Extraembryonale Matrix des frühen Embryos

Verglichen mit Untersuchungen des Einflusses der in vitro Kultur auf den Embryo selbst oder auf die ZP der Eizelle, gibt es nur relativ wenige Untersuchungen, die sich mit den Strukturveränderungen der EEM des frühen bovinen Embryos während seiner Entwicklung in vivo und in vitro vergleichend beschäftigen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich die Morphologie der EEM der in vivo Embryonen und der in vitro Embryonen erheblich unterscheidet. Außerdem zeigt sich vor allem bei den in vivo Embryonen eine Veränderung der Morphologie der EEM während der Embryonalentwicklung.

Die Breite der EEM unterschied sich initial mit Werten von 13,28 µm ±0,37^a bei den in vivo 2-/4-Zellern, 12,49 µm ±0,32 ^a bei den in vivo 2-/4-Zellern, 12,85 µm ±0,28 ^a bei den in vitro 8-/16-Zellern und 12,77 µm ±0,34 ^a bei den in vivo 8-/16-Zellern kaum. Bei der EEM der in vivo Morulae kam es dann aber zu einer erheblichen Breitenzunahme von über 4 µm (ca.

30%) auf 16,86 µm ±0,47 ^a, wohingegen die Breite der in vitro Morulae mit 13,41 µm ±0,33 nur geringgradig zunahm und sich damit signifikant von der Breite der in vivo Morulae unterschied. Die Breite der EEM der Blastozysten nahm dann auf Werte von 12,03 µm

±0,78 bei den in vivo und 9,28 µm ±0,58 bei den in vitro Blastozysten ab, wobei sich die Werte von in vivo und in vitro Blastozysten aber weiterhin signifikant unterschieden (siehe Abb. 18 und Tab. 04). Aus diesen Werten lässt sich folgendes ableiten: Es gibt eine Breitenzunahme der EEM beim Morula-Stadium, die, da sie nur bei den in vivo Embryonen in diesem Umfang zu beobachten war, von maternalem Material stammen muss, oder aufgrund eines maternalen Signals vom Embryo produziert wird. Da sich der Embryo zum Zeitpunkt des Morula-Stadiums im Uterus befindet, müsste es sich bei einem maternalen Ursprung der Breitenzunahme der EEM um uterines Sekret bzw. uterine Faktoren handeln. ABE et al. (1999) verglichen die EEM von bovinen in vivo und in vitro Blastozysten und stellten ebenfalls fest, dass die EEM der in vitro Blastozysten dünner erschien. Dies bedeutet, dass auch beim Rind Strukturveränderungen an der EEM während der Embryonalentwicklung durch maternale Faktoren und durch Ein- und Auflagerung von uterinem Sekret stattfinden, wie sie unter anderem bei Kaninchen, Pferd,

a=SEM

Pavian und vielen anderen Tierarten (zur Übersicht siehe DENKER 2000) nachgewiesen worden sind.

YASHINAGA und ADAMS (1967) transferierten Blastozysten von Ratten in Kaninchen-Eileiter und stellten fest, dass sich keine Mukoproteinschicht um die Ratten-Blastozysten bildete. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Embryo bei den Strukturveränderungen an der EEM nicht passiv zu sein scheint. Welche Mechanismen für die Präzipitation von Se-kretionen aus dem Genitaltrakt oder dem Trophoblasten verantwortlich sind, ist noch nicht geklärt. Bei niederen Tieren wie Seeigeln und Fischen, scheinen Peroxidasen und Transglutaminasen an der Formation und der Stabilisierung der Hüllen beteiligt zu sein (BATTAGLIA und SHAPIRO 1988, YAMAGAMI et al.1992). DENKER (2000) hält dies auch beim Säugetier für möglich.

Dass die EEM im Blastozysten Stadium dünner wird, liegt zum einen an der Expansion des Embryos und einer daraus folgenden Streckung der EEM (COLE 1967) und zum anderen an Abbauprozessen, die dem Embryo das Schlüpfen aus seiner Hülle ermög-lichen, wobei Zona-Lysine eine Rolle spielen (SCHIEWE et al. 1995), die anscheinend aus dem Trophoektoderm der Blastozyste und dem Endometrium stammen (PERONA und WASSARMAN 1986, SAWADA et al. 1990). Bei niederen Tieren sind seit langem Hatchingenzyme bekannt, die eine hohe Homologie zu den Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) aufweisen (NOMURA et al. 1997), diese konnten auch bei Mäusen nachgewiesen werden (TACHI 1998). Die genaue Funktion der MMPs im Schlüpfprozess konnte aber noch nicht nachgewiesen werden. So erscheint die dünnere EEM der in vitro Blastozyste oberflächlich betrachtet vorteilhaft, muss der Embryo doch so anscheinend eine dünnere Schicht durchbrechen als bei den in vivo Blastozysten. Das Gegenteil scheint aber der Fall zu sein, so kann es bei (suboptimalen) in vitro Kultur Bedingungen zu einer Verhärtung (hardening) der EEM, auch durch das Fehlen der oben beschriebenen MMPs und anderer EEM lysierender Proteasen, und damit zu einem Scheitern des Schlüpfvorganges des Embryos kommen (COHEN et al. 1990). Deshalb wurde die Technik des „Assisted Hatching“ entwickelt, bei der auf unterschiedliche Weise (mechanisch, chemisch oder

Ausdruck einer solchen Verhärtung der EEM könnte auch folgendes Ergebnis dieser Arbeit sein:

Bei allen in vitro Embryonalstadien gab es eine netzartige Oberfläche (in vitro 2 - /4 - Zeller 71,4%, 8 - /16 - Zeller 90%, Morulae 18,2%, Blastozysten 64,3%), die aber im Unterschied zu der bei den Eizellen und Zygoten beobachteten Struktur, feintrabekuläres Material der EEM zu sein schien und an Risse in diesem Material erinnerte (siehe Abb. 35). Bei den in vivo Embryonalstadien war dagegen keine netzartige Oberfläche zu beobachten.

Die Expansion des Embryos geschieht nicht kontinuierlich, sondern es ist bekannt, dass sich die Blastozyste, ähnlich einem Pumpmechanismus, stoßweise vergrößert. Bei einer Verhärtung der EEM könnten so Risse in der EEM entstanden sein, die bei den in vivo Embryonalstadien nicht zu beobachten waren. Sie könnten bei den in vivo Embryonen aber auch durch Auf- und Einlagerungen von Ovidukt- und Uterussekret verdeckt worden sein. Eine Verdichtung der EEM bei den in vitro Embryonalstadien zeigt auch die lichtmikroskopische Untersuchung der Embryonen, dabei wurde der retikuläre Anteil der ZP bzw. EEM gemessen. Bei allen Stadien konnte ein innerer, eher kompakter und homogener Bereich von einem retikulären, lockeren Bereich der ZP bzw. EEM abgegrenzt werden (siehe Abb. 03). Die unreifen Eizellen zeigten mit 30,54% ±2,26 nach den in vivo Morulae 32,32% ± 0,59 den zweit größten retikulären Anteil an der ZP. Bei allen in vitro Embryonalstadien war der retikuläre Anteil der EEM geringer als bei den entsprechenden in vivo Embryonalstadien (siehe Abb. 13), wobei die Differenzen bei den in vivo und in vitro Zygoten und Blastozysten signifikant und bei den in vivo und in vitro 2 - /4 - Zellern hochsignifikant war (siehe Tab. 03 a, b und Abb. 14-17). Ob es sich bei dieser offensicht-lichen Verdichtung der EEM der in vitro Embryonen um morphologische Veränderungen im Zusammenhang mit dem „Zona hardening“ handelt, ist Spekulation. Denkbar wäre auch, dass Material aus der in vitro Kultur den retikulären Anteil der EEM verdichtet oder dass es sich um eine retardierte Entwicklung der EEM in Kultur handelt, wo Ein- und Auflagerungen aus dem Ovidukt und dem Uterus fehlen und ebenso andere EEM modulierende Faktoren, auf die im Folgenden noch eingegangen werden wird.

Diese Verdichtung der EEM kann sich möglicherweise auf den Stoffaustausch zwischen dem in vitro produzierten Embryo und seiner Umgebung auswirken. In diesem Zusammen-hang muss noch einmal erwähnt werden, dass die Penetrationsfähigkeit eines Stoffes vor

allem durch bestimmte physiko-chemische Eigenschaften bestimmt wird, wobei lipophile Substanzen mit niedrigen Van der Waals-Kräften die EEM leichter penetrieren als hydro-phile Substanzen mit niedrigen Van der Waals-Kräften. Eine Beeinflussung der Pene-tration findet aber auch durch Bindungsproteine in der EEM statt (TURNER und HOROBIN 1997). Eine Veränderung der Struktur der EEM könnte auch mit einer veränderten mole-kularen Struktur und damit mit anderen Ladungsverhältnissen einhergehen, die sich auch negativ auf den Stoffaustausch auswirken können. Ein veränderter Stoffaustausch könnte zu einem negativen Einfluss auf die Embryonalentwicklung führen. Die EEM bildet das Interface zwischen dem Embryo und seiner Mutter, durch welches ein Austausch von Boten- und Nährstoffen stattfindet (HERRLER und BEIER 2000). Alle Signale des embryo-maternalen Dialoges müssen also die EEM durchdringen, dabei scheint es sich nicht nur um eine Passage, sondern teilweise auch um eine Modellierung der Signale zu handeln, was zum Beispiel für das IGF-System beschrieben wurde (siehe Schrifttum Kapitel 2.4.2 Funktion der ZP/EEM), ist dies durch eine veränderte Struktur der EEM nicht mehr gewährleistet, könnte das für den Embryo negative Auswirkungen haben. Bei dem Beispiel des IGF-Systems würde dem Embryo damit ein wichtiger „Survival Factor“ fehlen, der den Embryo vor Apoptose auslösenden Substanzen und phagozytierenden Zellen schützt (HERRLER und BEIER 1999).

ABE et al. (1999) beobachteten hingegen, dass die äußere Schicht der EEM im Trans-missionselektronenmikroskop bei den in vitro Blastozysten locker und porös erschien, wohingegen sich die EEM bei den in vivo Blastozysten als eine homogene Schicht darstellte. Eventuell handelt es sich bei ihren Beobachtungen um Degenerationser-scheinungen, die in der vorliegenden Arbeit ebenfalls bei den in vitro Embryonen festgestellt werden konnten. 42,9% der in vitro 2 - /4 - Zeller, 30% der in vitro 8 /16 -Zeller und 50% der in vitro Blastozysten wiesen eine degradiert erscheinende Struktur auf (siehe Abb. 34 und 36), die auf Degenerationserscheinungen durch die in vitro Kultur schließen lassen, da sie bei keinem in vivo Embryo zu beobachten waren.

Große Unterschiede zwischen den in vivo und den in vitro Embryonen ließen sich auch bei

100% den Granula-Typ 1 mit flachen Granula, die wie zusammengeschmolzen wirkten (siehe Abb. 32 bis 36). Eine Ausnahme bildeten die in vitro Zygoten bei denen 57,1% den Granula-Typ 2, 28,6% den Granula-Typ 1 und 14,3% den Granula-Typ 3 zeigten (siehe Abb. 30 und 31). RIDDEL et al. (1993) beobachteten dagegen, dass die EEM von in vivo Blastozysten verglichen mit der von Eizellen glatter erscheint. VANROOSE et al. (2000) untersuchten die rasterelektronenmikroskopische Struktur von in vitro gereiften bovinen Eizellen und Embryonen. Sie beschrieben die Struktur der Eizellen als schwammartiges Netzwerk mit einer rauen Oberfläche. Bei den in vitro Zygoten erschien dieses schwammartige Netzwerk kompakter und glatter und die Anzahl der Poren war geringer im Vergleich zu den in vitro gereiften Eizellen. Bei den Zygoten gab es noch einen zweiten Typ mit einer Oberfläche, die nur wenige nicht so tiefe Poren enthielt und ein „ge-schmolzenes“ Aussehen hatte, was mit der in der vorliegenden Arbeit als Granula-Typ 1 bezeichneten Oberflächenstruktur vergleichbar erscheint. Bei den in vitro 8 - Zellern kamen bei den Untersuchungen von VANROOSE et al. (2000) die beiden Oberflächen Typen zu gleichen Teilen vor. Es gab aber Bereiche mit granulären Ablagerungen auf der ZP-Oberfläche, diese konnten in dieser Arbeit nicht beobachtet werden. Bei den in vitro Morulae war die Oberfläche rauer und enthielt viele kleine Poren. Es gab viele granuläre Ablagerungen. Bei 8 - Zellern und Morulae gab es Brückenbildungen zwischen Poren, die von biologischem Material zu stammen schienen, diese Beobachtung ist eventuell mit der in der vorliegenden Arbeit als netzartige Struktur bezeichneten Oberfläche vergleichbar.

Der in dieser Arbeit darüber hinausgehende Strukturvergleich von in vivo und in vitro Embryonen verdeutlicht auch bei den Granula der Oberfläche eine deutliche Beein-flussung durch die in vitro Kultur.

Ausgehend von der bereits oben diskutierten Theorie, dass es sich bei den Granula um Glykoprotein Oligomere der EEM handelt, könnte der Granula-Typ 1 eine molekulare Veränderung der EEM Glykoproteine signalisieren, die auch wie oben schon diskutiert, zu einer veränderten Penetrierbarkeit der EEM führen könnte und zu den damit bereits erwähnten Konsequenzen für den Embryo. Denkbar ist dabei einerseits, dass der Granula-Typ 1 durch degenerative Einflüsse der in vitro Kultur entsteht, oder andererseits Konsequenz einer retardierten Entwicklung der EEM in in vitro Kultur ist. Eine andere

Möglichkeit ist, dass es sich bei den gut ausgebildeten Granula der in vivo Embryonen um Ein- und Auflagerungen von Ovidukt- bzw. Uterussekret handelt.

BUHI et al. (2000) zeigten in ihren Untersuchungen, dass es im Ovidukt aber auch im Uterus ein fein reguliertes System von aufbauenden und abbauenden Faktoren der EEM gibt. Östrogen-abhängige Glykoproteine, die vom Ovidukt sezerniert werden, konnten für das Rind (BOICE et al.1992) und viele andere Spezies nachgewiesen werden. Die OSP (Oviductal Secretory Proteins) konnten in der Zona pellucida, dem PVS und der Blastomermembran beim Rind bis zum 7. Tag der Trächtigkeit nachgewiesen werden (WEGENER und KILIAN 1991). Diese Proteine scheinen neben einem Einfluss auf die Spermien auch einen Effekt auf die Eizellpenetration, die Fertilisation und auf die Entwicklung des Embryos zu haben (BUHI et al. 2000). Ein weiteres Protein, das im Ovidukt synthetisiert und freigesetzt wird, ist das TIMP-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinase-1) (BUHI et al. 1997). Die genaue Funktion des TIMP-1 im Ovidukt und im Zusammenhang mit den Gameten bzw. Embryonen ist zwar noch nicht bekannt, doch gibt es Anhaltspunkte dafür, dass es eine Rolle spielt bei der Verbesserung der Em-bryonenteilungsaktivität, bei der Verzögerung des Schlüpfvorganges und eine Degra-dierung des Embryos verhindert. Es scheint eine regulierende Funktion bei der Model-lierung der EEM des Embryos zu haben. Eine regulierende Funktion der im Ovidukt vorkommenden Proteasen, wie z.B. den Metalloproteinasen, scheint auch dem PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor) zuzukommen (zur Übersicht siehe BUHI et al. 2000). Da diese Faktoren in der in vitro Kultur fehlen, ist eine veränderte Struktur der EEM bei in vitro Embryonen nicht verwunderlich.

Bei der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung der in vivo und in vitro Embryonen konnten in dieser Arbeit außerdem eine poröse Oberfläche und eine porenlose Oberfläche unterschieden werden. Alle Proben hatten eine poröse Oberfläche mit Ausnahme der in vivo Morulae und in vivo Blastozysten. Bei den in vivo Morulae waren bei 61,5% der Proben keine Poren sichtbar (siehe Abb. 26) und bei den restlichen 38,5% der Proben befanden sich nur eine geringe Anzahl an Poren (ca. 0 - 15 Poren pro 132,5µm²) auf der

feststellen, dass die in vivo Blastozysten im Vergleich mit den Eizellen weniger auffallende Poren besaßen.

Betrachtet man die porenlose Oberfläche der in vivo Morulae und Blastozysten, so war diese komplett mit Granula vom Typ 3 überzogen, die mehrschichtig teils schollenartig angeordnet waren (siehe Abb. 27 und 28). Auch bei den porösen in vivo Morulae und Blastozysten waren die Granula in dieser Weise angeordnet. Zusammen mit den bereits oben beschriebenen Beobachtungen, dass die EEM der in vivo Morulae und Blastozysten signifikant breiter war als die der in vitro Embryonen und dass der retikuläre Anteil der EEM bei allen in vivo Embryonen größer war als bei den in vitro Embryonen, liegt die Vermutung nahe, dass an der EEM der Embryonen einen Entwicklungsprozess stattgefunden hat, wobei die Poren der in vivo Morulae und Blastozysten von Auf-lagerungen aus dem Uterus verdeckt wurden. Denkbar wäre auch, dass Faktoren aus dem Uterus den Embryo zu einer derartigen Veränderung der EEM veranlassen. Dies würde auch die auffallend geringe Maximalfläche der Poren der in vivo Morulae und Blastozysten mit poröser Oberfläche erklären, und dass bei diesen nur eine geringe Anzahl an Poren (ca. 0 - 15) pro 132,5 µm² Oberfläche vorhanden waren.

Die in vitro Morulae und Blastozysten, bei denen keine Auflagerung von Uterussekret bzw.

keine Beeinflussung der EEM durch uterine Faktoren erfolgen konnte, zeigten nicht diese veränderte Oberfläche. Bei den in vitro Morulae hatten 54,5% der Proben eine große Anzahl an Poren (ca. 60 – 100 Poren pro 132,5µm²) und 45,5% hatten eine sehr große Anzahl an Poren (über 100 Poren pro 132,5µm²). Alle anderen Embryonalstadien zeigten zu 100% eine Oberfläche mit einer sehr großen Anzahl an Poren. Die Anzahl der Poren pro Fläche wurde ungefähr bestimmt, da nicht zu jeder Zeit die Sicherheit bestand, sich beim Auszählen in der obersten Schicht der ZP zu befinden, so dass keine statistische Auswertung der Porenanzahl erfolgte. Ebenso wurde bei der Bestimmung der Porenfläche verfahren, bei der von jeder Probe die minimale und die maximale Porenfläche bestimmt wurde, wobei sich eine erhebliche Variationsbreite der Porenfläche auf jeder Probe zeigte.

Bei den Embryonalstadien variierten die Mittelwerte der Porenfläche zwischen minimal 7,66 nm² und maximal 2357,23 nm², wobei sich keine Tendenz hinsichtlich der Herkunft von in vivo oder in vitro Embryonen ausmachen ließ (siehe Tab. 08). Auffällig war jedoch, dass die in vivo Morulae und Blastozysten die Poren mit der geringsten Maximalfläche

besaßen (Mittelwerte in vivo Morulae 165,14 nm² und Blastozysten 869,63 nm²). Die Form der Poren war rund oder elliptisch und die Fläche der Poren veränderte sich zum Inneren der EEM hin zentripetal.

VANROOSE et al. (2000) untersuchten ebenfalls die Anzahl der Poren pro Fläche und deren Durchmesser bei in vitro Zygoten, 8 - Zellern und Morulae. Sie fanden zwei ver-schiedene Oberflächentypen, wobei der eine ein netzartig, rau und schwammartig mit einer Vielzahl von Poren und der andere Typ von einer kompakteren Struktur mit weniger Poren und einer wie „geschmolzen“ wirkenden Oberfläche war. Die Poren waren bei allen Stadien ebenso wie bei den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit rund oder elliptisch und ihr Durchmesser nahm zum Inneren der ZP ab. Sie stellten fest, dass die Anzahl der Poren pro Fläche von den Zygoten zu den Morulae zunahm (Zygoten 1187 Poren pro 5000 µm²; 8 - Zeller 1658 Poren pro 5000 µm²; Morulae 3259 Poren pro 5000 µm²), wohingegen der mittlere Durchmesser der Poren abnahm (Zygoten 223 nm; 8 - Zeller 203 nm und Morulae 155 nm) (zur Übersicht siehe VANROOSE et al. 2000). Durch ihre Untersuchungen mittels Konfokaler Laserscan Mikroskopie (CLSM) kamen sie zu dem Schluss, dass die intakte ZP bzw. EEM von in vitro gereiften Eizellen und in vitro produzierten Embryonen derartig konstruiert ist, dass sie von BVDV (Bovines Virus Diarrhoe Virus, 40-50 nm) und BHV-1 (Bovines Herpesvirus-1, 180-200 nm) nicht über-wunden werden kann. Beide Viren können zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führen. Da sich bei allen Proben, wie oben beschrieben und auch von VANROOSE et al.

(2000) beobachtet, der Durchmesser der Poren zum Inneren der ZP hin zentripetal veränderte, kann durch eine Größenbestimmung der sichtbaren Poren nicht darauf geschlossen werden, ob ein Objekt die ZP penetrieren kann. Außerdem stellte sich die Größe der Poren als sehr variabel dar, was eine Mittelwertsbestimmung der Porengröße bedenklich erscheinen lässt.

Auf Grund der Unterschiede in der ZP-Struktur von in vivo und in vitro Embryonen kann man die Aussage von VANROOSE et al. (2000), dass BHV-1 und BVDV nicht in der Lage sind, die embryonalen Zellen der in vitro Embryonen zu erreichen, nicht ungeprüft auf die

Erkenntnissen führen. Dies ist von großer Bedeutung, da Embryonentransfere in der Praxis vor allem auch mit in vivo Embryonen durchgeführt werden.

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass die in vitro Kultur boviner Eizellen und Embryonen die Struktur der ZP bzw. EEM erheblich beeinflusst, was sich hinsichtlich der Funktionen der ZP bzw. EEM negativ auf die embryonale Entwicklung auswirken kann.

Weiteres Ergebnis dieser Arbeit ist, dass auch beim Rind Strukturveränderungen an der EEM während der frühembryonalen Entwicklung stattfinden, wie sie bereits bei vielen Tierarten (Übersicht siehe DENKER 2000) nachgewiesen worden sind.

Ob es sich bei diesen Strukturveränderungen um Sekrete aus Ovidukt und Uterus handelt, oder ob auch maternale Botenstoffe, den Embryo zu dieser Veränderung der EEM veranlassen, ist in weitergehenden Studien zu untersuchen.

6 Zusammenfassung