Um genauer beurteilen zu können, welchen Anteil CFTR-Kanäle und alternative Chloridkanä
le an den beschriebenen Veränderungen der elektrophysiologischen Parameter haben, wurden Versuche mit abgewandeltem Grundprotokoll (siehe Kap. 2.7.4) durchgeführt. Durch Präin
kubation mit DIDS oder NPPB sollten die alternativen Chloridkanäle bzw. die CFTR-Kanäle gehemmt werden, durch Depolarisation der basolateralen Zellmembran mittels kaliumreicher Lösung sollte der Einfluss der calciumabhängigen Kaliumkanäle ausgeschaltet werden.
3.4.1 Jejunum
Mit Mucosa des Jejunums wurden nur Versuche mit DIDS- und NPPB-Präinkubation unter
nommen. Untersuchungen in kaliumreichem Puffer wurden nicht durchgeführt.
Bei den Mucosastücken ohne Präinkubation, die als Kontrollen mitgeführt wurden, konnten die bereits beschriebenen Verläufe der Kurzschlussströme und der Gewebeleitfähigkeiten be
obachtet werden (Abb. 30 und 31). Sie unterschieden sich lediglich durch den veränderten zeitlichen Ablauf geringfügig von den Verläufen im Grundprotokoll. So erreichten die Kurz
schlussströme in den 20 Minuten zwischen Carbachol- und Forskolin-Zugabe nicht vollstän
dig das Basalniveau. Zudem wurde bereits 15 min nach Forskolin NPPB zugesetzt, so dass die Plateauphase nur kurz ausgeprägt war. Dadurch waren auch die Isc vor NPPB höher als in Versuchen mit dem Grundprotokoll, da hier ein längeres zeitabhängiges Absinken der Isc vor
Abb. 29: Vergleich der Isc im Colon vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB (MW ± SD). Die zweifaktorielle Varianzanalyse ergab einen Einfluss der Tiergruppe von 0,40% (p = 0,4117). Im Bonferroni-Posttest ergaben sich keine signifikanten Unterschiede.
vor Carbachol
10 Mastschweine (n = 13)
Absetzferkel (n = 22) Saugferkel (n = 4)
Isc [µEq⋅cm-2⋅h-1 ]
angegangen war. Nach NPPB-Gabe erreichten die Ströme jedoch wie im Grundprotokoll das Basalniveau.
Die Präinkubation mit DIDS als Hemmstoff alternativer Chloridkanäle beeinflusste weder die Höhe noch den Verlauf der Kurzschlussströme und Gewebeleitfähigkeiten im Vergleich zu den Kontrollgeweben ohne Präinkubation.
Dagegen hatte die Präinkubation mit dem CFTR-Hemmstoff NPPB ausgeprägte Auswirkun
gen auf die elektrophysiologischen Parameter. Die Kurzschlussströme reagierten auf die Gabe des NPPB mit einem vorübergehenden, kleinen Anstieg, wie er gelegentlich auch im Grund
protokoll auftrat (Kap. 3.1.1), um dann unter das Basalniveau abzusinken. Weder auf Carba
chol noch auf Forskolin erfolgte bei den NPPB-präinkubierten Mucosastücken eine Verände
rung der Isc. Stattdessen blieben die Ströme bis zum Ende des Versuchs konstant niedrig.
Die Gewebeleitfähigkeiten veränderten sich durch die NPPB-Präinkubation nicht, ebenso we
nig wie durch die Zugabe von Carbachol. Nach dem Zufügen von Forskolin war ein Anstei
gen der Gt zu verzeichnen, wobei jedoch nicht sicher auszumachen war, ob dieses Phänomen zeitabhängig oder durch Forskolin beeinflusst war.
Abb. 30: Verlauf der Isc (MW) nach Präinkuba
Abb. 31: Verlauf der Gt (MW) nach Präinkuba
tion mit DIDS oder NPPB im Vergleich zu
Die beschriebenen Effekte der Pharmaka zeigten sich auch in den diskreten Messwerten. Die
se wurden im Basalzustand nach den vorbereitenden Zugaben von Indomethacin (in den Puf
fer), Amilorid, Barium und TEA, und somit vor der Präinkubation, erhoben, und auf die Präinkubation folgend jeweils vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB. In der zweifak
toriellen Varianzanalyse ergab sich ein signifikanter Einfluss der Präinkubation auf die Kurz
schlussströme von 31%. Im Bonferroni-Posttest erwiesen sich die Werte der Isc im Basalzu
stand und auch nach Präinkubation als nicht signifikant verschieden. Nach Carbachol, vor und nach Forskolin und vor NPPB lagen sie dagegen signifikant höher bei den Mucosastücken ohne Präinkubation und mit DIDS-Präinkubation als bei denjenigen mit NPPB-Präinkubation (Abb. 32). 30 min nach NPPB waren die Unterschiede nicht mehr signifikant.
Für die Gewebeleitfähigkeiten errechnete sich in der zweifaktoriellen Varianzanalyse noch ein signifikanter Einfluss der Präinkubation von 8%, in den Bonferroni-Posttests blieben je
doch alle Vergleiche zwischen den Präinkubationen unter der Signifikanzgrenze (Abb. 33).
Tendenziell lagen die Gt nach Carbachol, vor und nach Forskolin und nach NPPB bei den Ge
weben ohne Präinkubation und mit DIDS-Präinkubation höher als bei denen mit NPPB-Präin
kubation.
Abb. 32: Vergleich der Isc im Jejunum bei unterschiedlichen Präinkubationen im Basalzu
stand, vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB (MW ± SD, n = 3). Die zweifaktorielle Varianzanalyse ergab einen Einfluss der Präinkubation von 30,72% (p < 0,0001). Signifi
kante Unterschiede im Bonferroni-Posttest an einem Messzeitpunkt sind mit unterschiedli
chen Buchstaben gekennzeichnet.
Die Mittelwerte und Standardabweichungen sowie die Ergebnisse und p-Werte der Varianz
analysen und der Bonferroni-Posttests sind in Anhang 8.5.1 aufgelistet.
3.4.2 Colon
Ebenso wie mit jejunalem Gewebe wurde auch mit Colon der Effekt einer Präinkubation mit DIDS oder NPPB untersucht. Für die Kontrollgewebe ohne Präinkubation galt auch hier, dass nur durch den veränderten Zeitablauf des Protokolls geringfügige Unterschiede zu dem be
schriebenen Verlauf der Kurzschlussströme und Gewebeleitfähigkeiten aus dem Grundproto
koll (siehe Kap. 3.1) entstanden. Im Einzelnen waren dies, wie schon für das Jejunum (Kap. 3.4.1) erläutert, geringfügig höhere Isc vor Forskolin und eine kurze Plateauphase nach Forskolin mit daraus folgenden höheren Isc vor NPPB (Abb. 34 und 35).
DIDS-Präinkubation und damit die Hemmung alternativer Chloridkanäle veränderte wie auch im Jejunum weder Verlauf noch Höhe der Isc und Gt gegenüber den Verhältnissen bei den Kontrollgeweben.
Abb. 33: Vergleich der Gt im Jejunum bei unterschiedlichen Präinkubationen im Basalzu
stand, vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB (MW ± SD, n = 3). Die zweifaktorielle Varianzanalyse ergab einen Einfluss der Präinkubation von 8,40% (p < 0,0020). Im Bonfer
roni-Posttest ergaben sich keine signifikanten Unterschiede.
basal
Die Hemmung der CFTR-Kanäle durch NPPB-Präinkubation führte dagegen nach einem tran
sienten Anstieg zu einem Absinken der Kurzschlussströme unter das Basalniveau und gleich
zeitig zu einem Ansteigen der Gewebeleitfähigkeiten. Carbachol verstärkte diesen Anstieg der Gt noch. Im Gegensatz zum Jejunum erzeugte das Colon nach Carbacholgabe auch bei NPPB-Präinkubation einen geringen, jedoch eindeutig identifizierbaren Anstieg der Isc. Nach Forsko
lin war das nicht der Fall. Die Gt stiegen hier jedoch noch weiter an, ehe sie nach einiger Zeit begannen, wieder zu sinken.
Entsprechend ergab sich in der zweifaktoriellen Varianzanalyse der Einzelmesswerte ein si
gnifikanter Einfluss der Präinkubation von 18% auf die Kurzschlussströme (Abb. 36). Die Bonferroni-Posttests zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Präinkubationen bei den basalen Isc sowie den Isc vor Carbachol und vor Forskolin. Dagegen lagen die maxima
len Isc nach Carbachol und Forskolin sowie die Isc vor NPPB signifikant höher in den Gewe
ben ohne oder mit DIDS-Präinkubation als in denjenigen mit NPPB-Präinkubation. Nach NPPB waren wiederum keine Unterschiede vorhanden.
Abb. 34: Verlauf der Isc (MW) nach Präinkuba
tion mit DIDS oder NPPB im Vergleich zu nicht präinkubierter Mucosa im Colon; n = 3.
Die Pfeile markieren die Zugaben:
Bei den Einzelmesswerten der Gewebeleitfähigkeiten zeigte sich in der Varianzanalyse ein si
gnifikanter Anteil der Präinkubation an der Gesamtvarianz von 14%. Die Bonferroni-Posttests ergaben signifikant höhere Gt bei NPPB-Präinkubation gegenüber Mucosa mit DIDS-Präinku
bation und ohne Präinkubation nach Carbacholzugabe und vor Forskolin. Zu den übrigen Messzeitpunkten waren die Leitfähigkeiten zwischen den verschieden präinkubierten Gewe
ben nicht signifikant unterschiedlich (Abb. 37).
Die Details zu den Mittelwerten und Standardabweichungen sowie zu den Ergebnissen und p-Werten der Varianzanalysen können dem Anhang 8.5.2 entnommen werden.
Abb. 36: Vergleich der Isc im Colon bei unterschiedlichen Präinkubationen im Basalzustand, vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB (MW ± SD, n = 3). Die zweifaktorielle Vari
anzanalyse ergab einen Einfluss der Präinkubation von 17,92% (p < 0,0001). Signifikante Unterschiede im Bonferroni-Posttest an einem Messzeitpunkt sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.
Zusätzlich wurden mit Colonmucosa Versuche in kaliumreichem Puffer durchgeführt, um eine Depolarisation der basolateralen Membran zu erzielen. Damit sollte der Einfluss basola
teraler calciumaktivierter Kaliumkanäle auf die Chloridsekretion ausgeschaltet werden. Auch bei diesen Versuchen wurde als Kontrolle Mucosa in normalem Darmpuffer inkubiert. Die Mucosastücke in kaliumreichem Puffer wurden entweder ohne Präinkubation oder mit NPPB-Präinkubation untersucht.
Die Kontrollgewebe in Darmpuffer zeigten die gleichen Verläufe der Kurzschlussströme und Gewebeleitfähigkeiten, wie sie bereits im Grundprotokoll beschrieben wurden.
In kaliumreichem Puffer lagen die basalen Isc niedriger und die basalen Gt höher als in Darm
puffer (Abb. 38 und 39). Carbacholzugabe führte nicht zu einem Anstieg der Isc und nur zu ei
nem sehr geringen Anstieg der Gt. Dagegen bewirkte Forskolin ein deutliches Ansteigen von Isc und Gt, das bei den Isc schwächer, bei den Gt stärker ausgeprägt war als im Darmpuffer.
DIDS hatte genau wie in Darmpuffer keinen Effekt auf die elektrophysiologischen Parameter.
NPPB ließ die Isc und Gt wieder absinken, die Isc fielen dabei deutlich unter das Ausgangsni
veau, während die Gt lediglich zu diesem zurückkehrten.
Abb. 37: Vergleich der Gt im Colon bei unterschiedlichen Präinkubationen im Basalzustand, vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB (MW ± SD, n = 3). Die zweifaktorielle Vari
anzanalyse ergab einen Einfluss der Präinkubation von 13,88% (p < 0,0001). Signifikante Unterschiede im Bonferroni-Posttest an einem Messzeitpunkt sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.
Wurde in kaliumreichem Puffer NPPB als Präinkubation eingesetzt, begannen die Isc ab der Zugabe von NPPB langsam zu sinken und die Gt zu steigen. Carbachol verstärkte diese Reak
tionen deutlich, wobei sich die Isc nach einiger Zeit auf einem neuen Niveau stabilisierten, während die Gt schnell einen Gipfel erreichten und danach wieder stark absanken. Dabei fie
len sie unter das Basalniveau. Auf Forskolin folgte ein geringfügiger Anstieg der Isc und ein etwas deutlicherer der Gt. Auf DIDS erfolgte auch hier keinerlei Veränderung.
In den Einzelmesswerten fanden sich die beschriebenen Unterschiede deutlich wieder. Die zweifaktorielle Varianzanalyse ergab einen signifikanten Anteil von Puffer und Präinkubation von 54% an der Gesamtvarianz der Kurzschlussströme und von 22% an der Gesamtvarianz der Gewebeleitfähigkeiten.
Die Kurzschlussströme waren basal und vor Carbachol signifikant höher bei Mucosa in Darmpuffer als bei solcher in kaliumreichem Puffer (Abb. 40). Nach Carbachol waren die Isc
mit kaliumreichem Puffer und NPPB deutlich negativ und damit signifikant verschieden von denen an nicht präinkubiertem Gewebe. Dabei waren die Isc in Darmpuffer deutlich höher als vor Carbachol und weiterhin signifikant verschieden von den niedrigeren Isc in K+-reichem Puffer.
Vor Forskolin waren die Isc in Darmpuffer wieder auf das Basalniveau abgesunken, in kalium
reichem Puffer hatten sich die Isc mit und ohne Präinkubation kaum verändert, so dass weiter
hin zwischen allen drei Versuchsgruppen ein signifikanter Unterschied bestand. Forskolin be
wirkte in allen drei Gruppen einen Anstieg der Isc, der in Darmpuffer am ausgeprägtesten aus
fiel. Somit unterschieden sich weiter alle Gruppen signifikant. Weitgehend identisch stellte sich die Situation vor NPPB dar.
Durch die Zugabe von NPPB sanken die Isc sowohl in Darm- als auch in K+-reichem Puffer stark ab. In K+-reichem Puffer sanken sie so stark, dass sie negative Werte und damit die glei
che Ebene wie die von NPPB-präinkubierter Mucosa erreichten. Ein signifikanter Unterschied bestand folglich zwischen den Geweben in Darmpuffer und denen in kaliumreichem Puffer mit und ohne Präinkubation.
Die Gewebeleitfähigkeiten unterschieden sich im Basalzustand sowie vor und nach Carbachol nur zwischen Darmpuffer und kaliumreichem Puffer mit NPPB signifikant (Abb. 41).
Abb. 40: Vergleich der Isc im Colon bei Inkubation in Darmpuffer und kaliumreichem Puf
fer sowie bei Präinkubation mit NPPB im Basalzustand, vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB (MW ± SD, n = 5). Die zweifaktorielle Varianzanalyse ergab einen Einfluss von Puffer und Präinkubation von 53,68% (p < 0,0001). Signifikante Unterschiede im Bonferro
ni-Posttest an einem Messzeitpunkt sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.
basal
Vor Forskolin waren die Gt in den NPPB-präinkubierten Geweben mit kaliumreichem Puffer gesunken und lagen nicht mehr signifikant höher als die Gt in Darmpuffer, die ebenfalls ge
sunken waren und nun signifikant niedriger ausfielen als diejenigen in nicht präinkubiertem K
+-reichem Puffer. Nach Forskolin waren die Gt nur in den nicht präinkubierten Geweben merklich angestiegen und erreichten in K+-reichem Puffer alleine signifikant höhere Werte als in Darmpuffer und in K+-reichem Puffer mit NPPB. Dies war auch die Lage vor NPPB-Zu
satz.
NPPB senkte die Gt in nicht präinkubiertem Gewebe in kaliumreichem Puffer auf das Niveau der beiden anderen Gruppen, so dass kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen mehr bestand.
Dem Anhang 8.5.2 sind die Mittelwerte und Standardabweichungen sowie die Ergebnisse und p-Werte der Varianzanalysen zu entnehmen.
Abb. 41: Vergleich der Gt im Colon bei Inkubation in Darmpuffer und kaliumreichem Puf
fer sowie bei Präinkubation mit NPPB im Basalzustand, vor und nach Carbachol, Forskolin und NPPB (MW ± SD, n = 5). Die zweifaktorielle Varianzanalyse ergab einen Einfluss von Puffer und Präinkubation von 22,20% (p < 0,0001). Signifikante Unterschiede im Bonferro
ni-Posttest an einem Messzeitpunkt sind mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.
basal