenz dienen.
Material und Methoden 45
3.2.6 Transepitheliale Fluxmessungen
Ionen bewegen sich durch passive Diffusion und durch primär, sekundär und tertiär aktive Transportprozesse der Zelle sowohl von serosal nach mukosal als auch in umgekehrter Rich-tung. Da der Isc nur die Summe der elektrogenen Ionenbewegungen über das Epithel wieder-spiegelt und somit nur allgemeine Aussagen zulässt, kann man die Bewegungen bestimmter Ionenarten mit Hilfe geeigneter Nuklide als Tracer messen. Im vorliegenden Fall wurde das Chlor-Isotop 36Cl- zur Aufklärung der Rolle des Cl- verwendet, wobei der Netto Cl--Flux die Summe sämtlicher Bewegungen des jeweiligen Ions über das Epithel, seien sie passiv, aktiv, elektrogen oder elektroneutral, darstellt. Um die Veränderung der parazellulären Permeabilität unter bestimmten Versuchsbedingungen zu messen, wird der 3H-markierte Zucker Mannit, der von der Zelle nicht verstoffwechselt werden kann, verwendet.
3.2.7 Verwendete Reagenzien
Die Lösungen und Puffer wurden mit Hilfe von deionisiertem und zusätzlich durch eine Milli-Q-Plus Filtrieranlage (Millipore) gereinigtem Wasser hergestellt. Die Zubereitung der Lösun-gen erfolgte entweder am Versuchstag oder am Abend zuvor. Die Osmolarität (Sollwert 308 mosm/l) und der pH-Wert (Sollwert 7,4±0,03) wurden überprüft und die Lösungen bei 4°C aufbewahrt. Tabelle 3 gibt die Ionenzusammensetzung und die Osmolarität im Einzelnen wieder.
Material und Methoden 46
Tabelle 3: Zusammensetzung der verwendeten Puffer und Lösungen
Substanz
Material und Methoden 47
Na-Pyruvat
**
20 20 20 20
Theo-retische Osmola-rität
308 (306,5) 308 (306,5) 308 (306,6) 308 (306,6) 308 308
*Zusatz von 2 mmol/l Mannit bilateral bei der Fluxbestimmung für 3H-Mannitol zur Vermei-dung eines Konzentrationsgradienten für Mannitol
** Zusatz kurz vor Versuchsbeginn
3.2.8 Versuchsschemata 3.2.8.1 Allgemeines Vorgehen
Zu Beginn der Experimente, d.h. unmittelbar nach Einspannen der präparierten Epithelien, wurden Tetrodotoxin [10-6 M], Indomethazin [30 µM] und NaPyruvat [10mM] in das serosale Perfusat appliziert. Tetrodotoxin ist das Gift des Kugelfisches und hemmt in dieser Konzent-ration schnelle Na+-Kanäle neuronaler Zellen, was zur Blockade der Neurotransmitterauss-chüttung führt. Dadurch wurden die Neurone des durch die Präparation nicht vollständig ent-fernten Plexus submucosus ausgeschaltet, deren Signale spontane PD- und Isc-Schwankungen verursachen können. Indomethazin diente der Verhinderung einer endogenen Prostaglandin-synthese, welche zu einer Stimulation der Chlorid- und Bikarbonatsekretion geführt hätte, und NaPyruvat sollte die sekretorische Leistung der Epithelzellen fördern.
Als Stimulatoren der intestinalen Sekretion wurde in den Versuchen mit NKCC1 Knockout-Mäusen Forskolin [10 µM], in den Versuchen mit CFTR Knockout-Knockout-Mäusen db-cAMP [1 mM] verwendet. Forskolin aktiviert die Adenylatzyklase, wodurch eine intrazelluläre
Produk-Material und Methoden 48
tion des sekundären Botenstoffes cAMP bewirkt wird. Das membrangängige db-cAMP führt zu einer direkten Erhöhung der intrazellulären cAMP-Konzentration.
Mit der Applikation der eigentlichen Testsubstanzen (3.2.8.2.2-4) wurde stets frühestens 10 Minuten nach Erreichen stabiler Basalparameter betreffend der Potentialdifferenz (PDt), des Kurzschlussstroms (Isc) und der Bikarbonatsekretion (HCO3
-) begonnen. Um hydrostatische und osmotische Druckdifferenzen und dadurch entstehende Störfaktoren zu vermeiden, wur-den alle Substanzen in einem Volumen von maximal 1% des entsprechenwur-den Perfusat-Volumens zugesetzt und, wenn es die chemischen Eigenschaften bezüglich der Hydrophilie der Substanz zulassen, in Aqua bidest. gelöst. Wenn sich die entsprechende Substanz nur in DMSO lösen ließ, wurde nur eine Menge, die 0,1% des Perfusat-Volumens entspricht, zuge-setzt, da DMSO seinerseits die elektrischen Verhältnisse an der Zellmembran verändern kann und in möglichst geringer Konzentration verwendet werden muss. Alle angegebenen Sub-stanzkonzentrationen stellten die Endkonzentrationen am Epithel dar.
3.2.8.2 Hemmung einzelner Ionentransportmechanismen
3.2.8.2.1 Blockade des Na+/K+/2Cl--Kotransports (NKCC) durch Bumetanid
Das Schleifendiuretikum Bumetanid hemmt in einer Konzentration von 0,5 mM selektiv die beiden Isoformen NKCC1 und NKCC2. Von funktioneller Bedeutung im Dünndarm ist die Isoform NKCC1, die basolateral exprimiert wird. Durch die Applikation von Bumetanid in das basolaterale Perfusat wird bei den NKCC1 (+/+) Mäusen ein wichtiger Teil der zellulären Cl--Aufnahme gehemmt.
3.2.8.2.2 Blockade des Na+/HCO3
--Kotransports durch S0859
Um eine Hemmung des basolateralen Na+/HCO3--Kotransporters zu erzielen, wurde eine von der Fa. Aventis eigens dafür erzeugte Substanz verwendet. Der NBC-Inhibitor S0859 kam in
Material und Methoden 49
einer Konzentration von 100 µM zum Einsatz und wurde dem basolateralen Perfusat zuge-fügt.
3.2.8.2.3 Hemmung der Karboanhydrase durch Azetazolamid
Eine Blockade des sich in den Enterozyten befindlichen Enzyms Karboanhydrase II, das die Gleichgewichtseinstellung der Reaktion H2O+CO2 ↔ H2CO3 ↔ HCO3
+ H+ beschleunigt, wird zu 99,9% durch die bilaterale Applikation von Azetazolamid in einer Konzentration von 1 mM erreicht. Da die intrazelluläre Bikarbonatherstellung dadurch faktisch zum Erliegen kommt, ließen sich hier differenziertere Aussagen über verschiedene Wege der Bikarbonat-gewinnung des Enterozyten ableiten.
Nach der bilateralen Applikation von Azetazolamid kam das durch diese Substanz angesäuer-te Perfusat (0,9 % ige luminale NaCl-Lösung) erst wieder mit dem Epithel in Berührung, nachdem der pH-Wert erneut auf 7,4 ± 0,03 eingestellt worden war.
3.2.8.2.4 Blockade des Cl-/HCO3
--Austausches und des Na+/HCO3
--