Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss boviner Trophoblastprodukte auf die Synthese und den Umbau der
Extrazellulären Matrix (EZM) durch plazentare Fibroblasten in vitro
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung eines Grades des Doktors der Veterinärmedizin
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Jörgen Köhlbrandt
Bad Segeberg
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Anatomisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachterin: Prof. Dr. Dagmar Waberski
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2015
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
2. Literaturübersicht ... 3
2.1. Die bovine Plazenta ... 3
2.2. Der bovine Trophoblast ... 3
2.3. Extrazelluläre Matrix und Gewebeumbau in der Plazenta ... 4
2.3.1. Extrazelluläre Matrix ... 4
2.3.2. Gewebeumbau in der bovinen Plazenta ... 7
2.3.3. Matrixmetalloproteinasen ... 9
2.4. Stimulanzien ... 14
2.4.1. Fibroblasten Wachstumsfaktoren ... 14
2.4.2. Insulinähnliche Wachstumsfaktoren ... 18
2.4.3. Epidermaler Wachstumsfaktor ... 20
2.4.4. Bovines plazentares Laktogen ... 21
2.4.5. Kotyledonen-konditioniertes Medium ... 22
3. Material und Methoden ... 24
3.1. Isolation boviner plazentarer Fibroblasten ... 24
3.2. Kultivierung boviner plazentarer Fibroblasten ... 25
3.3. Stimulation boviner plazentarer Fibroblasten ... 26
3.4. Methodik der mRNA Analysen ... 29
3.4.1. Qualitative RT-PCR ... 29
3.4.1.1. Isolation von RNA aus bovinen plazentaren Fibroblasten 29 3.4.1.2. Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) ... 30
3.4.1.3. Konventionelle PCR ... 31
3.4.1.4. Elektrophoretische Auftrennung der PCR Produkte ... 33
3.4.2. Quantitative Real-time PCR ... 34
3.4.3. Datenanalyse ... 38
3.5. Methodik der Protein Analysen ... 39
3.5.1. Proteinextraktion ... 39
3.5.2. SDS-Gelelektrophorese ... 40
3.5.3. Western Blot ... 41
3.5.4. Immunodetektion ... 41
3.5.5. Redetektion und densitometrische Auswertung ... 44
3.5.6. Zymographie ... 45
3.6. Methodik zur Untersuchung der Zellmotilität ... 47
3.7. Methodik zur Untersuchung der Zellproliferation ... 47
3.8. Statistische Auswertung ... 49
4. Ergebnisse ... 50
4.1. Ergebnisse der mRNA Analysen ... 50
4.1.1. Qualitative RT-PCR ... 50
4.1.2. Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) ... 61
4.2. Ergebnisse der Protein Analysen ... 70
4.2.1. Western Blot ... 70
4.2.2. Ergebnisse der Zymographie ... 74
4.3. Ergebnisse zur Untersuchung der Zellmotilität ... 75
4.4. Ergebnisse zur Untersuchung der Proliferation ... 76
5. Diskussion ... 77
5.1. Faktoren mit stimulierenden Effekten ... 77
5.2. Faktoren mit hemmenden Effekten ... 83
5.3. Biologische Wirkungen ... 86
5.3.1. Motilität ... 86
5.3.2. Proliferation ... 90
5. 4. Schlussfolgerungen ... 93
6. Zusammenfassung ... 94
7. Summary ... 96
8. Literaturverzeichnis ... 98
9. Anhang ... 113
9.1. Abkürzungen ... 113
9.2. Verwendete Puffer und Lösungen ... 116
9.3. Reagenzien ... 120
9.4. Verbrauchsmaterialien ... 122
9.5. Geräte ... 123
9.6. Daten Quantitative Real-Time PCR ... 124
10. Danksagung... 128
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1. Einleitung
Eine Plazenta dient dem Stoffaustausch zwischen dem Fetus und der Mutter. Die bovine Plazenta besteht aus fetalen Kotyledonen, welche in den Krypten der maternalen Karunkeln verankert sind. Kotyledone und Karunkel bilden jeweils ein Plazentom (Strahl 1906, Grosser 1927). Die Trächtigkeit des Rindes erfordert durch die kontinuierliche Größenzunahme der Frucht sowie die Regression des Gewebes nach der Geburt einen konstanten Auf-, Ab- und Umbau der endometrialen extrazellulären Matrix (EZM). Dieser Gewebeumbau wurde für die Implantation (MacIntyre et al. 2002, Yamada et al. 2002, Boos et al. 2003), Plazentation und Gestation (Boos et al. 2003, Pfarrer 2006) sowie die präpartale Phase (McNaughton u. Murray 2009) nachgewiesen. Daher scheint die Remodellierung der EZM auch Bedingung/Voraussetzung für eine erfolgreiche Reproduktion zu sein.
Bisher ist noch nicht hinreichend bekannt, welche Mechanismen der Regulation diesem Gewebeumbau zu Grunde liegen. Als regulatorisch wirkende Zellen kommen hier insbesondere die plazentaren Trophoblastzellen in Frage. Der bovine Trophoblast besteht aus einer uninukleären Zellpopulation (UTC) und den invasiven Trophoblastriesenzellen (TGC). TGC fusionieren mit einzelnen Epithelzellen zu Hybridzellen, welche TGC-Produkte in das mütterliche Stroma exozytieren (Wooding 1992, Klisch et al. 1999). Unter anderem konnten in den TGC schon Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF), der Insulin-like Growth Factor (IGF) und das bovine plazentare Laktogen (bPL) nachgewiesen werden (Wooding und Beckers 1987, Pfarrer et al. 2006, Lütkehus 2012). Da diese Produkte von Hybridzellen in das endometriale Stroma sezerniert werden, könnten sie dort auch parakrine Wirkungen auf die endometrialen Fibroblasten ausüben, die die Fähigkeit zur EZM-Synthese und zur EZM-Remodellierung besitzen. Die Fibroblasten synthetisieren u.a.
Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und Fibronektin (Chen u. Aplin 2003, Dziedziczko u.
Palgan 2003). Gleichzeitig produzieren sie Matrix-Metalloproteinasen (MMP) und deren Inhibitoren (TIMP) für den Abbau dieser EZM Komponenten (Herbst et al.
1995, Bjorn et al. 1997, Anacker et al. 2011). Fehlregulationen in der EZM-Synthese und dem EZM-Umbau können zu zahlreichen Erkrankungen in unterschiedlichen Geweben führen (Hutchinson et al. 2010, Luo et al. 2015). In der Rinderplazenta sind Dysregulationen dieser Balance möglicherweise an der Entstehung der
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Nachgeburtsverhaltung beteiligt (Eiler u. Hopkins 1993, Dilly et al. 2011). Ziel der Arbeit war es daher, parakrine Wirkungen der TGC-Produkte auf die Fibroblasten erstmalig aufzudecken, da bisher nur wenige Mechanismen der Zell-Zell Interaktionen zwischen dem bovinen Trophoblasten und den umgebenden, endometrialen Zellen bekannt sind.
Hierfür wurden aus Rinderplazentomen isolierte Fibroblastenzelllinien mit trophoblastären Faktoren stimuliert und der Einfluss der Stimulanzien auf die Expression von EZM (Kollagen I und -IV, Laminin und Fibronektin), MMP (-1, -2, -8, - 9 und -14) und TIMP1 und -2 auf mRNA- und Proteinebene untersucht. Als Stimulanzien dienten der Epidermal Growth Faktor (EGF), die Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF) -1, -2, -4 und -7, Insulin–like Growth Factor (IGF) -1 und -2, sowie EGF und IGF in Kombination, bovines plazentares Laktogen (bPL) und kotyledonen-konditioniertes Medium (KKM). Zusätzlich wurde der Einfluss der Stimulanzien auf das Motilitätsverhalten und die Proliferation von Fibroblasten untersucht, um die Zell-Zellinteraktionen zwischen den Trophoblastzellen und den Fibroblasten genauer zu charakterisieren.
Die gewonnenen Erkenntnisse sollen die Grundlage für ein tieferes Verständnis der biologischen Wirkungen der TGC-Produkte liefern und somit helfen, pathologische Veränderungen in der Rinderplazenta besser zu verstehen und zu behandeln.
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2. Literaturübersicht
2.1. Die bovine Plazenta
Die bovine Plazenta besitzt charakteristische Plazentome, die aus einer maternalen Karunkel und einer mit dieser interdigitierenden fetalen Kotyledone bestehen (Strahl 1906, Grosser 1909, Grosser 1927). Daher wird die bovine Plazenta auch als
„Placenta multiplex sive cotyledonata“ klassifiziert (Grosser 1909, Schlafer et al.
2000). Des Weiteren wird die bovine Plazenta als „synepitheliochorial“ bezeichnet (Wooding 1992, Leiser u. Kaufmann 1994, Carter u. Enders 2004). Hiernach befinden sich zwischen fetalem und maternalem Blutfluss folgende Gewebeschichten: fetales Endothel, fetales Stroma, Trophoblast, uterines Epithel, uterines Stroma und uterines Endothel. Der dennoch invasive Charakter der bovinen Plazenta ist durch die Fusion von Trophoblastriesenzellen (trophoblast giant cells, TGC) mit Karunkelepithelzellen zu fetomaternalen Hybridzellen gekennzeichnet, die nach Apoptose von einkernigen Trophoblastzellen durch Phagozytose eliminiert werden (Wooding 1992, Klisch et al. 1999). Diese geringe Invasivität bedingt nach der Geburt so gut wie keine Gewebeverluste auf der mütterlichen Seite. Daher zählt die bovine Plazenta zu den Adeciduata (Strahl 1906, Grosser 1909, Grosser 1927).
Eine wesentliche Funktion der Plazenta ist der Gas- und Stoffaustausch zwischen fetalem und mütterlichem Kompartiment (Grosser 1909, Grosser 1927). Auch die Produktion von Hormonen, wie z.B. von bovinem plazentaren Laktogen (Wooding u.
Beckers 1987, Wooding 1992), und Wachstumsfaktoren, wie dem FGF (Pfarrer et al.
2006) oder EGF (Dilly et al. 2010), ist eine entscheidende Funktion der bovinen Plazenta und wird unter anderem von den TGC übernommen.
2.2. Der bovine Trophoblast
Der bovine Trophoblast besteht aus zwei unterschiedlichen Zelltypen (Wimsatt 1951, Bjorkman u. Bloom 1957, Greenstein et al. 1958), zum einen aus mononukleären Trophoblastzellen (UTC), zum anderen aus Trophoblastriesenzellen (TGC). Die UTC besitzen typische Eigenschaften von Epithelzellen. Sie sitzen auf einer Basalmembran, sind polarisierte Zellen und bilden über apikale Mikrovilli mit Mikrovilli
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des uterinen Epithels die feto-maternale Kontaktzone (Bjorkman 1969, Klisch et al.
1999). Die TGC sind überwiegend zweikernige Zellen, weswegen sie früher auch als binucleate cells (BNC) bezeichnet wurden. Sie können aber auch mit einem oder drei Kernen vorkommen (Klisch et al. 1999). Des Weiteren haben sie keinen Kontakt zur Basalmembran und besitzen keine epitheloiden Eigenschaften (Wooding 1992, Klisch et al. 1999). Durch azytokinetische Mitose entstehen sie aus einkernigen Trophoblastzellen (Wimsatt 1951, Bjorkman 1968). Aufgrund ihrer fehlenden Polarität können sie in Richtung des uterinen Epithels migrieren und sind dort in der Lage mit uterinen Epithelzellen zu feto-maternalen Hybridzellen zu fusionieren, welche meistens dreikernig sind (Klisch et al. 1999). Da die Migration nur bis zur Basalmembran reicht, wird hier von einer eingeschränkten Trophoblastinvasion gesprochen (Pfarrer et al. 2003). Die TGC bilden einen Anteil von 15-20% aller Trophoblastzellen und besitzen charakteristische Granula, welche in das mütterliche Kompartiment der Plazenta exozytiert werden können (Wooding 1992, Klisch et al.
1999). Hierbei handelt es sich um Wachstumsfaktoren wie EGF und FGF (Pfarrer et al. 2006, Dilly et al. 2010), sowie plazentares Laktogen (Wooding u. Beckers 1987, Wooding 1992). Aber auch von anderen Hormonen, wie z.B. dem Progesteron (Reimers et al. 1985, Ullmann u. Reimers 1989) und sogenannten trächtigkeitsassoziierten Glykoproteinen (Green et al. 2000) weiß man, dass sie vom bovinen Trophoblasten sezerniert werden können.
2.3. Extrazelluläre Matrix und Gewebeumbau in der Plazenta
2.3.1. Extrazelluläre Matrix
Die Extrazelluläre Matrix (EZM) bildet ein Grundgerüst, welches sich zwischen den Zellen des Körpers befindet und diese zusammenhält. Sie besteht aus zwei funktionellen Einheiten, der Grundsubstanz und den Fasern. Die Grundsubstanz beinhaltet Polysaccharide vom Glykosaminoglykan-Typ (GAG). Bei den Faserproteinen unterscheidet man die Anheftungsproteine Laminin und Fibronektin, sowie die funktionellen Strukturproteine in Form von Kollagenen und Elastin. Der größte Anteil der EZM befindet sich im Bindegewebe, aber auch in allen anderen Gewebearten kommt EZM vor. Sie ist Bestandteil von Knochen, Sehnen, Zähnen
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oder auch der Kornea und bildet als Basalmembran die Unterlage für alle Epithelien (Hay 1991, Bosman u. Stamenkovic 2003, Haupt 2007). Die Aufgaben der EZM sind vielfältig. Sie reichen von Gerüst- und Formgebung, Fixierungsmöglichkeiten bis hin zur Signaltransduktion (Schuppan et al. 1994). Die EZM befindet sich in ständigen Wechselwirkungen mit den umliegenden Zellen und nimmt somit an Zellmigration, Proliferation und Zelldifferenzierung teil (Schuppan et al. 1994, Badylak et al. 2009).
Damit ist die EZM nicht statisch, sondern unterliegt einem kontinuierlichen Umbau.
Dieser Gewebeumbau wird durch Proteasen, wie die Matrix-Metalloproteinasen (MMP), bewirkt (Bosman u. Stamenkovic 2003).
Kollagenfasern besitzen eine hohe Zugfestigkeit und eine geringe Dehnbarkeit, daher kommen sie in Geweben mit derartigen Ansprüchen wie Sehnen, Bändern, Organkapseln, Faszien oder Knorpel vor. Sie machen 1/3 des menschlichen Proteins aus. Die Fasern bestehen aus einzelnen Fibrillen, welche wiederum aus Mikrofibrillen aufgebaut sind. Als Kollagenmolekül bezeichnet man das Tropokollagen, welches eine Tripelhelix aus drei Polypeptidketten darstellt. Tropokollagen wird von Fibroblasten aus Prokollagen synthetisiert. Man unterscheidet 20 verschiedene Kollagentypen, wovon die Typen I, II, III und IV am wichtigsten sind (Tackmann 2003). Kollagen I, III und IV kommen im bovinen, tragenden Uterus in vielen Strukturen in unterschiedlichen Konzentrationen vor und bilden die stützenden Elemente im tragenden Uterus. Die zunehmende Belastung des Allantochorions im Laufe der Trächtigkeit wird durch einen vermehrten Gehalt an Kollagen I kompensiert. Kollagen IV wird überwiegend in der Basalmembran am Übergang von Epithel zu Stroma und um die glatten Muskelzellen in der Plazenta detektiert (Boos 2000, Boos et al. 2003, Pfarrer et al. 2003, Pfarrer 2006).
Laminine sind Heterotrimere bestehend aus einer β- und ProteinketteEs gibt 5 verschiedene Ketten, 3 verschiedene-Ketten und 3 verschiedene Ketten. In Säugetieren wurden bisher 12 unterschiedliche Laminine identifiziert. Sie sind eine ubiquitäre Komponente der Basalmembranen im gesamten Körper und interagieren mit Zellen über Oberflächenrezeptoren wie Integrine. Über diese Interaktionen haben sie Einfluss auf die Zelldifferenzierung, Zelladhäsion und Zellmigration, sowie den Erhalt und das Wachstum von Geweben. Beispielsweise fördert Laminin-2 das Wachstum von Neuriten und Laminin-5 die Zelladhäsion von Epithelzellen (Colognato u. Yurchenco 2000, Bosman u. Stamenkovic 2003). Dementsprechend sind Laminine auch an der Entstehung vieler Erkrankungen beteiligt. So können
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Dysregulationen von Interaktionen zwischen Laminin und Zellen zur Tumorentstehung beitragen, in dem die Komposition der Lamininketten verändert wird. Dadurch wird die Integrität der Basalmembran geschwächt und die Tumorinvasion wird begünstigt (Patarroyo et al. 2002). Auch in der bovinen Plazenta wurde Laminin bereits beschrieben (MacIntyre et al. 2002, Pfarrer 2006, Zeiler et al.
2007). So wird von Pfarrer et al. (2003) angenommen, dass die gemeinsame Expression von Laminin und den Integrinen und in TGC für die Migration der TGC entlang ihrer eigenen Lamininmatrix spricht.
Fibronektin gehört zu einer Familie von Glykoproteinen, welche durch alternatives Spleißen entstehen. Es gibt zwei Hauptvertreter des Fibronektins: Zum einen das lösliche Plasma-Fibronektin, welches in der Leber produziert und ins Blut abgegeben wird, zum anderen das unlösliche Fibronektin, welches von Fibroblasten, Endothelzellen und anderen Zellen produziert wird und in die EZM eingebaut wird.
Das Plasma-Fibronektin erfüllt seine Aufgaben in Wundheilung und Blutgerinnung.
Fibronektin besitzt mehrere funktionelle Bindungsstellen für Kollagen, Heparin und Fibrin. In der EZM besitzt es außerordentliche adhäsive Eigenschaften. Es verbindet Kollagenmoleküle oder kommt auch als einzelne Faser vor. Über Integrine ist es in der Lage andere Zellen zu binden (Schild 2001, Labat-Robert 2012). Es wirkt chemotaktisch auf Entzündungszellen und unterstützt deren opsonine Eigenschaften.
Ferner dient es als Grundlage für die Migration und fördert die Wundheilung (Stoffels et al. 2013). In der bovinen Plazenta wurde Fibronektin nachgewiesen und beschrieben (MacLaren u. Wildeman 1995, Yamada et al. 2002, Pfarrer 2006, Zeiler et al. 2007). Yamada et al. (2002) zeigten, dass das Fibronektin im endometrialen Stroma und während der Gestation auch im Trophoblasten und dem uterinen Epithel vorkommt. Von Pfarrer (2006) wurde Fibronektin in der Basalmembran des Epithels und der Endothelien sowie auch in fetalem und maternalem Stroma der bovinen Plazenta detektiert.
7 2.3.2. Gewebeumbau in der bovinen Plazenta
Endometrialer Gewebeumbau ist ein entscheidender Faktor für eine erfolgreiche Implantation und Plazentation. Dennoch sind die zu Grunde liegenden Mechanismen der Remodelierung der Plazenta und der dafür verantwortlichen fetomaternalen Kommunikation noch nicht ausreichend verstanden (Yamada et al. 2002, Hashizume 2007).
Endometriales Remodeling beim Rind startet gleichzeitig mit der Elongation der Frucht um den 14. Tag der Trächtigkeit; um Tag 30 bilden sich zuerst embryonah Kotyledonen über den karunkulären Bereichen aus (King et al. 1980, Yamada et al.
2002, Maddox-Hyttel et al. 2003). Yamada et al. (2002) zeigten in karunkulären und interkarunkulären Bereichen im subepithelialen Stroma, dass sich die Expression von Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und Fibronektin während des Östrus nicht verändert, jedoch zu Beginn der Trächtigkeit bis zur Implantation (Tag 14 – 24) deutlich abnimmt und nach der Implantation (Tag 25 – 30) wieder deutlich zunimmt. Daraus wurde gefolgert, dass der Gewebeumbau entscheidend für die Etablierung der Trächtigkeit sein könnte. Dieser Gewebeumbau zum Zeitpunkt der Implantation konnte auch bei der Ziege aufgezeigt werden. Während des normalen Zyklus und bis zur Implantation veränderte sich die Intensität und Verteilung von Kollagen I, Kollagen IV und Laminin im uterinen Stroma und Epithel nicht. Hingegen kam es an Tag 18 der Trächtigkeit im Bereich der Adhäsion des Trophoblasten zu einer deutlichen Reduktion sowohl von stromalem Kollagen I als auch von Kollagen IV und Laminin in der Basalmembran des uterinen Epithels. Dieser EZM-Umbau bestätigt, dass es zum Zeitpunkt der ersten Kontaktaufnahme des Trophoblasten mit dem uterinen Epithel zu deutlichen Veränderungen in der Expression der EZM Moleküle bei Wiederkäuern kommt (Guillomot 1999). Eine Zunahme der EZM Moleküle des Endometriums zu Beginn der Trächtigkeit wurde bei Schafen dargelegt (Reynolds u.
Redmer 1992). Ebenfalls wurde festgestellt, dass die Expression von Laminin und Kollagen IV in der subepithelialen Basallamina mit fortschreitender Trächtigkeit (ab Tag 20) zunimmt (MacIntyre et al. 2002). Zu diesem Zeitpunkt beginnt auch die Adhäsion des Trophoblasten an das uterine Epithel. Außerdem migrieren die ersten binukleären Trophoblastzellen und fusionieren ab Tag 24 der Trächtigkeit mit uterinen Epithelzellen zu Hybridzellen (Wathes u. Wooding 1980). Daher wird von MacIntyre (2002) vermutet, dass diese Hybridzellen die Fähigkeit haben, die
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Veränderungen in den Matrixmolekülen zu induzieren. Da es sich um genau die Zellen mit endokriner Aktivität handelt (Wooding 1992), ist eine regulative Funktion für das Remodeling sehr wahrscheinlich.
Der endometriale Gewebeumbau setzt sich im Verlaufe der Trächtigkeit fort. Dabei wachsen die Plazentome während der gesamten Gestation (King et al. 1980, Reynolds et al. 1990, Schuler et al. 2000). Hierbei kommt es zu einer vermehrten Proliferation der plazentaren Zellen (Schuler et al. 2000, Boos et al. 2003), aber auch zu einem kontinuierlichen Umbau der EZM, die von den Zellen der Plazentome gebildet wird (Boos et al. 2003, Zeiler et al. 2007).
9 2.3.3. Matrixmetalloproteinasen
Die Degradation der EZM wird durch Matrixmetalloproteinasen (MMP) reguliert. Sie besitzen als Enzyme die Fähigkeit, die Spaltung von Faserproteinen zu katalysieren und somit den Gewebeumbau zu steuern (Curry u. Osteen 2003). Die Familie der MMP wird nach ihrer Substratspezifität und nach ihren funktionellen Domänen in verschiedene Gruppen eingeteilt. Es gibt Gelatinasen, Kollagenasen, Stromelysine, Matrilysine, membrangebundene Metalloproteinasen und andere nicht klassifizierte Proteinasen (Nagase u. Woessner 1999, Salamonsen 1999, Woessner u. Nagase 2000, Nagase et al. 2006). Typischerweise bestehen sie aus einem vorangeschalteten Signalpeptid, einer Propeptid-Domäne und einer katalytischen Domäne, die über ein Gelenk (sogenannte „hinge-Region“ oder auch Linker) mit einer Hemopexin-ähnlichen Domäne verbunden ist. In der katalytischen Domäne sind zwei Zinkionen vorhanden, wovon eines mit zwei bis drei Calciumionen für die Stabilität sorgt, während das andere im aktiven Zentrum mit einer Aminosäuresequenz (Zinkbindungsmotiv) für die katalytische Aktivität zuständig ist.
Die C-terminale Hemopexin-ähnliche Domäne ist für die kollagenauflösende Aktivität von Kollagenasen essentiell. Bei den Gelatinasen kommt in der katalytischen Domäne noch eine Fibronektindomäne hinzu, in der Kollagensubstrate, insbesondere Gelatine, gebunden werden kann. Die membrangebundenen MMP sind über eine Transmembrandomäne oder über einen Glykosylphosphatidylinositol- Anker in der Zellmembran befestigt. Es sind bisher mindestens 24 derartige Proteinasen bekannt, wovon MMP1 und MMP8 Kollagenasen sind, MMP2 und MMP9 Gelatinasen und MMP14 eine membrangebundene Proteinase ist (Nagase u.
Woessner 1999, Borkakoti 2000, Hartung u. Kieseier 2000, Nagase et al. 2006).
Die Regulation der MMP erfolgt auf unterschiedlichen Ebenen (Hadler-Olsen et al.
2011). Sie können erstens als Proenzyme aktiviert werden, zweitens kann die Expression reguliert werden oder drittens das aktivierte Enzym gehemmt werden.
Bei der Aktivierung des Proenzyms werden MMP in den extrazellulären Raum sezerniert. Darauf erfolgt die Abspaltung der Propeptid-Domäne und ein sogenannter cystein-switch (Abtrennung des Cysteins vom Zinkmolekül) wird benötigt. Über Konformationsänderungen des Enzyms kommt es zur Abspaltung des Propeptids und somit zur Aktivierung des Enzyms (Nagase u. Woessner 1999, Nagase et al.
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2006, Hadler-Olsen et al. 2011). Für diese proteolytische Aktivierung kommen zum einen andere MMP in Frage, zum anderen sind auch Endopeptidasen, wie z.B. das Trypsin in der Lage die Aktivierung zu induzieren (Moilanen et al. 2003). So kann z.B.
ein Komplex aus MMP14 und TIMP2 für die Aktivierung von MMP2 verantwortlich sein (Zucker et al. 1998, Dilly et al. 2011).
Der für diese Arbeit wichtigste Weg der Aktivierung ist die Regulation der Expression von MMP. Von Wachstumsfaktoren und Zytokinen ist bekannt, dass sie stimulierende oder hemmende Wirkungen auf die Expression ausüben können (Dasu et al. 2003, Hirata et al. 2003). Dilly et al. (2010) stellten fest, dass EGF die Expression von MMP9 und TIMP1 in bovinen Trophoblastzellen stimuliert. Auch FGF ist ein Wachstumsfaktor, welcher potenziell die Expression von MMP regulieren kann.
FGF2 reguliert in unterschiedlichen Zelllinien MMP1, -3, -9 und TIMP2 (Hakki et al.
2009, Eto et al. 2012). FGF7 ist beispielsweise in der Lage, die Expression von MMP9 im Adenokarzinom der Pankreasausführungsgänge zu induzieren (Cho et al.
2012).
Die Enzymhemmung erfolgt durch eine Familie von spezifischen Tissue Inhibitors of Matrix-Metalloproteinases (TIMP). Es sind bisher vier Inhibitoren beschrieben:
TIMP1, TIMP2, TIMP3 und TIMP4. Diese halten den Gewebeumbau im Zusammenspiel mit MMP in einer Balance und modulieren so den physiologischen Zustand im Verlauf des Zyklus und der Trächtigkeit. Abweichungen innerhalb dieses Gleichgewichts können zu pathologischen Zuständen führen (Gomez et al. 1997).
TIMP hemmen MMP, indem die N-terminale Domäne der TIMP mit der katalytischen Domäne der Proteinase interagiert. Die Bindung erfolgt dabei in einem Verhältnis von 1:1 (Curry u. Osteen 2003).
Zusätzlich haben TIMP auch Wirkungen auf Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Zellmigration, die sie möglicherweise über Rezeptoren auf der Zelloberfläche vermitteln können. Des Weiteren können sie die Apoptose sowohl hemmen als auch fördern (Hayakawa et al. 1994, Stetler-Stevenson 2008, Brew u. Nagase 2010).
Ferner zeigen TIMP anti-angiogenetische Effekte (Handsley u. Edwards 2005). Aus diesem Grund wurde versucht, die Angiogenese bei arteriosklerotischen Erkrankungen mit TIMP Inhibitoren zu stimulieren. So konnte die Expression des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in Herzmuskelgewebe der Maus durch die Behandlung mit dem TIMP Inhibitor Rosuvastatin erhöht werden, gleichzeitig
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wurde die Expression von TIMP1 und TIMP2 verringert (Siddiqui et al. 2014).
Interessanterweise wird TIMP2, welches alle MMP inhibieren kann, von binukleären Riesenzellen während der gesamten Trächtigkeit des Rindes exprimiert. Da die TGC zum Ende der Gestation hin weniger werden, ist davon auszugehen, dass zu dieser Zeit auch die TIMP2 Expression abnimmt (Walter u. Boos 2001).
Matrix-Metalloproteinasen haben äußerst vielfältige Funktionen und beeinflussen viele biologische Prozesse, wie z.B. die Embryonalentwicklung, die Organo- und Morphogenese, die Angiogenese und die Wundheilung. Außerdem sind sie wichtig für Zellmigration, Invasion, Differenzierung, Proliferation und Apoptose (Vu u. Werb 2000, Curry u. Osteen 2003, Visse u. Nagase 2003). Die klassische Funktion der MMP ist die Spaltung von EZM. So hat jede MMP spezifische Substrate, die sie degradieren kann. MMP1 wird auch als interstitielle Kollagenase bezeichnet. Es kann Kollagen I, II, III, VII und X spalten. Die für neutrophile Granulozyten spezifische Kollagenase MMP8 spaltet Kollagen I und III. Grundsätzlich sind Kollagenasen für die Spaltung von Kollagen im Interstitium zuständig (Hirose et al. 1993, Bischof et al.
2000, Nagase et al. 2006). Die Gelatinasen MMP2 (Gelatinase A) und MMP9 (Gelatinase B) spalten das Kollagen der Basalmembran (Kollagen IV). Außerdem spalten sie Kollagen V und Gelatine (denaturiertes Kollagen). MMP2 kann zusätzlich Kollagen VII, X, Fibronektin, Laminin und Elastin spalten (Bischof et al. 2000).
MMP14, als membrangebundene Proteinase auch MT1-MMP genannt, ist zum einen Aktivator von MMP2, kann zum anderen aber auch Kollagen I, Fibronektin, Laminin und andere EZM Bestandteile degradieren. Außerdem unterstützt es die Zellmigration (Strongin et al. 1995, Szabova et al. 2010, Itoh et al. 2011).
Die Relevanz von MMP während der Trächtigkeit wurde in mehreren Studien auf Proteinebene belegt. MMP2 wurde von mehreren Autoren sowohl im fetalen als auch im maternalen Kompartiment der Plazenta während der gesamten Trächtigkeit beschrieben (Maj u. Kankofer 1997, Walter u. Boos 2001, Kizaki et al. 2008, Mishra et al. 2012). Kizaki et al. (2008) nehmen an, dass MMP2 ein wichtiger Faktor für den Gewebeumbau zum Zeitpunkt der Implantation und der präpartalen Phase ist. Im Gegensatz dazu konnte MMP9 stärker im maternalen Stroma und im Epithel detektiert werden. Das Expressionsniveau war auch geringer als das von MMP2 (Walter u. Boos 2001, Kizaki et al. 2008). Hashizume (2007) stellte fest, dass die
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Expression von MMP9 während der Implantation geringer ist, als die von MMP2. Der Autor betonte jedoch auch noch einmal die Relevanz dieser Gelatinasen für die Matrixdegradation.
Die membrangebundene MMP14 wurde vor allem im fetalen Kompartiment der bovinen Plazenta auf mRNA- und Proteinebene detektiert (Dilly et al. 2011, Mishra et al. 2012, Streyl et al. 2012). Durch die gemeinsame Lokalisation von MMP2, MMP14 und TIMP2 in Trophoblastzellen (MMP2 und MMP14 in UTC und TGC, TIMP2 in TGC), wird angenommen, dass dem fetalen Kompartiment bei der Ablösung der Plazenta eine regulatorische Funktion zukommt (Dilly et al. 2011). Mishra et al.
(2012) betont entsprechend, dass MMP14 in der Plazenta eine regulatorische Funktion für die Aktivität von MMP2, welches einen Komplex mit MMP14 und TIMP2 bildet, besitzt.
Die ausschließliche Expression von TIMP2 in den TGC, welche aufgrund ihrer Eigenschaften (Sekretion, Migration, Invasion) als regulatorische Zellen angesehen werden, indiziert, dass dieser Inhibitor ebenfalls regulatorisch wirksam ist (Walter u.
Boos 2001). TIMP1 wurde im fetalen Kompartiment und im maternalen Epithel 12 Tage vor der Abkalbung beschrieben. MMP1 ist bisher nur auf mRNA-Ebene in der bovinen Plazenta untersucht worden (Streyl et al. 2012).
Auch in den Uteri und Plazenten anderer Säuger wurden MMP lokalisiert und die Beteiligung an physiologischen und pathologischen Prozessen des Reproduktionstraktes erörtert. Uekita et al. (2014) zeigten im ersten, zweiten und dritten Trimester der Trächtigkeit der Ziege die Expression von MMP2, MMP14 und TIMP2 in binukleären Trophoblastzellen, welche für eine Beteiligung dieser am plazentaren Gewebeumbau spricht. In der kaninen Plazenta wurde die Expression von MMP2 und MMP9 beschrieben (Beceriklisoy et al. 2007).
Bei der equinen Endometrose wird vermutet, dass auch dieser Erkrankung eine Veränderung der Aktivität der MMP und damit ein Ungleichgewicht zwischen Gewebeauf- und -abbau zu Grunde liegt (Walter et al. 2005). Ähnliches gilt auch bei der Endometriose der Frau (Pitsos u. Kanakas 2009). In der humanen, hämochorialen Plazenta konnte in Deziduagewebe, welches Zytotrophoblastzellen enthielt, im ersten bis dritten Trimester der Schwangerschaft die mRNA- und Proteinexpression nahezu aller MMP nachgewiesen werden. Aber auch in dezidualen Fibroblasten und isolierten Zytotrophoblastzellen wurde die Expression
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fast aller MMP dargelegt. Daher wurde gefolgert, dass MMP entscheidend für die Invasion des Zytotrophoblasten, dem Gewebeumbau zu Beginn der Schwangerschaft und zur Einleitung der Geburt sind (Anacker et al. 2011). In früheren Studien konnte MMP2 in humanen extravillösen Zytotrophoblastzellen detektiert werden, während MMP9 mehr im villösen Zytotrophoblastzellen exprimiert wurde (McEwan et al. 2009). Bischof et al. (2000) kamen zu dem Schluss, dass Wachstumsfaktoren, Zytokine, Hormone und EZM-Glykoproteine als Regulatoren für die Trophoblastinvasion in Frage kommen und diese in para- und autokriner Weise reguliert wird. Ein genauer Mechanismus der Regulation ist jedoch noch nicht bekannt. Dieses wäre von besonders großem Interesse, da die Trophoblastzellen sich hier wie metastatische Zellen verhalten und ihr Studium auch zur Aufklärung der invasiven Mechanismen von Tumorzellen beitragen könnte (Westermarck u. Kahari 1999).
Eine weitere Funktion von MMP ist die Modulation biologisch aktiver Substanzen. So können MMP von Substanzen einzelne Fragmente abspalten, welche dann wiederum eine neue Funktion haben können. Beispielsweise wird Angiostatin aus Abspaltung von Plasminogen durch MMP3, -7, -9 und -12 generiert oder Endostatin aus Kollagen XVIII abgespalten. Dadurch wird der Einfluss der MMP auf die Angiogenese verdeutlicht. Ein weiteres Beispiel ist die Regulation der Bioverfügbarkeit von Molekülen. So spalten MMP das IGF-Bindungsprotein (IGFBP) von IGF ab und kontrollieren so dessen Verfügbarkeit (Vu u. Werb 2000, Handsley u.
Edwards 2005). Die Vielschichtigkeit der Einflussmöglichkeiten von MMP zeigt sich außerdem darin, dass diese auch intrazellulär in unterschiedlichen Kompartimenten aktiv sind und hier beispielsweise das Zytoskelett oder die Proteinbiosynthese modulieren können (Cauwe u. Opdenakker 2010).
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2.4. Stimulanzien
Die aus den Rinderplazentomen isolierten Fibroblasten wurden mit verschiedenen trophoblastären Faktoren stimuliert. Nachfolgend wurde auf mRNA- und Proteinebene getestet, in welcher Weise die Expression von EZM, MMP und TIMP in den Fibroblasten beeinflusst wird. Es wurden folgende Faktoren in einem ersten Screening eingesetzt.
2.4.1. Fibroblasten Wachstumsfaktoren
Die Familie der Fibroblasten Wachstumsfaktoren (Fibroblast Growth Factor, FGF) besteht aus 22 Mitgliedern, die wiederum in einzelne Unterfamilien eingeteilt werden können. Allen gemeinsam ist eine zentrale Aminosäuresequenz von ca. 140 Aminosäuren, welche als „Core“ bezeichnet wird und eine sehr hohe Homologie innerhalb der FGF-Familie zeigt. Mit dieser identischen Kernregion haben sie ein Gewicht von 7 bis 38 kDa. Die FGF-Familie wirkt über FGF-Rezeptoren (FGFR).
Dieses sind Rezeptor-Tyrosinkinasen, von denen vier beschrieben sind (FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4). Die Tyrosinkinase-Domäne befindet sich intrazellulär.
Extrazellulär befinden sich drei Immunglobulin Domänen (Ig I, Ig II, Ig III). Eine große Diversität der Effekte von FGF auf ihre Zielzellen wird durch verschiedene Formen der FGFR erreicht. Diese entstehen entweder durch die Expression von Splice- Varianten eines FGFR Gens oder durch die Expression verschiedener FGFR Gene.
Durch alternatives Splicen wird die carboxyl-terminale Hälfte der Ig III Domäne zu Ig IIIb oder Ig IIIc modifiziert. Dieser Vorgang wird gewebespezifisch reguliert und entscheidet über die Ligand-Rezeptor Bindungsspezifität (Powers et al. 2000, Thisse u. Thisse 2005, Yun et al. 2010).
Die Signalwege, die nach Stimulation von FGFR benutzt werden, sind der Ras/MAP- Kinase-Weg, der PI3 Kinase/AKT und PLCy Weg, überwiegend jedoch der Ras/MAP Kinase Weg. Dabei kommt es nach Stimulation des FGFR zur Tyrosin- Phosphorylierung der Docking-Proteine FRS2, wodurch die Signalwege fortführend vermittelt werden. Eine weitere wichtige Eigenschaft ist die hohe Affinität der FGF zu Heparin, hochsulfatierten Glykosaminoglykanen oder zellulären Heparansulfaten/Heparansulfatproteoglykanen. Dadurch sind sie vor hohen
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Temperaturen, niedrigem pH und proteolytischem Abbau geschützt und dies gibt ihnen die Möglichkeit auch bei schwierigen metabolischen Bedingungen (z.B.
Wundheilung) in der extrazellulären Umwelt auf ihre Zielzellen zu wirken (Powers et al. 2000, Ornitz u. Itoh 2001, Weise 2001, Eswarakumar et al. 2005, Yun et al. 2010).
Über diese Signalwege üben die FGF vielfältige Funktionen aus. Sie beeinflussen die Zellproliferation (Dignass et al. 1994), die Zellmigration (Webb et al. 1997), die Zelldifferenzierung (Murphy et al. 1990), die Angiogenese (Presta et al. 2005) und die Wundheilung (Shi et al. 2013). Aber auch in Prozessen wie Entzündung, Reparation und Regeneration, sind sie von Relevanz. In der Embryonal- und Fetalphase beeinflussen sie die Gastrulation und die Organogenese, wobei sie hier insbesondere für die Entwicklung der Gliedmaßen von Bedeutung sind. Sie wirken auf Zellen mesodermalen oder neuroektodermalen Ursprungs, nämlich Fibroblasten, Endothelzellen, Epithelzellen, Keratinozyten, Astrozyten, neuro-epitheliale Zellen, Trophoblastenzellen und einige andere Zelltypen (Powers et al. 2000, Thisse u.
Thisse 2005, Yun et al. 2010).
FGF1 wird auch als acidic-FGF (a-FGF) bezeichnet und setzt sich beim Rind aus 140 Aminosäuren zusammen (Esch et al. 1985). Es hat besonders ausgeprägte mitogene Wirkungen auf verschiedene Zelltypen durch Verkürzung der G1-Phase des Zellzyklus (Weise 2001). Die Potenz von FGF1 zur Anregung der Angiogenese und Zellproliferation zeigt sich beispielsweise dadurch, dass in Ratten induzierte Hautwunden durch Behandlung mit FGF1 eine beschleunigte Entstehung von neuen Epithelien, Gefäßen und Granulationsgeweben aufwiesen (Mellin et al. 1992).
FGF2 (basic-FGF, b-FGF), wie auch FGF1, fehlt eine typische Signalsequenz, welche für den klassischen Weg der Sekretion aus der Zelle verantwortlich ist (Powers et al. 2000, Pellegrini 2001). Die Wirkungen von FGF2 sind ähnlich denen von FGF1. Es hat mitogene Wirkungen auf viele verschiedene Zelltypen und beeinflusst beispielsweise die Zellproliferation von neuroepithelialen Zellen, die Migration von Gliazellen und die Differenzierung von neuroepithelialen Zellen zu Neuronen und Gliazellen (Yun et al. 2010). Ebenfalls zeigt es einen starken Angiogenese stimulierenden Effekt (Norrby 1994). Durch seine Eigenschaften wird FGF2 zu einem hervorragenden Modulator von Wundheilung und Gewebeumbau, da es die Balance zwischen EZM-Synthese und Degradation reguliert (Varghese et al.
1995, Xie et al. 2008). FGF2 konnte sogar schon als geeignetes therapeutisches
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Mittel gegen hypertrophe Narben eingesetzt werden, weil es auf unterschiedlichen Wegen den Gewebeumbau anregt (Shi et al. 2013). Auf der anderen Seite wird FGF2 durch seine Eigenschaften zu einem Faktor, der die Tumorentstehung fördern kann (Miyake et al. 1997, Kottakis et al. 2011).
FGF4 wurde erstmals in menschlichen Magentumoren identifiziert und besitzt im Gegensatz zu FGF1 und -2 eine Signalsequenz (Powers et al. 2000). Es ist ebenfalls mitogen und angiogen wirksam und in Zellproliferation sowie Zelldifferenzierung involviert. Insbesondere in der Embryonalphase induziert es die Entstehung der Gliedmaßen und der Myotome. Es erhält die Pluripotenz von Stammzellen und fördert die Erneuerung von Trophoblaststammzellen. Im adulten Organismus ist es an der Spermatogenese beteiligt, indem es die Interaktion von Sertolizellen mit Keimzellen stimuliert. Außerdem wird es häufig in testikulären Tumoren exprimiert (Kosaka et al. 2009).
FGF7 wird auch als Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) bezeichnet. Dieser Faktor wird von mesenchymalen Zellen und T-Lymphozyten synthetisiert. Seine mitogenen Wirkungen beschränken sich überwiegend auf epitheliale Zellen und er wirkt spezifisch auf den FGFR2 IIIb (auch Keratinozyten Growth Factor Rezeptor, KGFR) (Tsuboi et al. 1993, Cho et al. 2012). Außerdem scheint der Faktor wichtig für Schutz und Reparatur von Epithelgeweben zu sein, da die Wundheilung bei FGF7 null- Mäusen verringert ist (Finch u. Rubin 2006). FGF7 ist auch am Gewebeumbau während der Tumorgenese beteiligt; beispielsweise wird sein Rezeptor KGFR vermehrt in Zervixkarzinomen der Frau exprimiert (Kurban et al. 2004).
Im Reproduktionstrakt, insbesondere in der Plazenta, konnte das FGF-System vielfältig nachgewiesen werden, was es zu einem potentiellen Kandidaten für die Regulation von EZM-Synthese und dem Gewebeumbau macht.
In der bovinen Plazenta wurde die Expression von FGF1,-2 und -7 sowie deren Rezeptoren FGFR, FGFR2 IIIb und FGFR2 IIIc von Tag 150 bis zur Geburt im karunkulären und kotyledonären Stroma, im karunkulären Epithel sowie in fetalen und maternalen Venen beschrieben. Insbesondere die Ko-Lokalisation von FGF1, -2, -7, und deren Rezeptoren in TGC (Pfarrer et al. 2006) machen diese Faktoren zu potentiell interessanten Kandidaten für die vorgelegte Studie. Durch diesen Nachweis vermuten die Autoren zum einen, dass die eingeschränkte Trophoblastinvasion des Rindes durch ein spezifisches FGF-Expressionsmuster
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charakterisiert werden kann. Zum anderen legt der spezifische Nachweis der Faktoren in den UTC und unreifen TGC nahe, dass diese auch eine wichtige Rolle in der Regulation von plazentarem Wachstum, Differenzierung und Angiogenese spielen (Pfarrer et al. 2006).
Gupta et al. (1997) konnten FGF1 und FGF2 im porzinen Uterus und dem Gewebe des Konzeptus nachweisen und hypothetisieren, dass diese eine Funktion während der Implantation einnehmen. Interessant ist auch, dass FGF7 in der epitheliochorialen Plazenta des Schweines, besonders zum Zeitpunkt der maternalen Erkennung der Frucht um den Tag 12 der Trächtigkeit, von endometrialen Epithelzellen exprimiert wird und entsprechend der Rezeptor FGFR2IIIb im endometrialen Epithel und im Trophektoderm der Frucht nachgewiesen werden konnte. Dieses deutet auf eine auto- und parakrine Wirkweise von FGF7 in der porzinen Plazenta hin (Ka et al. 2000). Weiterführend wurde festgestellt, dass Östrogen, das Trächtigkeitserkennungssignal beim Schwein, die Expression von FGF7 in uterinem Epithel erhöht und im Gegenzug fördert FGF7 die Proliferation und Differenzierung des Trophektoderms (Ka et al. 2001). In der Maus scheint die Implantation von FGF2 und FGF7 induziert zu werden. Diese Faktoren wurden im uterinen Epithel nachgewiesen und sie zeigen parakrine Effekte auf die Ausbreitung des Trophoblasten (Taniguchi et al. 1998).
Beim Rind wurde das FGF-System häufig im Eierstock beschrieben. In den Follikeln (vor, nach und zum Zeitpunkt des Anstiegs des luteotropen Hormons, LH) beim Rind wurde die Expression von FGF1, FGF7 und FGFR IIIb nachgewiesen und ein Einfluss dieser auf die Follikelreifung und die Entstehung des Corpus luteum (CL) demonstriert (Berisha et al. 2006). Nach dem LH-Anstieg im reifen Follikel und im frühen CL wird außerdem FGF2 hochreguliert (Berisha et al. 2006). Da zu diesem Zeitpunkt (4 h nach LH-Anstieg) auch MMP1 vermehrt exprimiert wird, wird hier ein Mechanismus vermutet, bei dem FGF2 die MMP1-Expression reguliert (Kliem et al.
2007). Derartige Wechselwirkungen zwischen FGF und MMP konnten auch schon in anderen Geweben aufgezeigt werden. In humanen glatten Muskelzellen, welche wichtig für den vaskulären Gewebeumbau sind, wurde gezeigt, dass FGF2 die Expression von MMP1 induziert und zusätzlich die Kollagenproduktion gehemmt wird (Pickering et al. 1997).
18 2.4.2. Insulinähnliche Wachstumsfaktoren
Das Insulin-like Growth Factor (IGF)-System besteht aus Liganden, Rezeptoren und Bindungsproteinen. Die Liganden des IGF-Systems sind die Faktoren IGF1 und IGF2, welche an die entsprechenden IGF-Rezeptoren (IGF1-R und IGF2-R) binden.
Die Verfügbarkeit der Liganden wird durch IGF-Bindungsproteine (IGFBP) reguliert.
Es gibt sechs unterschiedliche IGFBP. Eine weitere Rolle in der Regulation des IGF- Systems spielen Proteasen, welche die Liganden von den Bindungsproteinen spalten (Yu u. Rohan 2000, Monzavi u. Cohen 2002, Cohen 2006).
Die IGF haben eine Größe von 7 kDa, zeigen eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu Proinsulin (Rinderknecht u. Humbel 1978) und besitzen, synergistisch zu Insulin, blutzuckersenkende Wirkungen (Monzavi u. Cohen 2002). Ferner ist das IGF-System ein entscheidender Regulator zellulärer Prozesse, wie der Proliferation (Cohen 2006). IGF ist außerdem wichtig für die Steuerung von fetalem und plazentarem Wachstum. So konnte gezeigt werden, dass das Geburtsgewicht von Neugeborenen positiv mit dem IGF1-Spiegel im Serum korreliert und somit möglicherweise das fetale Wachstum reguliert (Osorio et al. 1996, Klauwer et al. 1997). Zusätzlich wird die Relevanz von IGF1 für das plazentare Wachstum dadurch verdeutlicht, dass IGF1 Knockout-Mäuse eine kleinere Plazenta entwickeln als IGF2 Knockout-Mäuse (Baker et al. 1993, Liu et al. 1993).
Das von unterschiedlichen Autoren beschriebene IGF-System der Plazenta des Rindes und seine potentiellen Funktionen machen es zu einem Kandidaten für diese Studie. Während des normalen Zyklus und am 14. Tag der Trächtigkeit wurde IGF1 überwiegend unterhalb des uterinen Epithels auf mRNA-Ebene detektiert. Die IGF2- Expression (mRNA) war im karunkulären Stroma am stärksten (Robinson et al.
2000). Die Bindungsproteine IGFBP 1 bis 5 wurden in unterschiedlicher Verteilung im Epithel bis ins Myometrium in verschiedener Intensität nachgewiesen (Llewellyn et al.
2008). Auch postpartal wurde gezeigt, dass das gesamte IGF-System auf mRNA- Ebene exprimiert wird. Daher wird eine Beteiligung von IGF an den starken Gewebeveränderungen nach der Geburt diskutiert (Llewellyn et al. 2008). Von Lütkehus (2012) wurde die IGF-System Expression auf mRNA- und Proteinebene in der bovinen Plazenta und im postpartalen Endometrium aufgezeigt. Besonders interessant für unsere Studie ist, dass die Liganden des IGF-Systems in den TGC
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detektiert werden konnten (Lütkehus 2012). Ebenfalls wurde das IGF-System von Richterich (2008) von Tag 50 bis zur Geburt auf mRNA- und Proteinebene untersucht. IGF1 dominierte hierbei im maternalen Kompartiment, während die IGF2- Expression in der fetalen Kotyledone deutlicher war. Entsprechend wurde der IGF2-R mehr im maternalen Anteil gefunden. Die IGF1-Expression war im ersten Trimester am deutlichsten. Hingegen zeigte IGF2 einen Expressionsanstieg vom ersten bis zum dritten Trimester. Durch die unterschiedliche Lokalisation und einen unterschiedlichen Verlauf der Intensität der Expression im Laufe der Trächtigkeit wurde angenommen, dass das IGF-System eine regulatorische Funktion für den Ablauf der Gestation einnimmt (Richterich 2008).
Auch die EZM und das Verhalten von Fibroblasten können von IGF moduliert werden. Diaz-Araya et al. (2003) zeigten, dass IGF1 die Adhäsion von kardialen Fibroblasten an Kollagen I, Laminin und Fibronektin verstärkt. Weiterhin wurde gezeigt, dass IGF nicht nur das Verhalten von Fibroblasten, sondern auch deren Synthese von EZM beeinflussen. So verstärkt IGF1 z.B. die Expression von Kollagen I in fetalen Herz-Fibroblasten (Diaz-Araya et al. 2003). Auch die Expression von Laminin, einem wichtigen Bestandteil von Basalmembranen (siehe 2.3.1.), wird in kornealen Epithelzellen von IGF1 stimuliert, sowie deren zelluläre Migration (Lee et al. 2006).
Zusammenfassend sind die IGF-Liganden, insbesondere durch die Lokalisation in den TGC, potentielle Kandidaten für die Regulation der Proliferation, der Motilität und der Expression von MMP und EZM in bovinen plazentaren Fibroblasten.
20 2.4.3. Epidermaler Wachstumsfaktor
Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) ist ein Faktor, der ursprünglich in der Speicheldrüse der Maus entdeckt wurde (Cohen 1962) und sich durch ausgeprägte mitogene Eigenschaften auszeichnet (Rall et al. 1985, Forbes and Westwood 2010).
Neben EGF gehören auch andere Wachstumsfaktoren wie der transforming growth factor-alpha (TGFA) und Epiregulin zur Proteinfamilie der EGF-Faktoren (Xian 2007, Higashiyama et al. 2008). EGF vermittelt seine biologischen Wirkungen über den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR/ErbB1), während die anderen Faktoren der Familie über einen von vier Rezeptor-Tyrosinkinasen (ErbB1-ErbB4) wirken (Prenzel et al. 2001). Über den EGFR aktiviert der Ligand (EGF) unterschiedliche Signalwege, wie z.B. die Phospholipase-C, die p38-MAPK und die p42/44-MAPK oder den PI3K-Signalweg (Oda et al. 2005, LaMarca et al. 2008). Diese führen in den Zellen letztendlich zur Veränderung der Zellmotilität, der Proliferation oder auch der Zelldifferenzierung (Prenzel et al. 2001). EGF beeinflusst die plazentare Entwicklung und Funktion (Forbes u. Westwood 2010). So konnte beispielsweise durch die Entnahme der Speicheldrüse während der Gestation ein EGF Defizit induziert werden. Dies führte zu reduziertem fetalen Wachstum, sowie verringertem transplazentaren Glukosetransport (Kamei et al. 1999).
Im bovinen Reproduktionstrakt konnte EGF während des Zyklus im endometrialen Stroma immunhistochemisch detektiert werden. Dabei war die Anzahl der EGF positiven Zellen an Tag 1-3, 6-7 und 11-13 am höchsten (Ohtani et al. 1996). Ebenso wurde der EGFR im maternalen Stroma sowie in allen Zellen des Trophoblasten mit einem schwachen zytosolischen Signal detektiert (Weise 2001). Stimulation der Trophoblastzelllinie F3 mit EGF führte zu einer erhöhten zellulären Motilität und Proliferation, welche über den Ras/MAPK-Signalweg vermittelt wurde. Außerdem regte EGF die Expression von MMP9 und TIMP1 in F3-Zellen an, was auf eine Beteiligung dieses Wachstumsfaktors am plazentaren Gewebeumbau hindeutet (Dilly et al. 2010, Hambruch et al. 2010).
Auch von der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Zellart, den Fibroblasten, ist bekannt, dass ihr zelluläres Verhalten und insbesondere die Proliferation von EGF moduliert werden kann (Carpenter u. Cohen 1976, Lembach 1976). Die erhöhte Proliferation von Fibroblasten durch EGF-Behandlung kann auch zu einer erhöhten
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Kollagen-Produktion und einer beschleunigten Wundheilung führen (Laato et al.
1987). Tamm und Kikuchi (1990) konnten zeigen, dass EGF in Kombination mit IGF1 eine anti-apoptotische Wirkung auf Fibroblasten besitzt. Weiterhin stellte Loot et al.
(2002) einen mitogenen Effekt von EGF auf Fibroblasten, die von chronischen Ulzera abstammen, fest. Dieses macht EGF zu einem potentiell regulierenden Faktor, der in der vorliegenden Arbeit auf seine Wirkung auf Fibroblasten untersucht wurde.
2.4.4. Bovines plazentares Laktogen
Das bovine plazentare Laktogen (bPL) gehört zur Wachstumshormon/Prolaktin-Gen- Familie und wird von der Plazenta sezerniert. Es ist ein 200 Aminosäuren langes und 31-33 kDa schweres Glykoproteinhormon (bei anderen Tierarten aufgrund fehlender Glykosylierung 23 kDa), welches laktogene und somatotrope Eigenschaften besitzt.
Dabei hat es eine höhere strukturelle Ähnlichkeit zu Prolaktin als zu Somatotropin.
Charakteristisch sind seine Bindungsfähigkeit zu Prolaktin-Rezeptoren (PRLR) und Wachstumshormon-Rezeptoren, über die es seine Wirkungen ausübt. Nach Aktivierung der Rezeptoren werden die Wirkungen überwiegend über den JAK/STAT-Signalweg vermittelt, aber auch der Ras/MAPK-Signalweg kann aktiviert werden (Byatt et al. 1992, Alvarez-Oxiley et al. 2008, Ben-Jonathan et al. 2008).
Das bPL konnte in den TGC der bovinen Plazenta nachgewiesen werden (Duello et al. 1986, Wooding u. Beckers 1987). Durch Exozytose der Hybridzellen gelangen die ehemaligen TGC-Granula in das endometriale Stroma. So gelangt bPL in die maternale Blutbahn (Wooding 1992), könnte aber auf dem Weg dorthin im endometrialen Stroma zelluläre Effekte auf direkt benachbarte Bindegewebszellen, z.B. Fibroblasten, ausüben.
Im maternalen Blut verbleibt die bPL-Plasmakonzentration beim Rind in den ersten beiden Trimestern gering, steigt dann bis zum 200. – 220. Tag an und bleibt bis zur Geburt auf diesem Niveau. Kühe mit Früh- oder Totgeburten zeigten Abweichungen im bPL-Profil. Daher wurde gefolgert, dass die Konzentration im Blut als Indikator für die feto-plazentare Viabilität genommen werden könnte (Wallace 1993, Patel et al.
1996). Außerdem ist die Konzentration von bPL beim Rind, im Gegensatz zu anderen Tierarten, im maternalen Blut geringer als im fetalen, weshalb angenommen wird, dass das bPL Einfluss auf das fetale Gewebe nimmt (Byatt et al. 1992, Alvarez-
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Oxiley et al. 2008). Ein Mechanismus, der die Synthese und Sekretion des bPL reguliert, ist noch nicht bekannt, jedoch wird hypothetisiert, dass die Expression von bPL mit der Differenzierung der Trophoblastzellen in Zusammenhang stehen könnte (Alvarez-Oxiley et al. 2008).
Weiterhin werden dem plazentaren Laktogen (PL) vielfältige Funktionen zugesprochen, zum Beispiel pro- und anti-angiogenetische Effekte, weil diese für Prolaktin nachgewiesen werden konnten (Corbacho et al. 2002). Ferner wurde von Noel et al. (2003) festgestellt, dass intrauterine Infusion von ovinem plazentaren Laktogen zum einen die Anzahl endometrialer Drüsen erhöht und zum anderen die Expression von Osteopontin beeinflusst. Zusätzliche besitzt bPL einen luteotropen Effekt, indem es möglicherweise die Anzahl der LH-Rezeptoren erhöht (Chan et al.
1980). Mit bPL behandelte Färsen zeigten ein gesteigertes Wachstum des Corpus luteum und die Plasmaprogesteron-Konzentration wurde erhöht (Lucy et al. 1994).
Außerdem soll bPL eine effektivere fetale Nährstoffzuführung sicherstellen. So stellten Rasby et al. (1990) fest, dass Kühe mit geringem body condition score (BCS) eine höhere bPL-Plasmakonzentration aufwiesen. Außerdem beeinflusst es sowohl die Laktogenese als auch die Mammogenese (Byatt et al. 1992, Kann et al. 1999).
Bei Nagetieren werden unterschiedliche Wirkungen durch PL außerhalb der Plazenta beschrieben. Es stimulierte z.B. die Serotonin-Biosynthese von Pankreaszellen bei der Maus oder regt die Glykogen-Synthese in der Leber der Ratte an (Gertler u.
Djiane 2002, Schraenen et al. 2010).
Die Tatsache, dass das bPL von den Hybridzellen in das endometriale Stroma exozytiert wird, macht es zu einem potentiellen Kandidaten in den vorliegenden Versuchen.
2.4.5. Kotyledonen-konditioniertes Medium
Das kotyledonen-konditionierte Medium (KKM) wurde selbst im Labor aus Kotyledonen von Tieren, die sich in der Mitte der Trächtigkeit befanden, hergestellt (siehe 3.3.). Es diente als in vivo Positivkontrolle, da diese Kotyledonen eine maximale Zahl von TGC enthalten (20% aller Trophoblastzellen) und somit auch ein Maximum der von TGC produzierten Faktoren abgegeben werden konnte. Von Hoedemaker et al. (1992) wurde ebenfalls ein durch Kotyledonen konditioniertes
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Medium eingesetzt und ein Einfluss auf die Funktion von bovinen neutrophilen Granulozyten beobachtet. In der humanen Plazentaforschung wird Trophoblast- konditioniertes Medium (TCM) als Referenz für Trophoblastprodukte oder als Positivkontrolle eingesetzt. In glatten Muskelzellen der plazentaren Spiralarterien konnte TCM eine vermehrte Apoptose der Zellen induzieren (Harris et al. 2006).
Weiterhin wurden humane endometriale Stromazellen mit TCM stimuliert. Dadurch wurde die Expression einer Vielzahl von Genen für Chemokine, Zytokine, Angiogenese-Faktoren sowie Proteinasen teilweise erhöht und teilweise verringert (Hess et al. 2007). Auch die Motilität von humanen endometrialen Stromazellen wurde durch TCM beeinflusst, wodurch der parakrine Einfluss des invadierenden Trophoblasten verdeutlicht wird (Schwenke et al. 2013). Aufgrund dieser spezifischen Wirkungen wurde der Einfluss des KKM auf die bovinen plazentaren Fibroblasten untersucht.
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3. Material und Methoden
3.1. Isolation boviner plazentarer Fibroblasten
Die Isolation von plazentaren Fibroblasten aus uterinem Gewebe lief nach folgendem Protokoll ab. Zunächst wurden im 4./5. Monat tragende Uteri vom Rind im Schlachthof gewonnen und ins Labor transportiert. Dort wurden sie mit 70% Ethanol (EtOH) gereinigt und zur Entnahme der Plazentome möglichst steril eröffnet. Unter der Sterilbank erfolgte anschließend die Trennung von Kotyledone und Karunkel, wobei nur das karunkuläre Gewebe weiter zur Verwendung kam, da der Einfluss auf maternale Fibroblasten untersucht werden sollte. Das Gewebe wurde mehrfach mit phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) abgespült, mit einem Faden zum Aufhängen versehen sowie in ein 50 ml Greiner Röhrchen überführt, welches schon 15 ml Trypsinlösung enthielt. Das Trypsin verdaute das Gewebe im Wasserbad (37°C, 20 min). Dieser Vorgang wurde anschließend nach Entnahme des Gewebes mit 10 ml fetalem Kälberserum (FCS) gestoppt. Dieser Verdauungsvorgang wurde dreimal wiederholt. Anschließend wurden die Greiner Röhrchen (mit jeweils 15 ml Verdaulösung plus 10 ml FCS) für 5 min bei 169 x g zentrifugiert und die pelletierten Zellen mit Vollmedium (HamsF12/DMEM mit 10% FCS) resuspendiert, durch ein 100 µm Sieb gefiltert und auf Eis gelagert.
In 15 ml Greiner Röhrchen wurden 5 ml Percoll/Easycoll vorgelegt und 3-5 ml Zellsuspension langsam am Rand auf die Percollschicht gegeben, so dass diese überschichtet wurde. Bei zäher Zellsuspension wurden max. 3 ml auf die Percollschicht gegeben. Nun wurde 20 min bei Raumtemperatur und 836 x g ohne Bremse zentrifugiert.
Damit sich die Schichten nicht wieder vermischten, wurde das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge entnommen. In diesem fanden sich nun unten ein Pellet aus Erythrozyten und Zelldetritus, welches verworfen wurde. Darüber befand sich eine weiße Percollschicht mit einem kleinen cremefarbigen Saum, der die Zellen enthielt und oben ein Überstand.
Der cremefarbige Saum wurde vorsichtig mit einer Pipette abgenommen (ca. 1-3 ml) und in ein neues 15 ml Greiner Röhrchen überführt. Das Röhrchen wurde mit 11 bis
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14 ml Vollmedium aufgefüllt und für 4 min 169 x g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert. Aus einem Zellpellet wurden dann je nach Größe zwei bis vier 75 cm² Zellkulturflaschen mit je 10 ml Vollmedium und dem jeweiligen Anteil der Zellsuspension angelegt. Anschließend erfolgte die Inkubation im CO2 Inkubator (5%
CO2, 37°C), wobei ein Mediumwechsel nach 2 oder 3 Tagen stattfand. Um eine erfolgreiche Isolation zu gewährleisten, wurde in dieser ersten Zeit besonders auf die Zellanheftung, sowie auf Kontaminationen mit Pilzen oder Bakterien geachtet.
In der nun folgenden ersten Subkultivierung nach der Zellisolation mussten noch Fibroblasten und karunkuläre Epithelzellen (BCEC) voneinander getrennt werden, da sich derzeitig noch eine Mischkultur aus beiden Zelltypen in der Zellkulturflasche befand. Hierbei wurde ausgenutzt, dass sich Fibroblasten schneller als Epithelzellen von der Unterlage ablösen.
Nach Abnahme des Mediums wurde die Zellkulturflasche mit PBS-EDTA-Wasser (PEM) gewaschen, um diese anschließend mit 5 ml PEM für 10 min zu inkubieren.
Danach wurden die Zellen „abgeschüttelt“, das PEM abgenommen und zusammen mit 5 ml Vollmedium für 4 min bei 169 x g und RT zentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig mit der Pipette resuspendiert und in eine neue Zellkulturflasche ausgesät.
In dieser Flasche befanden sich somit die Fibroblasten, die für die weiteren Versuche benutzt werden konnten. Die in der Flasche verbliebenen Epithelzellen wurden mittels Trypsin abgelöst und dann ebenfalls weiter kultiviert, jedoch nicht für diese Versuche verwendet.
Während weiterer Passagen wurden überschüssige Fibroblasten bei -150°C in folgender Zusammensetzung eingefroren: 100 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) + 100 µl FCS + 800 µl Zellsuspension. So konnten für die Versuche fortlaufend Fibroblasten gleicher Qualität aufgetaut werden.
Die Rezepturen für verwendete Puffer und Lösungen befinden sich im Anhang.
3.2. Kultivierung boviner plazentarer Fibroblasten
Die bovinen plazentaren Fibroblasten wurden im Inkubator bei 37°C, 5% CO2 und wasserdampfgesättigter Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wuchsen in 75 cm²
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Zellkulturflaschen. Als Medium diente dabei Dulbecco`s Modified Eagle Medium / HAM`s F12 (PAN-Biotech, DMEM/F12). Diesem wurden außerdem 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 µU/ml) und Streptomycin (100µg/ml) hinzugefügt (entspricht „Vollmedium“).
Wenn die ausgesäten Fibroblasten eine Konfluenz von ca. 90% erreicht hatten, erfolgte eine neue Passage der Zellen. Dafür wurde das Medium aus der Flasche genommen und die Zellkulturflasche mit 7 ml PEM ausgespült, so dass sich keine Reste des Mediums mehr in der Flasche befanden. Zur Subkultivierung bzw.
Passage wurden 3 ml einer Trypsin-Lösung auf die adhärenten Zellen gegeben und 5 min bei 37°C inkubiert, wodurch sich die Zellen von der Oberfläche ablösten. Noch an der Oberfläche haftende Zellen wurden durch leichtes Klopfen abgelöst. Das Trypsin wurde anschließend durch Zusatz von 7 ml Vollmedium inaktiviert. Die in Vollmedium und Trypsin befindlichen Zellen wurden in einem 15 ml Greiner Röhrchen 5 min bei RT und 169 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend abgeschüttet und das Zellpellet in 10 ml Vollmedium resuspendiert.
Nachfolgend erfolgte die Bestimmung der Zellzahl in der Neubauer-Zählkammer.
Hierfür wurden 10 µl Zellsuspension in die Zählkammer bzw. unter das Deckgläschen pipettiert, um 4 Quadrate (mit je 16 Unterquadranten) auszuzählen.
Dabei wurden nur lebende Zellen gezählt. Die Zellzahl pro ml berechnete sich dann wie folgt:
Summe der Zellen der 4 Quadrate / 4 = Mittelwert
Mittelwert * 104 = Anzahl Zellen pro ml
Die Zellen wurden in gewünschter Dichte neu ausgesät. Entsprechend der Verfärbung des Kultivierungsmediums galt es, dieses bis zu zweimal wöchentlich zu erneuern. Je nach benötigter Verwendung erfolgte eine Passage alle 10 bis 20 Tage.
3.3. Stimulation boviner plazentarer Fibroblasten
Um den Einfluss von TGC Produkten auf die Synthese von EZM Molekülen, MMP und ihren Inhibitoren in bovinen plazentaren Fibroblasten in vitro zu untersuchen,
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wurden die Fibroblasten mit den unten beschriebenen Faktoren in folgender Weise stimuliert:
Die Stimulationen für die mRNA Analysen wurden in 6 Well Platten (ca. 180.000 Zellen pro Well) durchgeführt. Nach 2–4 Tagen war eine für die Stimulationen ideale Konfluenz der Zellen von 70-80% erreicht. Für die Protein Analysen wurden die Zellen in Zellkulturschalen (6 cm Durchmesser) bis zur vollständigen Konfluenz kultiviert und dann erst stimuliert, um ausreichende Proteinmengen zu erhalten.
Da die genauen Inhaltsstoffe von dem im Vollmedium enthaltenen FCS weder bekannt noch in ihrer Wirkung eindeutig definierbar sind, erfolgte vor der Stimulation eine Umstellung der Zellen auf serumfreies Medium. Dafür wurde das Vollmedium mit einer Pipette abgenommen, die Wells bzw. Zellkulturschalen einmal mit serumfreiem Medium gespült und in der Folge für 4 h mit serumfreiem Medium inkubiert.
Anschließend wurden die einzelnen Wells bzw. Schalen für 12-16 h mit den jeweiligen Faktoren stimuliert. Dieses erfolgte durch Pipettieren der einzelnen Faktoren in entsprechend ausgetesteter oder aus der Literatur bekannter, wirksamer Konzentration in das serumfreie Medium, wobei pro Versuchsansatz zunächst 13 verschiedene Wells angelegt und wie folgt behandelt wurden:
1. 1 ml serumfreies Medium (PAN-Biotech, DMEM/F12) 2. 1 ml „Vollmedium“ (PAN-Biotech, DMEM/F12)
3. 50 ng/ml Epidermal Growth Factor 4. 50 ng/ml Insulin-like Growth Factor-1 5. 100 ng/ml Insulin-like Growth Factor-2 6. 50 ng/ml Fibroblast Growth Factor-1 7. 50 ng/ml Fibroblast Growth Factor-2 8. 50 ng/ml Fibroblast Growth Factor-4 9. 50 ng/ml Fibroblast Growth Factor-7 10. 50 ng/ml EGF + 50ng/ml IGF-1 11. 50 ng/ml EGF + 100ng/ml IGF-2 12. 200 ng/ml bPL
13. 1 ml kotyledonen-konditioniertes Medium
28 Tabelle 1: Herkunft der eingesetzten Faktoren
Faktor Spezies Hersteller, Katalognr.
Epidermal Growth Factor
(EGF) Human rekombinant Biomol, Katalognr. 50349 Insulin-like Growth Factor-1
(IGF-1) Human rekombinant Biomol, Katalognr. 50356 Insulin-like Growth Factor-2
(IGF-2) Human rekombinant Biomol, Katalognr. 50342 Fibroblast Growth Factor-1
(FGF-1) Human rekombinant Miltenyi Biotec, Katalognr.
130-093-835 Fibroblast Growth Factor-2
(FGF-2) Human rekombinant Miltenyi Biotec, Katalognr.
130-093-837 Fibroblast Growth Factor-4
(FGF-4) Human rekombinant Miltenyi Biotec, Katalognr.
130-093-845 Fibroblast Growth Factor-7
(FGF-7) Human rekombinant Miltenyi Biotec, Katalognr.
130-093-849 bovines plazentares
Laktogen (bPL) Bovin Prospec, Katalognr. cyt-511 Das KKM wurde selbst hergestellt. Dafür wurden am Schlachthof Plazentome gewonnen und die fetale Kotyledone von der Karunkel manuell abgelöst. Die Kotyledone wurde nun für 16-24 h in serumfreiem Medium inkubiert. Nach Entnahme des Gewebes folgten eine Zentrifugation (4 min 169 x g bei RT), sowie eine sterile Filtration des Mediums und eine anschließende Lagerung (-20°C).
Nach Ende der Stimulation wurde das Medium aus den Wells bzw. Schalen abgesaugt, diese mit 4°C kaltem PBS 1x gespült und auf Eis gelegt, um die Zellen anschließend direkt weiterzuverarbeiten oder bei -80°C einzufrieren.
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3.4. Methodik der mRNA-Analysen
3.4.1. Qualitative RT-PCR
In einem ersten Screening wurde die konventionelle RT-PCR verwendet, um auf mRNA-Ebene das Expressionsprofil von MMP1, -2, -8, -9, -14, TIMP1, -2, Kollagen I, -IV, Laminin B, Laminin C und Fibronektin zu untersuchen. Die Produkte der konventionellen PCR wurden auf ein Agarosegel aufgetragen und dann semiquantitativ, densitometrisch ausgewertet.
3.4.1.1. Isolation von RNA aus bovinen plazentaren Fibroblasten
Zur Isolierung von RNA diente das PeqGold RNA-Isolierungs-Kit (Firma Peqlab).
Hierbei wurden die 6 Well Platten entweder aufgetaut oder direkt verwendet. Alle folgenden Schritte erfolgten bei RT. Als Erstes wurden 400 µl RNA Lysis Buffer (pro Well) in die auf Eis liegenden Platten pipettiert, um die Zellen anschließend durch vorsichtiges Schaben mit einem Zellschaber mit dem Puffer zu vermengen und abzulösen. Diese Lösung wurde auf eine Säule (DNA-Removing Column), die auf einem Sammelgefäß (Collection Tube) steckte, pipettiert und für 1 min bei 12.000 x g zentrifugiert. Der Säulendurchfluss wurde mit gleicher Menge EtOH (95% unvergällt) vermengt und nach sorgfältigem Mischen auf eine neue Säule (PerfectBind RNA Column), die auf einem 1,5 ml Eppendorf Gefäß steckte, übertragen und zentrifugiert (1 min 10.000 x g). Die eluierte Flüssigkeit und das Eppendorf Gefäß wurden verworfen, während sich die RNA noch in der Membran der Säule befand. Danach folgte ein Waschgang mit 500 µl Wash Buffer I und nachfolgender Zentrifugation für 15 sek bei 10.000 x g. Noch in der Membran verbliebende DNA wurde mit DNase Puffer verdaut, welche direkt auf die Membran pipettiert wurde. Dieser Vorgang wurde nach 15 min durch Auftragen von 400 µl RNA Wash Buffer I angehalten und ein erneuter Zentrifugationsschritt durchgeführt (15 sek bei 10.000 x g).
Es folgten zwei Waschschritte (RNA Wash Buffer II) mit jeweils 600 µl für 15 sek bei 10.000 x g. Das Eluat wurde jeweils verworfen. Vor der abschließenden RNA Elution schlossen sich zwei weitere Zentrifugationsschritte für jeweils 2 min bei 10.000 x g an, um die Membran zu trocknen. Nach dem Umsetzen der Säule in ein neues
