HANNA LÜTKEHUS -LOKALIS./QUANTIF.STUDIE ZUR IGF-SYSTEM
HANNA LÜTKEHUS
und Plazenta des Rindes
VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAGédition scientifique
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INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
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1. Auflage 2012
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1 Edition 2012st
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édition scientifique
Charakterisierung der peripartalen IGF-System-Expression in Uterus
und Plazenta des Rindes
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Hanna Lütkehus
Minden (Westfalen)
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachterin: Prof. Dr. Martina Hoedemaker, PhD Klinik für Rinder
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2012
Diese Arbeit wurde unterstützt von Pfizer Inc.
2. Literaturübersicht……….. 3
2.1 Anatomie und Histologie des bovinen Uterus und der Plazenta……….. 3
2.1.1 Uterus und Plazenta während der Trächtigkeit……… 3
2.1.2 Peri- und postpartale Veränderungen des Uterus und der Plazenta……... 7
2.2 Erkrankungen des Uterus post partum……… 9
2.3 Das IGF-System……….. 14
2.3.1 Liganden des IGF-Systems……… 14
2.3.2 IGF-Rezeptoren……… 20
2.3.3 IGF-Bindungsproteine (IGFBPs)……….….. 23
3. Material und Methoden……….. 26
3.1 Gewebeentnahme und -bearbeitung………. 26
3.1.1 Lokalisation des IGF-Systems während der präpartalen Phase……… 26
3.1.2 Lokalisation des IGF-Systems während der postpartalen Phase………….. 27
3.2 Histologie……… 29
3.2.1 Protokoll der Handeinbettung (für Bouin-fixierte Proben)………... 29
3.2.2 Protokoll des Einbettungsautomaten (für formalinfixierte Proben)…….. …. 29
3.2.3 Vorbereitung der Schnitte für die Histologie/Immunhistochemie…………... 30
3.2.4 Hämatoxylin-Eosin-Färbung……….30
3.2.5 Immunhistochemie……….31
3.3 Molekularbiologie……….. 38
3.3.1 Proteinbiologie……… 38
3.3.2 mRNA-Analysen……….41
4. Ergebnisse………... 50
4.1 Western Blot……….. 50
4.2 Immunhistochemie………... 52
4.2.1 IGF-I………. 53
4.2.2 IGF-II……… 56
4.2.3 IGF1Rα………... 59
4.2.4 IGF1Rβ……… 62
4.2.8 IGFBP-7……….. 74
4.2.9 Sonderfall, Tier der Kaiserschnittgruppe……… 77
4.3 Ergebnisse der konventionellen PCR……….... 78
4.4 Ergebnisse der quantitativen PCR……… 79
4.4.1 IGF-I………. 79
4.4.2 IGF-II……… 81
4.4.3 IGF1R……….. 82
4.4.4 IGF2R……….. 83
4.4.5 IGFBP-2……….. 84
4.4.6 IGFBP-3……….. 85
4.4.7 IGFBP-7……….. 86
5. Diskussion………... 87
5.1 Immunhistochemische Lokalisation der IGF-Systemkomponenten…………. 87
5.2 mRNA-Expression der IGF-System-Komponenten……….... 102
5.3 Schlussfolgerung……….. 104
6. Zusammenfassung………. 106
7. Summary……….. 108
8. Literaturverzeichnis……… 110
9. Anhang………. 120
9.1 Abkürzungen……….. 120
9.2 Puffer und Lösungen……… 123
9.3 Reagenzien……… 128
9.4 Verbrauchsmaterialen……….. 131
9.5 Geräte………. 132
9.6 qPCR-Daten……….. 135
10. Danksagung……….. 153
1. Einleitung
Die peripartale Phase ist bei Kühen von hoher Bedeutung für die spätere Milchproduktion und Fertilität (Llewellyn et al., 2008). Innerhalb dieser Phase stellt die postpartale Endometritis eine häufige Erkrankung bei unseren heutigen Hochleistungsmilchkühen dar. Im Rahmen nahezu jeder Geburt kommt es durch die geöffnete Zervix zu einer Kontamination des bovinen Uterus mit Bakterien (Sheldon, 2004), welche aber zum größten Teil innerhalb der ersten Wochen post partum spontan eliminiert werden (Elliott et al., 1968). Bei 15-20% der Tiere allerdings persistiert die uterine Besiedelung mit Bakterien, so dass eine klinische Endometritis entsteht. Weitere 30% der Kühe entwickeln eine chronische Entzündung ohne klinische Zeichen einer Uteruserkrankung (LeBlanc et al., 2002; Gilbert et al., 2005;
Sheldon et al., 2006). Endometritis ist bei Hochleistungsmilchkühen von wirtschaftlich großer Bedeutung, denn durch die Entzündungsprozesse wird die Involution des Uterus verlangsamt, was Follikelwachstum und -funktion beeinträchtigt und sich damit negativ auf die Fertilität auswirkt (Mateus et al., 2002; Gilbert et al., 2005).
Niedrigere Konzeptionsraten, verlängerte Intervalle bis zur ersten Besamung bzw.
ersten Trächtigkeit nach erfolgter Geburt und eine erhöhte Menge von Abgängen wegen mangelnder Fertilität führen zu teils enormen finanziellen Verlusten (LeBlanc et al., 2002). Dazu kommen noch die verringerte Milchleistung bei erkrankten Kühen, die entstehenden Tierarztkosten und bei Einsatz von Medikamenten der Ausfall der Milchlieferung durch die nötige Einhaltung der Wartezeit (Bretzlaff, 1987).
In den letzten Jahren berichteten mehrere Studien, die große Datenmengen von Milchkühen umfassten, dass eine negative Energiebilanz in der späten Trächtigkeitsphase eine Schlüsselrolle für die Empfänglichkeit gegenüber postpartaler Erkrankung des Uterus und damit verbundenen Fertilitätsproblemen darstellt. Eine deutlich negative Energiebilanz präpartum bringt eine reduzierte systemische IGF-I-Konzentration im Blut mit sich und wird in Verbindung gebracht mit einem erhöhten Entzündungsgrad im Uterus sowie verzögerter Uterusinvolution und Heilungsprozessen nach dem Kalben (Wathes et al., 2007b; Wathes et al., 2009). Weiterhin zeigten Piechotta et al. (2012), dass niedrige IGF-I-Blutspiegel
zwischen Tag 242 und 248 nach künstlicher Besamung deutlich die Tiere aufzeigten, die nach dem Kalben Erkrankungen entwickelten.
Um den Zusammenhang zwischen systemischer IGF-I-Konzentration als Indikator für die Immunkompetenz der Kühe und den peripartalen Geschehnissen im Uterus herzustellen, wurden jeweils prä- und postpartal Kühe anhand ihres IGF-I- Blutspiegels in zwei Gruppen unterteilt (IGF-hoch und IGF-niedrig). Bei diesen Tieren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit dann vergleichend die Expression des IGF-Systems im Uterus und Plazenta auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht.
Durch die damit erlangten neuen Erkenntnisse können Rückschlüsse darauf gezogen werden, ob und inwieweit das IGF-System in die physiologischen und pathologischen Prozesse im peripartalen Uterus involviert ist und möglicherweise in naher Zukunft im therapeutischen oder prophylaktischen Einsatz gegen Endometritis genutzt werden kann. Dazu wurden neben den Liganden des Systems (IGF-I und IGF-II), die IGF-Rezeptoren 1 und 2 und die Bindungsproteine 2, 3 und 7 in den verschiedenen Zellpopulationen von Uterus und Plazenta lokalisiert und auf mRNA- Ebene quantitativ zwischen den beiden Gruppen verglichen.
2. Literaturübersicht
2.1 Anatomie und Histologie des bovinen Uterus und der Plazenta
2.1.1 Uterus und Plazenta während der Trächtigkeit
Makroskopisch lässt sich der bovine Uterus nach Nickel, Schummer und Seiferle (1987) wie folgt beschreiben: es handelt sich beim Rind um einen Uterus bicornis mit zwei widderhornartig gewundenen, sich nach kranial langsam verjüngenden Hörnern, die sich kaudal zum einheitlichen Uteruskörper vereinigen. Den Abschluss zur Vagina bildet der Gebärmutterhals, der von derber Beschaffenheit ist und zum Lumen hin deutliche Querwülste aufweist. Je nachdem, ob es sich um ein juveniles, geschlechtsreifes oder bereits trächtig gewesenes Tier handelt, tritt der Uterus unterschiedlich weit über den knöchernen Schambeinkamm hinweg in die Bauchhöhle hinein, ist aber in seiner ganzen Größe rektal zu ertasten. Die Schleimhaut des Uterus trägt Längs- und Querfalten, denen meist vier unregelmäßig gestaltete Reihen Karunkeln aufsitzen (siehe Abb. 1). Der gravide Uterus zeichnet sich durch eine deutliche Asymmetrie aus, da meist nur eine Frucht ausgetragen wird, welche sich zu 60% im rechten, zu 40% im linken Uterushorn befindet. Im Verlaufe der Trächtigkeit kommt es zur starken Größenzunahme des Uterus mit einem Umfang von bis zu 1,2m und einer Länge bis zu einem Meter (Gier und Marion, 1968).
Histologisch setzt sich die Gebärmutter nach Liebich (1990) aus folgenden Schichten zusammen: die lumenwärts gelegene Mukosa (Endometrium), eine darunter gelegene Tunica muscularis, eine Tela subserosa und eine Tela serosa, die den Abschluss zur Bauchhöhle bildet. Die Mukosa besteht, so Liebich, aus einem einschichtigen, hochprismatischen Epithel, welches beim Rind stellenweise auch mehrreihig sein kann, und einer Lamina propria, in der sich zahlreiche Uterindrüsen befinden. Außerdem ist die Propria Ort der Immunabwehr, in der sich subepithelial Zellen der spezifischen und unspezifischen Immunabwehr befinden. Die bereits erwähnten Karunkeln stellen knopfförmige, drüsenfreie Vorwölbungen der Propria mit bindegewebigem Grundgerüst dar (siehe Abb. 2).
Die Plazenta bildet während der Gravidität ein komplexes System aus interdigitierenden maternalen und fetalen Gewebeanteilen, das dem Stoffaustausch zwischen Mutterorganismus und Fetus dient (Björkman und Sollen, 1960; Leiser und Kaufmann, 1994) und außerdem in der Lage ist, Stoffe wie beispielsweise Hormone (Schlafer et al., 2000; Sousa et al., 2008) oder Wachstumsfaktoren wie z.B. die Insulin-like growth factors (Richterich, 2008) zu produzieren. Bei der Plazenta des Rindes ist dieses interdigitierende Gewebe auf bestimmte, eng umschriebene Bereiche begrenzt, welche als Plazentome bezeichnet werden (Björkman, 1969).
Man spricht daher beim Rind von einer Placenta cotyledonata sive multiplex (Grosser, 1927). Das Rind besitzt 80-140 solcher kissenförmiger Plazentome (siehe Abb. 3), innerhalb derer fetale verzweigte Chorionzotten (Kotyledonen) in Krypten der vergrößerten maternalen Uteruskarunkeln greifen (Björkman und Sollen, 1960).
Es handelt sich beim Rind also außerdem um eine Plazenta vom villösen Typ (Leiser und Kaufmann, 1994). Die Zotten bestehen dabei aus vaskularisiertem Mesenchym, welches von einer einzelnen Zellschicht Trophoblastektoderm überzogen ist (Björkman und Sollen, 1960). Der Trophoblast setzt sich aus ,,normalen“ einkernigen Trophoblastzellen und binukleären Riesenzellen (BNCs oder trophoblast giant cells, TGCs) zusammen, die etwa 15-20% der gesamten fetalen Epithelzellen ausmachen (Wooding, 1983) und zur Hormonproduktion befähigt sind (Reimers et al., 1985;
Ullmann und Reimers, 1989; Matamoros et al., 1994).
Zwischen den einzelnen Kotyledonen, die in ihrer Gesamtheit auch als Chorion frondosum bezeichnet werden, befinden sich sogenannte interkotyledonäre Bereiche. Hier stellt das fetale Chorion nur eine dünne Membran mit atrophierten Zotten dar, welche der Uterusmukosa gegenüberliegt und auch als Chorion laeve angesprochen wird (Leiser und Kaufmann, 1994). In diesen Bereichen kommt es nach Leiser und Kaufmann ebenfalls zum Stoffaustausch: bei den Wiederkäuern spielt die vom Muttertier produzierte Histiotrophe eine große Rolle, die sogenannte Uterinmilch enthält Eiweiß, Fett und abgestoßene Schleimhautanteile, welche vom Chorion laeve aufgenommen werden (Grosser, 1927).
Die maternalen Krypten bestehen aus einem besonders gefäßreichen, Bindegewebsgerüst (Grosser, 1927), das von einem einschichtigen, kubischen
Epithel überzogen ist (Björkman und Sollen, 1960). Einkernige Trophoblastzellen und Kryptenepithel tragen jeweils Mikrovilli und befinden sich in engem Kontakt miteinander, was zu einer starken Vergrößerung der Kontaktfläche zwischen fetalen und maternalen Geweben führt (Björkman und Bloom, 1957).
Anhand der Gewebeschichten, die bei der Plazentation zwischen fetalem und maternalem Blut bestehen bleiben, gab Grosser (1909) der Rinderplazenta die Bezeichnung Placenta syndesmochorialis. Er sah somit das maternale Epithel als fehlend an. Spätere Arbeiten zeigten, dass das maternale Epithel bestehen bleibt, so dass die Plazenta zum epitheliochorialen Typ gezählt wurde (Ludwig, 1962; Steven, 1975; Ramsey, 1982). In neuerer Zeit wurde dann bewiesen, dass von den möglichen sechs Gewebeschichten zwar grundsätzlich alle bestehen bleiben, jedoch die bereits erwähnten meist binukleären TGCs eine Ausnahme bilden, weil sie mit dem maternalen Epithel fusionieren und so fetomaternale Hybridzellen, also Synzytien formen können (Wooding, 1992; Leiser und Kaufmann, 1994). Da dies den entscheidenden Unterschied zum epitheliochorialen Typ darstellt, wird die Rinderplazenta heute zum synepitheliochorialen Typ gerechnet (Wooding, 1992).
Bei dieser kaum invasiven Form der Plazenta kommt es im Rahmen der Geburt zu einer Separation entlang der fetomaternalen Kontaktzone, wodurch das Rind zu den ,,Adeciduata“, also den Tieren mit einer Placenta apposita (Robinson, 1904) bzw.
Semiplacenta (Strahl, 1906) gezählt wird. In der Nachgeburt befinden sich beim Rind also nur wenige maternale Gewebeanteile (Leiser und Kaufmann, 1994).
Betrachtet man die geometrische Anordnung maternaler und fetaler Gefäße und Blutflüsse in den Austauschregionen der Plazenta, gehört die Rinderplazenta zum multivillösen Typ (Dantzer et al., 1988). Dieser multivillöse Blutstrom wird dadurch kompliziert, dass auch Bereiche mit Kreuzstrom und entgegengesetzt strömendem Blut vorkommen. Durch diese variable Anordnung der Blutflüsse könnte das Arrangement der Gefäße in der bovinen Plazenta auch als ungeordnet bezeichnet werden (Dantzer et al., 1988). Das Rind besitzt in Relation zum Geburtsgewicht des Kalbes ein geringes Plazentagewicht, was auf einen effektiven plazentaren Transport
bei dieser Tierart hindeutet (Dantzer et al., 1988).
Abb. 3: Die bovine Plazenta (Schnorr, 1985)
K
Kaarruunnkkeell
Maternale Karunkel
Fetale Kotyledone Maternale Karunkel
Plazentom 1 cm
Abb. 1: Uteruskarunkel im nicht-trächtigen Zustand
Abb. 2: Histologische Ansicht von Endometrium und Karunkel im nicht-trächtigen Zustand. Die Karunkel
stellt sich als drüsenfreier Bereich dar;
Vergrößerung 25x
2.1.2 Peri- und postpartale Veränderungen des Uterus und der Plazenta
Im Verlaufe der 285 Tage dauernden Gravidität (Grosser, 1927) verändern sich die Plazentome strukturell, vor allem im peripartalen Zeitraum. Es kommt mit fortschreitender Gravidität zu einer starken Größenzunahme der Plazentome (Ebert, 1993; Leiser et al., 1997a; Leiser et al., 1997b). In manchen Krypten atrophiert das maternale Epithel mehr oder weniger stark bzw. flacht ab, teilweise fehlt es sogar ganz, so dass die Basalmembran freiliegt (Björkman und Sollen, 1960). Es kann aber gegen Ende der Gravidität auch dazu kommen, dass im Kryptenepithel Plasmodien auftreten, die bis zu 10-20 Kerne besitzen (Björkman, 1954).
In den meisten Plazentomen bleiben die fetalen Zotten intakt, es kommt aber auch vor, dass das fetale Gewebe obliteriert und die Krypten mehr oder weniger stark mit Detritus gefüllt sind. In diesen Fällen ist das Kryptenepithel oft intakt (Björkman und Sollen, 1960).
Gegen Ende der Trächtigkeit (ca. ein bis zwei Tage vor der Geburt) nimmt die Anzahl der Trophoblastriesenzellen dann deutlich ab (Wooding, 1983).
Im Rahmen der Geburt kommt es zur Ablösung der fetalen Membranen, die dann in den ersten Stunden nach der Geburt abgestoßen werden sollten (Björkman und Sollen, 1960). Die zugrunde liegenden Mechanismen, welche zur Loslösung der fetalen Membranen führen, sind nach wie vor noch nicht vollständig bekannt (Gross et al., 1991; Schlafer et al., 2000; Dilly et al., 2011; Shenavai et al., 2012). Nach dieser Ablösung bleiben die Uteruskarunkeln als bindegewebiges System zurück, wobei die Krypten teilweise leer und kollabiert sind (Björkman und Sollen, 1960), aber auch Überreste von Chorionzotten enthalten können (Archbald et al., 1972). Im Falle dieser Reste, so Archbald et al. (1972), kommt es zur Nekrose und Mineralisation und im weiteren Verlauf zur Phagozytose dieser Reste bzw. der Abgabe mit den physiologischen Lochien. In den ersten fünf Tagen post partum wird eine Vasokonstriktion deutlich, die zu Nekrosen in den Karunkeln führt, es wandern Leukozyten ein und eine komplette Desorganisation des Gewebes entsteht (Gier und Marion, 1968). Bei den Leukozyten handelt es sich um Lymphozyten, Plasmazellen, Histiozyten und Granulozyten (Gier und Marion, 1968). Die oberflächlichen Schichten der Karunkel werden abgeschilfert und damit Teil der Lochien (Archbald et al., 1972).
Es kommt anschließend zur Heilung, wobei die Angaben über die vollständige Wiederherstellung der Epitheloberfläche schwanken. So berichten Archbald et al.
(1972) über eine Dauer von 19 Tagen, Marion und Gier (1968) von mindestens 25 Tagen.
Direkt nach der Geburt stellt der Uterus des Rindes einen großen, schlaffen Sack von der Länge bis zu einem Meter und einem Gewicht von 9kg dar, bei dem es in den Tagen post partum zur drastischen Größenreduktion, Gewebereorganisation und Heilung kommt (Gier und Marion, 1968). Das vormals fruchttragende Horn ist dabei meist größer als das nicht fruchttragende Horn, was sogar bis zur nächsten Trächtigkeit so erhalten bleiben kann. Obwohl die Größe des Uterus insgesamt durch Kontraktionen des Myometriums verringert wird, entsteht im Endometrium während des ersten Tages post partum ein starkes Ödem, welches einige Tage anhält (Gier und Marion, 1968). Archbald et al. (1972) berichteten sowohl von degenerierten als auch von regenerierten Epithelzellen im interkarunkulären Endometrium am ersten Tag post partum, wobei während keiner Phase der uterinen Involution das Epithel als fehlend anzusehen war. Die Regeneration ging, so Archbald et al. (1972), von basalen Zellen des Epithels aus. Im Gegensatz dazu berichteten Gier und Marion (1968), dass das Epithel direkt nach der Geburt von dort aus zu regenerieren begann, wo es während der Geburt nicht stark verletzt wurde und dass erst am 8.
Tag post partum wieder eine geschlossene Epitheldecke vorhanden war. Ein Ersatz des degenerierten Epithels fand nach Gier und Marion (1968) aus dem Bereich des Drüsenepithels statt. Bretzlaff (1987) berichtete ebenfalls von zerstörtem Epithel in den ersten Tagen nach der Geburt und von einer dadurch erhöhten Entzündungsgefahr des Uterus in Verbindung mit den im Lumen befindlichen Lochien, welche einen guten Nährboden für Bakterien darstellten.
Eine vollständige Wiederherstellung der Verhältnisse im Uterus vor der Gravidität ist nötig, um eine erneute Trächtigkeit erreichen zu können (Llewellyn et al., 2008).
Dieser Involutionsprozess wird durch die Anzahl vorheriger Trächtigkeiten, die Jahreszeit und Stressfaktoren im Umfeld der Tiere beeinflusst (Marion et al., 1968).
Ein balanciertes, koordiniertes endokrines System ist wichtig für die normale Involution, wobei das vom Endometrium produzierte PGF2α eine extrem hohe
Bedeutung hat (Leslie, 1983). Die palpierbare Involution ist im Normalfall nach 40 Tagen post partum abgeschlossen (Marion et al., 1968), wobei die endgültige histologische Involution bis zu 50 Tage dauert (Gier und Marion, 1968). Durch Infektionen des Uterus, Nachgeburtsverhaltung oder einen schlechten Allgemeinzustand des Tieres kann sich die Involution verzögern (Marion et al., 1968).
Im Falle einer schweren Entzündung kann es zum Ersatz des Endometriumsgewebes durch Narbengewebe kommen, zu Verdickungen des Gewebes und zu Atrophie, Abflachung und zystischer Veränderung der Drüsen (Bretzlaff, 1987).
2.2 Erkrankungen des Uterus post partum
Die peripartale Phase ist als Zeitraum 3 Wochen prä- bis 3 Wochen post partum definiert und von kritischer Bedeutung für Gesundheit, spätere Milchproduktion und Ertragskraft einer Milchkuh (Drackley, 1999). Diese Periode zeichnet sich durch ein hohes Risiko für metabolische und infektiöse Erkrankungen aus.
Puerperale Metritis, Pyometra und klinische bzw. subklinische Endometritis stellen dabei häufige Komplikationen dar, die zu Infertilität oder Subfertilität führen können (Földi et al., 2006; Sheldon et al., 2009).
Schwierigkeiten bestanden lange Zeit in der Diagnose dieser Erkrankungen auf Grund mangelnder präziser Definitionen, außerdem wurde bei Diagnosestellungen häufig der Effekt auf die Reproduktion nicht berücksichtigt (Gilbert et al., 2005). So unterschieden sich die Zahlen über die Häufigkeit des Auftretens zwischen einzelnen Autoren je nach genutzter Diagnostik stark, ein Vergleich zwischen einzelnen Studien gestaltete sich somit schwierig (Sheldon et al., 2006).
Aus histologischer Sicht unterscheidet die Tiefe der Entzündung Metritis und Endometritis, wobei Endometritis eine Erkrankung lediglich der Gebärmutterschleimhaut darstellt, während bei der Metritis alle Uterussschichten betroffen sind (LeBlanc, 2008). Diese Definitionen haben sich jedoch unter Praxisbedingungen als wenig relevant dargestellt.
Sheldon et al. (2006) lieferten unter Einbeziehung der Ergebnisse einer großen Studie von LeBlanc et al. (2002) Unterscheidungskriterien für die einzelnen peripartalen Erkrankungen des bovinen Uterus, die sowohl unter Praxisbedingungen anwendbar sind, als auch die Auswirkungen auf die Reproduktion einbeziehen.
Puerperale Metritis tritt demnach nur in den ersten 21 Tagen post partum auf und stellt eine akute, systemische Erkrankung durch die Infektion des Uterus mit Bakterien dar. Sie ist durch einen vergrößerten Uterus mit wässrigem, rot-braunen, übelriechenden Ausfluss gekennzeichnet und tritt normalerweise in den ersten 10 Tagen nach der Geburt auf. Oft haben betroffene Tiere Fieber, zeigen Inappetenz, Apathie und reduzierte Milchleistung. Als Risikofaktoren gelten Nachgeburtsverhaltung, Dystokie und Tot- oder Zwillingsgeburten. Entsprechend dieser Definition wird eine Prävalenz von 40% innerhalb der ersten postpartalen Woche angenommen (Sheldon et al., 2009).
Pyometra bezeichnet nach Sheldon et al. (2006) die Ansammlung von purulentem oder mukopurulentem Material im Uteruslumen mit Erweiterung des Uterus und Vorhandensein eines aktiven Corpus luteum am Ovar. Obwohl die Zervix funktionell geschlossen ist, muss das Lumen nicht zwangsläufig vollständig verschlossen sein, so dass purulenter Ausfluss in der Vagina der betroffenen Tiere auftreten kann.
Endometritis entwickelt sich häufig aus einer Metritis und kann in zwei Formen auftreten: als klinische oder als subklinische Form. Diese Uteruserkrankung ist von besonderer Bedeutung, da sie definitionsgemäß erst ab dem 21. Tag post partum auftritt und je nach Dauer bis in den Zeitraum hineinreichen kann, zu dem die Kühe nach erfolgter Kalbung wieder besamt werden sollen (50-60 Tage p.p.). Damit hat sie vor allem Einfluss auf die Reproduktionsleistung der Tiere.
Die klinische Endometritis ist durch purulenten oder mukopurulenten uterinen Ausfluss in der Vagina 21 bzw. 26 oder mehr Tage post partum charakterisiert. Der Durchmesser der Zervix beträgt 7,5cm oder mehr. Zeichen einer systemischen Erkrankung, wie es bei der Metritis der Fall ist, fehlen. Ein Problem bei der Diagnose kann dabei die physiologische Uterusinvolution darstellen, die je nach Rasse, Alter und Ernährung der Tiere unterschiedlich schnell abläuft und mit dem Abgang größerer Massen an Lochien verbunden ist.
Die subklinische Endometritis ist als Entzündung des Endometriums ohne klinische Zeichen, wie beispielsweise purulentem Material im Uterus, definiert. Die Diagnose erfolgt bei Tieren ohne diese klinischen Zeichen durch eine zytologische Untersuchung (z.B. von Uterusspülungen), bei der die Anzahl der neutrophilen Granulozyten entscheidend ist. Liegt der Anteil der Neutrophilen am 21.-33. Tag post partum über 18% oder am 34.-47. Tag bei über 10%, so spricht man von subklinischer Endometritis.
Von den heutigen Hochleistungsmilchkühen erkranken 15-20% an klinischer, weitere 30% an subklinischer Endometritis (LeBlanc, 2008). Man kann also davon ausgehen, dass ungefähr die Hälfte aller Milchkühe mit dieser Erkrankung zu kämpfen hat, was die Bedeutung von Endometritis für die Forschung besonders stark hervorhebt. Denn durch die Erkrankung entstehen teils enorme Kosten, die sich aus Medikamenten- bzw. Tierarztkosten, verworfener Milch und erhöhter Arbeit zusammensetzen (Bretzlaff, 1987). Ein wichtiger Faktor bei den entstehenden Kosten ist die negative Wirkung von Endometritis auf die Fertilität. Die Zwischenkalbezeit sollte 12-13 Monate umfassen, wobei die Kuh nach 80-110 Tagen post partum wieder tragend sein sollte (Bretzlaff, 1987). Dieses ist nur dann zu erreichen, wenn die Kuh nach 50- 60 Tagen beim ersten beobachteten Östrus wieder erfolgreich besamt werden kann.
Damit die Kühe wieder tragend werden können, muss der Genitaltrakt vollständig die anatomische und funktionelle Beschaffenheit von vor der Trächtigkeit zurückerlangt haben. Mateus et al. (2002) berichteten von verlangsamter Involution bei Infektion des Uterus und erhöhter Persistenz von pathogenen Bakterien bei Endometritis.
Außerdem führte die Erkrankung zu veränderter Ovaraktivität, wobei es zu verlängertem Anöstrus, verlängerten Lutealphasen und Ovarzysten kam. Gilbert et al. (2005) fanden heraus, dass sich Endometritis negativ auf die Reproduktion auswirkte: die nicht-trächtigen Tage post partum waren erhöht (206 Tage bei Endometritis, 118 Tage ohne Endometritis), die Anzahl an Tieren, die am 300. Tag wieder tragend waren, erniedrigt (63% mit Endometritis, 89% ohne) und die Trächtigkeitsrate nach erster Besamung herabgesetzt (11% bei Endometritis, 36%
ohne). LeBlanc et al. (2002) berichteten im Zusammenhang mit Endometritis
außerdem von 73% erhöhtem Risiko für eine Keulung auf Grund mangelnder Fertilität.
Die Wahrscheinlichkeit einer Ovulation post partum ist bei Tieren mit Uteruserkrankung durch verlangsamtes Wachstum des dominanten Follikels am Ovar, niedrigere periphere Östrogenkonzentrationen und Störung der Hypothalamus- und Hypophysenfunktion niedriger (Sheldon et al., 2009). Wenn Kühe mit Uteruserkrankungen ovulieren, haben sie niedrigere periphere Plasma-Progesteron- Konzentrationen. Außerdem sind die Lutealphasen oft verlängert, was dadurch zustande kommen könnte, dass das entzündete Endometrium mehr Prostaglandine der E-Serie, anstatt der sonst üblichen und für die Luteolyse nötigen F-Serie, synthetisiert.
Über die Entstehungsmechanismen von Uteruserkrankungen ist also schon einiges bekannt, aber vieles liegt noch im Dunkeln. Während der Gravidität ist der Uterus zunächst steril, aber im Rahmen nahezu jeder Geburt beim Rind kommt es zur Besiedelung mit Bakterien, da die anatomischen Barrieren nicht mehr gegeben sind (Bondurant, 1999; Singh et al., 2008). Die Vulva ist relaxiert und die Zervix dilatiert, so dass Bakterien aus der Umgebung des Tieres in das Uteruslumen vordringen können (Sheldon, 2004). In den zwei Wochen nach der Geburt sind 93% aller Uteri mit aeroben und anaeroben Bakterien besiedelt, aber diese werden in den meisten Fällen innerhalb der ersten 2-4 Wochen nach der Geburt spontan eliminiert (Elliott et al., 1968; Bretzlaff, 1987). Zwischen Tag 7 und Tag 14 kann es zu einem starken Anstieg der bakteriellen Besiedlung und der Anzahl an Tieren mit bakterieller Infektion kommen, was bedeutet, dass nicht nur die anfängliche Besiedelung im Rahmen der Geburt für Uterusprobleme verantwortlich ist. Die qualitative und quantitative Besiedelung des Uterus mit Bakterien ist abhängig von der Balance im Tier zwischen Kontaminationsfaktoren der Umgebung und den vorhandenen Bakterienarten einerseits sowie den Abwehrmechanismen des Tieres und seiner Immunantwort andererseits (Sheldon, 2004). Dabei spielt die hormonelle Lage des Tieres eine wichtige Rolle (LeBlanc, 2008). Die Dominanz von Progesteron wird mit einer erhöhten Empfänglichkeit gegenüber uterinem Bakterienwachstum und verminderter Clearance in Verbindung gebracht, während Östrogen bzw.
beginnender Östrus die Elimination von Bakterien aus dem Uterus verbessern (Hussain, 1989; Bondurant, 1999; Lewis, 2004).
Der peripartale Zeitraum beim Rind ist durch eine Phase der negativen Energiebilanz gekennzeichnet. Parameter der Fettmobilisation wie NEFA (non-esterified fatty acids) und BHB (β-Hydroxybutyrat) bzw. der Proteinmobilisierung wie UREA (Harnstoff) sind erhöht (Wathes et al., 2007a), wobei Tiere mit Erkrankungen des Uterus stärker erhöhte Werte durch ihre geringere Aufnahme von Trockenmasse aufweisen als gesunde Tiere. Diese Erhöhung hat eine deutliche Beeinträchtigung der Funktion von neutrophilen Granulozyten zur Folge (Hammon et al., 2006), die eine wichtige Funktion als erste Abwehr gegen Bakterien im Uterus haben (Sheldon, 2004). Es kommt also peripartal zu erhöhter Empfänglichkeit gegenüber Infektionen. Auch Cai et al. (1994) beobachteten Defekte von neutrophilen Granulozyten bei allen Kühen mit abnormalen Bedingungen nach der Geburt. Die Superoxid-Produktionsaktivität und die Chemotaxis der Neutrophilen waren bei Kühen mit Mastitis oder Metritis niedriger, was einen prädisponierenden Faktor für die Entstehung der Erkrankungen darstellen könnte.
Außerdem zeigten Urton et al. (2005) und Huzzey et al. (2007), dass es einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Metritis und der Dauer und Menge der Futteraufnahme gibt. Sie konnten nachweisen, dass bei Tieren mit verringerter Futteraufnahme und -dauer ein erhöhtes Risiko für die Entstehung von Metritis besteht.
Eine deutlich negative Energiebilanz ante partum bringt eine reduzierte systemische IGF-I-Konzentration (Taylor et al., 2004) im Blut mit sich und wird mit einem erhöhten Entzündungsgrad im Uterus sowie verzögerter Uterusinvolution und Heilungsprozessen nach dem Kalben in Verbindung gebracht (Wathes et al., 2007b;
Wathes et al., 2009). Weiterhin beschrieben Piechotta et al. (2012), dass niedrige IGF-I-Blutspiegel zwischen Tag 242 und 248 nach künstlicher Besamung deutlich die Tiere aufzeigten, die nach dem Kalben Erkrankungen entwickelten.
Es gibt also deutliche Hinweise darauf, dass das IGF-System als potentes Wachstumsfaktorsystem, welches auch auf die Wundheilung positive Effekte hat (Lynch et al., 1987; Lynch et al., 1989; Bitar, 1997), an den postpartalen
Heilungsprozessen im Uterus beteiligt sein könnte. Außerdem sind von diesem System ausgehende, immunmodulatorische Effekte denkbar (Kooijman et al., 2002;
Vangroenweghe et al., 2005). Da das IGF-System durch die Nährstoffversorgung des Tieres reguliert wird (Breier et al., 1986; Spicer et al., 1990; Roberts et al., 1997;
Taylor et al., 2004), welche wiederum Einfluss auf die Empfänglichkeit der Kühe gegenüber einer Uteruserkrankung hat, kommt das IGF-System als Mediator des Einflusses einer stark negativen Energiebilanz in Frage. Neuste Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der Energiebilanz post partum, dem IGF-I in der Leber bzw. dem Blut und der Expression des IGF-Systems im Uterus des Rindes lieferten Wathes et al. (2011).
2.3 Das IGF-System
Das IGF-System besteht zum einen aus den beiden Liganden (IGF-I und IGF-II), den beiden Rezeptoren (IGF1R und IGF2R), sechs Bindungsproteinen (IGFBPs) und weiteren, als IGF-Bindungsprotein-related-Proteine bezeichneten Proteinen, zu denen zum Beispiel das IGFBP-7 gehört.
2.3.1 Liganden des IGF-Systems
Die Insulin-like growth factors (IGF-I und IGF-II) sind hoch sequenzhomologe, niedrigmolekulare Polypeptide, die dem Proinsulin strukturell sehr ähnlich sind (Bowman et al., 2010). Aus vergleichenden Untersuchungen in verschiedenen Säugetierarten ist bekannt, dass die IGF-Struktur hoch konserviert ist. Es gibt zwischen den beiden Peptiden nur wenige Aminosäuresubstitutionen, was darauf hindeutet, dass eine evolutionäre Divergenz dieser Proteine verhindert wurde (Daughaday und Rotwein, 1989). Die Aminosäuresequenz des bovinen IGF-I ist identisch mit dem humanen, während sich das IGF-II zwischen den beiden Spezies in drei Aminosäuren unterscheidet (Honegger und Humbel, 1986). IGFs sind durch ihre zellwachstumsfördernde Wirkung für normales systemisches Wachstum und Entwicklung des Körpers essentiell (Clemmons, 1998).
Bei der Bezeichnung ,,Somatomedin“ (Daughaday et al., 1972) handelt es sich um ein Synonym für ,,IGF“, welches von den Entdeckern des IGFs geprägt wurde und
eine stärker eingeschränkte Bedeutung hat. Sie deutet darauf hin, dass die IGFs als Mediatoren die Wirkung von Growth Hormon (GH) vermitteln können und von diesem reguliert werden (Zapf und Froesch, 1986). Salmon und Daughaday (1957) hatten herausgefunden, dass die stimulierende Wirkung von GH auf das Knochengewebe durch eine sekundäre Substanz vermittelt wurde. Man sprach von der sogenannten Somatomedin-Hypothese, bei der von einer endokrinen Wirkung der IGFs ausgegangen wurde. Erst viele Jahre, nachdem die Existenz von Somatomedin(en) von Salmon und Daughaday postuliert worden war, wurden IGF-I und IGF-II identifiziert (D'Ercole und Calikoglu, 2001). Alles deutete zunächst darauf hin, dass die Leber der Hauptort oder sogar der einzige zur IGF-Synthese befähigte Ort im Körper war (D'Ercole und Calikoglu, 2001). Zu dieser These passen die Beobachtungen von Vicini et al. (1991) beim Rind, die zeigten, dass eine Injektion von bST (bovines Somatotropin oder GH) zu einer Erhöhung des Blut-IGF-I-Spiegels während aller Laktationsphasen bzw. der Trockenperiode führte. Dieser Effekt fiel für IGF-II weniger deutlich aus, es gab lediglich eine Tendenz zur Erhöhung während der Trockenstehzeit. Ähnliches beobachteten Bilby et al. (1999), die von einer Erhöhung des Blut-IGF-I-Wertes nach bST-Gabe sowohl bei laktierenden als auch bei nicht-laktierenden Kühen berichteten.
Erste Beweise für eine weit verbreitete IGF-I-Synthese im Körper unter der Kontrolle von GH lieferten unter anderem D’Ercole et al. (1984). Sie entfernten in ihrer Studie Ratten operativ die Hypophyse, welche allgemein als Quelle des GH im Körper bekannt ist. Es konnte gezeigt werden, dass der IGF-I-Gehalt in den untersuchten Organen höher war, als durch reine Verteilung aus dem Blut möglich gewesen wäre.
Mit dem Wegfall des GH sank der IGF-I-Gehalt der Gewebe deutlich ab und stieg in vier von fünf untersuchten Organen bei exogener GH-Gabe wieder auf das Niveau der Kontrolltiere an.
Ähnlich wie D’Ercole et al. (1984) es für die Ratte berichteten, gab es auch bei der Maus Hinweise auf eine GH-Regulation des IGF. So wiesen Mathews et al. (1986) die IGF-I-Expression in verschiedenen Geweben von GH-Knockout-Mäusen nach, wobei die Stärke der Expression in der Leber durch GH-Gabe deutlich anstieg, was bei den anderen untersuchten Geweben nicht der Fall war.
D’Ercole und Calikoglu (2001) vermuteten durch diese Erkenntnisse, dass das IGF vor allem lokal in den Organen auto- bzw. parakrin wirkt. Bestätigt wurde dies übereinstimmend durch Yakar et al. (1999) und Sjörgren et al. (1999), die mit Hilfe eines Mausmodells zeigen konnten, dass die Leber zwar für 75% des IGF-I im Blut verantwortlich war, ein leberspezifischer Knockout des IGF-I-Gens aber keine Auswirkungen auf das Wachstum der Tiere hatte. Sie lieferten damit einen Gegenbeweis für die Absolutheit der Somatomedin-Hypothese.
Beim Rind ist die Synthese von IGFs mittlerweile in zahlreichen Geweben nachgewiesen, so beispielsweise in der Leber (Rhoads et al., 2008; Fenwick et al., 2008a), in reproduktiven Organen (Schmidt et al., 1994; Ohtani et al., 1996; Schams et al., 1999; Meikle et al., 2001; Pershing et al., 2002; Pushpakumara et al., 2002;
Llewellyn et al., 2008; Rhoads et al., 2008; Richterich, 2008; Fenwick et al., 2008b;
Wathes et al., 2011) und in verschiedenen embryonalen (Moore et al., 2007) bzw.
fetalen Geweben (Farin et al., 2010).
Ein weiterer wichtiger Regulator der IGFs ist der Ernährungszustand, speziell die Protein- bzw. Energieversorgung, wobei die IGFs die entscheidende Verbindung zwischen Ernährung und Wachstum herstellen (Thissen et al., 1994). Rutter et al.
(1989) wiesen bei Rindern nach, dass die Energieverfügbarkeit und die Blutkonzentration von IGF-I positiv korreliert sind. Ähnliches wurde von Spicer et al.
(1990) berichtet. Bei einer stark negativen Energiebilanz von Milchkühen im peripartalen Zeitraum kommt es zum Absinken des Blut-IGF-I-Wertes (Llewellyn et al., 2007; Wathes et al., 2007b; Wathes et al., 2009; Wathes et al., 2011). Eine negative Korrelation besteht beim Rind zwischen dem Blut-IGF-I-Wert und Parametern, die auf eine verstärkte Fett- bzw. Proteinmobilisierung bei einer negativen Energiebilanz hindeuten, wie beispielsweise dem Keton Betahydroxybutyrat, den nicht-veresterten Fettsäuren und der Harnsäure (Wathes et al., 2007a). Außerdem korreliert eine hohe Milchleistung negativ mit dem Blut-IGF-I- Wert (Taylor et al., 2004). Mehrere Autoren berichteten, dass es beim Rind peripartal durch Herunterregulation der Leber-GH-Rezeptoren zum Absinken des IGF-I-Levels im Blut kommt (Kobayashi et al., 1999; Lucy et al., 2001; Radcliff et al., 2004). Dies führe, so Lucy et al. (2001), zur Entkopplung der GH-IGF-Achse im peripartalen
Zeitraum und damit zu erhöhten GH-Werten im Blut, da der negative Feedbackmechanismus durch das IGF wegfalle. Das erhöhte GH stelle dabei ein wichtiges hormonelles Signal dar, welches die metabolischen Voraussetzungen für den Beginn der Laktation ermögliche.
Bei der Regulation von IGF-I scheint zusätzlich auch das Insulin eine Rolle zu spielen. Es besteht eine Korrelation zwischen beiden Parametern, wobei verringerte Glucosewerte im Blut eine Erniedrigung von IGF-I parallel mit dem Insulin zur Folge hatten (Wathes et al., 2009), während bei erhöhten Glucosewerten auch IGF-I und Insulin anstiegen (Rutter et al., 1989). Für den Menschen wird ein Zusammenhang zwischen Adipositas, Typ-2-Diabetes und Krebs vermutet, wobei die beim Diabetes erhöhten Insulinwerte und eine parallele Erhöhung von IGF-I das Zellwachstum in der Peripherie und damit auch das Wachstum maligner entarteter Zellen fördern könnten (Gallagher und LeRoith, 2010).
Als weitere Regulatoren der IGFs kommen verschiedene Hormone in Frage.
Thyroxin scheint Einfluss auf die IGFs zu haben, denn bei Menschen mit Hypothyreoidismus ist das IGF-I deutlich erniedrigt (D'Ercole, 1987). Zudem wird eine Regulation der IGF-System-Expression in verschiedenen, vor allem reproduktiven Organen der Säuger durch gonadale Steroidhormone von vielen Autoren belegt (Ghahary et al., 1990; Simmen et al., 1990; Giudice et al., 1993;
Stevenson et al., 1994). Auch beim Rind wird eine solche Regulation diskutiert (Geisert et al., 1991; Ohtani et al., 1996; Robinson et al., 2000; Meikle et al., 2001).
Daughaday und Rotwein (1989) vermuteten weiterhin, dass Androgene beim Mann und Östrogene bei der Frau das Körperwachstum stimulieren, indem sie die GH- Sekretion und in Verbindung damit auch die IGF-Synthese anregen, was vor allem in der Pubertät von Bedeutung sei.
Durch ihre Eigenschaft, die Proliferation in Geweben zu beeinflussen, werden beide IGFs mit Tumorwachstum in Verbindung gebracht (Gallagher und LeRoith, 2010).
Foulstone et al. (2005) sprachen vom IGF-System als wichtigem Modifikator von Proliferation, Wachstum, Überleben und Behandlungssensitivität der Tumorzellen.
Des Weiteren wird dem IGF-System von vielen Autoren eine positive Wirkung auf die Wundheilung attestiert, wobei die IGFs die negativen Wirkungen von Typ-I-Diabetes
und erhöhtem Cortisolspiegel auf die Heilung ausgleichen können (Lynch et al., 1987; Lynch et al., 1989; Gartner et al., 1992; Suh et al., 1992; Steenfos, 1994; Bitar, 1997).
Außerdem hat das IGF-System eine direkte Wirkung auf das Immunsystem: so berichten Koojiman et al. (2002) von Inhibition der granulozytären Apoptose beim Menschen durch IGF-I. Vangroenweghe et al. (2005) vermuten beim Rind einen Zusammenhang zwischen dem niedrigen IGF-I im Blut zu Beginn der Laktation und der vermehrten Empfänglichkeit gegenüber Erkrankungen. Durch das erniedrigte IGF sei der stimulatorische Effekt auf die Qualität und Funktionalität der neutrophilen Granulozyten verringert.
Eine besonders große Rolle spielen die IGFs für das fetale Wachstum (D'Ercole und Underwood, 1985; D'Ercole, 1987; Bauer et al., 1998; Gicquel und Le Bouc, 2006;
Forbes und Westwood, 2008), was durch verschiedene Mausmodelle nachgewiesen wurde. So zeigten Powell-Braxton et al. (1993), dass ein homozygoter Knockout von IGF-I bei 95% der Mäuse zu perinataler Sterblichkeit führte. Die Feten hatten 60%
weniger Körpergewicht als ihre Wildtyp-Wurfgeschwister, unterentwickelte Lungen und Muskeldystrophien. Liu und LeRoith (1999) entwickelten ein anderes Knockout- Mausmodell und berichteten ebenfalls von schweren prä- und postnatalen Wachstumsstörungen durch einen homozygoten IGF-I-Knockout, jedoch von besseren Überlebensraten der Feten (42%). DeChiara et al. (1990; 1991) lieferten den Beweis, dass IGF-II dem Vorgang des Imprinting unterliegt. Das maternale IGF- II-Allel wird zwar weitervererbt, aber bei den Nachkommen mit der Ausnahme des Plexus chorioideus und der Leptomeningen nicht exprimiert. Es ,,schweigt“
gewissermaßen. Zur Synthese von IGF-II wird nur das paternal vererbte Allel herangezogen. Ein Knockout des maternalen Gens erzeugte demzufolge keine Wachstumsveränderungen bei den Nachkommen, während das Fehlen des paternalen Allels zur Reduktion des Geburtsgewichtes auf 60% der Wildtypgeschwister führte. Im Vergleich zum Verlust der IGF-I-Expression bewirkte das Fehlen des IGF-II nur präpartal Wachstumsveränderungen, postpartal nahmen die Tiere normal an Gewicht zu und erreichten das Erwachsenenalter. DeChiara et al. (1990; 1991) bewiesen folglich, dass IGF-II vor allem präpartal eine hohe
Bedeutung hat, während IGF-I sowohl prä- als auch postpartal unerlässlich für normales Wachstum ist.
In einer großen Studie analysierten Liu et al. (1993) verschiedene Kombinationen von Knockouts der IGF-System-Komponenten. Sie untersuchten die Auswirkungen von Verlusten des IGF-I, IGF-II und IGF1R und kombinierten diese Mutationen miteinander. Deutlich wurde vor allem, dass der Phänotyp bei Tieren mit Mutationen zweier IGF-System-Komponenten noch stärker beeinflusst war als bei einer Einzelmutation. So hatten Tiere ohne IGF-I bzw. IGF-II 60% des Geburtsgewichtes ihrer Wildtypgeschwister, während eine Kombination von beiden das Gewicht auf 30% reduzierte. Mutationen des IGF1R, wodurch die Wirkung der Liganden unterbunden wurde, führten zur Reduktion des Geburtsgewichtes auf 45% im Vergleich zum Wildtyp, eine Kombination zwischen IGF-I bzw. IGF-II und dem IGF1R auf 45 bzw. 30%. Außer dem reinen Knockout von IGF-II führten alle Mutationen zu erhöhter Sterblichkeit, bei allen Rezeptor-Knockouts sogar zu vollständiger Sterblichkeit der betroffenen Feten während der Geburt aufgrund von Atemversagen.
Wichtige Erkenntnisse dieser Studie waren zum einen, dass beide IGFs über den IGF1R das fetale Wachstum beeinflussen, wobei IGF-II noch über einen weiteren, unbekannten Rezeptor (XR) wirkt. Louvi et al. (1997) zeigten dann mit weiteren Knockoutversuchen an Mäusen, dass es sich bei dem XR vermutlich um den Insulinrezeptor handelt, der damit für einen Teil der IGF-II-Wirkung in vivo verantwortlich ist.
Gluckman und Butler (1983) stellten am Schaf dar, dass der Blut-IGF-I-Wert bei Feten niedriger als bei adulten Schafen war und im Verlauf der Gravidität stetig anstieg. Im Gegensatz dazu waren die Blut-IGF-II-Level während der letzten 100 Tage der Trächtigkeit beim Fetus dreifach höher als beim adulten Tier und fielen zum Zeitpunkt der Geburt rapide ab. Diese Studie bestätigt für den Wiederkäuer, was schon DeChiara et al. (1990; 1991) für die Maus vermutet hatten: einen peripartalen Switch von der Dominanz des IGF-II präpartal zu IGF-I postpartal.
Im Reproduktionstrakt des Rindes wurden beide IGF-Liganden bereits mehrfach im Uterus, bei Uterusspülungen und in der Plazenta nachgewiesen (Geisert et al., 1991;
Ohtani et al., 1996; Robinson et al., 2000; Meikle et al., 2001; Pershing et al., 2002;
Llewellyn et al., 2008; Rhoads et al., 2008; Richterich, 2008; Wathes et al., 2011).
Auch im Eileiter konnten sie lokalisiert werden (Schmidt et al., 1994; Pushpakumara et al., 2002). Im Eierstock wird dem IGF eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Ovarfunktion zugerechnet (Schams et al., 1999). Taylor et al. (2004) zeigten, dass Kühe mit niedrigeren IGF-I-Werten im Blut länger brauchten, um nach erfolgter Geburt wieder zyklisch zu werden. Sie wurden zudem schlechter wieder tragend, was die Bedeutung des IGF für die reproduktive Leistung der Tiere unterstreicht.
Für den Uterus wurde gezeigt, dass sich die Expression der Liganden im Endometrium bzw. der IGF-Gehalt in Uterusspülungen in verschiedenen Phasen des Zyklus unterschied (Geisert et al. 1992; Meikle et al. 2001; Ohtani et al. 1996). Durch eine negative Energiebilanz hingegen schien die IGF-Expression im Uterus nicht beeinflusst zu werden (Wathes et al., 2011).
Die Gabe von bST bewirkte bei laktierenden Kühen keine Erhöhung des IGF-I- Gehaltes im Endometrium, während IGF-II im Ovidukt hoch- und im Endometrium herunterreguliert wurde (Pershing et al., 2002). Außerdem zeigten Rhoads et al.
(2008), dass die Ligandenexpression in Reproduktionstrakt und Leber nicht parallel verliefen. Diese Ergebnisse lassen auf eine gewebespezifische Regulation der IGFs schließen.
2.3.2 IGF-Rezeptoren
Das IGF-System beinhaltet nach bisherigem Kenntnisstand zwei bekannte Rezeptoren: den IGF1R und den IGF2R (siehe Abb. 4). Für die Vermittlung der IGF- Ligandenwirkung ist dabei vor allem der IGF1R verantwortlich (Czech, 1989).
Der IGF1R bildet ein Heterotetramer aus jeweils zwei α-Untereinheiten und zwei β- Untereinheiten (Czech, 1989). Die α-Untereinheit liegt vollständig extrazellulär und besitzt eine cysteinreiche Region, die für die Ligandenbindung verantwortlich ist (Jones und Clemmons, 1995). Die β-Untereinheit dagegen besteht aus einem hydrophoben transmembranösen und einem kleinen intrazellulären Teil, der Tyrosinkinaseaktivität besitzt (LeRoith et al., 1995). Der Typ-I-Insulinrezeptor und der IGF1R zeigen eine hohe Sequenzhomologie (Czech, 1989). So ist es nicht überraschend, dass beide Rezeptoren sowohl IGFs, als auch Insulin binden können:
der IGF1R bindet IGF-II geringfügig und Insulin deutlich schwächer als IGF-I, der Typ-I-Insulinrezeptor dagegen bindet Insulin deutlich stärker als IGF-I und IGF-II mit einer Präferenz für IGF-I gegenüber IGF-II (Jones und Clemmons, 1995). Außerdem ist eine Bildung von Hybridrezeptoren möglich, die aus jeweils einem Dimer von α- und β-Untereinheit des IGF1R und des Insulinrezeptors bestehen (Jones und Clemmons, 1995).
Die Aktivierung des IGF1R durch Bindung eines Liganden führt zur Autophosphorylierung des Rezeptors, was die intrazelluläre Vermittlung der IGF- Wirkung ermöglicht. Da dem IGF-System eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung zugerechnet wird, ist die Blockierung der durch IGF1R ausgelösten Signalkaskade und damit Hemmung der promitogenen Eigenschaften auf zellulärer Ebene ein Ansatz in der Krebsforschung, der auch schon zur Entwicklung wirksamer Medikamente geführt hat (Foulstone et al., 2005; Gallagher und LeRoith, 2010).
Ein weiterer Rezeptor, der IGF2R, ist in nahezu allen Zelltypen vorhanden und bindet IGF-II viel stärker als IGF-I, Insulin hingegen bindet er nicht (Czech, 1989). Der IGF2R wird auch als kationenunabhängiger Mannose-6-Phosphat-Rezeptor bezeichnet und unterscheidet sich strukturell und funktionell deutlich vom IGF1R. Er besitzt eine monomere Struktur und erkennt Mannose-6-Phosphat-Reste auf lysosomalen Enzymen (Jones und Clemmons, 1995). Ist der IGF2R membrangebunden im Trans-Golgi-Netzwerk zu finden, bewirkt er die Translokation von neu synthetisierten lysosomalen Enzymen in Endosomen. Auf der Zelloberfläche bindet er extrazelluläre Glykoproteine, die dann in Endosomen überführt und abgebaut werden (Jones und Clemmons, 1995). Der IGF2R ist ein wichtiger Regulator der Assoziation des IGF-II mit dem IGF1R: bindet das IGF-II an den membranständigen IGF2R, kommt es zur Internalisierung und Degradierung des Liganden (Czech, 1989).
Barlow et al. (1991) zeigten für die Maus, dass auch der IGF2R, ähnlich wie das IGF- II, dem genetischen Imprinting unterliegt. Anders als beim IGF-II ist allerdings das maternale Allel bei den Nachkommen aktiv, während das paternale Allel ruht. Wird das mutierte Allel also von der Mutter geliefert, sterben die Feten präpartal, bei
paternaler Transmission kommen sie lebend zur Welt und wachsen normal.
Interessant ist, dass die nicht lebensfähigen Feten 25-30% größer waren als die Wildtypgeschwister, erhöhte IGF-II-Werte im Blut und Herzabnormalitäten aufwiesen (Lau et al., 1994). Bei einer Kombination aus Knockouts von IGF-II und IGF2R konnten einige Nachkommen vom Tod durch den IGF2R-Knockout bewahrt werden (Filson et al., 1993). Der IGF2R scheint also eine wichtige regulatorische Funktion beim fetalen Wachstum zu haben, indem er zu hohe und dadurch für den Fetus toxische IGF-II-Konzentrationen verhindert (Filson et al., 1993; Jones und Clemmons, 1995). Sowohl der IGF1R, als auch der IGF2R wurden bereits in Uterus und der Plazenta des Rindes (Robinson et al., 2000; Llewellyn et al., 2008;
Richterich, 2008; Wathes et al., 2011), im Eileiter (Pushpakumara et al., 2002), in embryonalen (Moore et al., 2007) und in fetalen Geweben (Farin et al., 2010) nachgewiesen. Die Energiebilanz der Rinder scheint keinen Einfluss auf die Expression der Rezeptoren im Uterus zu haben (Wathes et al., 2011).
Abb. 4: Schematische Darstellung der Rezeptoren und Liganden des IGF-Systems (Bowman et al., 2010)
2.3.3 IGF-Bindungsproteine (IGFBPs)
Die IGFs kommen im Körper zumeist nicht in der freien Form vor, sondern an eines von sechs Mitgliedern der IGF-Bindungsproteinfamilie gebunden, welche eine vielfach höhere Affinität zu den Liganden haben, als die membranständigen Rezeptoren (Jones und Clemmons, 1995). Alle IGFBPs besitzen hohe strukturelle Homologie, binden spezifisch IGFs und haben vier Hauptfunktionen: 1.) der Transport der Liganden im Plasma und die Kontrolle darüber, wie viel der IGFs die Blutgefäße verlässt, 2.) die Verlängerung der Halbwertszeit von den Liganden im Blut und damit Regulation der metabolischen Clearance, 3.) das Sicherstellen einer gewebe- und zelltypspezifischen Lokalisation, 4.) direkte Modulation der Liganden- Rezeptor-Interaktion und dadurch eine indirekte Kontrolle der biologischen Aktionen von IGF-I und IGF-II. Neben diesen Funktionen sind auch direkte Effekte der BPs unabhängig von den Liganden beschrieben.
Während BP-1, -3 und -4 beide IGF-Liganden gleich stark binden, zeigen BP-2, -5 und -6 eine Präferenz für IGF-II (Jones und Clemmons, 1995). Im Blut kommt vor allem das BP-3 vor (Payet et al., 2004). Ungefähr 75% der Liganden im Plasma sind an einen Komplex aus BP-3 und einer säurelabilen Untereinheit (ALS) gebunden (Jones und Clemmons, 1995). In Anwesenheit der ALS wird die Bindung von IGF an ein Bindungsprotein erhöht, so zeigten Payet et al. (2004), dass der transendotheliale IGF-Transport in Anwesenheit der ALS deutlich verlangsamt wurde, was für eine verringerte IGF-Freisetzung vom Bindungsprotein spricht. Dieser Effekt wurde von Payet et al. (2004) auch für das BP-5 beschrieben, wenn auch weniger deutlich als beim BP-3.
Die Bindungsproteine können die Ligandenwirkung sowohl inhibieren als auch fördern (Jones und Clemmons, 1995). Bekannt ist, dass spezifische Proteasen die Bindungsproteine in Formen zerlegen, die keine oder reduzierte Affinität zu den Liganden haben, was auf Ebene der Rezeptoren eine Bindung der Liganden und somit deren Wirkung ermöglicht (Jones und Clemmons, 1995; Clemmons, 1998).
Außerdem sind posttranslationale Modifikationen der Bindungsproteine, z.B.
Phosphorylierung und Assoziation mit der Zelloberfläche oder der extrazellulären
Matrix möglich, wodurch ebenfalls die Affinität zu den Liganden deutlich abnimmt (Jones und Clemmons, 1995; Clemmons, 1998).
Wie schon für die Liganden beschrieben, steht auch die Synthese der Bindungsproteine unter der Kontrolle von GH (Clemmons, 1998).
Für das Rind ist bekannt, dass BP-2 bei negativer Energiebilanz im Blut ansteigt, was auf eine Regulation dieses Bindungsproteins durch die Energieversorgung hindeutet (Vicini et al., 1991). Eine Erhöhung des BP-2 im Blut und damit verstärkte IGF-Bindung könnte die Wirkung der Liganden in der Peripherie vermindern, wodurch BP-2 als Mediator der Ernährungswirkung auf das Wachstum in Frage kommt. Durch Gabe von bST und dadurch bedingtes Absinken des BP-2 im Blut zeigten Vicini et al. (1991) die von Clemmons (1998) postulierte GH-Abhängigkeit der Bindungsproteine für das Rind.
Fenwick et al. (2008a) fanden heraus, dass bei stark negativer Energiebilanz postpartal die Expression von BP-2 in der Leber erhöht war, während die anderen Komponenten des IGF-Systems in dieser Phase weniger stark exprimiert wurden.
Auch Roberts et al. (1997) berichteten in ihrer Studie, dass IGF-I und BP-3 bei negativer Energiebilanz sanken und BP-2 anstieg. Es scheint also beim Rind eine gegensätzliche Regulation von IGF-I und BP-3 einerseits und BP-2 andererseits vorzuliegen.
Die IGFBPs wurden bereits im Uterus des Rindes nachgewiesen (Geisert et al., 1991; Lucy et al., 1995; Kirby et al., 1996; Ohtani et al., 1996; Keller et al., 1998;
Robinson et al., 2000; Meikle et al., 2001; Pershing et al., 2002; Bilby et al., 2004;
Llewellyn et al., 2008; Rhoads et al., 2008; Richterich, 2008; Simmons et al., 2009;
Wathes et al., 2011), wobei ein Nachweis des IGFBP-1 nicht immer gelang. Mehrere Autoren haben bisher untersucht, wie sich eine Gabe von GH (=bST) auf die Expression der Bindungsproteine im Endometrium bzw. auf den BP-Gehalt in Uterusspülungen auswirkt (Lucy et al., 1995; Kirby et al., 1996; Pershing et al., 2002;
Bilby et al., 2004). Die Ergebnisse sind widersprüchlich, was an den unterschiedlichen Untersuchungsmethoden und -zeitpunkten der einzelnen Autoren liegen könnte, aber auch auf eine unterschiedliche Empfänglichkeit des Uterus
gegenüber GH zu verschiedenen Zeitpunkten des Zyklus bzw. der Gravidität hindeuten könnte.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Proteine, deren Affinität zu den IGF- Liganden niedriger war als die der Bindungsproteine, zu IGFBP-related Proteinen (IGFBP-rP) reklassifiziert (Collet und Candy, 1998). Davon sind, so Collet und Candy, bis heute insgesamt vier bekannt. Oh et al. (1996) hatten schon früher dargelegt, dass die Aminosäuresequenz des humanen mac25-Genproduktes 20- 25% Homologie mit den IGFBPs aufwies und spezifisch IGFs band, wodurch es den Namen IGFBP-7 bekam (Oh et al., 1996). Diese Erkenntnisse führten dann zu der Annahme, dass es weitere Proteine dieser Art geben könnte. Kim et al. (1997) wiesen die Existenz eines weiteren IGFBP-rPs nach, welches ebenfalls spezifisch IGF-Liganden band und daher als IGFBP-8 bezeichnet wurde. IGFBP-7, welches auch als IGFB-rP1 bezeichnet wird, wurde bereits von Kutsukake et al. (2007) im humanen Endometrium nachgewiesen, wo ihm eine Rolle bei der Dezidualisierung der endometrialen Stromazellen zugesprochen wurde. Außerdem zeigten Kutsukake et al. (2010), dass das IGFBP-7 in vitro Einfluss auf endometriale Drüsenzellen hat, und vermuteten daher eine Rolle des BP-7 bei der Formation und sekretorischen Funktion der Drüsen. Auch im Uterus der Ratte wurde es gefunden, wo Tamura et al.
(2004) eine Mitwirkung an der endometrialen Funktion während der Implantation des Embryos und der Dezidualisierung vermuten. Beim Rind wurde das IGFBP-7 auf mRNA-Ebene bereits im Corpus luteum, Ovidukt und Uterus nachgewiesen (Casey et al., 2004).
3. Material und Methoden
Die Zusammensetzungen der verwendeten Puffer und Lösungen, sowie die benutzten Reagenzien und Geräte sind im Anhang aufgeführt.
3.1 Gewebeentnahme und -bearbeitung
3.1.1 Lokalisation des IGF-Systems während der präpartalen Phase
In diesem ersten Teil der Studie wurden 17 klinisch gesunde, multipare Milchkühe ausgewählt, die einen vergleichbaren Body Conditioning Score besaßen und in der vergangenen Laktation eine Milchleistung von 9500kg nicht überschritten. Sie stammten alle aus einem Milchbetrieb (Großbetrieb der Agrargesellschaft mbH Siedenlangenbeck, Kuhfelde) und waren in der zweiten oder dritten Laktationsperiode. Am 248. Tag nach künstlicher Besamung wurden Blutproben aus der Schwanzvene entnommen und der Blut-IGF-I-Wert bestimmt. Anhand des IGF-I- Wertes wurden die Tiere in zwei Gruppen unterteilt: Eine IGF-high- (n=10) und eine IGF-low-Gruppe (n=7). Die Tiere der IGF-high-Gruppe hatten bei der Auswahl IGF-I- Werte von 180 bis 250 ng/ml und die der IGF-low-Gruppe von 60 bis 100 ng/ml. Der Grenzwert zwischen den beiden Gruppen lag bei 140 ng/ml.
Die Auswahl der Tiere, die Blutentnahmen, die Betreuung und tägliche Untersuchung der Tiere sowie die Durchführung der Kaiserschnitte wurden von der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover übernommen. Der Kaiserschnitt wurde dabei bei allen Versuchstieren jeweils am 275. Trächtigkeitstag durchgeführt. Bei dieser nicht medikamentell eingeleiteten Geburt wurden nach Entwicklung des Kalbes zwei Plazentome entnommen. Dazu wurde ein Emaskulator am Karunkelstiel angesetzt, um größere Blutungen zu verhindern und anschließend mit einem Skalpell das Plazentom abgesetzt. Außerdem wurde ein Stück interkarunkuläres Uterusgewebe (ca. 5x10 cm) mit Hilfe eines Skalpells entnommen.
Von Plazentom und Uterus wurde jeweils ein Teil für die molekularbiologische Untersuchung in Alufolie gewickelt in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C
gelagert. Die Plazentome wurden dafür zunächst in Scheiben geschnitten (ca. 5mm dick), wobei die Schnittführung rechtwinklig zur Längsachse des Plazentoms erfolgte.
Der rein maternale Teil (Karunkelstiel) und der rein fetale Teil (plazentomäres Chorion) wurden entfernt, um nur fetomaternales, interdigitierendes Gewebe für die molekularbiologische Untersuchung zu erhalten.
Beim interplazentomären Uterusgewebe wurde das Endometrium mit Hilfe einer kleinen Schere abpräpariert und dann in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Ein weiterer Teil der entnommenen Gewebeproben von Plazentomen und Uterus wurde für die histologische Untersuchung in Bouin’scher Lösung bzw. Formalin nach Lillie für 48 Stunden fixiert. Die Plazentomstücke enthielten hierfür sowohl maternales (Karunkelstiel), sowie interdigitierendes und auch rein fetales Gewebe (plazentomäres Chorion) und wurden vor der Fixierung lediglich in Scheiben geschnitten. Das Uterusgewebe wurde ebenfalls in kleinere Stücke geschnitten (ca.
10x10x5mm), um eine gute Fixierung zu ermöglichen.
Nach der Fixierung wurden die Gewebeproben in Einbettungskaspeln verbracht. Die formalinfixierten Proben wurden dann zur Entfernung des Fixans zunächst ca. 3 Stunden unter fließendem Wasser gespült und anschließend in den Einbettungsautomaten (Fa. Leica, Nussloch) gegeben, der die Einbettung nach unten aufgeführtem Protokoll bis zum Paraffin durchführte (Punkt 3.2.1). Mit Bouin’scher Lösung fixierte Proben wurden zunächst in 70%igem Alkohol aufbewahrt, der an den darauf folgenden Tagen mehrmals gewechselt wurde, um das Fixans zu entfernen. Nach 1-2 Wochen wurden sie der Handeinbettung zugeführt, die nach dem unten aufgeführten Protokoll ablief (siehe Punkt 3.2.2).
3.1.2 Lokalisation des IGF-Systems während der postpartalen Phase
Für diesen zweiten Teil der Studie wurden 12 klinisch gesunde, multipare Milchkühe nach den oben aufgeführten Kriterien und aus demselben Betrieb ausgewählt. Die Unterteilung der Tiere in eine IGF-high- und eine IGF-I-low-Gruppe erfolgte wie oben beschrieben, wobei die Tiere der IGF-high-Gruppe (n=6) bei der Auswahl IGF-I-
Werte von 180 bis 280 ng/ml und die der IGF-low-Gruppe (n=6) von 80 bis 140 ng/ml hatten.
Im Gegensatz zum ersten Teil wurden in diesem Versuchsteil keine Kaiserschnitte durchgeführt. Die Kühe dieser Gruppe kalbten spontan ab und die Probenentnahme erfolgte eine halbe Stunde post partum transvaginal. Zwei Plazentome wurden wiederum mit Hilfe eines Emaskulators entnommen. Die weitere Bearbeitung der Plazentomproben für die Molekularbiologie und die Histologie erfolgte wie unter 3.1.1 bereits erläutert.
Nach abgeschlossener Probenentnahme wurde der Abgang der Nachgeburt abgewartet. Erfolgte dieser nicht innerhalb 12 Stunden post partum, wurden die betroffenen Tiere von der Studie ausgeschlossen (ursprüngliche Gruppengröße von IGF-I-high bzw. - low: n=10).
Nachdem die Nachgeburt abgegangen war, wurde den Tieren ein Liter einer auf 39°C erwärmten physiologischen NaCl-Lösung (Braun, Melsungen, Deutschland) mit 5mg LPS (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA, Endkonzentration 5µg/ml) mittels eines transvaginalen Katheters in den Uterus infundiert, um dort eine lokale Entzündungsreaktion auszulösen. Drei Stunden später wurden die Tiere mit 30.000mg Pentobarbital-Natrium (Release®, WDT, Garbsen, Deutschland) intravenös euthanasiert. Der Uterus wurde in seiner Gesamtheit entnommen, indem die Kuh an den Hinterbeinen aufgehängt und zwei bis fünf cm kranial des Euteransatzes der Bauchraum durch einen transversalen Schnitt auf einer Länge von ca. 50cm eröffnet und der Uterus kaudal der Zervix abgesetzt wurde. Es erfolgte dann eine erneute Beprobung.
Nach dorsaler Eröffnung der Uteri mit Hilfe eines Skalpells wurden jeweils zwei Karunkeln entnommen und ein ca. 5x10cm großes Stück interkarunkuläres Uterusgewebe. Die weitere Bearbeitung der Proben für die Molekularbiologie und die Histologie erfolgte wie für den ersten Versuchsteil bereits erläutert, wobei die Karunkeln analog der Plazentome behandelt wurden.
Der Tierversuch (sowohl der erste als auch der zweite Teil der Studie) wurde genehmigt vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Laves, Oldenburg; AZ 33.9-42502-04-09/1696.
3.2 Histologie
3.2.1 Protokoll der Handeinbettung (für Bouin-fixierte Proben)
70% Ethanol über Nacht
80% Ethanol über Nacht
100% Ethanol 2 Stunden Isopropanol 2 Stunden Xylol I 2 Stunden Xylol II 2 Stunden Paraffin I (ca.62°C) über Nacht Paraffin II (ca.62°C) 2 Stunden Paraffin III (ca.62°C) 1 Stunde
3.2.2 Protokoll des Einbettungsautomaten (für formalinfixierte Proben)
Programm: Routine Overnight
Alle Reagenzien im Einbettungsautomaten hatten Raumtemperatur, außer es ist im aufgeführten Protokoll anders erwähnt.
70% Ethanol PRÄ (Warteschritt) 2 Stunden 70% Ethanol 1, 5 Stunden 80% Ethanol 1, 5 Stunden 90% Ethanol 1, 5 Stunden 100% Ethanol 1 Stunde 100% Ethanol 1 Stunde Isopropanol 1 Stunde Xylol I 1 Stunde Xylol II (35°C) 1 Stunde Xylol III (50°C) 1 Stunde Paraffin I (62°C) 1 Stunde Paraffin II (62°C) 1 Stunde Paraffin II (62°C) 1 Stunde
Nach dem jeweils letzten Paraffinschritt wurden die Kapseln geöffnet, auf der Einbettungsstation (Fa. Leica, Nussloch) in 60°C wa rme Metallförmchen gelegt und mit flüssigem Paraffin ausgegossen. Die Einbettungskapseln dienten dabei als Deckel des Förmchens. Die ausgegossenen Proben wurden anschließend auf einer - 5°C kalten Platte ausgehärtet, aus den Förmchen ent fernt und bis zur Benutzung in speziellen Aufbewahrungsboxen (Fa. Medite, Burgdorf) gelagert.
3.2.3 Vorbereitung der Schnitte für die Histologie/Immunhistochemie
Mit Hilfe eines Rotationsmikrotoms (Fa. Leica, Nussloch) wurden aus den in Paraffin eingebetteten Proben 4µm dicke Schnitte hergestellt. Die Schnitte wurden zunächst auf ein Wasserbad gegeben, das mit destilliertem Wasser befüllt war, und anschließend auf silanbehandelte, gläserne Objektträger gezogen (Histobond, Paul Marienfeld, Laboratory Glassware, Lauda-Königshofen). Sie wurden dann über Nacht in einen Wärmeschrank (60°C) inkubiert und wa ren am nächsten Tag gebrauchsfertig. Bis zur Benutzung wurden die Schnitte bei Raumtemperatur in speziellen Aufbewahrungskisten dunkel gelagert.
3.2.4 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Um herauszufinden, welche Proben für eine immunhistochemische Untersuchung in Frage kamen, wurden zunächst von allen Proben Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbungen angefertigt. Diese Färbung ermöglicht einen guten Überblick über die Morphologie eines Gewebeschnittes.
Bei der HE-Färbung handelt es sich um eine dichromatische Färbemethode, bei der das basische Hämatoxylin die Zellkerne und das saure Eosin das Zytoplasma anfärbt.
Zunächst mussten dazu die Schnitte entparaffiniert werden, was mit Hilfe von Xylol geschah. Danach folgte eine Rehydrierung der Schnitte, die durch eine absteigende Alkoholreihe erfolgte und in destilliertem Wasser endete.
