Der Einfluss von Trophoblastzell-Produkten auf die plazentare Angiogenese des Rindes in vitro
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Enrica Zumnorde-Mertens
Münster (Westfalen)
Hannover 2016
Hannover
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christiane Pfarrer
Anatomisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachterin: Prof. Dr. Maren von Köckritz-Blickwede Institut für Physiologische Chemie Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 09.05.2016
Für meine lieben Eltern
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Schrifttum ... 3
2.1 Struktur und Einteilung der bovinen Plazenta ... 3
2.2 Der Trophoblast in der bovinen Plazenta ... 4
2.3 Die morphologische Entwicklung des Blutgefäßsystems in der bovinen Plazenta ... 5
2.4 Der Prozess der Angiogenese ... 9
2.5 Die Regulation der plazentaren Angiogenese ... 12
2.5.1 Regulatoren ... 15
2.5.1.1 Vascular Endothelial Growth Factor ... 16
2.5.1.2 Fibroblasten-Wachstumsfaktoren ... 19
2.5.1.3 Insulinähnliche Wachstumsfaktoren ... 23
2.5.1.4 Bovines plazentares Laktogen ... 26
2.5.1.5 Epidermaler Wachstumsfaktor ... 28
2.5.1.6 Kotyledonen-konditioniertes Medium ... 29
3 Material und Methoden ... 31
3.1 Zellkultur ... 31
3.1.1 Primärisolation der bovinen Endothelzellen ... 31
3.1.2 Kultivierung von Endothelzellen ... 33
3.1.3 Kultivierung boviner plazentarer Fibroblasten ... 33
3.1.4 Bestimmung des Zellgehaltes ... 34
3.1.5 Identifikation der Endothelzellen ... 35
3.1.6 Wachstums-Assay ... 36
3.1.7 Verwendete Endothelzell-Stimulanzien ... 37
3.1.8 MTT-Assay ... 40
3.1.9 Live Cell Imaging ... 42
3.1.10Angiogenese-Assays ... 43
3.1.10.1 Herstellung von Kollagengelen ... 43
3.1.10.2 Venous Ring Sprouting Assay ... 45
3.1.10.2.1 Durchführung des Venous Ring Sprouting Assay ... 45
3.1.10.2.2 Immunfluoreszenz ... 48
3.1.10.3 Sphäroid-basierter Sprouting Assay ... 49
3.1.10.3.1 Bildung und Ernte der Sphäroide ... 49
3.1.10.3.2 Markierung der Endothelzellen mit einem Zell Tracer ... 51
3.1.10.3.3 Durchführung des Sphäroid-basierten Sprouting Assays ... 52
3.1.10.3.4 Ultrastrukturelle Analyse der Sphäroide ... 52
3.1.10.4 Microcarrier-basierter Sprouting Assay ... 54
3.1.10.4.1 Microcarrier-Präparation und Besiedelung der Microcarrier ... 54
3.1.10.4.2 Durchführung des Microcarrier-basierten Sprouting Assay ... 56
3.1.10.4.3 Immunfluoreszenz ... 57
3.1.11Stimulation der Endothelzellen für die RNA-Isolation ... 58
3.2 Molekularbiologie ... 59
3.2.1 RNA-Isolation aus den bovinen Endothelzellen ... 59
3.2.2 Umschreibung der RNA mittels Reverser Transkriptase PCR ... 60
3.2.3 Überprüfung der Umschreibung von RNA in cDNA... 61
3.2.4 Quantitative Real-Time PCR ... 64
3.2.5 Auswertung der quantitativen Real Time PCR ... 71
3.3 Statistische Auswertung ... 72
4 Ergebnisse ... 75
4.1 Zellkultur ... 75
4.1.1 Identifikation der Endothelzellen ... 75
4.1.2 Wachstums-Assay ... 76
4.1.3 MTT-Assay ... 77
4.1.4 Live Cell Imaging ... 78
4.1.5 Angiogenese-Assays ... 79
4.1.5.1 Venous Ring Assay ... 79
4.1.5.2 Sphäroid-basierter Sprouting Assay ... 83
4.1.5.3 Microcarrier-basierter Sprouting Assay ... 85
4.2 Molekularbiologie ... 87
4.2.1 Quantitative Real-Time PCR ... 87
4.2.1.1 Matrix-Metalloproteinase 1 (MMP1) ... 88
4.2.1.2 Matrix-Metalloproteinase 14 (MMP14) ... 89
4.2.1.3 Syndekan 1 (SN1) ... 90
5 Diskussion ... 91
5.1 Die Isolation und Kultur der BUVEC ... 91
5.2 Die plazentare Angiogenese des Rindes in vitro ... 94
5.2.1 Effekte der Trophoblast-Produkte auf die Motilität und Proliferation ... 94
5.2.2 Effekte der Trophoblast-Produkte auf die Formation gefäßähnlicher Strukturen ... 98
5.2.2.1 Venous Ring Assay ... 98
5.2.2.2 Sphäroid-basierter Sprouting Assay ... 101
5.2.2.3 Microcarrier-basierter Sprouting Assay ... 105
5.3 Untersuchung der Effekte vielversprechender TGC-Produkte auf mRNA-Ebene ... 110
5.4 Schlussfolgerungen ... 114
6 Zusammenfassung ... 117
7 Summary ... 121
8 Literaturverzeichnis ... 125
9 Anhang ... 156
9.1 Abkürzungen ... 156
9.2 Puffer und Lösungen ... 160
9.3 Reagenzien ... 163
9.4 Verbrauchsmaterialien ... 165
9.5 Geräte ... 166
9.6 Daten der quantitativen Real-Time PCR ... 168
10 Danksagung ... 184
1 Einleitung
In der bovinen Plazenta setzt sich die Trophoblastzellschicht aus zwei unterschiedlichen Zelltypen zusammen. Neben den einkernigen Trophoblastzellen (UNC), die typische Epithelzelleigenschaften aufweisen, finden sich auch Trophoblastriesenzellen (TGC) (BJÖRKMAN 1954; BJÖRKMAN u. BLOOM 1957;
BJÖRKMAN 1969). Die TGC migrieren in das maternale Kompartiment der Plazenta und verschmelzen dort mit Epithelzellen zu Hybridzellen. Auf diese Weise gelangen in zytoplasmatischen Granula der TGC enthaltene Substanzen in das maternale Kompartiment der Plazenta (WOODING 1992). Zu diesen Stoffen gehören bovines plazentares Laktogen (bPL), PAG (Pregnancy Associated Glycoproteins, trächtigkeitsassoziierte Glykoproteine) und Mitglieder verschiedener Wachstumsfaktorenfamilien, wie Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) oder der Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) (WOODING u. BECKERS 1987; GREEN et al. 2000; PFARRER et al. 2006a; PFARRER et al. 2006b).
Im Allgemeinen setzt sich der Prozess der Angiogenese aus mehreren Schritten zusammen (CARMELIET 2000), die einer Regulation durch verschiedene Faktoren unterliegen. Zu diesen Faktoren gehören beispielsweise FGF (PRESTA et al.
2005) und VEGF (FERRARA 2001), deren Vorkommen nicht nur in gefäßassoziierten Lokalisationen in der Plazenta, sondern auch in TGC nachgewiesen werden konnte (PFARRER et al. 2006a; PFARRER et al. 2006b).
Bei Mensch und Maus war es bereits möglich, einen regulierenden Einfluss des Trophoblasten und seiner Produkte auf den Prozess der Angiogenese nachzuweisen (CROSS et al. 2002; ZHOU et al. 2003). Auch für das Rind wird eine Beeinflussung der plazentaren Angiogenese durch Produkte des Trophoblasten angenommen.
Neben der Tatsache, dass die Plazentagefäße eine wichtige Funktion im Rahmen des plazentaren Stoffaustausches zwischen Fetus und Muttertier einnehmen (REYNOLDS u. REDMER 1995), bestimmen die fetalen und maternalen Blutgefäße maßgeblich die Anatomie des Plazentoms, da Kotyledone und Karunkel eine strukturelle Basis vaskulärer Zotten beziehungsweise Krypten
besitzen (WOODING u. FLINT 1994; LEISER et al. 1998) und sich die Blutgefäße dicht dem Oberflächenepithel von Kotyledone und Karunkel anlagern (LEISER u.
KOOB 1992).
In der vorliegenden Studie wurden deshalb Endothelzellen aus der bovinen Nabelvene (BUVEC) isoliert, um potentiell pro-angiogene Effekte verschiedener TGC-Produkte in vitro zu untersuchen. Zu den verwendeten TGC-Produkten gehören FGF und VEGF, deren allgemeine pro-angiogene Wirkung bereits bekannt ist. Im Gegensatz dazu ist die pro-angiogene Wirksamkeit insulinähnlicher Wachstumsfaktoren, des bPL und des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), die auch verwendet wurden, teilweise noch nicht gesichert. In der angefertigten Arbeit wurden biologische Effekte der TGC-Produkte auf Einzelaspekte der Angiogenese (Proliferation und Migration der BUVEC) ebenso analysiert, wie die Fähigkeit, eine von den BUVEC ausgehende Formation gefäßähnlicher Strukturen in einer drei- dimensionalen Matrix hervorzurufen. Daneben wurde an BUVEC der Einfluss ausgewählter TGC-Produkte auf die Expression distinkter Gene auf mRNA-Ebene untersucht.
Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen dazu beitragen, die Physiologie der plazentaren Angiogenese des Rindes zu erfassen. Zusammen mit Erkenntnissen aus weiterer Forschungsarbeit in diesem Bereich, können diese Ergebnisse die Grundlage für die Therapie von Pathologien liefern, die im Zusammenhang mit einer gestörten plazentaren Angiogenese stehen.
2 Schrifttum
2.1 Struktur und Einteilung der bovinen Plazenta
Um während der Trächtigkeit den Stoffaustausch zwischen Mutter und Fetus zu gewährleisten, bilden Säugetiere eine Plazenta aus (GROSSER 1909, 1927). Die Plazenta entsteht durch die Kontaktaufnahme fetaler Membranen mit der uterinen Mukosa, die, je nach Plazenta-Typ, unterschiedlich gestaltet ist (LEISER u.
KAUFMANN 1994).
Die fetalen Membranen bestehen zum einen aus dem Amnion, welches den Fetus direkt umgibt und dem fetalen Ektoderm entstammt. Als weitere Strukturen der fetalen Membranen sind das Chorion, bestehend aus dem fetalen Trophektoderm und dem avaskulären Mesoderm, und die Allantois, welche sich als Ausstülpung des fetalen Darms bildet, zu nennen. Im Verlauf der frühen Trächtigkeit verbinden sich Allantois und Chorion und bilden gemeinsam das Allantochorion. Eine Vaskularisation von Amnion und Chorion erfolgt dabei ausgehend von Gefäßen der Allantois (STRAHL 1906; GROSSER 1909, 1927).
Als strukturelle Besonderheit weist die Plazenta der Wiederkäuer Plazentome auf, welche sich aus der Kotyledone und der Karunkel zusammensetzen. Äußerlich stellt das bovine Plazentom eine pilzförmige Struktur dar, welche im maternalen Kompartiment aus einem Karunkelstiel besteht, dem eine Basalplatte und Septen aufgelagert sind. Das fetale Kompartiment des Plazentoms zeigt eine Chorionplatte, die sich kappenartig über das maternale Gewebe stülpt und fingerförmige Fortsätze in die vorhandenen Septen entlässt (LEISER et al. 1997b).
Basierend auf der Ausbildung von Plazentomen wird die Plazenta der Wiederkäuer auch als „Placenta multiplex sive cotyledonata“ bezeichnet (STRAHL 1906;
GROSSER 1909, 1927). Die Karunkeln stellen spezialisierte Bereiche der Uterusschleimhaut dar, über denen das Allantochorion ab der vierten Woche der Trächtigkeit proliferiert und Zotten ausbildet, die sich im späteren Verlauf, ausgehend von den Primärzotten, zu Sekundär- und Tertiärzotten verzweigen.
Diese greifen in die karunkulären Bereiche der Uterusschleimhaut, in der es zur entsprechenden Ausbildung von Septen kommt, die Primär-, Sekundär- und
Tertiärkrypten bilden (SCHLAFER et al. 2000; PFARRER et al. 2001). Die Kotyledonen mit ihren zottenartigen Fortsätzen bestehen aus einem mesenchymalen Gewebestock, der mit einer Zellschicht des Trophoblasten überzogen ist und in dessen Zentrum sich aus der Allantois stammende Gefäße befinden (BJÖRKMAN 1954; BJÖRKMAN u. BLOOM 1957). Durch die Ausbildung der Zotten ist die Plazenta der Wiederkäuer dem villösen Typ zuzuordnen (LEISER u. KAUFMANN 1994).
Auch an Hand der Gewebeschichten, die den fetalen und maternalen Blutfluss voneinander trennen, lassen sich die unterschiedlichen Plazenta-Typen einteilen.
Bei den Wiederkäuern liegt ein synepitheliochorialer Plazenta-Typ vor, bei dem eine Schichtung von maternalem Endothel, Bindegewebe und Epithel sowie einer Trophoblastzellschicht, fetalem Bindegewebe und Endothel vorhanden ist (WOODING 1992; LEISER u. KAUFMANN 1994). Kennzeichnend für die Plazenta der Rinder ist eine Invasion von Trophoblastriesenzellen in das Uterusepithel, wo es zur Verschmelzung von TGC mit einzelnen maternalen Epithelzellen zu feto- maternalen Hybridzellen kommt (WOODING 1992). Somit haben die Trophoblastzellen einen schwach invasiven Charakter. Während der Geburt erfolgt eine Trennung der Gewebsschichten entlang der feto-maternalen Kontaktfläche, so dass es nur zu geringen Gewebsverlusten auf maternaler Seite kommt (STRAHL 1906). Auf Grund dieser Tatsache kann die bovine Plazenta als
„Semiplazenta“ (STRAHL 1906) bezeichnet und den „Adeciduata“ (HUXLEY 1864) zugeordnet werden.
2.2 Der Trophoblast in der bovinen Plazenta
In der Zellschicht des bovinen Trophoblasten sind zwei unterschiedliche Zelltypen anzufinden (BJÖRKMAN 1954; BJÖRKMAN u. BLOOM 1957). Der erste Zelltyp wird durch uninukleäre Trophoblastzellen repräsentiert (Uninuclear Trophoblast Cells, UNC), die einer Basalmembran aufliegen, durch apikolaterale Zellverbindungskomplexe Kontakt zu einander aufweisen und mit uterinen Epithelzellen über apikale Mikrovilli interdigitieren (BJÖRKMAN 1969).
Trophoblastriesenzellen (Trophoblast Giant Cells, TGC) stellen den zweiten Typ
dar. Die TGC haben die typischen Eigenschaften von Epithelzellen, wie sie die UNC aufweisen, verloren. TGC entstehen durch azytokinetische Mitose aus mononukleären Trophoblastzellen und weisen zumeist zwei, aber auch mehr Zellkerne auf (WIMSATT 1951; WOODING 1992). Die nicht polarisierten TGC verlieren den Kontakt zur Basalmembran und durchlaufen einen Maturationsprozess, nach dessen Abschluss sich zahlreiche Granula im Zytoplasma befinden. Die TGC verlassen die Trophoblastzellschicht und migrieren in das maternale Uterusepithel, wo es zur Bildung von Hybridzellen kommt, die sich aus jeweils einer TGC und einer Uterusepithelzelle zusammensetzen. Sie weisen in der Regel drei Zellkerne auf (WOODING 1992). Allerdings wird die Basalmembran des Uterusepithels während der Migration der TGC nicht überschritten (PFARRER et al. 2003). Durch die Migration der TGC wird ein Transport von Botenstoffen aus dem fetalen in das maternale Kompartiment der Plazenta ermöglicht (WOODING u. FLINT 1994).
Zu den Botenstoffen, die in das maternale Gewebe entlassen werden, zählen Hormone, wie Progesteron (REIMERS et al. 1985) oder Prostaglandin (GROSS u.
WILLIAMS 1988), sowie auch die Gruppe der PAG (GREEN et al. 2000). Eine weitere wichtige Stoffgruppe, die von den TGC in das maternale Kompartiment entlassen wird, sind Wachstumsfaktoren. Dieser Gruppe gehören die FGF (PFARRER et al. 2006a) und VEGF (PFARRER et al. 2006b) an. Es wird als wahrscheinlich angesehen, dass Wachstumsfaktoren Einfluss auf den Gewebeumbau der Plazenta nehmen. Zudem besteht der Verdacht, dass durch diese Faktoren auch die plazentare Angiogenese beeinflusst wird. Zudem geben die TGC bPL in das maternale Gewebe ab (WOODING u. BECKERS 1987), dem auch Effekte auf die Angiogenese zugesprochen werden (siehe Kapitel 2.5.1.4).
2.3 Die morphologische Entwicklung des Blutgefäßsystems in der bovinen Plazenta
In der bovinen Plazenta lagern sich die Blutgefäße des fetalen und maternalen Kreislaufs im Bereich von Kotyledone und Karunkel dem Oberflächenepithel dicht
an (LEISER u. KOOB 1992). Ausgehend von dieser Anordnung, besteht eine maternale Krypte aus einer Krypte vaskulärer Basis, umgebendem Stroma und dem Oberflächenepithel (WOODING u. FLINT 1994). Ein entsprechender Aufbau ist auch im fetalen Kompartiment anzutreffen, wo die fetalen Zotten aus einer vaskulären Basis, Stroma und der Trophoblastzellschicht zusammengesetzt sind (LEISER et al. 1998). Die Anatomie von Kotyledone und Karunkel ist somit maßgeblich durch die Anordnung der fetalen und maternalen Blutgefäße bestimmt.
Die im maternalen und fetalen Kompartiment befindlichen Blutgefäße lassen sich unter gleichen Aspekten einteilen: Stammarterien und -venen bilden die Grundlage der der kotyledonären Stammzotten beziehungsweise der Primärsepten der Karunkel. Die Stammarterien und -venen verzweigen sich zu Arteriolen und Venolen, welche die Basis für Intermediärsepten und -zotten darstellen. Tertiäre Strukturen der Karunkel und Kotyledone werden durch terminale Kapillarschlingen gebildet (PFARRER et al. 2001).
PFARRER et al. (2001) beschreiben und analysieren die Entwicklung des Gefäßsystems im maternalen Kompartiment der Plazenta des Rindes. Dieses zeigt im dritten Trächtigkeitsmonat im Bereich des Karunkelstiels eine Arterie mit gewundenem Verlauf, die von einer weniger gewunden verlaufenden Vene begleitet wird. Vorteil des gewundenen Verlaufs der Arterie ist, dass Blutfluss und Blutdruck reduziert und die im frühen Trächtigkeitsstadium noch empfindlichen fetalen Zotten vor schädlichen Druckeinflüssen geschont werden. Auf Höhe der Basalplatte der Karunkel entlassen diese im rechten Winkel Stammarterien und -venen, welche den Grundstock aller Primärsepten bilden und bis zur Höhe des ersten Drittels der Stammzotte reichen. Aus der Stammarterie und -vene entspringen Arteriolen und Venolen, auf deren Basis Intermediärsepten entstehen.
Eine Arteriole, die zentral in einem Intermediärseptum verläuft, wird dabei von mehreren randständig verlaufenden Venolen begleitet. Intermediärsepten reichen, im Vergleich zu Primärsepten, nahezu bis zur Karunkeloberfläche. Die zu diesem Trächtigkeitszeitpunkt in primitiver Form ausgebildeten Tertiärsepten sitzen den Sekundärsepten in fetaler Richtung auf. Im Inneren der Tertiärsepten befinden sich Kapillarschlingen, die Anastomosen und Dilatationen aufweisen. Bis zum sechsten
Trächtigkeitsmonat erfolgt eine Weiterentwicklung des maternalen Gefäßsystems.
Die Länge und der Durchmesser der Stammarterien und -venen nehmen zu.
Zudem entlassen sie vor allem nahe der feto-maternalen Grenzfläche weitere Arteriolen und Venolen, die die Grundlage für zusätzliche Intermediärsepten bilden. Durch diese Orientierung entsteht ein „trauerweidenartiges“ Aussehen des Gefäßbaumes. Zahlreiche weitere Kapillaren werden entlassen, die in zentrifugal am Gefäßbaum ausgerichteten Schlingen angeordnet sind und durch die Ausbildung von Anastomosen Arteriolen und Venolen miteinander verbinden. Es entsteht ein „honigwabenartiges“ Aussehen der karunkulären Gefäßstruktur. Durch die starke Zunahme tertiärer Gefäßstrukturen bis zum sechsten Trächtigkeitsmonat wird nicht nur ein gesteigerter Stoffaustausch zwischen Fetus und Muttertier ermöglicht, sondern erfolgt dadurch auch eine festere Verbindung der Plazenta mit dem Uterus (LEISER et al. 1998; PFARRER et al. 2001). Ab dem sechsten Trächtigkeitsmonat bis zur Geburt unterliegt das maternale Gefäßsystem nur noch geringgradigen weiteren Entwicklungen und Veränderungen.
LEISER et al. (1997b) und PFARRER et al. (2001) beschreiben das Blutgefäßsystem des fetalen Kompartiments ab dem vierten Trächtigkeitsmonat bis zur Geburt. Gefäße des Allantochorions entlassen zur Versorgung eines Plazentoms 1-3 Arterien, die einen geraden Verlauf aufweisen. Sie werden von 1-3 Venen größeren Durchmessers, die einen eher gewundenen Verlauf aufweisen, begleitet. Ab der Basis der fetalen Gefäßbäume werden die in feto-maternaler Richtung verlaufenden Gefäße als Stammarterien bezeichnet, die von jeweils einer Stammvene begleitet werden und die Grundlage der Stammzotten bilden.
Stammarterie und -vene verlaufen parallel und mittig in der Stammzotte. Mit zunehmender Trächtigkeitsdauer begleiten weitere Stammvenen eine Stammarterie. Die Intermediärzotten des fetalen Kompartiments basieren auf einer Arteriole und mehreren Venolen, die geschwungen verlaufen und die gestreckt verlaufende Arterie röhrenartig begleiten. Vorteil der Tatsache, dass mehrere venöse Gefäße ein arterielles Gefäß begleiten, ist, dass Substanzen, wie zum Beispiel Hormone, gemäß dem Gegenstromprinzip rückresorbiert werden können.
Terminal erfolgt eine Verzweigung zu Kapillarschlingen, wobei mehrere
Kapillarschlingen die Basis tertiärer Zotten bilden. Die Anzahl der Kapillarschlingen und sich bildendenden Anastomosen zwischen Kapillarschlingen nehmen im Verlauf der Trächtigkeit zu. Zudem treten sinusoidale Erweiterungen an den äußeren Schlingenlokalisationen auf. Durch diese Entwicklung wird der gesteigerte Stoffwechselbedarf des Fetus gesichert, zudem führt sie zu einer verbesserten Verankerung der fetalen und maternalen Plazentaanteile in einander (LEISER et al. 1998).
Durch die Entwicklung des fetalen und maternalen Gefäßsystems im Verlauf der Trächtigkeit verändert sich auch die Blutflussrichtung zwischen den beiden Kompartimenten. Die Anordnung fetaler und maternaler Gefäße ist ein entscheidender Faktor für die Effizienz des jeweiligen Plazenta-Typs, der auch im feto-plazentaren Gewichtsverhältnis Ausdruck findet (LEISER u. KAUFMANN 1994). Im dritten und vierten Monat der Trächtigkeit liegt eine noch primitive Ausbildung tertiärer Gefäßstrukturen in der Plazenta des Rindes vor. Dadurch erfolgt vorranging ein Blutfluss nach dem Gegenstromprinzip, der als sehr effektiv einzuordnen ist (LEISER u. KAUFMANN 1994). Durch die fortschreitende Entwicklung von Kapillarschlingen im fetalen und maternalen Anteil des Plazentakreislaufs und der damit verbundenen Ausbildung von Tertiärzotten und -krypten dominiert ab dem zweiten Drittel der Trächtigkeit ein Blutfluss nach dem Querstromprinzip. Trotz dieser Entwicklung ist die bovine Plazenta als effektiv einzuschätzen, da beide Austauschprinzipien parallel vorhanden sind und durch die zunehmende Ausbildung von Kapillarschlingen die feto-maternale Austauschfläche vergrößert wird. Zudem gelangt das Blut über verhältnismäßig kurze zu- und abführende Gefäße zu den Kapillarschlingen, wo der feto-maternale Stoffaustausch größtenteils stattfindet (PFARRER et al. 2001).
Die bovine Plazenta mit dem dazugehörigen Blutgefäßsystem weist viele Ähnlichkeiten zur humanen Plazenta auf, da es sich bei beiden Plazentaformen um einen villösen Plazentatyp handelt. Im Unterschied zum Wiederkäuer greift ein Teil der fetalen Zotten in das endometriale Stroma („Stamm- oder Haftzotten“), während der andere Teil frei im Blut des intervillösen Raums schwimmt (MOORE 1980; LEISER et al. 1997a).
2.4 Der Prozess der Angiogenese
Grundsätzlich können neue Blutgefäße durch zwei unterschiedliche Prozesse entstehen. Zum einen ist die Vaskulogenese anzuführen, die vorrangig die de novo Entwicklung eines primitiven Gefäßsystems in der frühen Embryonalphase beschreibt. Aus dem Dottersack stammenden Angioblasten ordnen sich an, um ein primitives Gefäßnetzwerk zu bilden. Auch in adulten Individuen sind Endothelzellvorläufer im Knochenmark oder im zirkulierenden Blut vorhanden, so dass auch hier noch eine Blutgefäßbildung durch Vaskulogenese vorkommen kann (RISAU u. FLAMME 1995; CARMELIET 2000).
Zum anderen ist die Blutgefäßbildung durch Angiogenese zu nennen, die alle Prozesse umfasst, bei denen neue Blutgefäße auf Basis bereits bestehender Gefäße entstehen. Diese Form der Blutgefäßbildung ist in der späteren Embryonalentwicklung und in wachsenden Geweben anzutreffen. Im adulten Individuum ist die Angiogenese im Rahmen physiologischer Vorgänge, wie dem ovariellen und uterinen Zyklus und in der Trächtigkeit bzw. Schwangerschaft, aber auch während pathologischer Zustände, wie der Wundheilung, in Tumoren, rheumatoiden Arthritiden oder Retinopathien anzutreffen (CARMELIET 2000). Es werden verschiedene Typen der Angiogenese unterschieden. Die Angiogenese erfolgt durch Sprossung oder Einstülpung, sie kann aber auch durch transendotheliale Brückenbildung vollzogen werden (RISAU 1997; CARMELIET 2000).
Die Angiogenese durch Sprossung ist der am intensivsten untersuchte Angiogenese-Typ, welcher sich aus der Basalmembrandegradation, der Endothelzellmigration und -proliferation, einer Lumenbildung, funktioneller Reifung des Endothels und dem Abbau extrazellulärer Matrix zusammensetzt (RISAU 1996; CARMELIET 2000). Im Detail erfolgt zu Beginn eine Vasodilatation des bestehenden Gefäßes, die durch Stickstoffmonoxid (NO) vermittelt wird. VEGF, welches in einem Wirkungszusammenhang mit NO steht und durch NO vermehrt durch Endothelzellen exprimiert wird, bewirkt eine gesteigerte Gefäßpermeabilität (KIMURA et al. 2000; CAO et al. 2004). Diese wird durch Fenestrierung der Basalmembran, Bildung von vesikulo-vakuolären Organellen und der
Umstrukturierung von Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekülen (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule, PECAM1) und vaskulär-endothelialem Cadherin (VE-Cadherin) erreicht. Durch die gesteigerte Permeabilität gelangen Plasmaproteine in die extrazelluläre Matrix (EZM), die später ein Leitgerüst für die migrierenden Endothelzellen bilden (CARMELIET 2000). Um jedoch einen übermäßigen Übertritt von Plasmaproteinen in die extrazelluläre Matrix zu verhindern, fungiert Angiopoetin 1 (Ang1) mit dem dazugehörigen Rezeptor Tie2 als Anti-Permeabilitätsfaktor (THURSTON et al. 2000).
Im Weiteren werden ruhende Endothelzellen des bestehenden Gefäßes aktiviert, sie übernehmen die Rolle von „tip cells“, die die umliegenden Endothelzellen inhibieren. In der Maus-Retina konnte gezeigt werden, das diese laterale Hemmung über die Expression von Delta-like-4 Liganden (DLL4) in „tip cells“ und die Aktivierung des Notch 1-Signalweges in den ruhenden Zellen erfolgt (HELLSTRÖM et al. 2007). Die Aktivierung von Endothelzellen zu „tip cells“ wird durch pro-angiogen wirkende Wachstumsfaktoren hervorgerufen. Zu diesen Wachstumsfaktoren gehört VEGF, welches Mitosen in arteriellen und venösen sowie lymphatischen Endothelzellen induziert (FERRARA u. HENZEL 1989;
PLOUËT et al. 1989). Auch werden Endothelzellen durch FGF aktiviert, hier sind vor allem der FGF1 und 2 zu nennen (GOSPODAROWICZ et al. 1986). Aktivierte Endothelzellen durchlaufen einige Veränderungen, die sie befähigen, in die Richtung des pro-angiogenen Stimulus zu migrieren. Dazu zählen die Sekretion von Proteasen, die die subendotheliale Basalmembran degradieren, und die Ausbildung von Filopodien. Des Weiteren wird die apiko-basale Polarität der Endothelzellen umgekehrt, da Gefäßsprosse grundsätzlich von der basalen Seite der Endothelzellschicht ausgehen (ADAMS u. ALITALO 2007). An der Basis des durch die migrierenden Endothelzellen entstehenden Gefäßsprosses proliferieren weitere Endothelzellen, um eine ausreichende Menge an Zellen für den entstehenden Gefäßspross zur Verfügung zu stellen. Nicht nur die Aktivierung der Endothelzellen, sondern auch die Migration und Proliferation werden durch Wachstumsfaktoren, wie VEGF, gesteuert. Es konnte im Rahmen des Aortic Ring Assays der Ratte gezeigt werden, dass die Migration von „tip cells“ entlang eines
Konzentrationsgradienten von VEGF-A, einer Form des VEGF, erfolgt, wohingegen die Proliferation der Endothelzellen durch die Konzentration des lokal vorhandenen VEGF-A gesteuert wird (GERHARDT et al. 2003). In einigen Fällen wird das entstehende Gefäß in die Richtung eines bereits bestehenden oder sich ebenfalls entwickelnden Gefäßes geleitet, so dass eine Fusion von gegenüberliegenden „tip cells“ erfolgt. Es wird vermutet, dass die Vermittlung über Adhäsionsmoleküle wie VE-Cadherin oder PECAM1 erfolgt (RAMJAUN u.
HODIVALA-DILKE 2009).
In einem weiteren Schritt wird die Lumenbildung des entstehenden Gefäßes vollzogen. In verschiedenen in vitro Modellen und in vivo bei Ratte und Kaninchen konnte gezeigt werden, dass dieser Prozess durch Pinozytose mehrerer Vesikel erfolgt, die im Zytoplasma zu einer Vakuole verschmelzen. Nach Exozytose der Vakuole bildet die Endothelzelle zwischen den entstandenen Zytoplasmafortsätzen Zellverbindungen aus, so dass ein Lumen entsteht. Die Zell-Matrix-Interaktionen werden dabei durch Integrine vermittelt, die Signaltransduktion innerhalb der Zelle erfolgt über Rho-GTPasen (DAVIS u. BAYLESS 2003).
Die weitere Entwicklung des Gefäßes beinhaltet auch die Differenzierung des Gefäßes zu einer Arterie, Vene oder Kapillare. Hierbei muss zwischen der embryonalen Entwicklung und Vorgängen im adulten Organismus unterschieden werden (JAIN 2003). Arterien zeichnen sich durch eine Anlagerung von glatten Muskelzellen, extrazellulärer Matrix und elastischen Fasern um das Primitivgefäß aus, wohingegen Venen durch die Bildung von Klappen innerhalb des Lumens und eine vergleichsweise sehr dünne Schicht glatter Muskelzellen charakterisiert sind (ADAMS u. ALITALO 2007). Die molekularen Signale, die die Anlagerung spezifischer periendothelialer Zellen dabei bestimmen, sind noch weitestgehend unbekannt. Dennoch übernehmen periendotheliale Zellen und die das Gefäß umgebende EZM wichtige Funktionen in Bezug auf die funktionelle und strukturelle Unterstützung des Gefäßes. Zum einen schützen die umgebenden Zellen das Endothel vor Regression, falls angiogene Faktoren in nur begrenzter Menge vorhanden sein sollten. Zum anderen mobilisieren sie angiogene
Wachstumsfaktoren und vermitteln interzelluläre Signale (BENJAMIN et al. 1998;
CONWAY et al. 2001).
Notwendig zur Entstehung des Gefäßsprosses ist zudem eine Umgestaltung der Basalmembran des bestehenden Gefäßes und der extrazellulären Matrix (EZM), so dass Endothelzellen losgelöst und zur Migration befähigt werden. Dies erfolgt durch Proteasen wie Matrixmetalloproteinasen (MMP) und Urokinase-Typ Plasminogen Aktivator (uPA) und deren Inhibitoren (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases, TIMP, und Plasminogen Aktivator Inhibitor) (JAIN 2003). Für Angiopoetin 2, einem weiteren Liganden des Tie2 Rezeptors, konnte gezeigt werden, dass dessen angiogene Wirkung zu einem Teil über eine gesteigerte Sekretion von MMP2, 3 und 9 durch die Endothelzellen und einer Unterdrückung von TIMP2 erreicht wird (KIM et al. 2000a). Durch den Abbau der EZM wird nicht nur die Dichte vorhandener Matrixmoleküle herabgesetzt, sondern werden auch Bindungsstellen einzelner Matrixmoleküle freigelegt, so dass eine gesteigerte Migration der Endothelzellen erfolgen kann (XU et al. 2001).
2.5 Die Regulation der plazentaren Angiogenese
Die Regulation der plazentaren Angiogenese unterliegt einer Vielzahl von Einflüssen (ZYGMUNT et al. 2003). Im Folgenden wird nun der Fokus auf die Regulation des Angiogenese-Prozesses durch Trophoblastzellen und deren spezifische Produkte gelegt.
In der Plazenta der Maus gelangt das maternale arterielle Blut über Kanäle in den fetalen Anteil der Plazenta. Hier erfolgt ein Abbauvorgang des Gefäßendothels, so dass das Blut nunmehr durch eine Trophoblastzellschicht begrenzt ist (ADAMSON et al. 2002). Basierend auf zahlreichen Untersuchungen gilt es als wahrscheinlich, dass der Umbau der aus dem maternalen in den fetalen Bereich eintretenden Blutgefäße durch die parakrine Abgabe von TGC-spezifischen Substanzen reguliert wird (CROSS et al. 2002). Dies konnte an Mäusen bestätigt werden, die eine Mutation des Gens Esx1 trugen, bei dem es sich um eine Homeobox DNA- Sequenz handelt, die in Trophoblastzellen der Chorionplatte und des Labyrinths
exprimiert wird. Die Mutanten wiesen eine gestörte Morphogenese des Labyrinths sowie abnormal ausgebildete Gefäße in diesem Bereich auf. Es wurde gefolgert, dass die Transkription des Esx1-Gens und die anschließende parakrine Abgabe der entsprechenden Substanzen für eine vollständige Morphogenese und die Ausbildung der plazentaren Blutgefäße notwendig sind (LI u. BEHRINGER 1998).
Die TGC der Maus exprimieren auto- und parakrin wirksame Substanzen, wie VEGF (VOSS et al. 2000) und Proliferin (LEE et al. 1988). Auch wurde plazentares Laktogen nachgewiesen (FARIA et al. 1991), für das ein Einfluss auf die Angiogenese ebenfalls vermutet wird (siehe Kapitel 2.5.1.4). Neben den pro- angiogenen Faktoren sezernieren die TGC der Maus auch vasodilatativ wirkende Faktoren, wie NO (GAGIOTI et al. 2000) oder Thrombomodulin (WEILER- GUETTLER et al. 1996). In unmittelbarer Umgebung der TGC wurde auch die Expression anti-angiogener Faktoren nachgewiesen. Dazu gehört das Flt1-Gen, welches durch alternatives Spleißen auch in löslicher Form besteht (sFlt1) und in der Spongiotrophoblastzellschicht nachgewiesen werden konnte. Lösliches Flt1 antagonisiert pro-angiogene Effekte, in dem es zirkulierendes VEGF bindet (HE et al. 1999).
Auch Studien an der Plazenta des Menschen liefern Ergebnisse, die deutlich auf eine trophoblastäre Regulation der plazentaren Angiogenese hinweisen. Durch die Verwendung Trophoblasten-konditionierter Medien gelang es in mehreren Untersuchungen, die pro-angiogene Wirkung trophoblastärer Produkte nachzuweisen. HAMAI et al. (1998) wiesen nicht nur FGF2 in humanen Trophoblastzellen mit immunhistochemischen Methoden nach, sondern zeigten auch seine pro-angiogene Wirkung durch die Stimulation humaner mikrovaskulärer Endothelzellen mit konditioniertem Medium, in dem das Vorhandensein von FGF2 nachgewiesen worden war. Auch verwendeten ZHOU et al. (2003) Trophoblast- konditioniertes Medium, um sowohl in vitro an mikrovaskulären Endothelien, wie auch in vivo unter Verwendung des Chorioallantois-Membran (CAM) Assay pro- angiogene Wirkungen von Ang2, dem plazentaren Wachstumsfaktors (PlGF) und VEGF-C nachzuweisen. SCHIESSL et al. (2009) zeigten an Plazentabiopsien, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Schwangerschaft entnommen wurden, das
Vorhandensein von angiogenen Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren mittels Immunhistochemie. Auch in der humanen Plazenta erfolgt ein Umbauvorgang der uterinen Gefäße durch die Invasion von Trophoblastzellen (PIJNENBORG et al.
2006). Vor diesem Hintergrund ist der Nachweis von VEGF-A und VEGF-C in endovaskulären Trophoblastzellen der frühen Schwangerschaft interessant, der einen Zusammenhang zwischen diesen Faktoren und dem Umbau der Spiralarterien nahe legt (SCHIESSL et al. 2009), da die Gefäßpermeabilitäts- steigernden Eigenschaften dieser Isoformen bekannt sind (CAO et al. 2004). Auch konnte Ang2 in gefäßnahen Trophoblastzellen nachgewiesen werden, der korrespondierende Rezeptor Tie2 wurde in Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen lokalisiert (SCHIESSL et al. 2009). Da Ang2 destabilisierend auf die Gefäßstruktur wirkt (DISTLER et al. 2003), folgern die Autoren, dass dieser Faktor den veränderten Zustand der Spiralarterien während der Schwangerschaft aufrechterhält.
Neben der Regulation durch TGC-spezifische Faktoren unterliegt die plazentare Angiogenese zahlreichen weiteren Einflussfaktoren. Im Folgenden wird auf einige dieser Faktoren eingegangen.
In diesem Zusammenhang ist der Einfluss der EZM zu nennen, die während der Angiogenese einen Um- und Abbauprozess durch Enzyme erfährt. Durch diese Umbauprozesse werden matrixgebundene, angiogen wirksame Wachstumsfaktoren freigesetzt, die sich wiederum positiv auf die Bildung des Gefäßsprosses auswirken. Zu den freigesetzten Faktoren zählen FGF2 (RIBATTI et al. 1999) und VEGF (PARK et al. 1993). Auch führt der Umbau der EZM zur Loslösung von anti-angiogen wirksamen Matrixmolekülen wie Thrombospondin 1 und 2 (GOOD et al. 1990; STREIT et al. 1999). Ebenso wirken Spaltprodukte dieser Matrixmoleküle anti-angiogen, hierzu zählt auch Tumstatin, ein Bestandteil des Kollagen VXIII (MAESHIMA et al. 2000). Wichtig ist zudem die Interaktion zwischen Bestandteilen der EZM und Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche der Endothelzellen. Diese Interaktionen ermöglichen, dass aus der EZM stammende Signale in das Zellinnere übertragen werden und so zelluläre Prozesse, wie die Migration, reguliert und moduliert werden. Dies konnte in einer
Studie gezeigt werden, die Notwendigkeit der Interaktion zwischen Fibronektin und Integrin α5β1 sowie Integrin αvβ3 für die Migration von humanen Endothelzellen der Nabelvene beschreibt (KIM et al. 2000b). Auch sind in diesem Zusammenhang die Syndekane, eine weitere Gruppe von Transmembranproteinen, zu nennen.
Syndekan 1, ein Transmembran-Glykoprotein, welches von Endothelzellen exprimiert wird, fungiert als Korezeptor für FGF2 (FILLA et al. 1998).
Auch ist die Gewebshypoxie ein Modulator der plazentaren Angiogenese. Dies konnte für die Plazenta des Menschen und des Meerschweinchens nachgewiesen werden (BACON et al. 1984; SCHEFFEN et al. 1990; RESHETNIKOVA et al.
1994). Ein Mangel an Sauerstoff führt zu einer gesteigerten Expression von VEGF und dessen Rezeptoren, sowie weiteren in der Angiogenese involvierten Genen.
Der Transkriptionskomplex Hypoxie-induzierter Faktor (HIF) verstärkt dabei die Expression dieser Gene (SEMENZA 2000).
Auch unterliegt die plazentare Angiogenese hormonellen Einflüssen. Dieser Zusammenhang konnte für das humane Choriongonadotropin (hCG), einem Glykoprotein, bestätigt werden, welches pro-angiogen wirksam ist und in Trophoblastzellen detektiert werden konnte (ZYGMUNT et al. 2002; HERR et al.
2007). Der Stoffgruppe der Glykoproteine gehören auch die PAG an, die ebenfalls in den zytoplasmatischen Granula der TGC des Rindes lokalisiert wurden (ZOLI et al. 1992). Die PAG sind dem Choriongonadotropin strukturell sehr ähnlich. Da das humane Choriongonadotropin eine angiogene Wirksamkeit zeigte (HERR et al.
2007), werden auch für die PAG pro-angiogene Effekte vermutet.
In der bovinen Plazenta, beziehungsweise in den TGC, wurden bereits potentielle Regulatoren der plazentaren Angiogenese, sowie deren Rezeptoren, identifiziert.
Der Verdacht liegt nahe, dass die Regulation der plazentaren Angiogenese des Rindes, ähnlich wie bei Mensch und Maus, dem Trophoblasten und seinen spezifischen Produkten unterliegt.
2.5.1 Regulatoren
Nachfolgend wird auf potentielle Regulatoren der plazentaren Angiogenese des Rindes eingegangen, die im Rahmen der durchgeführten Versuche verwendet wurden (siehe Kapitel 3.1.7).
2.5.1.1 Vascular Endothelial Growth Factor
Die Familie des Gefäßendothel-Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) umfasst mehrere Mitglieder, zu denen VEGF-A, oft als VEGF bezeichnet, VEGF-B, -C, -D, und -E sowie der plazentare Wachstumsfaktor (Placenta Growth Factor, PlGF) gehören. Beim Mensch konnten sechs Isoformen des VEGF (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189, VEGF206) nachgewiesen werden, die durch alternatives Spleißen eines Gens entstehen. Die Isoformen stehen als frei verfügbare Proteine oder nach Aktivierung und Spaltung durch Proteasen zur Verfügung, zudem weisen sie unterschiedliche biologische Eigenschaften auf (FERRARA 2001; ROBINSON u. STRINGER 2001).
Die biologischen Effekte des VEGF sind vielfältig. VEGF induziert Mitosen von arteriellen, venösen und lymphatischen Endothelzellen (FERRARA u. HENZEL 1989; PLOUËT et al. 1989). Plazentare Endothelzellen zeigten nach Stimulation mit VEGF nicht nur eine gesteigerte Proliferation und Migration, sondern auch eine Bildung von dreidimensionalen Gefäßvorläufern im Rahmen des Tube Formation Assays (LIAO et al. 2009; LIAO et al. 2010). Auch in weiteren in vitro Assays, wie zum Beispiel dem Rat Aortic Ring Assay, konnte die Bildung gefäßähnlicher Strukturen nach Stimulation mit VEGF erreicht werden (NICOSIA et al. 1994).
Daneben wirkt VEGF der Apoptose von Endothelzellen entgegen. So konnte gezeigt werden, dass VEGF in humanen Endothelzellen die Expression der anti- apoptotischen Proteine Bcl-2 und A1 induziert (GERBER et al. 1998). Zudem fördert VEGF die Expression endothelialer Proteasen, wie Plasminogen- Aktivatoren und interstitiellen Kollagenasen. Wie bereits angeführt (Kapitel 2.4) bauen diese Proteasen EZM-Moleküle ab, so dass dadurch aus dem Zellverband gelöste Endothelzellen im Rahmen des Angiogenese-Prozesses zur Migration und Proliferation befähigt werden (PEPPER et al. 1991; UNEMORI et al. 1992). VEGF vermittelt eine erhöhte Gefäßpermeabilität, so dass während des Angiogenese- Prozesses Plasmaproteine in die extrazelluläre Matrix gelangen und eine Leitstruktur für migrierende Endothelzellen bilden (ROBERTS u. PALADE 1995).
VEGF ist auch an einem weiteren elementaren Schritt der Angiogenese beteiligt.
MATA-GREENWOOD et al. (2010) wiesen nach, dass VEGF die Produktion von
Stickstoffmonoxid (NO) in arteriellen Endothelzellen der Schafplazenta induziert.
NO gilt als potenter Vasodilatator und angiogener Faktor in der Plazenta des Schafes (ZHENG et al. 2006).
Die Regulation der VEGF-Genexpression wird durch mehrere Mechanismen reguliert. Hypoxische Zustände des Gewebes führen zu einer gesteigerten mRNA- Expression von VEGF, die über HIF vermittelt wird. Dies wurde durch zahlreiche Studien an verschiedenen Zelltypen in vivo und in vitro gezeigt. Beispielsweise führte der Verschluss einer Koronararterie am porzinen Herzen zu einer gesteigerten mRNA Expression für VEGF im Myokard (BANAI et al. 1994). Auch wird die Expression von VEGF über verschiedene Zytokine und Wachstumsfaktoren reguliert. Von SEGHEZZI et al. (1998) wurde an Endothelzellen gezeigt, dass FGF2 zur einer gesteigerten Expression von VEGF führt. Die Genexpression von VEGF kann auch durch Zelldifferenzierungs- und Transformationsprozesse reguliert werden. In Granulosazellen des Rindes führte eine in vitro Stimulation mit dem luteinisierenden Hormon (LH) zu einer vermehrten VEGF-Expression auf mRNA-Ebene (GARRIDO et al. 1993).
Die biologischen Wirkungen der VEGF-Familie werden über die Bindung an VEGF- Rezeptoren (VEGFR) vermittelt, wobei drei unterschiedliche Rezeptoren vorkommen: VEGFR1 (Flt1), VEGFR2 (Flk1/ KDR) und VEGFR3 (Flt4). Bei diesen Rezeptoren handelt es sich um Rezeptor-Tyrosinkinasen, die sich durch sieben extrazelluläre Immunglobulin-ähnliche Domänen, eine Transmembranregion und eine intrazelluläre Tyrosinkinase-Domäne, die durch eine Insert-Sequenz unterbrochen wird, auszeichnen (SHIBUYA et al. 1990; TERMAN et al. 1991;
KARKKAINEN et al. 2002). Der VEGFR2 wird im Dottersack, im intraembryonalen Mesoderm, im Endokard sowie in mikro- und makrovaskulären Endothelzellen exprimiert. Zudem ist es wahrscheinlich, dass die Expression des VEGFR2 in adulten Endothelzellen geringer ist als in Endothelzellen fetalen Ursprungs (MILLAUER et al. 1993; QUINN et al. 1993). Die Expression des VEGFR1 erfolgt durch fetale und adulte Endothelzellen, die ruhen oder proliferieren (PETERS et al.
1993). VEGFR3 findet sich auf der Oberfläche lymphatischer Endothelzellen (TAIPALE et al. 1999). Ein weiterer VEGF-bindender Rezeptor-Typ ist
Neuropilin-1, ein Glykoprotein, welches in Endothelzellen und Tumorzellen nachgewiesen werden konnte (SOKER et al. 1998).
Die Signaltransduktion für VEGR1 und 2 verläuft innerhalb der Zelle über eine Autophosphorylierung der Rezeptor-Tyrosinreste, wobei der VEGFR2 dabei eine höhere Effizienz aufweist. Es konnte an porzinen Endothelzellen gezeigt werden, dass durch die Bindung von VEGF an VEGFR2 Signale für Mitogenität, Chemotaxis, Aktin-Reorganisation und Veränderungen in der Morphologie vermittelt werden. Für VEGFR1 war dies nicht der Fall, obwohl dieser Rezeptor im Vergleich zu VEGFR2 eine höhere Bindungsaffinität für VEGF aufwies (WALTENBERGER et al. 1994). Genetisch modifizierte Mäuse, denen die Tyrosinkinase-Domäne des VEGFR1 Rezeptors fehlte, zeigten trotzdem typische, durch VEGF induzierte Reaktionen, so dass gefolgert werden kann, dass der VEGFR1 vor allem eine VEGF-bindende Funktion übernimmt und die biologischen Effekte des VEGF über den VEGFR2 vermittelt werden (HIRATSUKA et al. 1998).
Neuropilin-1 fungiert als Isoform-spezifischer (VEGF165) Korezeptor, der die Bindung von VEGF165 an VEGFR2 fördert und somit die biologische Wirkung von VEGF165 potenziert. Dieser Rezeptor ist identisch mit dem humanen neuronalen Rezeptor Neuropilin-1 der Collapsin/Semaphorin-Familie (SOKER et al. 1998).
Die Signalwege, die von den VEGFR genutzt werden, sind zahlreich. Biologische Effekte werden dabei hauptsächlich über VEGFR2 vermittelt. Nach der Phosphorylierung der Tyrosinreste kommt es zur Bindung von Docking-Proteinen, die die Signalwege in der Zelle weiter vermitteln. Eine gesteigerte Proliferation wird beispielsweise über den Signalweg der p42/44 Mitogen-aktivierten Protein Kinase (MAPK) vermittelt (KANNO et al. 2000; WU et al. 2000). Über den Signalweg der p38 MAPK wird nicht nur die Zellmigration gesteuert, sondern erfolgt auch eine Reorganisation des Zytoskeletts (ROUSSEAU et al. 1997).
Ein Vorkommen von VEGF in der Plazenta konnte für den Menschen und einige Tierarten nachgewiesen werden. In der hämochorialen Plazenta des Menschen ist VEGF im Zyto- und Synzytiotrophoblasten sowie im extravillösen Trophoblasten lokalisiert (JACKSON et al. 1994b; AHMED et al. 1995; CLARK et al. 1996;
SHIRAISHI et al. 1996). Die pro-angiogene Wirkung von VEGF-C, welches von
Zytotrophoblastzellen sekretiert wird, wurde an humanen mikrovaskulären Endothelzellen in vitro und unter Verwendung des CAM Assay nachgewiesen (ZHOU et al. 2003).
In der synepitheliochorialen Plazenta des Rindes war es möglich, VEGF sowie VEGFR1 und 2 mittels immunhistologischer Methoden (polyklonale Antikörper) zu lokalisieren (PFARRER et al. 2006b). Während der Implantationsphase ließ sich VEGF und der VEGFR1 in Blutgefäßen des maternalen Kompartiments nachweisen, so dass VEGF eine Bedeutung für die Angiogenese während der Implantation und der Plazentation zugeschrieben wird. Bis zur Mitte der Trächtigkeit wurde VEGF in den fetalen Blutgefäßen und im Bindegewebe der maternalen Septen nachgewiesen. In der späteren Trächtigkeit dagegen wurde die VEGF Immunreaktion im maternalen Stroma schwächer. Der Nachweis des VEGFR1 und 2 erfolgte durchgehend im maternalen Gefäßsystem, wohingegen im fetalen System ausschließlich VEGFR2 lokalisiert werden konnte. Daraus resultierend wird angenommen, dass VEGF im späteren Trächtigkeitsstadium spezifische Funktionen, wie zum Beispiel die Regulation der Gefäßpermeabilität, übernimmt. Zudem lässt die Lokalisation von VEGF und den korrespondierenden Rezeptoren vermuten, dass die TGC durch die parakrine Abgabe von VEGF die plazentare Angiogenese beeinflussen. Neben der potentiell pro-angiogenen Wirkung von VEGF in der bovinen Plazenta, wird diesem Faktor auch ein Einfluss auf die Reifung und das Wachstum mononukleärer Trophoblastzellen sowie der Plazentome zugesprochen (PFARRER et al. 2006b).
Auf Basis der nachgewiesenen Lokalisation des VEGF-Systems in der bovinen Plazenta und der pro-angiogenen Wirkung des VEGF, ist dieser Faktor ein potentieller Regulator der plazentaren Angiogenese des Rindes.
2.5.1.2 Fibroblasten-Wachstumsfaktoren
Die Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (Fibroblast Growth Factors, FGF) umfasst mindestens 22 Mitglieder, von denen circa 16-65% in ihrer primären Sequenz, die 120 Aminosäuren umfasst, identisch sind. Die FGF lassen sich in Subfamilien unterteilen. Für den Menschen beispielsweise erfolgte auf Basis
phylogenetischer Analysen eine Unterteilung in 7 Subfamilien (ESWARAKUMAR et al. 2005; YUN et al. 2010).
FGF entfalten ihre biologischen Wirkungen, welche im Rahmen der Mitogenese, der Zellmigration und -differenzierung, der Angiogenese und der Wundheilung von Bedeutung sind, durch die Bindung an spezifische Rezeptoren (FGFR). Bei Mensch und Maus wurden vier FGFR identifiziert (FGFR1, 2, 3, 4), die auf unterschiedlichen Zelltypen exprimiert sind und bei denen es sich um in der Zellmembran lokalisierte Rezeptor-Tyrosinkinasen handelt. Endothelzellen unterschiedlichen Ursprungs exprimierten in vitro vor allem FGFR1, seltener auch FGFR2 (BASTAKI et al. 1997; NAKAMURA et al. 2001). Diese Rezeptoren setzten sich aus einer extrazellulären Ligandenbindungs-Domäne in Form von drei Immunglobulin-Domänen (IgI, II, III), einer Transmembrandomäne und einer gespaltenen intrazellulären Tyrosinkinase-Domäne zusammen (JAYE et al. 1992).
FGF weisen eine Vielfalt biologischer Wirkungen auf und nehmen Einfluss auf zahlreiche unterschiedliche Zelltypen. Diese Diversität wird über unterschiedliche Typen der FGFR erreicht, die entweder durch Spleiß-Varianten eines gegebenen FGFR-Gens oder durch die Expression verschiedener FGFR-Gene entstehen (POWERS et al. 2000).
Die FGF weisen eine hohe Affinität zu Heparansulfatproteoglykanen (HSPG) auf, welche entweder auf Zelloberflächen oder in der extrazellulären Matrix lokalisiert sind. Durch die Bindung dieser Wachstumsfaktoren an HSPG entsteht ein Reservoir an FGF in der EZM. Enzyme, wie die Heparanase, können die Wachstumsfaktoren freisetzten, so dass sie ihre biologische Wirkung entfalten (VLODAVSKY et al. 1991). Zudem wirken HSPG als Korezeptoren modulierend für die FGF. Als Beispiel ist Syndekan 1 anzuführen, dass auf der Endothelzelloberfläche als Korezeptor für FGF2 fungiert (FILLA et al. 1998).
Nach Bindung an den FGFR erfolgt die Signalweiterleitung innerhalb der Zelle über verschiedene Wege. Der RAS/ MAPK Weg ist dabei der wichtigste Weg, über den Wirkungen der FGF vermittelt werden (YUN et al. 2010). Initiiert wird der RAS/MAPK Weg, über den Signale für Zellwachstum und Differenzierung vermittelt werden, durch den Docking-Protein-FGFR-Substrat-Komplex 2α (FRS2α), welcher
wiederum Proteine auf direktem oder indirektem Weg rekrutiert (LAX et al. 2002;
WONG et al. 2002). Ein zweiter Signalweg, der Phosphoinositid 3 (PI3) Kinase/
anti-apoptotischer Protein Kinase (AKT) Weg, wird ebenfalls durch einen FRS2 Komplex initiiert (LAMOTHE et al. 2004). Über diesen Signalweg werden Signale für das Zellüberleben und die Apoptose vermittelt (KATOH u. KATOH 2006). Der dritte Signalweg, über den Wirkungen der FGF vermittelt werden, ist der Phospholipase Cγ (PLCγ) Weg, dessen Funktion bislang nicht geklärt ist, da er weder die Mitogenese, noch die Zelldifferenzierung beeinflusst (MOHAMMADI et al. 1991; PETERS et al. 1992; SPIVAK-KROIZMAN et al. 1994).
Die FGF regulieren und modulieren verschiedene Schritte des Angiogenese- Prozesses (siehe dazu auch Kapitel 2.4). Die Behandlung mit FGF1 führte zu einer gesteigerten Proliferation mikrovaskulärer, aus der Plazenta stammender Endothelzellen und erhöhte zudem die Permeabilität dieser Zellen (DYE et al.
2001). Die Migration der Endothelzellen während der Angiogenese wird durch die chemotaktisch wirksamen Faktoren FGF1 und 2 beeinflusst (TERRANOVA et al.
1985; STOKES et al. 1990). Zudem konnte in vitro gezeigt werden, dass FGF2 morphogenetische Veränderungen der Endothelzellen bewirkt, so dass sich diese zu gefäßähnlichen Strukturen anordnen (MONTESANO et al. 1986). Auch wird FGF2 eine Beeinflussung der im Rahmen der Angiogenese notwendigen Adhäsionsmoleküle, wie Integrin αvβ3, zugeschrieben (SEPP et al. 1994). Für FGF7, der auch als Keratinozyten-Wachstumsfaktor bezeichnet und durch mesenchymale Zellen produziert wird, konnten durch den Neovaskularisations- Assay an der Kornea der Ratte pro-angiogene Eigenschaften gezeigt werden.
Zudem steigerte FGF7 das Proliferationsverhalten und die Barrierefunktionseigenschaften boviner mikrovaskulärer Endothelzellen (GILLIS et al. 1999). Durch FGF wird zudem die Produktion von MMP und des uPA in Endothelzellen hochreguliert. Durch diese Enzyme erfolgt der Abbau der extrazellulären Matrix im Rahmen der Angiogenese (PRESTA et al. 2005). Die Überexpression von FGF1 in genetisch modifizierten Endothelzellen führte im Zusammenhang mit einer erhöhten MMP9 Expression zu einer gesteigerten Migration dieser Zellen (PARTRIDGE et al. 2000).
Im weiblichen Reproduktionstrakt konnten Mitglieder der FGF-Familie und deren Rezeptoren nachgewiesen werden. PFARRER et al. (2006a) wiesen in der Plazenta des Rindes das Vorkommen von FGF1, 2, 7 und den Rezeptoren FGFR, FGFR2(IIIb) und FGFR2(IIIc) in unreifen TGC nach, während dies in reifen TGC und in feto-maternalen Hybridzellen nicht der Fall war. Es wird vermutet, dass diese Mitglieder der FGF-Familie durch auto- und parakrine Wirkungswege an der Differenzierung, Migration und restriktiven Invasion der Trophoblastzellen beteiligt sind. Zudem wurden FGF1 und 2 sowie der FGFR im plazentomaren Gefäßsystem und umgebenden Stroma lokalisiert, so dass auch parakrine Wirkungen der TGC auf die plazentare Angiogenese anzunehmen sind. Nicht nur beim Rind, sondern auch beim Schaf, bei dem es sich ebenfalls um einen synepitheliochorialen Plazentatyp handelt, war es möglich, das Vorkommen von Mitgliedern der FGF- Familie nachzuweisen. ZHENG et al. (1997) wiesen FGF2 unter anderem in TGC und Endothelzellen nach, so dass die Autoren auch beim Schaf eine auto- und parakrine Wirkung von FGF2 auf die plazentare Angiogenese vermuten. Diese Untersuchungen stimmen mit Studienergebnissen der humanen Plazenta überein.
FERRIANI et al. (1994) wiesen mit immunhistologischen Methoden das Vorhandensein von FGF1 und 2 in im Zytotrophoblasten nach. Im ersten Drittel der Trächtigkeit zeigten Antikörper für FGF1 und 2 starke Färbereaktionen, die aber bis zum Zeitpunkt der Geburt abnahmen. Endothelzellen und Blutgefäße zeigten ebenfalls starke Färbereaktionen für FGF1 und 2.
Auch am bovinen Ovar wurden Mitglieder der FGF-Familie detektiert und deren Vorkommen mit der Angiogenese in Zusammenhang gebracht. Mittels molekularbiologischer Untersuchungsmethoden konnte das Vorhandensein von FGF1 und 7 sowie des FGFR2(IIIb) in Follikeln nachgewiesen werden. Dabei wurden die untersuchten Follikel verschiedenen Maturationsstadien zugeordnet:
vor dem LH Anstieg, zwischen dem Anstieg von LH und der Ovulation und in der frühen Gelbkörperphase. Die Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass FGF1 und 7 maßgeblich an der Angiogenese im Rahmen der Gelbkörperentwicklung beteiligt sind (BERISHA et al. 2006).
Vor diesem Hintergrund sind FGF1, 2, 4, und 7 als Mitglieder der FGF-Familie interessante Kandidaten im Hinblick auf die Regulation der plazentaren Angiogenese des Rindes und wurden deshalb im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen verwendet.
2.5.1.3 Insulinähnliche Wachstumsfaktoren
Die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren 1 und 2 (Insulin-like Growth Factors, IGF) sind Mitglieder der IGF-Peptidfamilie, der insgesamt mindestens zehn strukturähnliche Proteine angehören. Unter diesen weisen IGF1 und 2 eine hohe Homologie (>50%) zu Insulin auf. Im Allgemeinen wird den IGF eine wichtige Funktion in Bezug auf das somatische Zellwachstum und die Zellproliferation zugesprochen (MONZAVI u. COHEN 2002; COHEN 2006). Die Aminosäuresequenz des IGF1 entspricht der Sequenz des humanen IGF1, wohingegen sich bei IGF2 drei der 67 Aminosäuren zum humanen IGF2 unterscheiden (HONEGGER u. HUMBEL 1986). Die Produktion von IGF1 unterliegt verschiedenen Einflüssen, zu denen vorrangig die Wirkung des Wachstumshormons (Growth Hormon, GH), aber auch von Östrogenen und Glukokortikoiden zählen. Das Vorhandensein von IGF2 unterliegt einem schwächeren Einfluss von GH (COLLETT-SOLBERG u. COHEN 2000).
Die Wirkung von IGF1 und 2 wird durch die Bindung an korrespondierende Rezeptoren entfaltet (IGFR1 und 2). Der IGFR1 befindet sich auf zahlreichen Zelltypen und bindet IGF1 und 2 mit hoher Affinität. Nach der Ligandenbindung erfolgt die Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinase und konsekutiv wird das Signal in das Zellinnere weiter geleitet, unter anderem durch die Phosphorylierung von Proteinen der IRS-Familie (HOLZENBERGER et al. 2004; COHEN 2006). Der IGFR2 bindet neben IGF2 auch Mannose-6-haltige lysosomale Enzyme und Retinsäure, wohingegen die Affinität zu IGF1 sehr gering bis nicht vorhanden ist (SCOTT u. FIRTH 2004). IGFR2 wird vor allem im Zellinneren in den Bereichen des Golgi-Apparates sowie in Endo- und Lysosomen exprimiert (CHAKRABORTY et al. 2002).
Im Plasma zirkulieren insulinähnliche Wachstumsfaktoren größtenteils in gebundener Form. Diese Bindungsproteine (IGFBP1-6) verlängern nicht nur die
Halbwertszeit von IGF1 und 2, sondern transportieren diese auch zu ihren Zielzellen und modulieren die Interaktion zwischen ihnen und den IGFR (MONZAVI u. COHEN 2002). Zumeist fungieren die IGFBP als Inhibitoren der IGF, jedoch können einige dieser Bindungsproteine die Wirkung der IGF verstärken, in dem sie die Bindung an den Zielzellrezeptor fördern (WETTERAU et al. 1999; COLLETT- SOLBERG u. COHEN 2000).
Die biologischen Wirkungen der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren sind zahlreich. Neben einer blutzuckersenkenden Wirkung und einer Bedeutung in der Tumorbiologie (Vermittlung anti-apoptotischer Signale), sind diese Faktoren für das fetale und plazentare Wachstum von zentraler Bedeutung (COHEN 2006). In einer Studie am Tiermodell zeigten BEHRINGER et al. (1990), dass IGF1 eine zentrale Bedeutung für das fetale Wachstum zukommt. Die Verpaarung von GH-defizienten mit IGF1-transgenen Mäusen führte zu Nachkommen mit normalem Körpergewicht und linearem Wachstum. Zudem traten GH-unabhängige IGF1-Effekte auf, wie zum Beispiel ein höheres Volumen des Gehirns, welches die stärkere Bedeutung von IGF1 im Vergleich zu GH unterstrich. Mäuse, die eine Defizienz des IGF1- Gens aufwiesen, zeigten ein geringes Geburtsgewicht und waren nur eingeschränkt lebensfähig. Die Plazenta wies jedoch ein normales Gewicht auf (LIU et al. 1993). IGF2-defiziente Mäuse ließen eine reduzierte Gewichtsentwicklung und ein verringertes Plazentagewicht erkennen. Diese Tiere waren im Gegensatz zu IGF1-defizienten Mäusen lebensfähig und zeichneten sich post partum durch eine normale Gewichtsentwicklung aus. Es kann gefolgert werden, dass IGF2 eine große Bedeutung für das plazentare Wachstum und folglich für das fetale Gewicht hat. Jedoch ist IGF2 für das postpartale Wachstum, im Gegensatz zu IGF1, nicht zwingend notwendig (DECHIARA et al. 1990; BAKER et al. 1993; MONZAVI u. COHEN 2002).
In der Plazenta des Rindes gelang es bereits, Mitglieder des IGF-Systems nachzuweisen. ROBINSON et al. (2000) zeigten das Vorkommen während des Sexualzyklus und in der Phase der frühen Trächtigkeit. Die stärkste Expression von IGF1 fand sich im subepithelialen Stroma des Endometriums, wohingegen IGF2 vorrangig im karunkulären Stroma exprimiert wurde. Der IGFR1 wurde an
Tag 16 der Trächtigkeit in tiefen Drüsen des Endometriums, dem karunkulären Stroma und im Myometrium lokalisiert. Die Expression der IGFBP1-3 wurde durch die Anwesenheit des Embryos modifiziert, zudem änderte sich IGFBP1-Expression auch im Verlauf des normalen Zyklus. In einer weiteren Studie, die von RICHTERICH (2009) durchgeführt wurde, wurde das Vorkommen von Mitgliedern des IGF-Systems in Plazentomen des Rindes von Tag 50 der Trächtigkeit bis zur Geburt untersucht. Auf mRNA-Ebene war IGF1 am stärksten im ersten Drittel der Trächtigkeit exprimiert und konnte vor allem in den Karunkeln lokalisiert werden.
Im Gegensatz dazu war IGF2 vornehmlich in den Kotyledonen zu finden, wo die Expression im Trächtigkeitsverlauf kontinuierlich anstieg. Der IGFR1 wurde gleichmäßig im fetalen und maternalen Kompartiment detektiert, während der IGFR2 vorrangig in der Karunkel exprimiert wurde. Auf Proteinebene wurden Mitglieder des IGF-Systems (IGF1 und 2, IGFR1 und 2) vor allem in gefäßassoziierten Bereichen nachgewiesen, so dass der Autor einen wichtigen Zusammenhang zwischen den Mitgliedern des IGF-Systems und der Angiogenese in der bovinen Plazenta vermutet. Die Veränderungen in den Expressionsmustern deuten darauf hin, dass die Mitglieder des IGF-Systems im Rahmen der Trächtigkeit aktiv regulatorische Funktionen übernehmen (RICHTERICH 2009).
Auch in der humanen Plazenta gelang es, Liganden des IGF-Systems sowie der IGFBP nachzuweisen. In den Trophoblastzellen wurden sowohl IGF1, wie auch IGF2 nachgewiesen, wobei IGF2 stärker exprimiert war (HAN et al. 1996). In einer weiteren Studie zeigten HERR et al. (2003) die Expression von IGF2 durch Endothelzellen in der Plazenta und wiesen außerdem angiogene Effekte nach, so dass neben einer regulatorischen Funktion im Rahmen der Trophoblastinvasion auch eine Bedeutung für die plazentare Angiogenese besteht.
Durch die Lokalisation der IGF in den Blutgefäßen und ihrer Umgebung, sowie der Detektion dieser Faktoren in den Trophoblastzellen, beziehungsweise TGC, liegt die Vermutung nahe, dass Liganden des IGF-Systems Einfluss auf die plazentare Angiogenese des Rindes nehmen und diese Regulation auch über die parakrine Sekretion der Liganden durch die Trophoblastzellen erfolgt. Deshalb sind IGF1 und 2 als Endothelzellstimulanzien in der vorliegenden Studie verwendet worden.
2.5.1.4 Bovines plazentares Laktogen
Das bovine plazentare Laktogen (bPL) ist ein Glykoprotein-Hormon, das der GH / Prolaktin (PRL)-Genfamilie angehört und in der Plazenta des Rindes sezerniert wird (ALVAREZ-OXILEY et al. 2008). Ihm werden laktogene und somatotrope Eigenschaften zugesprochen (SCHELLENBERG u. FRIESEN 1982; OGREN u.
TALAMANTES 1988). Strukturell besteht das reife bPL aus 200 Aminosäuren, wobei das Signalpeptid 36 Aminosäuren einnimmt. Eine Homologie von 51% in der Aminosäuresequenz besteht zu bovinem PRL (SCHULER et al. 1988). Insgesamt ist das von der Plazenta sezernierte bPL sehr heterogen. Diese Heterogenität wird zum einen durch das Auftreten von gespaltenen bPL-Transkripten hervorgerufen.
Zum anderen unterläuft das bPL post-translationale Glykosylierungsprozesse, wodurch die entstehenden Isoformen zwar die gleiche molekulare Größe, aber unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen (BYATT et al. 1986; BYATT et al.
1990; KESSLER u. SCHULER 1991; TAKAHASHI 2006).
Das bPL bindet an den Prolaktinrezeptor (PRLR) (SCHELLENBERG u. FRIESEN 1982; TAKAHASHI et al. 2001) und an den GH-Rezeptor (STATEN et al. 1993;
TAKAHASHI et al. 2001).
Die Synthese des bPL erfolgt in den TGC der Plazenta, wo ab Tag 30 der Trächtigkeit die korrespondierende mRNA detektiert werden konnte (YAMADA et al. 2002). Das bPL ist in zytoplasmatischen Granula lokalisiert und wird, nach Verschmelzung der TGC mit maternalen Uterusepithelzellen, in das maternale Stroma abgegeben (WOODING u. BECKERS 1987). Die Mechanismen, die die Synthese und Abgabe des bPL regulieren, sind ungeklärt. Beim Schaf wird eine Regulation über Kortisol vermutet, da dieses auch die Anzahl der TGC beeinflusst (WARD et al. 2002; BRAUN et al. 2007). PATEL et al. (1996) untersuchten das Vorkommen von bPL im Plasma tragender Kühe. Ab Tag 60 der Trächtigkeit war dies nachweisbar und stieg kontinuierlich bis Tag 200 bis 220 an, bevor es in eine Plateau-Phase überging. Auch gelang es, bPL im fetalen Kreislauf nachzuweisen, wo die Konzentration höher war als im maternalen Kreislauf (BYATT et al. 1987).
Mehrere Autoren hypothetisieren auf Basis dieser Konzentrationsverhältnisse,
dass das Wirkungsfeld des bPL vorrangig das fetale Kompartiment ist (TAKAHASHI 2006; ALVAREZ-OXILEY et al. 2008).
Im Rahmen der Trächtigkeit übernimmt bPL vielfältige Funktionen. Beispielsweise konnte für rekombinantes bPL an Färsen eine luteotrope Wirkung gezeigt werden, da nach Applikation ein vergrößerter Gelbkörper und erhöhte Plasmaspiegel von Progesteron verzeichnet wurden (LUCY et al. 1994). Auch wird das bPL mit dem fetalen Wachstum in Zusammenhang gebracht. In der Studie von RASBY et al.
(1990) wurden unter anderem bPL-Spiegel im maternalen Plasma und das fetale Wachstum von Kühen mit niedrigem und mittleren Körpergewicht verglichen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied des fetalen Wachstums zwischen den beiden Gruppen, jedoch lagen die bPL-Plasmaspiegel bei Kühen mit niedrigem Körpergewicht höher. Diese Gruppe wies zudem niedrigere Fruktose-Spiegel in der Allantoisflüssigkeit auf, so dass gefolgert wurde, dass bPL bei Nährstoffmangel höhere Verfügbarkeiten vorhandener Nährstoffe vermittelt. Auf Grund der Bindungseigenschaften von PL zum PRL-Rezeptor, werden für PL weitere, dem PRL ähnliche Eigenschaften angenommen, zu denen auch eine Beeinflussung der plazentaren Angiogenese gehört (CORBACHO et al. 2002). STRUMAN et al.
(1999) zeigten für humanes PL (hPL) und PRL (hPRL) pro-angiogene Wirkungen im CAM Assay. Allerdings konnten diese Effekte in vitro an bovinen Endothelzellen, die aus Kapillaren des Gehirns isoliert worden waren, nicht bestätigt werden. In der Studie wurden zudem 16kDa große, N-terminale Spaltprodukte des hPL und hPRL in vivo und in vitro getestet. Diese wirkten im Gegensatz sogar anti-angiogen. In humanen Geweben entstehen diese Spaltprodukte durch Plasmin, Thrombin und Subtilisin (FUKUOKA et al. 1991). Die Autoren schlussfolgerten, dass auf diese Weise sowohl pro- als auch anti- angiogene Eigenschaften der Mitglieder der GH / PRL-Familie vermittelt werden.
Bislang sind für bPL, bPRL oder deren Spaltprodukte keine angiogenesemodulierenden Effekte in bovinen Geweben beschrieben worden.
Jedoch ist das bPL auf Grund seiner Lokalisation in den TGC und der angiogenen Potenz in anderen Spezies, als ein geeignetes Stimulanz für die vorliegenden Versuche eingestuft worden.
2.5.1.5 Epidermaler Wachstumsfaktor
Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) gehört zur gleichnamigen Familie, der auch der Transforming Growth Factor (TGF-α), Amphiregulin, heparin-bindender EGF (HB-EGF), Betacellulin und Epiregulin angehören. Die Mitglieder der EGF- Familie zeichnen sich dadurch aus, dass sie durch proteolytische Abspaltung aus membranständigen Vorläufern entstehen und die gleiche EGF-ähnliche Proteindomäne beinhalten (LEE et al. 1995; XIAN 2007). Biologische Effekte des EGF werden durch die Bindung an den EGF-Rezeptor (EGFR) vermittelt. Bei diesem Rezeptor handelt es sich um ein Transmembran-Glykoprotein mit Tyrosinkinase-Aktivität (CARPENTER et al. 1991; PRIGENT u. LEMOINE 1992).
Durch die Rezeptor-Ligandenbindung werden unterschiedliche intrazelluläre Signalwege aktiviert, zu denen MAPK, PI3K, Akt, p38 und p42/44 MAPK gehören (QIU et al. 2004; ODA et al. 2005; LAMARCA et al. 2008).
Der epidermale Wachstumsfaktor übt mitogene Effekte in nahezu allen Organen des Körpers aus (CASALINI et al. 2004). In verschiedenen Studien konnte die Bedeutung des EGF für die plazentare und fetale Entwicklung gezeigt werden.
Unter anderem zeigten DACKOR et al. (2009) am Mausmodell, dass Veränderungen im EGFR mit reduziertem plazentaren und fetalen Gewicht verbunden sind. Auch wurde eine Korrelation zwischen dem maternalen EGF- Spiegel und dem fetalen Wachstum gezeigt (KAMEI et al. 1999).
In der bovinen Plazenta wurde EGF in vielen Bereichen lokalisiert, während der EGFR in den TGC und im maternalen Epithel zu finden waren (WEISE 2001). Das Vorkommen des EGFR konnte in vitro auch für die Trophoblastzellen des Rindes bestätigt werden (DILLY et al. 2010).
Neben Studien, die eine Funktion des EGF im Rahmen der Trophoblastinvasion in der bovinen Plazenta nahe legen (DILLY et al. 2010; HAMBRUCH et al. 2010), werden auch pro-angiogene Effekte des EGF im Rahmen der plazentaren Angiogenese des Rindes vermutet. Untersuchungen im Bereich des Reproduktionstrakts zeigten bereits die pro-angiogene Potenz des EGF. MEHTA et al. (2007) wiesen an humanen, aus der Nabelvene isolierten Endothelzellen, pro- angiogene Effekte des HB-EGF nach. Im Endometrium der Frau wurden neben
