Charakterisierung der Chloridsekretion im Jejunum und Colon von Schweinen
verschiedener Altersgruppen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Julia Irene Hempe geb. Kock
Rendsburg
Hannover 2007
1. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves
2. Gutachter: Prof. Dr. Marcus Pröpsting
Tag der mündlichen Prüfung: 05. November 2007
Characterisation of chloride currents in the jejunum and colon of pigs.
Vortrag, 16. Symposium der Fachgruppe Physiologie und Biochemie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft e.V.
19. - 21.02.2006 in Gießen
KOCK J., B. SCHRÖDER u. G. BREVES (2006):
Characterisation of chloride currents in the jejunum and colon of pigs.
Vortrag, 60. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 21. - 23.03.2006 in Göttingen
Abstract in: Proc. Soc. Nutr. Physiol. 15, 121
KOCK J., B. SCHRÖDER u. G. BREVES (2006):
Characterisation of chloride currents in the jejunum and colon of pigs.
Poster, 10th International Symposium on Digestive Physiology in Pigs 25. - 27.05.2006 in Vejle (DK)
Short Paper in: Livest. Sci. 109, 42 - 45
KOCK J., S. LEONHARD-MAREK u. G. BREVES (2007):
Functional studies on Ca2+-activated chloride secretion in the porcine colon.
Vortrag, 21. Tagung der European Intestinal Transport Group 03. - 06.03.2007 in Oberwiesenthal
Abstract in: J. Physiol. Biochem. 63, 18
KOCK J., B. SCHRÖDER u. G. BREVES (2007):
Effects of weaning on chloride secretion in the jejunum of piglets.
Vortrag, 61. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 06. - 08.03.2007 in Göttingen
Abstract in: Proc. Soc. Nutr. Physiol. 16, 53
KOCK J., S. LEONHARD-MAREK u. G. BREVES (2007):
Functional studies on Ca2+-activated chloride secretion in the porcine colon.
Vortrag, 86. Tagung der Deutschen Physiologischen Gesellschaft 25. - 28.03.2007 in Hannover
Abstract in: Acta Physiol. 189, Suppl. 653, 57
Inhaltsverzeichnis
V
ERZEICHNISDER VERWENDETENA
BKÜRZUNGEN1 E
INLEITUNG UNDL
ITERATURÜBERSICHT1
1.1 Bedeutung der intestinalen Chloridsekretion 1 1.1.1 Physiologische Funktionen der Chloridsekretion 1 1.1.2 Klinisch relevante Störungen der Chloridsekretion 1 1.2 Mechanismen der intestinalen Chloridsekretion 2
1.3 Stimulation der Chloridsekretion 3
1.4 Altersabhängigkeit der Chloridsekretion 4
1.5 Effekt des Absetzens auf die Chloridsekretion 5
1.6 Ziel der Arbeit 7
2 M
ATERIALUNDM
ETHODEN8
2.1 Tiere 8
2.1.1 Mastschweine 8
2.1.2 Ferkel 8
2.2 Haltungsbedingungen 9
2.3 Gesundheitszustand der Tiere 10
2.4 Gewebeentnahme 10
2.5 Präparation der Mucosa 11
2.6 Untersuchungen in der Ussingkammer 12
2.6.1 Prinzip der Ussingkammer-Technik 12
2.6.2 Verwendete Apparaturen 14
2.6.3 Ablauf der Ussingkammerversuche 14
2.7 Versuchsprotokolle 15
2.7.1 Das Grundprotokoll 16
2.7.2 Anwendung des Grundprotokolls 17
2.7.3 Dosis-Wirkungskurven für NPPB 18
2.7.4 Abwandlungen des Grundprotokolls 19
2.8 Auswertung der elektrophysiologischen Parameter 20
2.8.1 Verlaufskurven 21
2.8.2 Diskrete Messpunkte 22
2.8.3 Dosis-Wirkungskurven 23
2.9 Statistik 24
3 E
RGEBNISSE25
3.1 Elektrophysiologische Parameter im Grundprotokoll 25
3.1.1 Allgemeines Muster der Verlaufskurven 25
3.1.2 Spezifische Beobachtungen an Jejunum und Colon 26
3.2 Dosis-Wirkungsbeziehungen für NPPB 27
3.3 Vergleich der Tiergruppen 30
3.3.1 Jejunum 31
3.3.2 Colon 34
3.4 Beobachtungen mit dem abgewandelten Grundprotokoll 37
3.4.1 Jejunum 37
3.4.2 Colon 40
4 D
ISKUSSION47
4.1 Allgemeine Charakterisierung der Chloridsekretion 47
4.1.1 Konzeption des Grundprotokolls 47
4.1.2 Zuordnung der elektrophysiologischen Veränderungen zu Ionenströmen 50
4.1.3 Besonderheiten von Jejunum und Colon 54
4.1.4 Beurteilung der eingesetzten NPPB-Konzentrationen 55 4.2 Einfluss von Alter und Absetzen auf die Chloridsekretion 57 4.3 Funktionelle Differenzierung intestinaler Chloridkanäle 61
4.3.1 Jejunum 62
4.3.2 Colon 63
5 Z
USAMMENFASSUNG68
6 S
UMMARY70
7 L
ITERATURVERZEICHNIS72
8 A
NHANG80
8.1 Verwendete Substanzen sowie Geräte und Material 80
8.1.1 Substanzen 80
8.1.2 Geräte und Material 81
8.2 Lösungen und Puffer 81
8.3 Auswirkungen der Infektion mit enterotoxischen E. coli 83 8.4 Statistische Vergleiche zwischen den Tiergruppen 86
8.4.1 Jejunum 86
8.4.2 Colon 90
8.5 Statistische Vergleiche im abgewandelten Grundprotokoll 94
8.5.1 Jejunum 94
8.5.2 Colon 99
D
ANKSAGUNGVerzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Zusätzlich zu allgemein üblichen Abkürzungen werden folgende Abkürzungen in der Arbeit verwendet:
AC Adenylatcyclase
Aqua dest. destilliertes Wasser („Aqua destillata“)
ATP Adenosintriphosphat
CaCC calciumaktivierte Chloridkanäle („calcium activated chloride channels“) cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat
CI Konfidenzintervall
CRH Corticotropin-Releasing-Hormon
CT Choleratoxin
DAG Diacylglycerol
DE Deutsches Edelschwein
DIDS 4,4'-Diisothiocyanostilben-2,2'-disulfonsäure
DL Deutsche Landrasse
DMSO Dimethylsulfoxid
EC50 halbmaximale effektive Konzentration
EGF epidermaler Wachstumsfaktor („epidermal growth factor“) ETEC enterotoxigene Escherichia coli
Fa. Firma
GC Guanylatcyclase
Gt Gewebeleitfähigkeit
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure
Ic Klemmstrom
IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat
Isc Kurzschlussstrom
LIS lateraler Interzellulärspalt MW arithmetischer Mittelwert
n Grundgesamtheit, hier Anzahl der Tiere NKCC Natrium-Kalium-2Chlorid-Cotransporter NPPB 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoat
ORCC auswärts rektifizierender Chloridkanal („outwardly rectifying chloride channel”)
PDt transepitheliale Potentialdifferenz
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PKG Proteinkinase G
PLC Phospholipase C
R² Bestimmtheitsmaß
SD Standardabweichung („standard deviation“)
TEA Tetraethylammonium
VIP vasoaktives intestinales Peptid
Chemische Elemente werden entsprechend der internationalen Nomenklatur abgekürzt.
1 Einleitung und Literaturübersicht
1.1 Bedeutung der intestinalen Chloridsekretion
1.1.1 Physiologische Funktionen der Chloridsekretion
Chlorid hat als Regulativ der Flüssigkeitsbewegungen eine wichtige Aufgabe an sekretori
schen Epithelien. Im Verbund mit Natrium fungiert es als osmotische Triebkraft für einen pa
razellulären Wasserstrom, so dass Chloridsekretion stets eine Flüssigkeitsabgabe über die Mu
cosa nach sich zieht.
Auch an der Darmschleimhaut besteht dieser Zusammenhang von Chlorid- und Wassersekre
tion. Das richtige Maß von Flüssigkeitsabgabe in den Darm ist für die Verdauungsvorgänge von großer Bedeutung und wird über die Chloridsekretion reguliert. Die Aufgaben des Was
sers im Darmlumen sind vielfältig. Es erzeugt eine optimale Konsistenz der Digesta für Durchmischung und Transport und befeuchtet die Mucosa, um sie vor mechanischen Schädi
gungen zu schützen. Verdauungsenzyme können nur in einem wässrigen Milieu zu ihren Sub
straten diffundieren und auf sie einwirken. Auch die wasserlöslichen Verdauungsprodukte be
nötigen dieses Milieu, um zum absorptiven Epithel diffundieren zu können (FORSYTH u.
GABRIEL 1988, BARRETT u. KEELY 2000).
1.1.2 Klinisch relevante Störungen der Chloridsekretion
Sowohl übermäßige als auch zu geringe intestinalen Chloridsekretion führt zu ernstzuneh
menden Krankheitserscheinungen.
Eine reduzierte Chloridabgabe ins Darmlumen ist vor allem bei der genetisch bedingten Er
krankung Mukoviszidose oder Zystische Fibrose bekannt. Durch das fehlende wässrige Mi
lieu kommt es hier zu Maldigestion und Malabsorption, die Kombination mit sehr zähem Mu
cus kann zu Obstipation und im Extremfall zu einem Ileus führen (MILLA 1998).
Die übermäßige Stimulation der Chloridsekretion findet sich bei einer sekretorischen Diar
rhöe. Hier bedingt eine überschießende Chloridsekretion einen massiven Flüssigkeitseinstrom ins Darmlumen, der die absorptiven Kapazitäten der Mucosa übersteigt und so zu den klini
schen Erscheinungen der Diarrhöe führt. Die Ursache für diese Erkrankung liegt häufig in ei
ner Infektion mit toxinbildenden Bakterien wie den enterotoxigenen Escherichia coli (ETEC).
Die sekretorische Diarrhöe kann mit großen Flüssigkeitsverlusten einhergehen und stellt des
wegen eine erhebliche Gefahr für Kinder und Jungtiere dar, bei denen die schnell eintretende Dehydratation unbehandelt häufig zum Tode führt (THAPAR u. SANDERSON 2004). Zu
sätzlich weisen juvenile Individuen generell eine höhere Empfindlichkeit für infektiöse Durchfallerkrankungen auf als adulte (FARTHING 2000).
1.2 Mechanismen der intestinalen Chloridsekretion
Chlorid wird vom Blut über den Natrium-Kalium-2Chlorid-Cotransporter (NKCC) in der ba
solateralen Zellmembran in die Zellen des intestinalen Epithels aufgenommen. Energetisiert wird dieser Transport über den transmembranären Natriumgradienten, der von der basolateral lokalisierten Natrium-Kalium-ATPase aufrechterhalten wird. Es handelt sich also um einen sekundär aktiven Transport. Das über NKCC und Na+-K+-ATPase aufgenommene Kalium verlässt die Zelle über Kaliumkanäle in der basolateralen Membran, trägt so zum Erhalt des Transmembranpotentials bei und erzeugt eine negative Ladung im Zellinnern, die als Trieb
kraft für den Chloridausstrom an der apikalen Membran wirkt (BREVES u. DIENER 2005).
Dieser Chloridausstrom erfolgt im intestinalen Epithel hauptsächlich über den Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-Kanal (BARRETT u. KEELY 2000). Ergeb
nisse verschiedener Autoren weisen auf die Existenz weiterer alternativer Chloridkanäle hin, deren molekulare Identität allerdings noch nicht vollständig geklärt ist. So wird die Existenz calciumaktivierter Chloridkanäle (CaCC) angenommen (GRUBER et al. 1998, BRONSVELD et al. 2000); die Vermutung, sie in den Proteinen der CLCA-Familie gefunden zu haben (FULLER et al. 2001, LOEWEN et al. 2002), konnte jedoch nicht bestätigt werden (LOEWEN et al. 2004, GIBSON et al. 2005). Auch die molekulare Struktur und physiologi
sche Relevanz des auswärts rektifizierenden Chloridkanals („outwardly rectifying chloride channel”, ORCC) (SCHWIEBERT et al. 1994, HRYCIW u. GUGGINO 2000) ist bisher un
klar (JENTSCH et al. 2002).
Da die Sekretion von Chlorid eine Verschiebung negativer Ladung von der serosalen zur mu
cosalen Seite des Epithels bedeutet, wird ein elektrischer Gradient aufgebaut, der den passi
ven parazellulären Transport von Natriumionen nach mucosal begünstigt. Der dadurch er
zeugte osmotische Gradient führt zu einem parazellulären Wassereinstrom ins Darmlumen (BREVES u. DIENER 2005).
1.3 Stimulation der Chloridsekretion
Es existieren zwei prinzipielle Aktivatoren der Chloridsekretion: cyclische Purinnukleotide und freie Calciumionen. Die zugehörigen Stimulationswege sowie die in Kap. 1.2 beschriebe
nen Mechanismen der Chloridsekretion sind in Abb. 1 dargestellt.
Die cyclischen Purinnukleotide cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) und cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) werden durch Adenylatcyclase (AC) bzw. Guanylatcyclase (GC) in der Zelle gebildet, wenn ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor durch einen sekretions
fördernden Stoff wie vasoaktives intestinales Peptid (VIP) aktiviert wurde. cAMP aktiviert Proteinkinase A (PKA), cGMP Proteinkinase G (PKG), die beide eine Phosphorylierung und damit eine Aktivierung von CFTR-Kanälen bewirken (VAANDRAGER et al. 1997, BARRETT u. KEELY 2000). cAMP führt auch zu einer Öffnung von ORCC (SCHWIEBERT et al. 1994). Die Proteinkinasen A und G haben nicht nur die Öffnung be
reits in der Membran vorhandener CFTR-Kanäle zur Folge, sondern auch die Neuintegration aus subapikalen Vesikeln (AMEEN et al. 2003, GOLIN-BISELLO et al. 2005).
Abb. 1: Schema der Mechanismen der transepithelialen Chloridsekretion und ihrer zwei Stimulati
onswege. Erläuterungen siehe Kap. 1.2 und 1.3.
K+ _ +
ATPase 3Na+
2K+ Na+, H2O
serosale Seite mucosale Seite
PLC AC/GC
PKA/G
IP3
DAG Ca2+
Na+ K+ 2Cl-
NKCC G
Ligand m3
Ligand
cAMP/
cGMP
Cl- CaCC CFTR
Cl- ORCC
Cl-
PKC
Calciumionen werden intrazellulär freigesetzt, wenn durch Bindung eines Liganden, physiolo
gischerweise Acetylcholin, an den muscarinergen m3-Rezeptor die membranassoziierte Phos
pholipase C (PLC) aktiviert wird. Diese hydrolysiert Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat zu Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG). IP3 bewirkt dann die Freisetzung von Calcium, während DAG zur Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) führt (BERKES et al. 2003). Durch Calcium werden basolateral Kaliumkanäle geöffnet, wodurch ein verstärkter Kaliumausstrom aus der Zelle entsteht und durch die resultierende Hyperpolarisation die Triebkraft für die Chloridsekretion erhöht wird. Zusätzlich werden eventuell vorhandene cal
ciumaktivierte Chloridkanäle (CaCC) geöffnet (BARRETT u. KEELY 2000). Proteinkinase C aktiviert zusätzlich CFTR-Kanäle, die somit auch an der calciumvermittelten Chloridsekretion beteiligt sind (BRONSVELD et al. 2000, CHAPPE et al. 2004).
1.4 Altersabhängigkeit der Chloridsekretion
Wie bereits erwähnt (Kap. 1.1.2), zeigen Jungtiere allgemein eine höhere Empfänglichkeit für sekretorische Diarrhöe als Adulte. Auch für das Schwein ist aus der Praxis bekannt, dass Fer
kel besonders gefährdet sind, während ältere Tiere im Mastalter sehr viel seltener eine Diar
rhöe entwickeln.
Soweit es sich um Infektionen mit ETEC handelt, kann die abnehmende Empfindlichkeit teil
weise mit altersbedingten Veränderungen an den F5-Fimbrienrezeptoren erklärt werden. Die F5-Fimbrien werden von den ETEC zur Adhäsion an der Bürstensaummembran der Darm
schleimhaut benötigt. Bei Tieren über 6 Monaten fehlen die Zielstrukturen zur Adhäsion für die Fimbrien, so dass keine Erkrankungen mehr auftreten können (TENEBERG et al. 1990).
Jedoch weisen nicht alle ETEC-Stämme auch F5-Fimbrien auf, und nicht alle sekretorischen Diarrhöe-Erkrankungen sind ETEC-assoziiert. Es werden daher weitere Gründe für die Al
tersabhängigkeit der Inzidenz dieser Erkrankungen vermutet. Zwei mögliche Ursachen sind eine verminderte Empfindlichkeit bzw. eine verringerte Rezeptordichte der Darmschleimhaut für Enterotoxine oder eine herabgesetzte sekretorische Kapazität der Mucosa bei älteren Tie
ren (McEWAN et al. 1990).
Verschiedene Autoren sind diesen Hypothesen nachgegangen. McEWAN et al. (1990) fan
den im proximalen Jejunum und distalen Ileum bei 14 Tage alten Ferkeln eine 100- bis 1000- fach höhere Empfindlichkeit für Choleratoxin (CT) sowie bei identischer CT-Dosis eine vier-
bis fünfmal höhere Nettoflüssigkeitssekretion als bei 14 Wochen alten Schweinen. Sie stellten jedoch keine Unterschiede im Chloridtransport nach Stimulation mit Prostaglandin E2 und Theophyllin zwischen den Altersgruppen fest.
GRØNDAHL et al. (1996) verglichen proximales, mittleres und distales Jejunum von sieben bis elf Tage alten Ferkeln, sechs bis acht Wochen alten Absetzern und 13 bis 15 Wochen alten Mastschweinen. Dabei zeigten die Tiere umso stärkere Flüssigkeits- und Chloridsekretion auf Serotoninstimulation, je jünger sie waren. Auch unstimuliert zeigten die Ferkel einen höheren Nettoionentransport als Absetzer und Mastschweine.
Mit den gleichen Altersgruppen arbeiteten ERLWANGER et al. (1999). An proximalem Jeju
num konnten sie die Ergebnisse von GRØNDAHL et al. (1996) zum Nettoionentransport im unstimulierten Zustand bestätigen. Nach Stimulation der Chloridsekretion mit vasoaktivem intestinalen Peptid (VIP) oder mit Theophyllin beobachteten sie bei den Ferkeln und Abset
zern signifikant stärkere Reaktionen als bei den 13 bis 15 Wochen alten Schweinen.
Alle Autoren konnten somit eine reduzierte intestinale Sekretion bei älteren Tieren feststellen, McEWAN et al. (1990) konnten sie jedoch nicht mit einer veränderten Chloridsekretion in Verbindung bringen.
1.5 Effekt des Absetzens auf die Chloridsekretion
Nicht nur das Alter bestimmt das Risiko einer Diarrhöe bei Schweinen. Auch das Absetzen geht mit einer deutlich erhöhten Inzidenz an Durchfallerkrankungen einher (PLUSKE et al.
1997). Mehrere Faktoren, die zu diesem Zeitpunkt zusammenfallen, können hieran beteiligt sein. So bedeutet das Absetzen für die Tiere einen ausgeprägten sozialen Stress. Gleichzeitig müssen sie sich mit einer einschneidenden Futterumstellung auseinandersetzen. Zusätzlich entsteht im üblichen Absetzalter von drei bis vier Wochen allmählich eine immunologische Lücke, da der Plasmaspiegel der maternalen Antikörper sinkt, eine aktive Immunität der Fer
kel gegen viele Erreger jedoch noch nicht besteht. Im Zusammenspiel können diese Einflüsse die Widerstandskraft gegen Infektionen deutlich herabsetzen. Möglicherweise bewirken Stress und Futterumstellung allerdings auch davon unabhängig eine höhere Sekretionsbereit
schaft der intestinalen Mucosa.
Diese Vermutung haben MILLER und SKADHAUGE (1997) überprüft. Sie verglichen die Chloridsekretion am Ileum von nicht abgesetzten und seit sieben Tagen abgesetzten Ferkeln im Alter von vier Wochen. Dabei fanden sie ohne Stimulation sowie nach Gabe von Prosta
glandin E2 oder Theophyllin keine Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich des Netto
chloridtransports über die Mucosa.
Umfangreicher waren die Untersuchungen von BOUDRY et al. (2004). Am proximalen Jeju
num und proximalen Colon fanden sie bei seit zwei Tagen abgesetzten Ferkeln einen stärke
ren Nettoionentransport als am Absetztag und 5, 8 oder 15 Tage nach dem Absetzen. 35 Tage nach dem Absetzen lag der Nettoionentransport niedriger als an den vorhergehenden Zeit
punkten. Stimulation mit Serotonin oder Theophyllin hatte bei den am Absetztag getöteten Tieren eine stärkere Chloridsekretion zur Folge als bei den seit 15 Tagen abgesetzten.
CARLSON et al. (2004) konnten dagegen keine Unterschiede im nicht stimulierten Nettoio
nentransport zwischen nicht abgesetzten, seit ein bis zwei Tagen, fünf bis sechs Tagen oder 14 bis 15 Tagen abgesetzten Ferkeln beobachten. Die Chloridsekretion nach Stimulation mit Serotonin oder Theophyllin jedoch lag in dieser Studie bei den seit ein bis zwei Tagen abge
setzten Tieren signifikant höher als bei nicht abgesetzten, war fünf bis sechs Tage nach dem Absetzen wieder auf das Niveau vor dem Absetzen gesunken und lag 14 bis 15 Tage nach dem Absetzen noch einmal niedriger.
Im Einklang mit BOUDRY et al. (2004) maßen MOESER et al. (2007b) ohne Stimulation einen gesteigerten Nettoionentransport im Jejunum und Colon von Ferkeln 24 Stunden nach dem Absetzen im Vergleich zu nicht abgesetzten Tieren. Zwei Tage nach dem Absetzen war der Nettoionentransport deutlich geringer, jedoch noch signifikant höher als bei nicht abge
setzten Tieren, nach sieben Tagen bestand kein Unterschied mehr.
Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Autoren folglich darauf hin, dass wenige Tage nach dem Absetzen eine Steigerung der Sekretionsbereitschaft der intestinalen Mucosa vorliegen könnte. Ab etwa einer Woche nach dem Absetzen scheint dieser Effekt verschwun
den zu sein, und die Sekretionsbereitschaft sinkt unter das vorige Niveau.
Zur Klärung der Frage, ob die Futterumstellung alleine zu einem veränderten Sekretionsver
halten der intestinalen Mucosa führen kann, untersuchten BOUDRY et al. (2002) Ferkel, die zunächst auf eine Milchfütterung abgesetzt und nach vier bis sechs Wochen auf Getreidefütte
rung umgestellt worden waren. Vier Tage nach der Futterumstellung zeigten die Tiere eine stärkere Reaktion auf Stimulation der Chloridsekretion mit Serotonin oder VIP als Ver
gleichstiere, die auf Milchfütterung belassen worden waren. Nach Stimulation mit Carbachol oder Theophyllin unterschieden sich die Reaktionen der milch- und der getreidegefütterten Tiere jedoch nicht.
1.6 Ziel der Arbeit
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die intestinale Chloridsekretion bei Schweinen funk
tionell zu charakterisieren und durch Einsatz von Stimulantien und Hemmstoffen Rückschlüs
se auf die beteiligten Ionenkanäle zu ermöglichen. Insbesondere die Frage, inwieweit andere Chloridkanaltypen als CFTR-Kanäle an der Sekretion beteiligt sein könnten, sollte beantwor
tet werden.
Dabei sollten zum einen mit dem mittleren Jejunum und dem proximalen Colon ein Dünn
darm- und ein Dickdarmabschnitt in ihren Sekretionscharakteristika verglichen werden. Die Ergebnisse sollten in Bezug zu den unterschiedlichen physiologischen Aufgaben der Darmab
schnitte in Bezug auf Resorption und Sekretion gesetzt werden.
Zum anderen sollten die Verhältnisse bei saugenden Jungtieren, gerade von der Mutter abge
setzten Jungtieren und heranwachsenden Mastschweinen gegenübergestellt werden, um den Einfluss des Absetzens und altersbedingte Veränderungen zu beurteilen. Von besonderem In
teresse war in diesem Zusammenhang, inwieweit eventuelle Unterschiede in der intestinalen Chloridsekretion Ursachen für die hohe Empfindlichkeit neu abgesetzter Ferkel für sekretori
sche Diarrhöe sein könnten.
2 Material und Methoden
Eine alphabetisch geordnete Aufzählung der verwendeten Substanzen, Geräte und Materialien mit Angaben zum Hersteller befindet sich im Anhang 8.1. Lösungs- und Pufferrezepte sind in der Reihenfolge ihrer Erwähnung im Text in Anhang 8.2 aufgelistet.
2.1 Tiere
Für die Versuche wurde Gewebe von 13 Mastschweinen sowie von 33 Ferkeln eingesetzt.
2.1.1 Mastschweine
Die Mastschweine einer Kreuzung der Rassen („Deutsche Landrasse“ x „Deutsches Edel
schwein“) x „Piétrain“ stammten vom Versuchsgut Relliehausen der Universität Göttingen und wurden mindestens einen Monat vor der Tötung im Physiologischen Institut der Tierärzt
lichen Hochschule Hannover eingestallt. Alle Tiere waren männlich und kastriert. Bei der Einstallung waren sie etwa drei Monate alt und wogen im Durchschnitt ca. 17 kg.
2.1.2 Ferkel
Die Ferkel stammten aus je zwei Würfen von zwei Muttersauen und wurden alle im Physiolo
gischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover geboren. Eine der Sauen war tragend vom Versuchsgut Relliehausen der Universität Göttingen erworben worden, die andere eben
falls tragend vom Lehr- und Versuchsgut Ruthe der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Sie wurden mehrere Wochen vor dem Abferkeltermin im Physiologischen Institut eingestallt. Die Besamungen zu den beiden zweiten Würfen und die kompletten nachfolgenden Trächtigkei
ten fanden im Physiologischen Institut statt. Beide Sauen entstammten einer Kreuzung der Rassen „Deutsche Landrasse (DL)“ und „Deutsches Edelschwein (DE)“; besamt wurden sie mit Sperma von Ebern der Rasse „Piétrain“ (Wurf 1) oder „Deutsche Landrasse (DL)“ (Wurf 2 bis 4). Einen Überblick über die Zuordnung der Würfe zu den Sauen bietet Tab. 1.
Ein Wurf bestand aus sieben, ein Wurf aus acht und zwei Würfe aus jeweils neun lebenden Ferkeln. 20 Ferkel waren männlich, 13 weiblich. Am dritten und am 18. Lebenstag erhielten alle Ferkel eine prophylaktische Injektion von je 1 ml Eisendextran (Eisendextran 20), ent
sprechend 200 mg Fe3+ subkutan.
Tab. 1: Verteilung der Ferkel auf die vier Würfe.
Wurf Mutter
(Herkunft, Rasse)
Vater (Rasse)
Ferkel (Anzahl)
Geschlecht
Wurf 1 Sau 1: Relliehausen DL x DE
Piétrain 7 4 männlich
3 weiblich Wurf 2 Sau 2: Ruthe
DL x DE DL 9 6 männlich
3 weiblich Wurf 3 Sau 1: Relliehausen
DL x DE
DL 8 6 männlich
2 weiblich Wurf 4 Sau 2: Ruthe
DL x DE DL 9 4 männlich
5 weiblich
2.2 Haltungsbedingungen
Die Mastschweine wurden in Gruppen zu zwei oder drei Tieren auf Stroh gehalten und mit zunächst 0,8 kg, später 1,0 kg und zuletzt 1,1 kg Kraftfutter pro Tag, verteilt auf zwei Mahl
zeiten, gefüttert. Wasser stand ad libitum über eine Selbsttränke zur Verfügung.
Die Sauen wurden einzeln ebenfalls auf Stroh gehalten und hatten Wasser über eine Selbst
tränke jederzeit zur Verfügung. Gefüttert wurden sie mit Kraftfutter ein- bis zweimal täglich abhängig vom Bedarf. Zusätzlich wurde Heu zur Beschäftigung und zum Nestbau vorgelegt.
Nach der Geburt wurden für die Ferkel Wärmelampen aufgehängt und ein Ferkelnest einge
richtet. Die Ferkel hatten jederzeit Zugang zu Trinkwasser, ab dem siebten Lebenstag wurde ihnen auch Futter zur freien Aufnahme angeboten.
Alle Ferkel der ersten zwei Würfe sowie zwei Ferkel aus dem dritten und vier Ferkel aus dem vierten Wurf wurden nach der dritten Lebenswoche von der Mutter abgesetzt. Das Alter beim Absetzen lag zwischen 22 und 34 Tagen, im Mittel bei 28 Tagen. Die abgesetzten Ferkel wur
den einzeln in Haustiertransportkisten (Vari-Kennel® XL) auf Weichholzgranulatstreu (Tier
Wohl Super) untergebracht. Trinkwasser und das gleiche Futter, das sie bereits bei der Mutter angeboten bekommen hatten, standen ihnen ständig zur Verfügung. Zusätzlich erhielten die Tiere Heu und Stroh zur Beschäftigung.
2.3 Gesundheitszustand der Tiere
Keines der Mastschweine zeigte in der Zeit im Physiologischen Institut gesundheitliche Be
einträchtigungen.
Die Ferkel aus Wurf 1 erkrankten am 21. Lebenstag an Durchfall ohne Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens. In Kotproben der am stärksten betroffenen Tiere konnten keine spezifi
schen Erreger, namentlich keine Salmonellen und hämolysierenden Escherichia coli nachge
wiesen werden, so dass die Ätiologie der Erkrankung ungeklärt blieb. Die Ferkel dieses Wurfs wurden erst ab dem 32. Lebenstag abgesetzt, nachdem sie mehrere Tage vollständig sym
ptomfrei waren.
Im Rahmen von von der vorliegenden Untersuchung unabhängigen Versuchen wurden vier Ferkel aus Wurf 1, alle neun Ferkel aus Wurf 2 sowie zwei Ferkel aus Wurf 3 vier Stunden sowie 28 Stunden nach dem Absetzen über eine Magensonde mit 1010 bis 1011 koloniebilden
den Einheiten des enterotoxischen Escherichia coli-Stamms „Abbotstown“ infiziert. Keines der infizierten Tiere zeigte nach der Infektion klinische Erscheinungen einer Diarrhöe. Auch in den in dieser Arbeit erfassten Parametern zeigte sich bei den infizierten gegenüber den nicht infizierten Tieren keine statistisch signifikante Erhöhung (siehe Anhang 8.3), so dass die Infektion in dieser Arbeit keine weitere Berücksichtigung findet.
2.4 Gewebeentnahme
Die Mastschweine wurden im Alter von ca. vier Monaten und mit einem Gewicht von 38,4 ± 3,4 kg getötet.
Die 22 abgesetzten Ferkel wurden 48 bis 52 Stunden nach dem Absetzen getötet und waren dann 24 bis 36 Tage alt, im Mittel 30 Tage. Sie wogen bei der Tötung 8,1 ± 1,3 kg. Die 11 üb
rigen Ferkel wurden mit 22 bis 34 Tagen, im Mittel 26 Tagen, direkt von der Mutter geholt und mit einem Gewicht von 8,1 ± 1,5 kg getötet.
Alle Tiere wurden im Physiologischen Institut mittels Bolzenschuss betäubt und durch Blut
entzug nach Eröffnung der großen Halsgefäße getötet.
Die Mastschweine wurden zur Entnahme des Darmkonvoluts an den Hinterbeinen aufge
hängt. Nach Eröffnung der Bauchhöhle in der Linea alba wurde der Magen an der Cardia vom Oesophagus getrennt und das Colon descendens am Übergang zum Rectum abgetrennt. Die
Gekröse wurden durchtrennt und das Darmkonvolut mit Magen, Pankreas und Milz entnom
men. In einer Plastikwanne wurde das Darmkonvolut abgelegt und die weitere Präparation vorgenommen. Dazu wurde der Pylorus aufgesucht, Duodenum und vier Meter Jejunum ab
gemessen und verworfen und die folgenden 60 cm mittleres Jejunum entnommen. Vom Be
ginn des Colons am Caecum ausgehend, wurden 30 cm proximales Colon freipräpariert und entnommen.
Die Ferkel wurden in Rückenlage fixiert, die Bauchhöhle wurde ebenfalls in der Linea alba eröffnet, das Darmkonvolut jedoch in situ belassen und die zu entnehmenden Darmabschnitte direkt aufgesucht. Wie bei den Mastschweinen wurde zunächst der Pylorus aufgesucht, dann das Duodenum und hier nur zwei Meter Jejunum abgemessen und verworfen und die folgen
den 60 cm mittleres Jejunum entnommen. Die Entnahme des proximalen Colons erfolgte ana
log zur Vorgehensweise bei den Mastschweinen. Bei vier der fünf nicht abgesetzten Tiere aus Wurf 4 wurde auf die Entnahme des Colons aus organisatorischen Gründen verzichtet.
2.5 Präparation der Mucosa
Die entnommenen Darmabschnitte wurden mit 4 °C kalter physiologischer Kochsalzlösung mehrfach gespült, bis die Spülflüssigkeit klar blieb und kein Darminhalt mehr im Lumen zu erkennen war. Bis zur weiteren Präparation wurden sie in eisgekühlter, mit Carbogen (95% O2, 5% CO2) begaster modifizierter glucosehaltiger Krebs-Henseleit-Lösung, im folgen
den bezeichnet als serosaler Darmpuffer (296 mosm/l, pH 7,4), aufbewahrt. Bei den Tieren der Würfe 3 und 4 enthielt der Puffer zusätzlich 10-5 mol/l Indomethacin. Um eine Zuordnung der Darmabschnitte zu den Tieren zu gewährleisten und das proximale und distale Ende der Abschnitte zu kennzeichnen, wurden mit beschriftetem Klebeband versehene Klemmen an die distalen Enden gesetzt.
Von den Darmabschnitten wurden zur weiteren Präparation vom proximalen Ende ausgehend wenige Zentimeter kurze Stücke abgeteilt und am Ansatz des Mesenteriums entlang aufge
schnitten. Um die Tunica mucosa von den übrigen Gewebeschichten abzutrennen, wurde das Darmstück mit der Tunica serosa nach unten auf ein PVC-Brett gelegt, mit eisgekühltem sero
salen Darmpuffer befeuchtet, am proximalen Ende mit einem Objektträger fixiert, die Tunica mucosa mithilfe eines ca. 0,2 mm starken, etwa fünf Zentimeter breiten Blechs eingeritzt und von der Tela submucosa abgeschoben. Das Blech wurde abgelegt und die Tunica mucosa mit
feinen Pinzetten vorsichtig an den Ecken gefasst und auf dem Blech ausgebreitet. Nach einer Sichtkontrolle auf beschädigte oder veränderte Bereiche und auf Lymphfollikel wurde ein au
genscheinlich einwandfreier Bereich der Mucosa von etwa 2 x 2 cm ausgewählt und durch Entlangziehen einer geschlossenen Schere am aufgesetzten Objektträger vom übrigen Stück abgeteilt. Während des gesamten Vorgangs wurde die Mucosa stets mit eisgekühltem Puffer feucht gehalten.
2.6 Untersuchungen in der Ussingkammer
2.6.1 Prinzip der Ussingkammer-Technik
Die Ussingkammer-Methode zur Ex-Vivo-Untersuchung von Transportprozessen an isolierten Epithelien geht zurück auf USSING und ZEHRAN (1951). Dabei wird das zu untersuchende Epithel so zwischen die zwei Hälften einer Plexiglaskammer gespannt, dass zwei voneinander getrennte Kompartimente entstehen (Abb. 2). Diese Kompartimente entsprechen der serosalen oder blutseitigen und der mucosalen oder lumenseitigen Gewebeseite. An jede Hälfte der Us
singkammer ist über zwei Kunststoffschläuche der innere Kreislauf einer Hälfte eines doppel
wandigen gläsernen Gaslifts angeschlossen, in dem eine Pufferlösung zirkuliert; zur Umwäl
zung und Sauerstoffversorgung dient eine kontinuierliche Einleitung von Carbogengas. Die Temperatur der Pufferlösung wird durch ein umgewälztes Wasserbad in der Außenschicht der Gaslifte auf 37 °C konstant gehalten. Über gewebenahe Agarbrücken und gewebeferne Ag/AgCl-Elektroden sind die Kammern an eine computergesteuerte Strom-/Spannungs
klemmeinrichtung angeschlossen.
Durch Ionentransport über das Epithel bildet sich eine transepitheliale Potentialdifferenz PDt
zwischen den beiden getrennten Kompartimenten. Diese kann über die gewebenahen Agar
brücken gemessen und vom Computer aufgezeichnet werden. Über die gewebefernen Ag/AgCl-Elektroden kann ein Stromimpuls definierter Stärke auf das System aufgeschaltet werden, so dass aus der resultierenden Änderung der Potentialdifferenz mit Hilfe des Ohm'
schen Gesetzes der Gewebewiderstand errechnet werden kann. Der reziproke Wert des Gewe
bewiderstands ergibt die Gewebeleitfähigkeit Gt, die sich aus der transzellulären und der para
zellulären Leitfähigkeit zusammensetzt.
Das Messverfahren, bei dem unter den eben beschriebenen Bedingungen die spontan entste
hende Potentialdifferenz PDt sowie die Gewebeleitfähigkeit Gt registriert werden, bezeichnet man als Open-Circuit-Verfahren. Im Unterschied dazu wird beim sogenannten Short-Circuit- Verfahren über die gewebefernen Ag/AgCl-Elektroden ein Klemmstrom Ic auf das System aufgeschaltet, der die transepitheliale Potentialdifferenz PDt konstant auf 0 mV ausgleicht.
Dazu muss der Klemmstrom in seiner Stärke genau dem Strom entsprechen, der durch die Summe aller elektrogen über das Gewebe transportierten Ionen entsteht (Kurzschlussstrom Isc), allerdings mit umgekehrter Polarität (Ic = -Isc). Mit dem Short-Circuit-Verfahren kann also der elektrogene Nettoionentransport über das Gewebe in Abwesenheit eines elektrischen Gra
dienten beobachtet werden. Definitionsgemäß erhält der Kurzschlussstrom ein positives Vor
zeichen, wenn ein positiver Ionenstrom von der mucosalen zur serosalen Seite des Epithels Abb. 2: Schema der Ussingkammer mit Gaslift und angeschlossener
Strom-/Spannungsklemmeinrichtung.
Pufferlösung, mucosales Kompartiment
Pufferlösung, serosales Kompartiment
mV µEq Epithel Carbogen-
begasung
computergesteuerte Strom-/Spannungs- klemmeinrichtung
Gaslift Wasserbad
Plexiglas- kammer
fließt, also bei Kationenresorption oder Anionensekretion. Auch bei diesem Messverfahren wird durch regelmäßig aufgeschaltete zusätzliche Stromimpulse und Messung der resultieren
den Änderung der Potentialdifferenz die Gewebeleitfähigkeit bestimmt.
2.6.2 Verwendete Apparaturen
Bei den verwendeten Ussingkammern und Gasliften handelte es sich um Eigenbauten des Physiologischen Instituts der Tierärztlichen Hochschule; auch die Agarbrücken zur Registrie
rung der Potentialdifferenz wurden im Physiologischen Institut gegossen. Dazu wurde Agar in einer Krebs-Henseleit-Lösung ohne Zusatz von Glucose und Mannit (Osmolarität 270 mosm/l) aufgekocht und mit einer Spritze und stumpfen Kanüle in Kunststoffschläuche gefüllt. Die Ag/AgCl-Elektroden stammten von der Firma Mettler Toledo GmbH.
Zwölf der insgesamt 24 vorhandenen Ussingkammern waren mit der Strom-/Spannungs
klemmeinrichtung „VCC MC6 Multichannel Clamp” verbunden, die Datenerfassung erfolgte mit dem Programm „Acquire & Analyze” in Intervallen von zehn bis 30 Sekunden. Die Stromimpulse zur Ermittlung der Gewebeleitfähigkeit wurden alle 4,3 Sekunden mit einer Stärke von 50 µA und einer Dauer von 111 ms appliziert. Die anderen zwölf Kammern waren mit der Strom-/Spannungsklemmeinrichtung „AC Microclamp“ verbunden, die Daten wurden mit dem Programm „CLAMP“ alle sechs Sekunden erfasst. Hier wurden die Stromimpulse alle sechs Sekunden mit einer Stärke von 100 µA und einer Dauer von 200 ms aufgeschaltet.
2.6.3 Ablauf der Ussingkammerversuche
Es wurden Plexiglaskammern mit einer runden Öffnung von 1,13 cm² verwendet, bei denen auf einer Hälfte der Kammer sechs kurze Präpariernadeln kreisförmig um die Öffnung ange
bracht waren. Die Öffnungen wurden mit Kunststoffnetzen überdeckt, um das Gewebe me
chanisch zu stabilisieren. Darüber wurden zur Abdichtung und zur Vermeidung von Rand
druckstellen („edge damage“) am Gewebe Silikonringe auf die Kammerhälften aufgelegt.
Vor dem Einspannen der Gewebe wurden die Ussingkammern bereits einmal in die Apparatur eingebaut und mit dem später verwendeten Puffer befüllt, um das Eigenpotential der Elektro
den und den Lösungswiderstand zu messen. Hierbei lag nur ein Kompartiment vor. Es wurde für dieses stets der Puffer verwendet, der im eigentlichen Versuch für das serosale Komparti
ment eingesetzt wurde. Für die Leermessungen wurden die Silikonringe, nicht aber die Kunst
stoffnetze, in die Kammern eingesetzt. Die später erhobenen Messwerte wurden von den Da
tenerfassungsprogrammen um die ermittelten Eigenpotential- bzw. Lösungswiderstandswerte korrigiert.
Unmittelbar nach ihrer Präparation (siehe Kap. 2.5) wurden die Mucosastücke mit feinen Pin
zetten angehoben, mit der mucosalen Seite nach oben über die Präpariernadeln gebreitet und unter leichter Spannung fixiert. Die beiden Kammerhälften wurden zusammengesetzt, umge
hend in das Haltegestell eingebaut, mit den puffergefüllten Gasliften verbunden und die Elek
troden angeschlossen. Je nach Versuch wurden pro Tier und Darmabschnitt drei oder sechs Kammern bestückt. Details sind Tab. 2 zu entnehmen.
Tab. 2: Anzahl der Ussingkammern pro Tier und Darmabschnitt.
Mast- schweine
Wurf 1 ab- gesetzt
Wurf 2 ab- gesetzt
Wurf 3 Wurf 4
ab- gesetzt
nicht abgesetzt
ab- gesetzt
nicht abgesetzt
Jejunum 6 3 3 3 3/6* 6 6
Colon 6 3 3 3 3/6* 6 --/6**
* Drei Kammern für Dosis-Wirkungskurven mit NPPB (siehe Kap. 2.7.3), sonst sechs Kammern
** Nur von einem nicht abgesetzten Tier aus Wurf 4 wurde Colon entnommen.
Alle Mucosastücke wurden mindestens zehn Minuten im Open-Circuit-Verfahren an die Ver
suchsbedingungen adaptiert. Während dieser Phase wurden bereits die Messwerte für die Ge
webeleitfähigkeit auf Plausibilität geprüft. Mucosastücke, die mit ungewöhnlich hohen Wer
ten auffielen, wurden als mutmaßlich beschädigt eingestuft und durch frisch präparierte er
setzt. Zeigten die Gewebestücke eine stabile Potentialdifferenz und eine akzeptable Leitfähig
keit, wurde die Kammer in den Short-Circuit-Modus umgeschaltet und erneut für mindestens zehn Minuten äquilibriert, ehe mit der Zugabe von Pharmaka begonnen wurde.
2.7 Versuchsprotokolle
In allen durchgeführten Untersuchungen kamen die gleichen Pharmaka in den gleichen Kon
zentrationen zum Einsatz, während Reihenfolge und Zeitabstände der Zugabe zu den Puffer
lösungen in den Ussingkammern variierten. Mittels Stimulantien und Hemmstoffen sollte der Anteil verschiedener Sekretionswege an der Chloridsekretion im Jejunum und Colon der Schweine funktionell untersucht und bei den verschiedenen Tiergruppen verglichen werden.
2.7.1 Das Grundprotokoll
Das allen Versuchen zugrunde liegende Protokoll (Tab. 3) wurde in Anlehnung an ein Proto
koll zur Diagnose von zystischer Fibrose an humanen Rektumbiopsien (DE JONGE et al.
2004) und an eine Arbeit zur Charakterisierung von Chloridströmen am Colon von Mäusen (BLEICH 2004) erstellt.
Tab. 3: Prinzipielle Reihenfolge der Zugabe von Pharmaka in die Ussingkammern.
Pharmakon Applikationsort Konzentration Lösungsmittel Indomethacin mucosal und serosal 10-5 mol/l Aqua dest.
Amilorid mucosal 10-4 mol/l Aqua dest.
TEA mucosal 5·10-3 mol/l Aqua dest.
Barium mucosal 10-3 mol/l Aqua dest.
Carbachol serosal 10-5 mol/l Aqua dest.
Forskolin serosal 5·10-6 mol/l DMSO
DIDS mucosal 2·10-4 mol/l DMSO
NPPB serosal 5·10-4 mol/l DMSO
Indomethacin sollte die endogene Prostaglandinsekretion hemmen und somit die spontane Chloridsekretion minimieren. Amilorid blockiert die apikalen Natriumkanäle, Tetraethylam
monium (TEA) und Barium blockieren die apikalen Kaliumkanäle, so dass die Chloridsekreti
on isoliert von anderen mengenmäßig bedeutsamen Ionenströmen registriert werden konnte.
Carbachol wirkt als Acetylcholinanalogon und stimuliert über muscarinerge m3-Rezeptoren die calciumvermittelte Chloridsekretion, während Forskolin als Aktivator der Adenylatcyclase die cAMP-vermittelte Chloridsekretion stimuliert. 4,4'-Diisothiocyanostilben-2,2'-disulfon
säure (DIDS) ist als Hemmstoff alternativer Chloridkanäle (CaCC und ORCC) beschrieben, und 5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoat (NPPB) inhibiert die Cystic Fibrosis Trans
membrane Conductance Regulator (CFTR)-Kanäle. Sämtliche Pharmaka wurden auf der Seite des Epithels zugegeben, auf der ihr Wirkort lokalisiert war, mit Ausnahme des NPPB, bei dem frühere Untersuchungen gezeigt hatten, dass trotz mucosaler Lokalisation der CFTR- Kanäle eine stärkere Wirkung bei serosaler Zugabe eintrat (GREGER et al. 1991, BLEICH
2004). Als mögliche Erklärung hierfür wird die Schleimproduktion auf der mucosalen Seite des Epithels genannt, die die Einwirkung von NPPB auf das Gewebe erschweren kann. Da NPPB von intrazellulär an den CFTR-Kanälen wirkt und als lipophiles Molekül gut mem
brangängig ist (SHEPPARD 2004), ist eine Wirksamkeit nach serosaler Zugabe gut nachvoll
ziehbar.
2.7.2 Anwendung des Grundprotokolls
Das Grundprotokoll kam bei Jejunum und Colon der Mastschweine, aller Ferkel der Würfe 1 und 2 und zweier Ferkel aus Wurf 3 sowie beim Jejunum der Ferkel aus Wurf 4 zum Einsatz.
In allen diesen Versuchen wurde auf der serosalen Seite der Ussingkammern der bereits er
wähnte serosale Darmpuffer (siehe Kap. 2.5) verwendet, im mucosalen Kompartiment wurde ein fast identischer Puffer eingefüllt, bei dem Glucose durch 4-(2-Hydroxyethyl)- piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) und Natriumgluconat durch Natronlauge ersetzt wor
den war (mucosaler Darmpuffer), um einen elektrogenen Natrium-Glucose-Cotransport zu vermeiden. Beide Puffer wiesen eine Osmolarität von 296 mosm/l und bei 37 °C und unter Carbogenbegasung einen pH von 7,4 auf. Ihr Gehalt an Natrium (143,6 mmol/l), Kalium (5,4 mmol/l) und Chlorid (124,0 mmol/l) war identisch, so dass kein pH-Gradient und für die
se Ionen kein chemischer Gradient zwischen den Kompartimenten bestand. Das Puffervolu
men betrug jeweils 10 ml.
Bei den Mastschweinen und den Ferkeln aus Wurf 1 und 2 wurde nach dem Umschalten in den Short-Circuit-Modus zunächst eine Stabilisierung der Kurzschlussströme abgewartet und dann Indomethacin zugegeben. Vor allem am Colon wurden bei dieser Vorgehensweise teil
weise sehr hohe initiale Gewebeleitfähigkeiten und Kurzschlussströme beobachtet, die auf den bei der Präparation auf das Gewebe einwirkenden mechanischen Stress und die resultie
rende endogene Prostaglandinproduktion zurückgeführt wurden. Die Indomethacingabe konn
te diese hohen Leitfähigkeiten und Kurzschlussströme effektiv reduzieren. Um das Gewebe zu schonen und die Versuche zu verkürzen, wurde bei den Ferkeln aus Wurf 3 und 4 das In
domethacin daraufhin direkt nach dem Ansetzen zu den Pufferlösungen gegeben.
Wenn das Protokoll mit Indomethacin ge
startet wurde, wurde zehn Minuten später Amilorid, weitere 15 Minuten später TEA und wiederum zehn Minuten danach Bari
um zugesetzt. Zehn Minuten nach diesen vorbereitenden Pharmaka begann dann mit der Zugabe von Carbachol die eigent
liche Versuchsphase (Abb. 3).
Da durch das Zusetzen von Indomethacin in die Pufferlösung statt in die messende Ussingkammer die Phase der Äquilibrie
rung im Short-Circuit-Modus verkürzt wurde, wurde vor der Zugabe von Amilo
rid hier eine Wartezeit nach dem Um
schalten von 15 Minuten eingehalten. Al
lerdings wurden TEA und Barium bei diesen Versuchen unmittelbar nach Amilorid zugege
ben. Aufgrund der Beobachtungen aus den vorhergehenden Versuchen, dass diese Pharmaka keine bedeutenden Auswirkungen auf Kurzschlussstrom und Leitfähigkeit hatten und beide Parameter in dieser Phase stabile Verläufe zeigten, wurde diese Zusammenfassung für vertret
bar erachtet. Die Zugabe von Carbachol erfolgte dann weitere 15 Minuten später.
30 Minuten nach der Carbacholgabe, wenn dessen Wirkung vollständig abgeklungen war, wurde Forskolin zugesetzt, noch einmal 30 min später DIDS. Als letzter Wirkstoff wurde 20 min nach DIDS NPPB eingesetzt und die Messung danach noch für mindestens 40 min fortgeführt.
2.7.3 Dosis-Wirkungskurven für NPPB
Die im Grundprotokoll eingesetzte Dosierung von NPPB war aus den Untersuchungen von BLEICH (2004) übernommen worden und führte bei allen untersuchten Tieren zu einer Hem
mung des Kurzschlussstroms auf das Niveau vor jeglicher Stimulation. Um die Effektivität dieser Dosierung zur vollständigen Hemmung der CFTR-Kanäle dennoch genauer zu untersu
chen, wurden Dosis-Wirkungskurven an Jejunum und Colon von drei Tieren aus Wurf 3 auf
Abb. 3: Zeitliche Abfolge der Zugaben bis Carba
chol im Grundprotokoll.
Links bei Zugabe von Indomethacin in die Ussing
kammern, rechts bei Indomethacin in den Puffer
lösungen.
Short-Circuit-Modus Short-Circuit-Modus
Indomethacin
Amilorid, TEA, Barium Amilorid
Carbachol TEA
Barium Carbachol
t
gestellt. Dazu wurde wie in den oben beschriebenen Versuchen Indomethacin direkt in den Puffer gegeben und 15 min nach dem Umschalten in den Short-Circuit-Modus Amilorid, TEA und Barium zugesetzt. Zehn Minuten später wurde Forskolin zugegeben und NPPB nach 15 min, nachdem der Kurzschlussstrom sein Maximum erreicht hatte, in steigender Dosierung eingesetzt. Die Dosierungsstufen waren 5·10-6 mol/l, 10-5 mol/l, 2·10-5 mol/l, 5·10-5 mol/l, 10-4 mol/l, 2·10-4 mol/l und 5·10-4 mol/l; die höchste eingesetzte Dosierung entsprach also der in den übrigen Versuchen eingesetzten. Der zeitliche Abstand zwischen den einzelnen Dosie
rungen betrug zehn Minuten. Beim zweiten und dritten Tier blieb jeweils eine Kammer mit Jejunum und Colon als Zeitkontrolle ohne NPPB. 20 min nach der letzten NPPB-Gabe wurde auf einen verbliebenen Effekt von Carbachol getestet und danach noch mindestens 10 min die Messung fortgesetzt.
2.7.4 Abwandlungen des Grundprotokolls
An Jejunum und Colon von drei Ferkeln aus Wurf 3 und am Colon der Ferkel aus Wurf 4 sollte die Beteiligung möglicher alternativer Chloridkanäle an der Chloridsekretion genauer untersucht werden. Dazu wurde das oben (Kap. 2.7.1) beschriebene Grundprotokoll variiert.
Indomethacin wurde bei diesen Versuchen direkt den Pufferlösungen zugesetzt. 15 min nach dem Umschalten in den Short-Circuit-Modus wurden Amilorid, TEA und Barium unmittelbar nacheinander zugegeben.
Bei den Ferkeln aus Wurf 3 wurden weitere 15 min später zwei der sechs Kammern mit DIDS und zwei weitere Kammern mit NPPB präinkubiert, um entweder die alternativen oder die CFTR-Chloridkanäle zu inhibieren. Nach erneut 15-minütiger Wartezeit wurde die Chloridse
kretion mit Carbachol stimuliert, 20 min darauf mit Forskolin. Die vier Kammern, die NPPB nicht als Präinkubation erhalten hatten, wurden 15 min nach Forskolin mit NPPB behandelt, danach wurde noch über 40 min die Messung fortgesetzt.
Am Colon der Tiere aus Wurf 4 wurde die Chloridsekretion bei depolarisierter basolateraler Membran untersucht. Dazu wurden einige Mucosastücke in einer kaliumreichen Pufferlösung inkubiert. Dies führte zu einem veränderten Kaliumgleichgewichtspotential und dadurch zu einer Depolarisation der basolateralen Membran (CUTHBERT 2001). Damit wurde erreicht, dass die basolateralen calciumaktivierten Kaliumkanäle nicht mehr durch Hyperpolarisation
der Zelle die Triebkraft für die Chloridsekretion erhöhen konnten. Folglich konnte die Wir
kung des Calciums auf Chloridkanäle direkt beurteilt werden.
Von den sechs bestückten Kammern pro Tier wurden zwei mit dem auch beim Grundproto
koll verwendeten mucosalen und serosalen Darmpuffer befüllt. Die anderen vier Kammern wurden mit einem kaliumreichen Puffer auf der serosalen Seite und einem kaliumreichen chloridarmen Puffer auf der mucosalen Seite befüllt. Diese Puffer hatten eine Osmolarität von 300 mosm/l und einen pH-Wert von 7,5 bei 37 °C und Carbogenbegasung. Sie enthielten 26,4 mmol/l Natrium, 119,0 mmol/l Kalium und 124,0 mmol/l (serosale Seite) bzw.
8,0 mmol/l (mucosale Seite) Chlorid, so dass die transmembranären Natrium- und Kaliumgra
dienten minimiert waren und ein transepithelialer Chloridgradient bestand. Der Chloridgradi
ent war nötig, um trotz fehlender elektrischer Triebkraft eine Chloridsekretion zu initiieren, sobald Chloridkanäle geöffnet wurden. Das Puffervolumen betrug auch bei diesen Versuchen stets 10 ml pro Kompartiment.
Zehn Minuten nach der Zugabe von Amilorid, TEA und Barium wurden zwei der vier Kam
mern mit kaliumreichem Puffer mit NPPB präinkubiert. Nach zehn Minuten Einwirkzeit wur
de Carbachol, 30 min später Forskolin zugegeben. Alle Kammern erhielten nach weiteren 30 min DIDS, die vier Kammern, die keine Präinkubation erhalten hatten, wurden noch ein
mal 35 min später mit NPPB behandelt. 40 min später wurde die Messung beendet.
Einen Überblick über die hier beschriebenen Kombinationen an Pufferlösungen und Präinku
bationen bietet Tab. 4.
Tab. 4: Pufferlösungen und Präinkubationen in den Versuchen mit abgewandeltem Grundproto
koll.
Anzahl Kammern Wurf 3 Wurf 4
2 Darmpuffer Darmpuffer
2 Darmpuffer + DIDS kaliumreicher Puffer
2 Darmpuffer + NPPB kaliumreicher Puffer + NPPB
2.8 Auswertung der elektrophysiologischen Parameter
Alle statistischen Auswertungen erfolgten auf Tierebene, mit dem einzelnen Tier als statisti
scher Einheit. Dazu wurden aus den Daten der einzelnen gleich behandelten Ussingkammern
pro Tier arithmetische Mittelwerte errechnet, die als erhobene Messwerte für das Tier behan
delt wurden. Aus diesen Einzeltierwerten wurden dann arithmetische Gruppenmittelwerte und Standardabweichungen für die verschiedenen Tiergruppen errechnet. Alle Ergebnisse sind folglich, wenn nicht anders vermerkt, als arithmetischer Mittelwert (MW) ± Standardabwei
chung (SD) angegeben, wobei die Grundgesamtheit n der Zahl der Tiere entspricht.
2.8.1 Verlaufskurven
Um den zeitlichen Verlauf von Kurzschlussströmen und Gewebeleitfähigkeiten über die ge
samte Dauer des Protokolls möglichst genau darzustellen, wurden die Messkurven der einzel
nen Kammern und Tiere zu einer Mittelwertskurve überlagert; das bedeutet, dass für jeden er
fassten Messpunkt ein Mittelwert aus allen Kammern bzw. allen Tieren errechnet wurde.
Dazu wurden die Kurven der einzelnen Kammern in Teilstücke unterteilt, die jeweils fünf Mi
nuten vor der Zugabe eines Wirkstoffs begannen und fünf Minuten vor der Zugabe des nächs
ten Pharmakons endeten. Diese Teilstücke wurden dann für alle Kammern eines Tieres so überlagert, dass die Zugabezeitpunkte exakt in Deckung kamen. Waren die Nachlaufzeiten zur Zugabe nicht bei allen Kammern gleich lang, wurde die Überlagerung nur bis zum Ende des kürzesten auftretenden Zeitabschnitts durchgeführt und weitere Messwerte bei den ande
ren Kammern nicht berücksichtigt. Analog wurde verfahren, um die Kurven aller Tiere einer Gruppe zu einer Mittelwertskurve mit Standardabweichung zu überlagern.
Als gemeinsame Zeitachse der überlagerten Kurven wurde dabei die Zeitachse einer zufällig ausgewählten Kammer bzw. eines Tieres genutzt. Durch dieses Verfahren kam es in den Mit
telwertskurven zu Unterbrechungen im Zeitverlauf, wenn bei der Kammer oder dem Tier, von dem die Zeitachse stammte, Messwerte ausgelassen werden mussten. Diese Unterbrechungen sind in den Abbildungen als Lücken im Kurvenverlauf zu erkennen. Die Zeitachsen der Ver
laufskurven können daher nur als grober Anhaltspunkt für die tatsächliche Versuchsdauer bei einzelnen Tieren angesehen werden. Eine Zeitkontinuität darf nur innerhalb eines Teilstücks angenommen werden, nicht über den gesamten Kurvenverlauf.
Bei einigen Versuchen ergab sich die Schwierigkeit, dass die Messungen mit verschiedenen Strom-/Spannungsklemmeinrichtungen durchgeführt worden waren, die in unterschiedlichen Intervallen Messwerte erhoben hatten. War der Unterschied in den Messintervallen klein (Messung alle sechs gegen alle zehn Sekunden) und bestand aufgrund schneller Veränderun
gen der Messparameter ein Interesse an guter zeitlicher Auflösung der Daten, wurde die Zahl der Messwerte pro 30 Sekunden in beiden Kurven auf den gleichen Wert gebracht, indem bei der Kurve mit häufigerer Messung in gleichmäßigen Abständen Werte ausgelassen wurden.
Eine leichte Verzerrung der Zeitachse wurde dabei in Kauf genommen. Bei größeren Unter
schieden in den Messintervallen (alle sechs gegen alle 20 oder 30 Sekunden) und langsamer zeitlicher Veränderung der Messparameter wurde das kleinste gemeinsame Vielfache der Messintervalle ermittelt, und nur die in diesem Abstand erhobenen Messwerte wurden in die Mittelwertskurve aufgenommen.
Die Mittelwertskurven für Leitfähigkeiten und Kurzschlussströme wurden stets identisch er
stellt, so dass jedem Punkt auf der Verlaufskurve der Kurzschlussströme der zugehörige Punkt auf der Kurve der Leitfähigkeiten zugeordnet werden kann und umgekehrt.
2.8.2 Diskrete Messpunkte
Für die Stimulatoren und Hemmstoffe der Chloridsekretion sollte der maximale Effekt auf die elektrophysiologischen Parameter bestimmt werden. Da dieser nicht an jedem Mucosastück nach der gleichen Zeitspanne nach Zugabe des Wirkstoffs eintrat, konnte der Mittelwert nicht aus der gemittelten Verlaufskurve entnommen werden, sondern musste an den Einzelkurven ermittelt werden. Hierzu wurden verschiedene Punkte definiert, an denen Kurzschlussstrom und Gewebeleitfähigkeit in die Auswertung eingingen.
Zunächst wurde ein Basalwert für Isc und Gt nach Zugabe aller vorbereitenden Pharmaka, also Indomethacin, Amilorid, TEA und Barium, erhoben. Als dieser Basalwert wurde ein Wert un
mittelbar vor der ersten Zugabe mit Wirkung auf die Chloridsekretion gewählt, also unmittel
bar vor der ersten Stimulation oder der hemmenden Präinkubation. Es wurde darauf geachtet, einen Wert zu wählen, der dem Niveau in den letzten Minuten vor dieser Zugabe möglichst gut entsprach, das heißt Werte, die aus diesem Niveau herausstachen, wurden übergangen. In der gleichen Weise wurden auch vor den weiteren Zugaben mit Wirkung auf die Chloridse
kretion Ausgangswerte bestimmt.
Um die maximale Wirkung von Carbachol und Forskolin zu erfassen, wurde der am weitesten vom Basalniveau abweichende Wert für Isc und Gt ermittelt. Da bei Gt der Kurvenverlauf nicht in jedem Mucosastück nach dem gleichen Muster ablief, wurde zunächst an den überlagerten Verlaufskurven die Veränderung bestimmt, die die größte mittlere Abweichung vom Basal
wert ergeben hatte. An den Einzelkurven wurde dann die analoge Veränderung in ihrer maxi
malen Ausprägung als entsprechender Wert herangezogen, auch wenn bei manchen Mucosa
stücken eine früher oder später auftretende Veränderung einen größeren Betrag aufwies.
Auch bei der Ermittlung der maximalen Veränderungen wurden einzelne Werte, die stark vom umgebenden Niveau abwichen und vermutlich durch Störfaktoren während der Messung verfälscht worden waren, nicht berücksichtigt. Die Punkte der maximalen Wirkung wurden für Isc und Gt unabhängig ermittelt und lagen meist zeitversetzt.
Für DIDS und NPPB war es aufgrund des Kurvenverlaufs nicht möglich, den Punkt der maxi
malen Wirkung sicher zu bestimmen. Wurden sie als Präinkubation eingesetzt, wurde der ent
sprechende Messwert unmittelbar vor der folgenden Stimulation ermittelt. Bei einer Zugabe nach vorangegangener Stimulation ergab sich für DIDS die zusätzliche Schwierigkeit, dass eine Wirkung anhand der Kurven nicht festgestellt werden konnte. Die Veränderungen der Kurzschlussströme und Leitfähigkeiten nach Zugabe von DIDS unterschieden sich nicht von den vorher zu beobachtenden zeitabhängigen Veränderungen. Da allerdings keine Zeitkon
trollwerte erhoben wurden, die als Vergleich herangezogen werden könnten, wurde die Er
mittlung einer maximalen Veränderung nach DIDS als nicht sinnvoll beurteilt, und Einzel
messwerte wurden nicht erhoben. Bei NPPB wurden Leitfähigkeit und Kurzschlussstrom nach der Zugabe erfasst, wenn sich beide Parameter wieder stabilisiert hatten. Konkret wurde dafür ein Zeitpunkt 30 Minuten nach der Zugabe festgelegt. Wie bei allen anderen Wirkstoffen auch wurden Werte, die offensichtlich verfälscht waren, nicht ausgewählt.
Im abgewandelten Grundprotokoll (Kap. 2.7.4) wurden einzelne Pharmaka nicht in alle Kam
mern gegeben. In diesen Fällen wurde jeweils ein Zeitkontrollwert ermittelt, der den gleichen zeitlichen Abstand zur vorangegangenen Zugabe hatte wie die Vergleichswerte.
Aus den für jede Kammer ermittelten Daten wurden arithmetische Mittelwerte für jedes Tier und daraus arithmetische Mittelwerte und Standardabweichungen für die Tiergruppen errech
net.
2.8.3 Dosis-Wirkungskurven
Als Ausgangspunkt der Dosis-Wirkungskurven wurden die maximalen Kurzschlussströme nach Forskolin herangezogen. Die Isc, die acht Minuten nach der Applikation der jeweiligen NPPB-Konzentration gemessen wurden, stellten das Maß für die Wirkung dar. Diese Isc wur
den gegen die logarithmierte NPPB-Konzentration aufgetragen. Als Vergleich wurden jeweils die Werte der nicht mit NPPB behandelten Zeitkontrollen dargestellt.
Um das zeitabhängige Absinken der Isc aus den Dosis-Wirkungskurven herauszurechnen, wur
de für jede NPPB-Konzentration die Differenz aus den Isc der Zeitkontrollen und denen der NPPB-behandelten Kammern gebildet. Diese wurde wiederum gegen die logarithmierte NPPB-Konzentration aufgetragen und für die so erhaltene Kurve die sigmoidale Dosis-Wir
kungskurve durch Regression ermittelt.
2.9 Statistik
Alle statistischen Berechnungen wurden mit dem Programm GraphPad Prism 4 für Windows, Version 4.00, durchgeführt.
Die Kurzschlussströme und Gewebeleitfähigkeiten wurden jeweils für Jejunum und Colon für alle drei Tiergruppen bzw. alle Inkubationsverfahren und an allen erhobenen Messpunkten in einer zweifaktoriellen Varianzanalyse für verbundene Stichproben mittels des Verfahrens Two-way Repeated-Measurements ANOVA mit anschließendem Bonferroni-Posttest vergli
chen. Als verbundene Stichproben wurden alle Daten betrachtet, die von Gewebe eines Tieres stammten, also die Daten aller Messpunkte bei einem Tier sowie die Ergebnisse mit verschie
denen Inkubationsverfahren an Gewebe des gleichen Tieres. Ab einer Irrtumswahrscheinlich
keit unter 5% (p < 0,05) wurde ein Unterschied als signifikant bezeichnet.
Die Dosis-Wirkungskurven wurden nach logarithmischer Transformation der Konzentrations
daten mit dem Verfahren „Sigmoidal dose-response (variable slope)“ berechnet.
3 Ergebnisse
3.1 Elektrophysiologische Parameter im Grundprotokoll
3.1.1 Allgemeines Muster der Verlaufskurven
Prinzipiell verliefen die Kurzschlussströme im Grundprotokoll bei allen Tieren sowohl im Je
junum als auch im Colon nach einem ähnlichen Muster. Die Veränderungen der Gewebeleit
fähigkeiten unterschieden sich zwischen Jejunum und Colon, waren bei den verschiedenen Tiergruppen aber im Grundsatz identisch. Einen typischen Verlauf von Kurzschlussstrom und Gewebeleitfähigkeit im Jejunum und Colon zeigen die Abbildungen 4 und 5.
Nach Zugabe der vorbereitenden Pharmaka Indomethacin, Amilorid, TEA und Barium zeig
ten sowohl die Kurzschlussströme als auch die Gewebeleitfähigkeiten eine Stabilisierung auf einem individuellen konstanten Wert.
Die Zugabe von Carbachol führte stets zu einem rapiden Anstieg der Kurzschlussströme, der jedoch nur von kurzer Dauer war. Der Abfall zurück auf das Ausgangsniveau erfolgte inner
halb von etwa 20 Minuten. Die Reaktion der Gewebeleitfähigkeiten auf Carbachol stellte sich nicht einheitlich dar.
Abb. 4: Typischer Verlauf von Isc und Gt im Jejunum.
Die Pfeile markieren die Zugaben der Pharmaka des Grundprotokolls: 1 = Indo
methacin, 2 = Amilorid, 3 = TEA, 4 = Barium, 5 = Carbachol, 6 = Forskolin, 7 = DIDS, 8 = NPPB.
0 50 100 150 200 250
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8
0 10 20 30 40 Isc
Gt
Zeit [min]
Isc [µEq⋅cm-2 ⋅h-1 ] Gt[mS⋅cm -2]
Auf das Zusetzen von Forskolin folgte erneut ein schneller Anstieg der Isc, der in diesem Fall in eine andauernde Plateauphase überging. Während dieser Plateauphase sanken die Kurz
schlussströme nur langsam. Die Gewebeleitfähigkeiten reagierten auf Forskolin zunächst mit einem Anstieg; der weitere Verlauf war im Jejunum und Colon unterschiedlich.
DIDS beeinflusste weder die Kurzschlussströme noch die Leitfähigkeiten erkennbar. Die Ver
läufe der Kurzschlussströme und der Leitfähigkeiten zeigten keine Veränderungen nach der Zugabe gegenüber der Phase vor der Zugabe.
NPPB bewirkte ein zügiges Absinken der Kurzschlussströme bis auf das Niveau vor Beginn der Stimulation und unterschiedliche Veränderungen der Gewebeleitfähigkeiten im Jejunum und Colon. Bei einigen Epithelien war direkt nach der Gabe von NPPB zunächst ein geringer Anstieg des Kurzschlussstroms und erst anschließend ein Absinken zu beobachten. Dies trat jedoch nicht durchgängig auf.
3.1.2 Spezifische Beobachtungen an Jejunum und Colon
Unabhängig von der untersuchten Tiergruppe konnten Unterschiede zwischen dem Dünn
darmabschnitt Jejunum und dem Dickdarmrepräsentanten Colon festgestellt werden.
Abb. 5: Typischer Verlauf von Isc und Gt im Colon.
Die Pfeile markieren die Zugaben der Pharmaka des Grundprotokolls: 1 = Indome
thacin, 2 = Amilorid, 3 = TEA, 4 = Barium, 5 = Carbachol, 6 = Forskolin, 7 = DIDS, 8 = NPPB.
0 50 100 150 200 250
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Isc
Gt
Zeit [min]
Isc [µEq⋅cm-2 ⋅h-1 ] Gt [mS⋅cm -2]
