Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss funktionalisierter metallischer Implantate auf die Angiogenese in vitro
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Laura Christine Roland Köln
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte Klinik für Kleintiere
PD Dr. rer. nat. Hugo Murua Escobar
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Ingo Nolte Klinik für Kleintiere
2. Gutachter: Univ.-Prof Dr. med. vet. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut
Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2016
Die hier vorliegende Arbeit entstand im Rahmen eines durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, N= 299/11-1) geförderten Projekts und in Assoziation mit dem Sonderforschungsbereich 599 (SFB 599). Sie wurde unterstützt durch ein Stipendium des Graduiertenkollegs Biomedizintechnik des SFB 599 und der Hannoverschen Gesellschaft zur
Meiner Familie
Teile dieser Dissertation sind bereits publiziert:
Poly-ε-caprolactone Coated and Functionalized Porous Titanium and Magnesium Implants for Enhancing Angiogenesis in Critically Sized Bone Defects
Laura Roland, Michael Grau, Julia Matena, Michel Teske, Matthias Gieseke, Andreas Kampmann, Martin Beyerbach, Hugo Murua Escobar, Heinz Haferkamp, Nils – Claudius Gellrich, Ingo Nolte (Int J Mol Sci. 2015 Dec 22;17(1),1)
Evaluation of functionalized porous titanium implants for enhancing angiogenesis in vitro
Laura Roland, Samantha Backhaus, Michael Grau, Julia Matena, Michael Teske, Martin Beyerbach, Hugo Murua Escobar, Heinz Haferkamp, Nils-Claudius Gellrich and Ingo Nolte (Materials 2016 Apr 18;9(4),304)
Teilergebnisse dieser Dissertation wurden bei folgenden Fachkonferenzen präsentiert:
24. Jahrestagung der FG Innere Medizin und klinische Labordiagnostik der DVG, InnLab (29.
Januar 2016, Berlin)
Laura Roland, Julia Matena, Michael Grau, Michael Teske, Hugo Murua Escobar, Nils – Claudius Gellrich, Heinz Haferkamp, Ingo Nolte
Implantate zur Förderung einer frühen Angiogenese in vitro
9. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biomechanik (DGfB) am (06. - 08.05.2015, Bonn)
Laura Roland, Julia Matena, Michael Grau, Matthias Gieseke, Svea Petersen, Andreas Kampmann, Hugo Murua Escobar, Nils – Claudius Gellrich, Heinz Haferkamp, Ingo Nolte Osteoblastenproliferation und Vaskularisation auf beschichteten und funktionalisierten Titanimplantaten
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 4
2.1 Kritische Schädeldefekte ... 4
2.2 Angiogenese und Knochendefekte ... 5
2.3 Titan als Implantatmaterial ... 5
2.4 Magnesium als Implantatmaterial ... 6
2.5 Polymere als Drug-Delivery Systeme und Implantatbeschichtung ... 7
2.6 Proangiogene Faktoren ... 8
2.6.1 Vascular Ebdothelial Growth Factor (VEGF) ... 9
2.6.2 High Mobility Group Box 1 (HMGB1) ... 10
2.7 Funktionalisierte Implantate und Proteinadsorption an Oberflächen ... 11
2.8 Angiogenese in vitro und in vivo ... 12
2.9 Reduktion von Tierversuchen ... 14
3 Material und Methoden ... 15
3.1 Herstellung der PCL- und P(3HB)/P(4HB)-Folien ... 15
3.2 Laserstrahlschmelzen von Titan- und Magnesiumimplantaten ... 15
3.3 PCL-Beschichtung von Titan-und Magnesiumimplantaten ... 15
3.4 Inkorporation von VEGF und HMGB1 in PCL-beschichtete Titan- und Magnesiumimplantate ... 15
3.5 Isolation von murinen Osteoblasten und GFP-Osteoblasten ... 16
3.6 Vitalitäts- und Proliferationsassay mit murinen Osteoblasten ... 16
3.6.1 Polymere PCL und P(3HB)/P(4HB) ... 16
3.6.2 Titanimplantate ... 16
3.7 Live Cell Imaging auf PCL-beschichteten und unbeschichteten Titanimplantaten ... 17
3.8 Angiogenese Assay ... 17
3.9 Migrations Assay ... 17
4 Ergebnisse ... 19
4.1 Studie 1 ... 19
4.2 Studie 2 ... 37
5 Diskussion ... 54
6 Zusammenfassung ... 60
Inhaltsverzeichnis
7 Summary ... 62
8 Literaturverzeichnis ... 64
9 Abkürzungsverzeichnis ... 77
10 Danksagung ... 79
Einleitung
1 Einleitung
Kritische Defekte im Schädelbereich treten in Folge von Traumata, zum Beispiel nach Verkehrsunfällen, exzessiven Tumorresektionen, entzündlich – nekrotisierenden Prozessen oder kongenitalen Missbildungen auf (XU et al. 2012). Ein Defekt gilt als kritisch, wenn auf Grund seiner Größe und / oder Lokalisation eine adäquate Knochenheilung durch eine mangelhafte Blutgefäßversorgung in dem betroffenen Gebiet ausbleibt (WU et al. 2010;
SARAN et al. 2014).
Zur Behandlung solcher kritischen Defekte werden in der Humanmedizin, wie in der Veterinärmedizin vielfach autogene Knochentransplantate verwendet. Dazu wird in der Regel Knochenmaterial aus dem Hüftkamm des Patienten entnommen und in den Defektbereich eingesetzt. Dieses Vorgehen geht jedoch mit den Nachteilen einer zusätzlichen Verletzung von ursprünglich gesundem Gewebe und damit verbundenen zusätzlichen Schmerzen für den Patienten einher (SILBER et al. 2003). Außerdem ist das zur Verfügung stehende Material in seiner Menge begrenzt und manchmal nicht ausreichend für die Größe des Defektes (CHENARD et al. 2012).
Titan ist ein häufig verwendetes Implantatmaterial mit vielen positiven Eigenschaften. Es ist lasttragend, biokompatibel, osteokonduktiv (LI et al. 2006) und wird bereits im Schädelbe- reich verwendet (LAU u. MCDERMOTT 2015). Da die Blutgefäßversorgung ein häufig limitierender Faktor in der Einheilung von Implantaten ist, sollen im Rahmen dieser Arbeit Titanimplantate so optimiert und funktionalisiert werden, dass sie eine frühe Angiogenese und somit eine schnelle und effiziente Regeneration fördern.
Die in der Studie verwendeten Implantate bestehen aus einer TiAl6V4-Legierung und wurden mittels Selective Laser Melting® (SLM) hergestellt. Dabei handelt es sich um ein etabliertes additives Fertigungsverfahren, mit dessen Hilfe es gelingt, schnell und kosteneffizient patientenindividuelle Implantate zu produzieren (THIJS et al. 2010; VAN DER STOK et al.
2013).
Da eine poröse Implantatstruktur sowohl die Knochenheilung als auch das Einsprossen von Blutgefäßen begünstigt, und der Leichtbauweise des Knochens näherkommt als ein kompakter Implantatkörper, wurden für die vorliegende Studie Implantate mit einer
Einleitung
Porengröße von 600 µm ausgewählt (KARAGEORGIOU u. KAPLAN 2005; LOH u.
CHOONG 2013).
Der Nachteil von dauerhaften Implantaten wie Titan ist jedoch, dass sie ein im Vergleich zu Knochen höheres E-Modul haben (10 – 30 GPa bei Knochen und 110 GPa bei Titan). Diese Differenz führt zu einer inadäquaten Lastübertragung auf den Knochen, was langfristig zu Knochenabbau und Lockerung des Implantates führen kann. Zusätzliche Operationen sind die Konsequenz (KE ZHU et al. 2007). Deshalb steigt die Nachfrage nach resorbierbaren Implantaten, die ähnliche mechanische Eigenschaften wie Knochen besitzen. Magnesium scheint ein ideales Implantatmaterial zu sein, da es biologisch degradierbar ist und in verschiedenen Studien auch eine gute Biokompatibilität nachgewiesen werden konnte (WAIZY et al. 2013; CHAYA et al. 2015b). Ein Magnesiumkonstrukt mit 600 µm Porengröße wurde für die eigene Untersuchung mittels SLM hergestellt und die Biokompatibilität in vitro untersucht und mit Titan verglichen (GIESEKE et al. 2014;
MATENA et al. 2015b).
Um eine frühe Angiogenese zu fördern, ist die Funktionalisierung von Implantaten mit proangiogenen Faktoren vielversprechend (LINDHORST et al. 2010). Hierzu wurden die beiden Faktoren VEGF und HMGB1 in vorangehenden Arbeiten in vitro getestet und ihre chemotaktische Wirkung auf Endothelzellen mittels Migrationsassays nachgewiesen (MATENA et al. 2015a). Damit auf dem porösen Titanimplantat VEGF bzw. HMGB1 deponiert werden kann, ist eine Beschichtung mit einem biokompatiblen Polymer erforderlich (DE GIGLIO et al. 2010). Außerdem soll die Polymerschicht die schnelle Degradation der Magnesiumimplantate reduzieren (SHADANBAZ et al. 2014).
Ein wichtiges Ziel der eigenen Arbeit war es, eine geeignete Methode zu finden, mit der der Einfluss dreidimensionaler, metallischer Testkomponenten auf die Angiogenese in vitro evaluiert werden kann.
Zur Untersuchung der Angiogenese existieren verschiedene Modelle. Die meisten in vitro Methoden beinhalten Proliferations- oder Migrationsversuche mit Endothelzellen, denen angiogenesefördernde oder –hemmende Substanzen zugesetzt werden. Die meisten dieser Testsysteme sind nicht mit der Situation in vivo vergleichbar, da Endothelzellen ein sehr spezies- und herkunftsspezifisches Verhalten zeigen (STATON et al. 2004). 3D-Matrigel
Einleitung
Assays und Co-Kultur Assays, in denen Tubuli-Wachstum visualisiert werden kann, korrespondieren dagegen besser mit in vivo Ergebnissen (KORFF et al. 2001; STATON et al.
2009).
Die vorliegende Arbeit beinhaltet daher 2 Studien, in denen Implantate zur Förderung einer frühen Angiogenese für die Versorgung von kritischen Defekten im Schädelbereich untersucht wurden.
Um ein geeignetes Implantat- und Beschichtungsmaterial für funktionalisierte Implantate zu definieren, wurde in der ersten Studie die Vitalität und die Proliferation von Osteoblasten auf zwei verschiedenen Polymerbeschichtungen Poly-ɛ-caprolacton (PCL) und Poly-(3- hydroxybutyrat)/poly-(4-hydroxybutyrat) P(3HB)/P(4HB)) miteinander verglichen.
Außerdem wurde die Proliferation und die Vitalität von Osteoblasten auf porösen Titanimplantaten mit 600 µm Porengröße untersucht. Mit dem Live Cell Imaging (LCI) wurde der Einfluss von PCL-beschichteten Titanimplantaten und unbeschichteten Titanimplantaten auf das Wachstumsverhalten von Osteoblasten evaluiert.
Außerdem wurde ein Co-Kultur Angiogenese Assay zur Untersuchung des Einflusses metallischer Implantate auf die Angiogenese geprüft, um ein in vitro Modell zu entwickeln, das Tierversuche in Zukunft zu reduzieren hilft. Mit diesem Assay wurde der Einfluss von mit VEGF bzw. HMGB1 funktionalisierten Titanimplantaten auf die Angiogenese geprüft.
Auf Grund der Ergebnisse der ersten Studie wurde die für die Inkorporation der Faktoren in die Polymerschicht verwendete Konzentration erhöht und die Inkubationszeit verlängert. Die Bioaktivität der Faktoren VEGF und HMGB1 nach Inkorporation wurde mit einem Migrationsassay geprüft. Der Angiogenese Assay mit den nach dem neuen Protokoll funktionalisierten, beschichteten Titanimplantaten wurde durchgeführt zur Prüfung der Angiogenese-stimulierenden Wirkung der Implantate. Parallel dazu wurde die Freisetzungskinetik der Faktoren aus den Implantaten während des Angiogenese Assays mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) untersucht. Die proangiogene Wirkung der Faktoren VEGF und HMGB1 wurde außerdem unabhängig vom Implantat im Co-Kultur Angiogenese Modell überprüft.
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Kritische Schädeldefekte
Kritische Defekte sind definiert als knöcherne Wunden, die eine kritische Größe überschreiten und die komplette Knochenheilung während des gesamten Lebens des Individuums ausbleibt.
Die Größe ist u.a. abhängig von der Art des Individuums und seines Alters (WU et al. 2010).
Ursachen für solche Defekte im Schädelbereich sind kongenitale Anomalien, Traumata, Tumorresektionen, degenerative Erkrankungen oder entzündliche Prozesse (GEIGER et al.
2003). Die Folgen kritischer Schädeldefekte variieren von kosmetischen Fehlern bis hin zum Funktionsverlust. Eine chirurgische Behandlung ist notwendig, um die Form und Funktion wiederherstellen zu können (GEIGER et al. 2003; CHENARD et al. 2012).
Goldstandard zur Behandlung kritischer Schädeldefekte ist der Einsatz von autologen Knochentransplantaten. Dazu wird Knochenmaterial aus dem Hüftkamm des Patienten entnommen und in den Defekt eingesetzt. Obwohl diese Methode mit einigen Nachteilen einhergeht, wie einer Komplikationsrate von 10-40 %, zusätzlichen postoperativen Schmerzen von der Zweitoperation, verlängerter Operationsdauer und limitierter Materialverfügbarkeit, überwiegen die Vorteile einer guten Vaskularisation und Osseointegration (SILBER et al. 2003; ROGERS u. GREENE 2012; VAN DER STOK et al.
2013). In der Veterinärmedizin werden autologe Knochentransplantate ebenfalls eingesetzt, mit den gleichen Vor- und Nachteilen wie in der Humanmedizin (BRACKER u. TROUT 2000; OSTBERG et al. 2014).
Um die Nachteile, die autogene Knochentransplantate mit sich bringen, zu umgehen, werden verschiedene Implantatmaterialien für die Rekonstruktion kritischer Schädeldefekte verwendet (CHENARD et al. 2012). Die eingesetzten Materialien müssen initial stabil, biokompatibel und osteokonduktiv sein und im Idealfall gegenüber dem Knochen ähnliche mechanische Eigenschaften verfügen (RUBSHTEIN et al. 2015). Um ein möglichst gutes funktionelles und ästhetisches Ergebnis nach der Operation zu erhalten, sollten die Implantate für Anwendungen im Schädelbereich möglichst patientenindividuell gefertigt werden können, da die Größe und Form von Defekten in diesem Bereich oft sehr stark variiert. Ein ideales alloplastisches Material, das diese Anforderungen erfüllt, steht bisher nicht zur Verfügung
Literaturübersicht
2.2 Angiogenese und Knochendefekte
Knochen ist ein gut durchblutetes Gewebe. Die Entwicklung des Knochenskeletts und die Heilung von Frakturen sind angewiesen auf eine gute Mikrozirkulation (SCHMID et al.
1997). Das Einsprossen von Blutgefäßen aus dem umgebenden Knochen- und Weichgewebe ist einer der ersten Schritte bei der Knochenheilung (GLOWACKI 1998). Blutgefäße transportieren Sauerstoff, Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und verschiedene Zellarten in das Gewebe (KANCZLER u. OREFFO 2008). Außerdem sind sie verantwortlich für den Abtransport von Stoffwechselprodukten und für die Kommunikation zwischen Knochen und Nachbargeweben (SARAN et al. 2014). Eine gute und frühe Vaskularisation ist Voraussetzung sowohl für die enchondrale, also auch für die desmale Ossifikation (JIAN ZHOU 2012). Eine der wichtigsten Komponenten der Blutgefäße ist das Endothelium. Es stellt eine hochpermeable Barriere dar und ermöglicht somit die Homöostase und sezerniert Faktoren, die wiederum zirkulierende Zellen, insbesondere hämatopoetische Zellen, rekrutieren (BRANDI u. COLLIN-OSDOBY 2006).
Bei der Angiogenese entstehen durch Absprossung von bestehenden Blutgefäßen neue Kapillaren. Sie verfügen über eine Endothelzellauskleidung, glatte Muskelzellen sowie Perizyten. Die Knochenheilung eines großen Defektes wird primär initiiert durch entzündliche Reaktionen und die Aggregation von mesenchymalen Zellen (WEISS et al.
2009). Mesenchymale Vorläuferzellen differenzieren sich weiter zu Chondrozyten, die extrazelluläre Matrixmoleküle wie Kollagen-2 und Proteoglykane sezernieren, um einen knorpeligen Kallus zu bilden (IVASKA et al. 2007). Dieser gibt initiale Stabilität. Um den Knorpel zu Knochen umzubauen, ist das Einwachsen von Blutgefäßen essentiell. Matrix- Metalloproteinasen (MMPs) lockern die extrazelluläre Matrix auf und ermöglichen das Einwachsen der Blutgefäße in den Knorpel. Dieser Prozess wird stimuliert durch proangiogene Zytokine (WEISS et al. 2009).
2.3 Titan als Implantatmaterial
Titan ist ein häufig verwendetes Implantatmaterial (ROTARU et al. 2015). Es zeichnet sich durch eine hohe Stabilität und Biokompatibilität aus. Außerdem wirkt es osteokonduktiv und ist sehr korrosionsbeständig (NIINOMI 2008; VAN DER STOK et al. 2013; RUBSHTEIN et
Literaturübersicht
al. 2015). Ein Nachteil von Titanimplantaten ist jedoch das hohe Elastizitätsmodul (E-Modul) (105 – 110 GPa) im Vergleich zu Knochen (10 – 30 GPa). Dies führt zu einer verminderten Lastübertragung auf den Knochen, die in der Atrophie des Knochens (stress-shielding) und letztendlich in der Lockerung des Implantates resultieren kann. Die Konsequenz ist eine erneute Operation zur Entfernung des Implantates, die erhebliche Belastungen für den Patienten und auch weitere Kosten verursacht (LI et al. 2006; KE ZHU et al. 2007). Um das E-Modul eines Implantates dem vom Knochen anzugleichen, hat sich eine poröse Implantatstruktur bewährt (KE ZHU et al. 2007; YAVARI et al. 2013). Ein weiterer Vorteil von porösen Implantaten ist, dass sie die Adhäsion, Migration und das Einwachsen von Zellen fördern (ROTARU et al. 2015). Osteoblasten, die auf porösen Implantaten angesiedelt wurden, migrierten nicht nur über die Implantatoberfläche, sondern auch in die Poren des Implantates (MATENA et al. 2013). Zellvitalität, -proliferation und -differenzierung sind abhängig von Porengröße und – form (VAN BAEL et al. 2012). Die für die Biomedizintechnik empfohlene Porengröße variiert von 20 – 1500 µm (LOH u. CHOONG 2013).
Zur Herstellung von porösen Titanimplantaten eignen sich additive Fertigungsverfahren. Mit verschiedenen Methoden, wie SLM, Electron Beam Melting (EBM), 3D Druck und Laser Engineered Net Shaping (LENS) können verschiedene Porengrößen und –formen hergestellt werden (EL-HAJJE et al. 2014). SLM ist ein etabliertes Verfahren, um poröse Titanimplantate patientenindividuell, basierend auf einer rechnerunterstützten Konstruktion (computer aided design (CAD) model), herzustellen (VAN BAEL et al. 2012).
2.4 Magnesium als Implantatmaterial
Ein Nachteil von permanenten Implantatmaterialien wie Titan ist, dass diese im Körper verbleiben und gelegentlich in einer zweiten Operation wieder entfernt werden müssen (SCHUMANN et al. 2013). Deshalb steigt die Nachfrage nach resorbierbaren Implantatmaterialien. Als resorbierbare Materialien kommen grundsätzlich Metalle, Polymere und Keramiken in Frage (TAN et al. 2013). Für den Einsatz im Knochen eignen sich Polymere und Keramiken aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften aber nur bedingt (FARZADI et al. 2014; CHAYA et al. 2015a; SKARDAL u. ATALA 2015).
Literaturübersicht
Magnesium stellt durch verschiedene biologische und mechanische Eigenschaften ein vielversprechendes Implantatmaterial dar (YUSOP et al. 2012). Es zeichnet sich durch ein dem Knochen sehr ähnliches E-Modul (4 GPa) und eine gute Biokompatibilität aus.
Zusätzlich ist es vom Körper komplett resorbierbar, ohne dass toxische Abbauprodukte entstehen (WAIZY et al. 2013). Bei der Degradation von Magnesium wird Magnesiumhydroxid (MgOH) freigesetzt und diffundiert in das umliegende Gewebe. MgOH reagiert im wässrigen Milieu zu dem besser wasserlöslichen Magnesiumchlorid (MgCl2). Die dadurch bedingte pH Änderung in den leicht alkalischen Bereich führt zu einer erhöhten Aktivität von Osteoblasten und einer reduzierten Aktivität von Osteoklasten (BUSHINSKY 1996; JANNING et al. 2010). Dies konnte ebenfalls in verschiedenen in vivo Studien belegt werden, in denen ein verstärktes Knochenwachstum in der nahen Umgebung von verschiedenen Magnesiumlegierungen beobachtet wurde (WITTE et al. 2005; WITTE et al.
2007).
Ein Problem bei der Verwendung von Magnesium als Implantatmaterial stellt die initial sehr schnelle Korrosion dar (CHAYA et al. 2015a). Diese kann durch Legierung mit anderen Elementen oder Beschichtungen verlangsamt werden (REIFENRATH et al. 2010;
SHADANBAZ et al. 2014).
Die Herstellung von porösen Magnesiumimplantaten mittels SLM-Verfahren mit einer Porengröße von 600 µm konnte bereits realisiert werden (GIESEKE et al. 2013; GIESEKE et al. 2014) und diese Implantate wurden in einer früheren Studie auf ihre Biokompatibilität hin untersucht (MATENA et al. 2015b).
2.5 Polymere als Drug-Delivery Systeme und Implantatbeschichtung
In der Biomedizintechnik gewinnen Drug-Delivery Systeme immer mehr an Bedeutung. Sie basieren darauf, dass gewisse Substanzen am gewünschten Zielort kontrolliert und konzentriert abgegeben werden, um dort optimal wirken zu können und die Nebenwirkungen im Vergleich zu einer systemischen Gabe des Medikaments zu minimieren (GEIGER et al.
2003; LINDHORST et al. 2010). Polymer-basierte Drug-Delivery Systeme mit bioresorbierbaren Polymeren sind sehr vielversprechend, da das Polymer nach erfolgter Abgabe des Wirkstoffes degradiert und vom Körper abgebaut wird (DASH u.
Literaturübersicht
KONKIMALLA 2012). Voraussetzung hierfür ist, dass das eingesetzte Polymer bioresorbierbar und biokompatibel ist. Das synthetisch hergestellte Poly-ɛ-caprolacton (PCL) ist ein bekanntes, biokompatibles Polymer und geeignet für viele Indikationen der Biomedizintechnik (WOODRUFF u. HUTMACHER 2010; WULF et al. 2011). Die hydrophobe Oberfläche und die Kristallinität von PCL sind der Grund für die langsame Degradation, die dazu führt, dass bei einer PCL-Beschichtung der Wirkstoff über mehrere Monate abgegeben wird (SINHA et al. 2004).
Die Beschichtung von Magnesiumimplantaten mit Polymeren ist eine geeignete Methode zur Verlangsamung der Degradation. In einer vorherigen Studie konnte gezeigt werden, dass eine Beschichtung mit PCL die Korrosion von Magnesiumimplantaten reduziert und dass Osteoblasten im LCI über einen Verlauf von 7 Tagen auf den Implantaten vital waren und eine normale Zellmorphologie zeigten (MATENA et al. 2015b).
Polyhydroxybuttersäure (PHB) gehört zu der Gruppe der Polyhydroxyalkanoate (PHA).
PHAs sind geprüfte Materialien für die Biomedizintechnik, die als Drug-Delivery Systeme einsetzbar sind. Da sie biokompatibel, bioresorbierbar und aufgrund ihres natürlichen Ursprungs erneuerbar sind, bieten sie sich für die Beschichtung von Implantaten an (HAZER 2010).
Um Implantate mit einem Polymer zu beschichten, sind verschiedene Verfahren geeignet.
Dazu gehören die Tauchbeschichtung, Sprühbeschichtung oder elektrochemische Beschichtung (Y. CHEN et al. 2011; GUILLAUME et al. 2012; SEBAA et al. 2015). Der Vorteil der Tauchbeschichtung liegt in seinem einfachen technischen Aufbau, mit der komplexe und poröse Implantatgeometrien flächendeckend beschichtet werden können.
2.6 Proangiogene Faktoren
Verschiedene Wachstumsfaktoren werden bei der Knochenheilung verstärkt exprimiert und können diese positiv beeinflussen. Die am weitesten verbreitete Substanz ist der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) (STREET et al. 2002). High Mobility Group Box 1 (HMGB1) ist ein proinflammatorisches Zytokin, das auch angiogenesefördernd wirkt, ein niedriges Molekulargewicht hat und somit eine Alternative darstellt, um eine frühe
Literaturübersicht
Vaskularisation von Knochendefekten zu fördern (SCHLUETER et al. 2005; MITOLA et al.
2006).
2.6.1 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
VEGF ist ein proangiogen wirkendes Zytokin mit einem Molekulargewicht von 46 kDa in seiner monomeren Form. Es ist von großer Bedeutung sowohl für die Vaskulogenese (de novo Bildung von Blutgefäßen) als auch für die Angiogenese (Absprossung von Kapillaren aus bereits bestehenden Blutgefäßen) (BREIER u. RISAU 1996). VEGF ist beteiligt am Wachstum und an der Differenzierung von Endothelzellen während der Embryonalentwicklung, aber auch essentiell für viele physiologische und pathologische Prozesse, bei denen Neovaskularisation eine Rolle spielt (u. a. Wundheilung, Tumorwachstum und -metastasierung, Retinopathien) (BREIER u. RISAU 1996; KALKA et al. 2000).
Lokale Hypoxie, verschiedene Wachstumsfaktoren, wie z. B. TGF-α (Transforming Growth Factor α), TGF-β (Transforming Growth Factor β), FGF (Fibroblast Growth Factor), proinflammatorische Zytokine, wie z. B. IL-1-α (Interleukin 1-α), IL-6 (Interleukin 6) und HMGB1 (High Mobility Group Box 1) und Hormone, wie z. B. TSH (Thyreoidea- stimulierendes Hormon) und ACTH (Adrenocorticotropes Hormon) stimulieren die mRNA Expression von VEGF und führen somit zu einer vermehrten Synthese und Freisetzung (FERRARA 2004).
VEGF wirkt in vitro chemotaktisch auf Endothelzellen (MATENA et al. 2015a) und fördert die Angiogenese in dreidimensionalen Modellen, indem es Endothelzellen dazu stimuliert, invasiv in eine Matrix aus Kollagen einzuwachsen und Tubuli-ähnliche Strukturen zu bilden (PEPPER et al. 1992). Es konnte auch eine proangiogene Wirkung in verschiedenen in vivo Modellen nachgewiesen werden (PHILLIPS et al. 1994; MESRI et al. 1995). Außerdem wird durch Zugabe von VEGF zu humanen Osteoblasten eine verstärkte noduläre Formation und eine erhöhte alkalische Phosphatase (AP) Aktivität bewirkt (STREET et al. 2002). Das führt zu der Erkenntnis, dass VEGF die Ausdifferenzierung von Osteoblasten in vitro fördert. In der Literatur ist weiterhin ein chemotaktischer Effekt von VEGF auf Osteoblasten beschrieben (MAYR-WOHLFART et al. 2002).
Literaturübersicht
Die enchondrale Ossifikation, bei der das vorläufige Knorpelgewebe durch Knochengewebe ersetzt wird, ist vom Einwachsen von metaphysalen Blutgefäßen abhängig, das durch VEGF stimuliert wird (GERBER et al. 1999). Dies beruht auf einer Blockade des VEGF-Rezeptors durch monoklonale anti-VEGF Antikörper, die das Einwachsen der Blutgefäße unterdrückt und die Bildung von trabekulärem Knochennetzwerk vermindert (GERBER et al. 1999). Bei der Heilung von enchondralen und desmalen Knochen in verschiedenen Frakturmodellen führte eine Blockade des VEGF-Rezeptors zu einer reduzierten Knochenheilung (STREET et al. 2002).
2.6.2 High Mobility Group Box 1 (HMGB1)
HMGB1 ist ein hoch konserviertes Protein mit einem Molekulargewicht von 24,9 kDa, das über den Receptor for Advanced Glycation End Products (RAGE) und über die Toll-like Rezeptoren 2 und 4 (TLR2, TLR4) als proinflammatorisches und proangiogenes Zytokin wirkt (SCHLUETER et al. 2005; VAN BEIJNUM et al. 2008).
Verschiedene Zellen, dazu gehören aktivierte Monozyten und Makrophagen (BONALDI et al.
2003), dendritische Zellen (LOTZE u. TRACEY 2005), natürliche Killerzellen (NK) (SEMINO et al. 2005) und Endothelzellen (MULLINS et al. 2004), können HMGB1 aktiv sezernieren. Dies geschieht insbesondere als Antwort auf Hypoxie, Endotoxine, TNF-α (Tumornekrosefaktor α) oder IL-1-β (Interleukin 1-β) (WANG et al. 1999). HMGB1 wird passiv von nekrotischen Zellen abgegeben und ist daher auch ein Signal für Gewebeschäden (BIANCHI u. MANFREDI 2007).
Abgesehen von seinem proinflammatorischen Potenzial wurde HMGB1 aber auch als potenzieller proangiogener Faktor identifiziert (SCHLUETER et al. 2005; VAN BEIJNUM et al. 2008). HMGB1 führt zu einer vermehrten Produktion des proangiogenen Faktors VEGF, wirkt aber auch in vitro direkt chemotaktisch auf Endothelzellen (MITOLA et al. 2006;
MATENA et al. 2015a) und kann diese dazu stimulieren, in einen Spheroid-Model Tubuli- ähnliche Strukturen zu bilden (SCHLUETER et al. 2005). In einer anderen Studie konnte gezeigt werden, dass HMGB1 die Proliferation von Endothelzellen und den Verschluss eines Wound Scratch Assays fördert (MITOLA et al. 2006). Endotheliale Vorläuferzellen und
Literaturübersicht
Tumoren gelockt und führen zusätzlich zu einer Steigerung der Neovaskularisation (MITOLA et al. 2006).
2.7 Funktionalisierte Implantate und Proteinadsorption an Oberflächen
Die Funktionalisierung von Implantaten mit Wachstumsfaktoren ist eine vielversprechende Möglichkeit in der Biomedizintechnik für die Verbesserung der Behandlung kritischer Defekte (DE GIGLIO et al. 2010). Implantate, die mit verschiedenen proangiogenen Faktoren beladen worden waren, führten zu einer verbesserten Angiogenese (SINGH et al. 2013).
Kollagenschwämme, mit Bone Morphogenic Protein 2 (BMP-2) beladen, konnten eine bessere Osseointegration erzielen als Kollagenschwämme ohne BMP-2 (SIGURDSSON et al. 1997).
Polymere wie das PCL dienen dabei als Trägermaterialien für Wachstumsfaktoren (SINGH et al. 2011). Für die Funktionalisierung der Implantate existieren verschiedene Möglichkeiten.
Häufig verwendete Methoden beruhen auf Proteinadsorption (LINDHORST et al. 2010), Verkapselung des Proteins (ENNETT et al. 2006; BORSELLI et al. 2010), Proteineinschlüssen (PEATTIE et al. 2006) oder kovalenter Bindung (CHIU et al. 2011). Die Adsorption von Proteinen ist eine geeignete Methode zur Proteininkorporation und kann bei bereits fertig produzierten Implantaten erfolgen (SINGH et al. 2012). Andere Methoden führen zu einer kontrollierten Freisetzung der Proteine, erfordern aber verschiedene zusätzliche Schritte bei der Implantatherstellung (SINGH et al. 2012).
Die Adsorption von Proteinen an Polymeren beruht auf hydrophoben Interaktionen, ionischer Bindung, hydrogener Bindung und van-der-Waals Wechselwirkungen. Exposition von Proteinen gegenüber hydrophoben Oberflächen, wie dem PCL, kann jedoch zu einer Strukturveränderung und zum partiellen oder totalen Funktionsverlust des Proteins führen (ZIEGLER et al. 2002; SINGH et al. 2012).
Nichtsdestotrotz wurde die Adsorption von VEGF an kollagen-beschichteten PCL- Implantaten bereits erfolgreich durchgeführt und bewirkte in vitro und in vivo einen positiven Effekt auf die Angiogenese (LINDHORST et al. 2010; SINGH et al. 2011).
Literaturübersicht
2.8 Angiogenese in vitro und in vivo
Angiogenese spielt eine Schlüsselrolle bei vielen physiologischen Vorgängen, wie der Wundheilung und beim weiblichen Reproduktionsapparat, aber auch bei einigen pathologischen Vorgängen, wie z.B. bei Tumorwachstum und –metastasierung, Retinopathien bei Diabetes und rheumatoider Arthritis (BREIER u. RISAU 1996). Es ist deshalb wichtig, geeignete Modelle zu finden, um den stimulierenden oder hemmenden Effekt von Substanzen, wie z.B. Zytokinen oder Medikamenten, auf die Angiogenese zu untersuchen (DONOVAN et al. 2001). Dazu gibt es sowohl in vitro als auch in vivo verschiedene Ansätze.
In vivo Angiogenese Assays kommen den komplexen Vorgängern der Angiogenese am nächsten, sind aber sehr kostenintensiv, fordern viel Zeit und es müssen Tiere dafür eingesetzt werden (JAIN et al. 1997).
In vitro Assays mit Endothelzellen prüfen das Wachstumsverhalten, die Proliferation, gemessen an der Anzahl an Zellteilungen oder das Migrationsverhalten in Bezug auf die Chemotaxis bestimmter Substanzen. Endothelzellen haben ein sehr organspezifisches Verhalten in ihrer Antwort auf Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren (JACKSON u.
NGUYEN 1997), abhängig von dem Gewebe, aus dem sie isoliert wurden. Außerdem repräsentieren sie nicht adäquat die komplexe Interaktion in vivo. Der Vorteil dieser Assays ist, dass sie im Vergleich zu in vivo Modellen schnell und einfach durchführbar, kostengünstig und gut reproduzierbar sind (STATON et al. 2004). Sie geben erste Anhaltspunkte, inwiefern Testsubstanzen die Angiogenese beeinflussen könnten und erlauben eine differenzierte Vorauswahl.
Differenzierungsassays sind eine weitere Möglichkeit, die Angiogenese in vitro zu prüfen. Sie beruhen darauf, dass Endothelzellen stimuliert werden, Tubuli-ähnliche Strukturen zu bilden, und somit über die dreidimensionale Ausrichtung den Verhältnissen in vivo näher zu kommen (KANZAWA et al. 1993). Dabei werden Matrigel Assays, bzw. Growth Factor Reduced (GFR) Matrigel Assays und Co-Kultur Assays unterschieden. Matrigel ist eine Mischung aus extrazellulären und basalen Membranproteinen, die aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EH) Sarkom der Maus gewonnen wurden. Wenn humane Endothelzellen auf dieser Matrix angesiedelt werden, bilden sie innerhalb von vier bis zwölf Stunden Tubuli-ähnliche
Literaturübersicht
enthalten reduzierte Mengen an stimulierenden Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die bei herkömmlichen Matrigel-Assays zu einer Überstimulation der Endothelzellen führen würden.
GFR-Matrigel Assays enthalten aber immer noch eine minimale Konzentration an Wachstumsfaktoren (DONOVAN et al. 2001). Bei den Co-Kultur Assays werden Endothelzellen zusammen mit stromalen Zellen, wie Fibroblasten oder glatten Muskelzellen, kultiviert. Die stromalen Zellen bilden Proteine zur Bildung einer extrazellularen Matrix, an dieser Endothelzellen entlang migrieren, proliferieren und schlussendlich in Tubuli differenzieren. Dieser Vorgang dauert zwölf bis vierzehn Tage (BISHOP et al. 1999;
TAHERGORABI u. KHAZAEI 2012).
Es existieren diverse in vivo Angiogenese-Modelle. Gängige Methoden sind u.a. der Hornhaut-Mikrotaschen Assay, die subkutane Implantation von Biomaterialien oder Kammer Modelle wie die Rückenhautkammer oder Kalottenkammer (RUCKER et al. 2006; STATON et al. 2009; SINIKOVIC et al. 2011). Alle diese Methoden sind aber, wie bereits beschrieben, mit erheblichen Nachteilen wie Kosten- und Zeitaufwand und den ethischen Aspekten eines Tierversuchs verbunden. Außerdem muss das für die jeweilige Indikation passende Modell sorgfältig ausgewählt werden (STATON et al. 2009).
Donovan et al. 2001 verglich in einer Studie die drei oben beschriebenen in vitro Assays (Matrigel Assay, GFR-Matrigel Assay und Co-Kultur Angiogenese Assay) miteinander und mit Kapillaren in einem mikrovaskulären Netzwerk in vivo. Die geformten Tubuli Strukturen beider Matrigel Assays sind kurz und eher homogen und die Zellen bildeten z. T.
Zellklumpen. Die Tubuli des Co-Kultur-Assays dagegen sind sehr inhomogen, was die Kapillaren in vivo eher repräsentiert als die Matrigel Assays. Zellklumpen wurden hier nicht beobachtet. Außerdem wurden in Matrigel-Assays auch von anderen Zellen als von Endothelzellen Tubuli gebildet (DONOVAN et al. 2001). Es ließ sich somit zeigen, dass Co- Kultur Assays die Vorgänge der Angiogenese in vivo besser repräsentieren als Matrigel Assays und somit eine geeignete Methode sind, um den Einfluss von verschiedenen Substanzen auf die Angiogenese in vitro zu überprüfen. In der zugänglichen Literatur liegen keine Berichte über in vitro Angiogenese Assays mit metallischen Implantaten vor.
Literaturübersicht
2.9 Reduktion von Tierversuchen
Tierversuche sind definiert als Behandlungen oder Eingriffe an Tieren, die zu Schmerzen, Leiden oder Schäden bei den dafür eingesetzten Tieren führen (RUSCHE 2003). Neben den ethischen Aspekten gehen Tierversuche mit weiteren Nachteilen einher, wie einem hohen zeitlichen und personellen Aufwand und hohen Kosten (ROLLIN 2003). Russel und Burch et al. 1959 verfassten die 3R’s (Reduction, Refinement, Replacement) um Tierversuche zu minimieren bzw. unter besseren Bedingungen für die Tiere durchzuführen (RUSSELL u.
BURCH 1959). Danach sollten Tierversuche durch den Einsatz von in vitro Methoden, z. B.
Zellkulturassays, reduziert werden, in dem eine Vorauswahl an zu testenden Substanzen getroffen werden kann (KIMBER et al. 2001). Doke et al. 2015 beschreibt eine Vielzahl gängiger in vitro und ex vivo Methoden um den beschriebenen 3R’s nahe zu kommen (DOKE u. DHAWALE 2015). Außerdem sollen die Haltungsbedingungen der Tiere soweit möglich optimiert werden. Diese verursachen weniger Stress bei den Tieren und können somit zu besseren Forschungsergebnisse führen (HENDRIKSEN 2009).
Dennoch sind Tierversuche für die Wissenschaft nötig, um die Sicherheit von beispielsweise Medikamenten oder Implantaten vor ihrem Einsatz am Menschen hinreichend zu testen, da in vitro und ex vivo Ansätze die Komplexität des Gesamtorganismus in vivo nicht vollständig simulieren können (PEARCE et al. 2007). Außerdem sind immer Speziesunterschiede zu berücksichtigen (PEARCE et al. 2007).
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Herstellung der PCL- und P(3HB)/P(4HB)- Folien
Die Herstellung der Polymerfolien erfolgte im Institut für Biomedizintechnik der Universität Rostock, Rostock (Deutschland), wie in der Studie 1 (ROLAND et al. 2015) beschrieben.
Damit sie in eine 96-Well Platte eingebracht werden konnten, wurden Kreise mit einem Durchmesser von 0,64 cm ausgestanzt. Diese wurden mit 70 % Äthanol sterilisiert.
3.2 Laserstrahlschmelzen von Titan- und Magnesiumimplantaten
Die Titanimplantate mit einer Porengröße von 600 µm stellte die SLM Solutions GmbH, Lübeck Deutschland aus einer TiAl6V4 Legierung mit einem SLM® 280HL Selective Laser Melting Maschinensystem her (ROLAND et al. 2015).
Mit einem SLM® 125HL Selective Laser Melting Maschinensystem konnten im Laser Zentrum Hannover Magnesiumimplantate aus ATOULTRA 325 Magnesium Pulver mit einer Porengröße von 600 µm hergestellt werden (MATENA et al. 2015b).
3.3 PCL Beschichtung von Titan und Magnesiumimplantaten
Die Beschichtung der porösen Titan- und Magnesiumimplantate erfolgte mit einem Tauchverfahren. Mit einer speziell dafür angefertigten Halterung wurden die Implantate achtmal in eine PCL-Chloroform-Lösung getaucht. (ROLAND et al. 2015).
3.4 Inkorporation von VEGF und HMGB1 in PCL-beschichtete Titan- und Magnesiumimplantate
Die Funktionalisierung der mit PCL-beschichteten Titan- und Magnesiumimplantate mit den proangiogenen Faktoren VEGF und HMGB1 erfolgte über Physisorption (ROLAND et al.
2015). VEGF in einer Konzentration von 1 µg/ml bzw. HMGB1 in einer Konzentration von 10 µg/ml lagen gelöst in einem Carbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,6 vor. Die Ergebnisse der Studie 1 machten die Anpassung der Konzentrationen für weitere Versuche erforderlich. (ROLAND et al. 2015). Die für die Studie Roland et al. 2016 verwendeten Proteinkonzentrationen in dem Carbonatpuffer betrugen für VEGF 10 µg/ml und für HMGB1 100 µg/ml (ROLAND et al. 2016). Bei der Kombination beider Faktoren wurden die gleichen Konzentrationen wie bei den Einzelfaktoren gewählt.
Material und Methoden
3.5 Isolation von murinen Osteoblasten und murinen GFP-Osteoblasten
Die Isolation und Kultivierung der murinen Osteoblasten und murinen GFP-Osteoblasten erfolgte nach einem etablierten Protokoll (X. D. CHEN et al. 1999; ROLAND et al. 2015) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Kälberserum bei 37 °C und 5% CO2.
3.6 Vitalitäts- und Proliferationsassay mit murinen Osteoblasten
Für die Bestimmung der Proliferation wurden murine Osteoblasten aus den Passagen acht bis zehn (P 8-10) mit dem CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) gemäß dem Protokoll der Firma gefärbt (ROLAND et al. 2015).
CFSE in seiner ursprünglichen Form ist membranpermeabel und nicht fluoreszierend. Nach der Diffusion in die Zelle wird durch eine unspezifische Esterase das CFSE so gespalten, dass es fluoresziert, nicht mehr permeabel ist und über Tage im Zytoplasma der Zelle verbleibt.
Somit wird der Farbstoff bei jeder Zellteilung zur Hälfte an die Tochterzelle abgegeben.
Anhand der Intensität des Farbstoffes in den gemessenen Zellen kann ermittelt werden, wie viele Zellteilungen stattgefunden haben.
3.6.1 Polymere PCL und P(3HB)/P(4HB)
Zur Prüfung der Zytokompatibilität der Polymere PCL bzw. P(3HB)/P(4HB) wurden mit CFSE gefärbte murine Osteoblasten auf den jeweiligen Folien bzw. auf Wellboden als Positivkontrolle für 48h, 72h und 96h ausgesät. Die Proliferation und die Vitalität der Osteoblasten konnten mit einem FACS-Durchflusszytometer (FACSCalibur, BDBiosciences, Heidelberg, Deutschland) gemessen und mit Hilfe der Software FlowJo 7.6.1 ausgewertet werden(ROLAND et al. 2015).
3.6.2 Titanimplantate
Die Prüfung der Zytokompatibilität der Titanimplantate erfolgte nach dem gleichen Protokoll, wie die Vitalitäts- und Proliferationsassays auf den Polymerfolien (ROLAND et al. 2015).
Material und Methoden
3.7 Live Cell Imaging auf PCL-beschichteten und unbeschichteten Titanimplantaten Um den Einfluss einer PCL Beschichtung auf das Wachstumsverhalten von Osteoblasten auf Titanimplantaten mit einer Porengröße von 600 µm beurteilen zu können, wurde ein Live Cell Imaging (LCI) mit Mediumwechsel über sieben Tage durchgeführt. Dieses wurde bereits in früheren Studien etabliert und ermöglicht die Verfolgung von Zellen auf Implantatoberflächen (MATENA et al. 2013). Von GFP-Osteoblasten auf drei PCL-beschichteten und drei unbeschichteten Titanimplantaten wurden mit einem LCI-Mikroskop (DMI6000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) über einen Zeitraum von sieben Tagen in 100-facher Vergrößerung täglich jeweils Fotos von fünf verschiedenen Stellen pro Implantat aufgenommen. Die Zellzahl und Zellflächenbesiedlung konnten anhand der aufgenommenen Fotos von Wimasis Image Analysis GmbH, München, Deutschland ausgewertet werden. Die Versuchsdurchführung wurde detailliert in Roland et al. 2015 beschrieben (ROLAND et al.
2015).
3.8 Angiogenese Assay
Der Angiogenese Assay wurde wie in Roland et al. 2015 und Roland et al. 2016 beschrieben nach dem Protokoll des Herstellers, jedoch mit metallischen Implantaten als Testkomponente durchgeführt. Er beinhaltet eine Co-Kultur aus humanen Endothelzellen (HUVEC) und dermalen Fibroblasten (HDF), die über einen Zeitraum von 14 Tagen kultiviert werden. An Tag zwei der Ausführung wurden die Implantate eingesetzt. Nach 14 Tagen erfolgte die abschließende Darstellung der Tubuli-Strukturen über eine Färbung mit mouse anti-human CD31 Primär-Antikörper, goat anti-mouse IgG AP Sekundärantikörper und BCIP/NBT- Substrat (TCSCellworks, Buckingham, Großbritannien). Aufnahmen in 100-facher Vergrößerung wurden mit der Software AngioSys2.0 ausgewertet (ROLAND et al. 2015).
Sowohl funktionalisierte Implantate als auch die beiden Faktoren VEGF und HMGB1 alleine durchliefen den Test, um ihren Einfluss auf die Angiogenese zu evaluieren.
3.9 Migrations Assay
Für den Migrations-Assay wurden bovine Endothelzellen auf Transwell-Einsätze in einer 12- Well Platte ausgesät. Unter die Transwells wurde der Mediumüberstand von den jeweils funktionalisierten Implantaten gegeben um zu prüfen, ob die darin gelösten Faktoren nach
Material und Methoden
ihrer Freisetzung aus den Implantaten noch eine chemotaktische Wirkung auf Endothelzellen besitzen. Nach 75 Minuten wurden die migrierten Zellen mit eiskaltem Methanol fixiert und mit 1%iger Kristall-Violett-Lösung gefärbt. Zur Dokumentation der Ergebnisse erfolgten fünf Aufnahmen in 40-facher Vergrößerung von jedem Transwell mit dem Live Cell Imaging Mikroskop, auf denen die fixierten und gefärbten Zellen manuell ausgezählt werden konnten.
Ergebnisse
4 Ergebnisse 4.1 Studie 1
Das folgende Manuskript wurde von dem Journal „International Journal of Molecular Sciences“ am 22.12.2015 zur Publikation akzeptiert (doi: 10.3390/ijms17010001). Poly-ε-caprolactone Coated and Functionalized Porous Titanium and Magnesium Implants for Enhancing Angiogenesis in Critically Sized Bone Defects
Laura Roland 1,2 , Michael Grau 1,2, Julia Matena 1, Michael Teske 3, Matthias Gieseke 4, Andreas Kampmann 5, Martin Beyerbach 6, Hugo Murua Escobar 1, 2, Heinz Haferkamp 7, Nils-Claudius Gellrich 5 and Ingo Nolte 1, *
1 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559 Hannover, Germany; E-Mails: laura.roland@tiho-hannover.de (L.R.); michael.grau@tiho- hannover.de (M.G.); julia.matena@tiho-hannover.de (J.M.); martin.beyerbach@tiho- hannover.de (M.B.); hugo.murua.escobar@med.uni-rostock.de (H.M.E.)
2 Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, D-18057 Rostock, Germany
3 Institute for Biomedical Engineering, Rostock University Medical Center, D-18119 Rostock, Germany; E-Mail: michael.teske@uni-rostock.de (M.T.)
4 Materials and Processes Department, Laser Zentrum Hannover e. V., D-30419 Hannover, Germany; E-Mail: m.gieseke@lzh.de (M.G.)
5 Clinic for Cranio-Maxillo-Facial Surgery, Hannover Medical School, D-30625 Hannover, Germany; E-Mails: kampmann.andreas@mh-hannover.de (A.K.); gellrich.nils-
claudius@mh-hannover.de (N.-C.G.)
6 Institute for Biometry, Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559 Hannover, Germany; E-Mail:
martin.beyerbach@tiho-hannover.de (M.B.)
Ergebnisse
7 Institut fuer Werkstoffkunde, Leibniz Universitaet Hannover, D-30823 Garbsen, Germany;
E-Mail: haferkamp@iw.uni-hannover.de (H.H.)
* Correspondance: ingo.nolte@tiho-hannover.de Tel.: +49-511-953-6400; Fax: +49-511-953-6203.
Abstract
For healing of critically sized bone defects, biocompatible and angiogenesis supporting implants are favourable. Murine osteoblasts showed equal proliferation behaviour on the polymers poly-ɛ-caprolactone (PCL) and poly-(3-hydroxybutyrate)/poly-(4-hydroxybutyrate) (P(3HB)/P(4HB). As vitality was significantly better for PCL, it was chosen as a suitable coating material for further experiments. Titanium implants with 600 µm pore size were evaluated and found to be a good implant material for bone, as primary osteoblasts showed a vitality and proliferation behaviour onto the implants comparable to well bottom (WB). Pure porous titanium implants and PCL coated porous titanium implants were compared using Live Cell Imaging (LCI) with GFP-osteoblasts. Cell count and cell covered area did not differ between the implants after seven days. To improve ingrowth of blood vessels into porous implants, proangiogenic factors like Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and High Mobility Group Box 1 (HMGB1) were incorporated into PCL coated, porous titanium and magnesium implants. An angiogenesis assay was performed to establish an in vitro method for evaluating the impact of metallic implants on angiogenesis to reduce and refine animal experiments in future. Incorporated concentrations of proangiogenic factors were probably too low, as they did not lead to any effect. Magnesium implants did not yield evaluable results, as they led to pH increase and subsequent cell death.
Keywords: titanium implants; angiogenesis; poly-ɛ-caprolactone; VEGF; HMGB1; poly-(3- hydroxybutyrate)/poly-(4-hydroxybutyrate)
Article
Poly- ε -caprolactone Coated and Functionalized Porous Titanium and Magnesium Implants for Enhancing Angiogenesis in Critically Sized Bone Defects
Laura Roland1,2, Michael Grau1,2, Julia Matena1, Michael Teske3, Matthias Gieseke4, Andreas Kampmann5, Martin Beyerbach6, Hugo Murua Escobar1,2, Heinz Haferkamp7, Nils-Claudius Gellrich5and Ingo Nolte1,*
Received: 28 October 2015; Accepted: 14 December 2015; Published: 22 December 2015 Academic Editor: Mohamed N. Rahaman
1 Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover D-30559, Germany; laura.roland@tiho-hannover.de (L.R.); michael.grau@tiho-hannover.de (M.G.);
julia.matena@tiho-hannover.de (J.M.); hugo.murua.escobar@med.uni-rostock.de (H.M.E.)
2 Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine, University of Rostock, Rostock D-18057, Germany
3 Institute for Biomedical Engineering, Rostock University Medical Center, Rostock D-18119, Germany;
michael.teske@uni-rostock.de
4 Materials and Processes Department, Laser Zentrum Hannover e. V., Hannover D-30419, Germany;
m.gieseke@lzh.de
5 Clinic for Cranio-Maxillo-Facial Surgery, Hannover Medical School, Hannover D-30625, Germany;
kampmann.andreas@mh-hannover.de (A.K.); gellrich.nils-claudius@mh-hannover.de (N.-C.G.)
6 Institute for Biometry, Epidemiology and Information Processing,
University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover D-30559, Germany;
martin.beyerbach@tiho-hannover.de
7 Institut fuer Werkstoffkunde, Leibniz Universitaet Hannover, Garbsen D-30823, Germany;
haferkamp@iw.uni-hannover.de
* Correspondence: ingo.nolte@tiho-hannover.de; Tel.: +49-511-953-6400; Fax: +49-511-953-6203
Abstract:For healing of critically sized bone defects, biocompatible and angiogenesis supporting implants are favorable. Murine osteoblasts showed equal proliferation behavior on the polymers poly-ε-caprolactone (PCL) and poly-(3-hydroxybutyrate)/poly-(4-hydroxybutyrate) (P(3HB)/P(4HB)). As vitality was significantly better for PCL, it was chosen as a suitable coating material for further experiments. Titanium implants with 600µm pore size were evaluated and found to be a good implant material for bone, as primary osteoblasts showed a vitality and proliferation onto the implants comparable to well bottom (WB). Pure porous titanium implants and PCL coated porous titanium implants were compared using Live Cell Imaging (LCI) with Green fluorescent protein (GFP)-osteoblasts. Cell count and cell covered area did not differ between the implants after seven days. To improve ingrowth of blood vessels into porous implants, proangiogenic factors like Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and High Mobility Group Box 1 (HMGB1) were incorporated into PCL coated, porous titanium and magnesium implants. An angiogenesis assay was performed to establish anin vitromethod for evaluating the impact of metallic implants on angiogenesis to reduce and refine animal experiments in future. Incorporated concentrations of proangiogenic factors were probably too low, as they did not lead to any effect. Magnesium implants did not yield evaluable results, as they led to pH increase and subsequent cell death.
Keywords: titanium implants; angiogenesis; poly-ε-caprolactone; VEGF; HMGB1;
Int. J. Mol. Sci.2015,17, 1 2 of 16
1. Introduction
Large bone defects due to trauma, neoplasia or congenital anomaly are a challenging problem, especially in oral and maxillofacial surgery. If the defect exceeds a critical size, adequate bone regeneration often does not take place because of insufficient vascularisation [1,2].
Autologous bone transplants derived from the patient’s iliac crest are commonly used for treatment of those critically-sized bone defects. Disadvantage of this treatment option additionally are donor site morbidity, which is caused by the required additional surgical intervention, limited access of bone material and elevated costs [3–5].
Metallic biomaterials are widely used in bone surgery for different approaches. Titanium is preferred as implant material, as it is highly biocompatible, osteoconductive and resistant to corrosion [6]. It is currently used e.g., for artificial hip joints, surgery plates, screws and nails.
Mechanical mismatch of implant and bone and insufficient vascularisation in critical size defects frequently leads to loosening of the implant. The higher Young’s modulus of titanium compared to that of cortical bone resulting in stress-shielding is of major concern [7].
To overcome some disadvantages of conventional titanium, porous titanium implants are favourable [8]. In addition, a porous implant structure has been reported to improve cell adhesion and spreading [9], consequently leading to a tight bone-implant interface and efficient bone-ingrowth without the implant [10]. Recommended pore size for bone tissue engineering varies from 20 to 1500µm [11].
For manufacturing of open porous titanium implants, Selective Laser Melting (SLM®) has proven to be a suitable method as it offers the opportunity to produce patient-individual implants for different approaches quickly and cost-efficiently [12]. SLM® is a well-established manufacturing process for metal parts, and the successful implantation of SLM-made titanium implants in human patients has already been reported [13]. Manufacturing of open porous magnesium implants with SLM also has been described previously [14,15].
The demand for biodegradable implant materials has grown during the last years, so that magnesium as implant material came into focus. Magnesium is biocompatible, stimulates bone growth and, to overcome the major disadvantage of titanium implants, it has a Young’s modulus similar to that of cortical bone [16–18]. To control the fast degradation rate of magnesium, different coatings and magnesium alloys are used [19].
Open porous implants and insertion of proangiogenic factors are known to improve ingrowth of new blood vessels into implants [20]. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and High Mobility Group Box 1 (HMGB1) are proangiogenic cytokines reported to enhance angiogenesis. VEGF is a well-known protein, which promotes vasculogenesis and angiogenesis and is among other things released by insufficient oxygen supply. HMGB1 is a highly conserved protein, which is upregulated in inflammatory conditions and may be associated with angiogenesis during inflammation as it induces chemotaxis and sprouting of endothelial cells. [21,22]. They were also reported to stimulate endothelial cell migrationin vitroand, in the case of VEGF, to improve induction of angiogenesis and bone tissue regeneration rate in vivo [20,23]. Therefore, implants functionalized with these cytokines could be promising for enhancing early angiogenesis in critically sized bone defects, thus improving bone regeneration. For incorporation of proangiogenic factors, a biocompatible coating able to adjust and to release cytokines is required. Scaffolds based on poly-ε-caprolactone (PCL) and poly-(3-hydroxybutyrate)/poly-(4-hydroxybutyrate) (P(3HB)/P(4HB)) have already been evaluated as biocompatible polymers for bone tissue engineering [24,25]. PCL is a well-known synthetically produced polymer, whereas P(3HB) and P(4HB) are bacterially synthesized polymers [26,27]. All of these biopolymers can easily be blended, surface modified and loaded with growth factors to adjust their biocompatibility, bioactivity, mechanical properties, drug release and degradation under
Int. J. Mol. Sci.2015,17, 1 3 of 16
In this study, anin vitroangiogenesis assay for evaluating the influence of coated metallic implants on angiogenesis was tested. The assay was supposed to show the influence of titanium and magnesium implants functionalized with VEGF or HMGB1 on angiogenesis without animal experiments.
In addition, pure titanium implants and PCL covered titanium implants were seeded with murine Green fluorescent protein (GFP)-osteoblasts and imaged using Live Cell Imaging (LCI) to compare cell behavior on both materials under close-toin vivoconditions as recently described [28].
2. Results and Discussion
2.1. Vitality and Proliferation of Murine Osteoblasts on Polymers
2.1.1. Vitality of Murine Osteoblasts on Polymers
Murine osteoblasts showed a significant lower vitality for P(3HB)/P(4HB) in comparison to well bottom after a seeding period of 48, 72 and 96 h (Figure1) and a significant lower vitality for PCL in comparison to well bottom (WB) after a seeding period of 48 and 72 h. There was no statistically significant difference between the vitality of osteoblasts growing on P(3HB)/P(4HB) in comparison to PCL after 48 and 72 h. Merely, after 96 h, osteoblasts showed significantly better vitality for PCL in comparison to P(3HB)/P(4HB), and no statistically significant difference in vitality between PCL and well bottom (Figure1). The PCL surface appears to be more attractive for osteoblast-growth.
A non-sufficient blending of P(3HB) with P(4HB) possibly leads to increased stress for osteoblasts, causing partial regions covered only by pure P(3HB) or by pure P(4HB). Vitality is represented as a percent of living cells of the total cell count of each sample.
Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 0001
and magnesium implants functionalized with VEGF or HMGB1 on angiogenesis without animal experiments.
In addition, pure titanium implants and PCL covered titanium implants were seeded with murine Green fluorescent protein (GFP)-osteoblasts and imaged using Live Cell Imaging (LCI) to compare cell behavior on both materials under close-to in vivo conditions as recently described [28].
2. Results and Discussion
2.1. Vitality and Proliferation of Murine Osteoblasts on Polymers 2.1.1. Vitality of Murine Osteoblasts on Polymers
Murine osteoblasts showed a significant lower vitality for P(3HB)/P(4HB) in comparison to well bottom after a seeding period of 48, 72 and 96 h (Figure 1) and a significant lower vitality for PCL in comparison to well bottom (WB) after a seeding period of 48 and 72 h. There was no statistically significant difference between the vitality of osteoblasts growing on P(3HB)/P(4HB) in comparison to PCL after 48 and 72 h. Merely, after 96 h, osteoblasts showed significantly better vitality for PCL in comparison to P(3HB)/P(4HB), and no statistically significant difference in vitality between PCL and well bottom (Figure 1). The PCL surface appears to be more attractive for osteoblast-growth.
A non-sufficient blending of P(3HB) with P(4HB) possibly leads to increased stress for osteoblasts, causing partial regions covered only by pure P(3HB) or by pure P(4HB). Vitality is represented as a percent of living cells of the total cell count of each sample.
Figure 1. Vitality (%) of murine osteoblasts settled on PCL (poly-ε-caprolactone), P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/poly(4-hydroxy-butyrate)) and WB (well bottom) for 96 h. Global F-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test showed a significant difference between PCL and (P(3HB)/P(4HB)) meanwhile between WB and (P(3HB)/P(4HB)) (* = p ≤ 0.05, n = 8; circle = outlier; rhombus = mean;
centered line = median).
No significant difference between the vitality of osteoblasts after 48, 72 and 96 h seeding period could be documented for PCL.
For P(3HB)/P(4HB), the vitality of murine osteoblasts significantly decreased from 48 to 72 h and from 48 to 96 h seeding period (Figure 2).
Figure 1. Vitality (%) of murine osteoblasts settled on PCL (poly-ε-caprolactone), P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/poly(4-hydroxy-butyrate)) and WB (well bottom) for 96 h. GlobalF-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test showed a significant difference between PCL and (P(3HB)/P(4HB)) meanwhile between WB and (P(3HB)/P(4HB)) (* =pď0.05,n= 8; circle = outlier; rhombus = mean;
centered line = median).
No significant difference between the vitality of osteoblasts after 48, 72 and 96 h seeding period could be documented for PCL.
For P(3HB)/P(4HB), the vitality of murine osteoblasts significantly decreased from 48 to 72 h and
Int. J. Mol. Sci.2015,17, 1 4 of 16 Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 0001
Figure 2. Vitality (%) of murine osteoblasts settled on P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/
poly(4-hydroxy-butyrate) for 48, 72 and 96 h. Global F-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test showed a significant difference between the vitality after 48 and 72 h meanwhile between 48 and 96 h (* = p ≤ 0.05, n = 8;
circle = outlier; rhombus = mean; centered line = median).
2.1.2. Proliferation of Murine Osteoblasts on Polymers
Proliferation index, which is the number of cell divisions divided by the number of cells that went into division, showed no difference between the three groups (Figure 3).
Figure 3. Proliferation index of murine osteoblasts for different materials PCL (poly-ε-caprolactone), P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/poly(4-hydroxy-butyrate)) and WB (well bottom). No significant difference between the materials could be observed using Global F-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test, * = p ≤ 0.05, n = 9; circle = outlier; rhombus = mean; centered line = median.
Figure 2. Vitality (%) of murine osteoblasts settled on P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/poly(4-hydroxy-butyrate) for 48, 72 and 96 h. Global F-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test showed a significant difference between the vitality after 48 and 72 h meanwhile between 48 and 96 h (* =pď0.05,n= 8; circle = outlier; rhombus = mean; centered line = median).
2.1.2. Proliferation of Murine Osteoblasts on Polymers
Proliferation index, which is the number of cell divisions divided by the number of cells that went into division, showed no difference between the three groups (Figure3).
Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 0001
Figure 2. Vitality (%) of murine osteoblasts settled on P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/
poly(4-hydroxy-butyrate) for 48, 72 and 96 h. Global F-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test showed a significant difference between the vitality after 48 and 72 h meanwhile between 48 and 96 h (* = p ≤ 0.05, n = 8;
circle = outlier; rhombus = mean; centered line = median).
2.1.2. Proliferation of Murine Osteoblasts on Polymers
Proliferation index, which is the number of cell divisions divided by the number of cells that went into division, showed no difference between the three groups (Figure 3).
Figure 3. Proliferation index of murine osteoblasts for different materials PCL (poly-ε-caprolactone), P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/poly(4-hydroxy-butyrate)) and WB (well bottom). No significant difference between the materials could be observed using Global F-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test, * = p ≤ 0.05, n = 9; circle = outlier; rhombus = mean; centered line = median.
Figure 3.Proliferation index of murine osteoblasts for different materials PCL (poly-ε-caprolactone), P(3HB)/P(4HB) (poly(3-hydroxy-butyrate)/poly(4-hydroxy-butyrate)) and WB (well bottom). No significant difference between the materials could be observed using GlobalF-test from the analyses of variance followed by pairwise multiple means comparisons with the Least Significant Difference test,
* = pď0.05,n= 9; circle = outlier; rhombus = mean; centered line = median.
