Einfluss der Maturation auf die Morphologie der Zona pellucida

Bei der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchung der Eizellen konnten bei dieser Arbeit vor allem zwei verschiedene Oberflächenstrukturen unterschieden werden. Die eine Struktur war eine poröse Oberfläche (über 100 Poren pro 132,5 µm²) mit Granula-Typ 3 (kugelige Granula). Diese Struktur fand sich bei den unreifen Eizellen und den in vivo gereiften Eizellen zu 100% (siehe Abb. 19 und 21). Die andere Struktur war eine poren-lose Oberfläche mit Granula-Typ 2 (flache und kugelige Granula). Diese Struktur war bei dem überwiegenden Teil der in vitro gereiften Eizellen (62,5% der in vitro gereiften Eizellen Q 1-2; 75% der in vitro gereiften Eizellen Q3) vorhanden (siehe Abb. 22). Der übrige Teil der in vitro gereiften Eizellen zeigte den gleichen Oberflächentyp wie die

unreifen und die in vivo gereiften Eizellen mit einer porösen Oberfläche (über 100 Poren pro 132,5 µm²) und Granula-Typ 3.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich auf eine Beeinflussung der Oberflächenstruktur durch eine in vitro Maturation schließen.

SUZUKI et al. (1994) konnten beim Rind ebenfalls eine Beeinflussung der Oberflächen-struktur der ZP durch in vitro Maturation feststellen. Die unreifen Eizellen zeigten bei ihren Untersuchungen eine Oberfläche mit einem fibrösen Netzwerk, vielen weiten Maschen und tiefen Poren. Nach einer zehnstündigen in vitro Reifung zeigte sich noch keine Ober-flächenveränderung, aber nach 22 Stunden erschienen die Fasern des Netzwerkes feiner und die Poren weniger tief. CALAFELL et al. (1992) konnten auch bei der Maus eine Korrelation zwischen Oberflächenstruktur und erfolgter Reifung feststellen, dabei zeigten die unreifen Eizellen eine unstrukturierte Oberfläche, wohingegen die Oberfläche der in vitro gereiften Eizellen ein fibröses Netzwerk mit einer Vielzahl an Poren zeigte, die einen größeren Durchmesser hatten und tiefer waren als die Poren der unreifen Eizellen. Beim Schwein beobachteten FUNAHASHI et al. (2000), dass die Oberfläche der in vivo ge-reiften Oozyten maschenartig mit vielen Fenstern, uneben und mikrotrabekulär erschien, wohingegen die in vitro gereiften Eizellen eine eher glatte und kompakte Oberfläche auf-wiesen.

Die porenlose Oberfläche mit Granula-Typ 2, die bei den in vitro gereiften Eizellen überwiegend auftrat, könnte demnach Folge einer negativen Beeinflussung durch in vitro Maturation sein.

Andere Quellen können keine Korrelation zwischen erfolgter Reifung und Oberflächen-struktur verzeichnen oder berichten sogar von gegenteiligen Ergebnissen. FAMILIARI et al. (1992) und MOTTA et al. (1991) kamen zu dem Ergebnis, dass unreife und degenerierte humane Eizellen eine kompakte, porenlose Oberfläche und gereifte Eizellen eine netzartige, poröse Oberfläche haben. SATHANANTHAN (1994), MAGERKURTH et al. (1999), die ebenfalls humane Eizellen untersuchten, und RATH et al. (2005), die ihre Untersuchungen an porcinen Oozyten durchführten, konnten keine Korrelation zwischen

porösen, netzartigen Struktur bis zu einer beinahe glatten, kompakten Struktur reichten.

Diese vier Typen traten aber sowohl bei unreifen als auch bei gereiften Eizellen auf ohne signifikante Korrelation zwischen Reifestadium und Oberflächenstruktur. RATH et al.

(2005) unterschieden beim Schwein vier verschiedene Oberflächen-Typen der ZP, die von einer netzartigen, porösen Oberfläche bis zu einer relativ glatten Oberfläche mit nur wenigen oder gar keinen Poren reichte. Zusätzlich wurde die Oberfläche noch in gefaltet, ungefaltet, rau oder glatt unterteilt. Auch hier zeigte sich eine große Heterogenität der Oberfläche ohne deutliche Korrelation mit dem Reifungsgrad. Auffällig war jedoch, dass die meisten (44%) unreifen Eizellen eine netzartige, poröse Struktur zeigten, ähnlich den 48 Stunden in vitro gereiften Eizellen (48%). Bei den 24 Stunden in vitro gereiften Eizellen zeigten nur 18% diese Struktur, sie ähnelten zum größten Teil den in vivo gereiften Eizellen, die eine glattere Oberfläche zeigten. RATH et al. (2005) vermuteten darin Anzeichen einer Art Zona Degeneration nach 48 Stunden in vitro Reifung. Im Gegensatz zu den in vitro gereiften Eizellen, zeigten die in vivo gereiften Eizellen eine relativ einheitliche Morpholgie einer netzartigen, glatten, ungefalteten Oberfläche ohne Poren.

MACCHIARELLI et al. (1992) vermuteten, dass die netzartige, poröse Struktur durch die Penetration der Zytoplasmafortsätze der Corona radiata Zellen entsteht, die in engem Kontakt zu der Plasmamembran der Eizelle stehen (SUZUKI et al. 1994).

Reste dieser Ausläufer schienen auf den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Proben, vor allem bei den unreifen Eizellen der Qualität 1-2 (66,6%) (siehe Abb. 20) und den in vivo gereiften Eizellen (100%) (siehe Abb. 21) vorhanden zu sein. Sie wurden aufgrund ihrer fein verästelten Struktur in der vorliegenden Arbeit als netzartige Oberfläche beschrieben. Die auf Abbildung 21 sichtbare Struktur darf aber nicht mit der von RATH et al. (2005) und MAGERKURTH et al. (1999) als netzartig beschriebene Struktur der Oberfläche verwechselt werden. Die in der vorliegenden Arbeit als netzartig beschriebene Struktur könnte, wie oben beschrieben, der von FUNAHASHI et al. (2000) bei den in vivo gereiften Eizellen als mikrotrabekulär bezeichneten Struktur entsprechen, die sich bei ihren Untersuchungen nicht bei den in vitro gereiften Eizellen fand.

Bei den unreifen Eizellen der Qualität 3 waren diese Zytoplasmafortsätze bei den Unter-suchungen für diese Arbeit nur bei 33,3% der Proben vorhanden, und bei den in vitro

gereiften Eizellen fanden sie sich nicht auf der porenlosen (siehe Abb. 22) sondern nur auf der porösen Oberfläche.

Falls die oben beschriebene Theorie von MACCHIARELLI et al. (1992) über die Entstehung der Poren stimmt, könnte die porenlose Struktur bei den in vitro gereiften Eizellen demnach eventuell durch einen unzureichenden Kontakt der Corona radiata-Zellen, eine nur wenig ausgeprägte Penetration oder vorzeitige Retraktion der Zyto-plasmafortsätze entstanden sein.

Auffallend ist auch die oben schon beschriebene unterschiedliche Ausprägung der Granula bei den unreifen und den in vivo bzw. in vitro gereiften Eizellen. Bei den unreifen Eizellen und den in vivo gereiften Eizellen fand sich bei 100% der Proben der Granula-Typ 3, bei dem sich auf der gesamten Oberfläche gut ausgebildete, kugelige Granula befanden. Bei den in vivo gereiften Eizellen schienen die Granula zudem noch mehrschichtig wie Auflagerungen zu sein. Bei den in vitro gereiften Eizellen befanden sich auf dem überwiegenden Teil der Proben (62,5% bei der Qualität 1-2 und 75% bei der Qualität 3) wie oben beschrieben Granula vom Typ 2 (siehe Abb. 22), d.h. neben kugeligen Granula kamen auch flachere Granula auf der Oberfläche vor. Der Rest der in vitro gereiften Eizellen zeigte die gleiche Oberflächenstruktur wie die in vivo gereiften Eizellen.

Auch MAGERKURTH et al. (1999) konnten verschiedene Granula unterscheiden, wobei sie bei ihren Untersuchungen von Kügelchen sprachen. Sie fanden bei allen 4 Morpho-logie Typen der ZP Kügelchen, wobei diese bei den Typen mit poröser Oberfläche rund und regelmäßig angeordnet waren, wie Perlen auf einer Kette. Bei den Typen, die kaum oder keine Poren aufwiesen waren diese Kügelchen auch vorhanden, aber sie schienen unregelmäßig angeordnet zu sein, und wirkten teilweise flacher, wie zusammenge-schmolzen. FAMILIARI et al. (1989, 1992) beobachteten beim Menschen und der Maus ebenfalls einen perlschnurartigen Aufbau der ZP-Filamente, der bei degenerierten Eizellen verloren ging, da die Kügelchen dort wie zusammengeschmolzen aussahen. Unklar ist aber, ob diese Kügelchen einem einzelnen Glykoprotein entsprechen (ZPA, ZPB, ZPC)

120 nm. GREVE und WASSARMAN (1985) schätzten den Abstand zwischen mZP2 und mZP3 auf ungefähr 15 bis 17 nm und die Länge einer mZP2-mZP3 Heterodimerkette bis zum nächsten Schnittpunkt mit einem mZP1 (siehe Schrifttum Abschnitt 2.4.1.1.

Chemischer Aufbau der ZP) auf cirka 75 bis 85 nm. Es könnte also sein, dass es sich bei den Granula um den Schnittpunkt handelt, wo zwei ZP2-ZP3 Heterodimere über ein ZP1 verbunden werden, und dass der Abstand zwischen den Granula der ZP2-ZP3 Heterodimerkette zwischen den Schnittpunkten mit ZP1 entspricht.

Die flachere Ausbildung der Granula bei den in vitro gereiften Eizellen könnte so einer veränderten Morphologie der ZP auf molekularer Ebene entsprechen. Dies könnte ent-weder Anzeichen einer Degeneration der ZP durch in vitro Kultur sein, wofür auch die oben genannte Beobachtung von FAMILIARI et al. (1989, 1992) spricht, dass die flacheren Granula bei degenerierten Eizellen gefunden wurden. Außerdem spricht das Ergebnis dieser Arbeit, dass bei 37,5% der in vitro gereiften Eizellen der Qualität 1-2 eine degradiert erscheinende Oberfläche auftrat für Degenerationserscheinungen durch die in vitro Kultur. Eine degradiert erscheinende Oberfläche trat außerdem noch bei 50% der unreifen Eizellen der Qualität 3 auf.

Der Granula-Typ 2 bei den in vitro gereiften Eizellen könnte aber auch Anzeichen einer retardierten Entwicklung bzw. einer mangelhaften Reifung der ZP sein. In diesem Zu-sammenhang muß noch die Tatsache angeführt werden, dass das Kulturmedium die Synthese von ZPC in den Follikelzellen während der in vitro Reifung von bovinen Kumulus-Oozyten-Komplexen entscheidend beeinflusst. SCHELLANDER et al. (1990) beobachteten den positiven Einfluss von FSH, LH und OCS (Oestrus cow serum) auf die Befruchtungsfrequenz und die Entwicklung von Blastozysten. KÖLLE et al. (1998) stellten den Zusammenhang zu einer erhöhten ZPC-Syntheserate in Anwesenheit dieser Faktoren fest. Es wäre also denkbar, dass der in vitro Kultur Faktoren zu einer vollständigen Reifung der ZP fehlen.

Die Beobachtung, dass die Granula bei den in vivo gereiften Eizellen mehrschichtig vorzuliegen schienen, lässt die Vermutung zu, dass es sich dabei um Auflagerungen durch Ovidukt Sekret handelt, oder dass Faktoren aus dem Ovidukt eine Proliferation und damit eventuell eine Reifung der ZP beeinflussen. Dafür spricht auch der von FUNAHASHI et al.

(2000) gemessene Durchmesser der ZP beim Schwein, der bei in vivo gereiften Eizellen

größer war als bei in vitro gereiften Eizellen, was bedeutet, dass es sich dabei um maternales Material bzw. maternale Faktoren handelt, die in der in vitro Kultur nicht zugesetzt werden können.

Im Hinblick auf die entscheidenden Funktionen der ZP bei der Spermien-Eizell-Inter-aktion, während der Fertilisation und zur Verhinderung einer Polyspermie, kann eine veränderte Morphologie der ZP auf molekularer Ebene erhebliche Auswirkungen auf eine erfolgreiche Befruchtung haben. In diesem Zusammenhang seien noch die Untersuchun-gen von RANKIN et al. (1996, 1999) angesprochen. Sie kamen zu dem Ergebnis, dass ZP3 out Mäuse keine ZP bildeten und dadurch unfruchtbar waren. Bei ZP1 knock-out Mäusen war die ZP zwar vorhanden, aber dünner und insgesamt sehr locker. Der normalerweise in der ZP vorhandene innere, kompakte Bereich fehlte. Achtzig Prozent der untersuchten Tiere waren zwar fruchtbar, aber die Embryonen zeigten vorzeitiges Hatching und die Würfe waren nur halb so groß.