Microcarrier-basierter Sprouting Assay

Um die Wirkung verschiedener Stimulanzien auf die Angiogenese in vitro zu testen, wurde ein Microcarrier-basierter Angiogenese-Assay eingesetzt. In diesem fungieren in eine drei-dimensionale eingebrachte Microcarrier als Träger für Endothelzellen. Ziel war es auch bei diesem Assay, eine organisierte Invasion von Endothelzellen in die drei-dimensionale Matrix und anschließend die Anordnung der Zellen zu einer gefäßähnlichen Struktur zu erreichen. Zur Durchführung der Versuche erwiesen sich im Rahmen von Vorversuchen identifizierte Kollagen-beschichtete Microcarrier (Collagen-coated Microcarrier, SoloHill^® Engineering) für BUVEC als besonders geeignet.

3.1.10.4.1 Microcarrier-Präparation und Besiedelung der Microcarrier

Die Präparation und Besiedelung der Microcarrier erfolgte in Anlehnung an das Protokoll „small-scale mircocarrier screening studies using six-well plates and snap top tubes“ der Firma Pall Life Sciences (PALL^® 2015) mit Änderungen.

In einem ersten Schritt wurde eine Microcarrier-Stocklösung hergestellt, für die mit einer Feinwaage 500mg Microcarrier abgewogen und in 20ml autoklaviertem, vollentsalztem H20 (VE H2O) gelöst wurden (Konzentration der Stocklösung: 25mg Microcarrier/ ml). Anschließend erfolgte eine Autoklavierung der Stocklösung. Die Besiedelung der Microcarrier durch BUVEC erfolgte auf einer 12-Well-Platte, die vorab mit Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)-Lösung beschichtet wurde, so dass die Endothelzellen nicht auf der Wachstumsfläche des Wells, sondern nur auf den Microcarriern anheften konnten. Endothelzellen wurden passagiert und deren Zellgehalt wurde bestimmt. Um anschließend die Zellzahl zur Besiedelung der Microcarrier zu bestimmen, kam folgende Formel zur Anwendung:

6 =6 7 7 8 7

VZ Volumen der einzusetzenden Zellsuspension (ml)

VWell Flüssigkeitsvolumen des Wells (1,3ml pro Well der 12-Well Platte)

CMC Konzentration der Microcarrier (cm²/ ml, für die Kollagen-beschichteten Microcarrier 5cm²/ ml)

DZellen Zelldichte je cm² Microcarrierfläche (für BUVEC 60.000 Zellen/ cm²) CZellen Zellgehalt der Zellsuspension (Zellen/ ml)

In jedes beschichtete Well wurden 360µl Microcarrier Stocklösung pipettiert (9mg Microcarrier pro Well). Nach der Sedimentation der Microcarrier am Boden des Wells wurde unter zu Hilfenahme einer Pipette das VE H20 abpipettiert und durch eine definierte Menge Endothelzellvollmedium ersetzt, die durch die folgende Formel berechnet wurde:

6 = 6 − 6

VMedium Volumen des Endothelzellvollmediums (ml) VZ Volumen der einzusetzenden Zellsuspension (ml)

VWell Flüssigkeitsvolumen des Wells (1,3 ml pro Well der 12-Well Platte)

Durch leichtes Schwenken der Well Platte wurde eine Durchmischung der Microcarrier mit dem Medium erreicht. Im nächsten Schritt erfolgte eine 20-minütige Inkubationszeit (37°C, 5% CO2), in der sich die Microcarrier im Endothelzellmedium akklimatisierten und es zur Anpassung des pH Wertes kam.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das berechnete Volumen der Zellsuspension den Wells hinzugefügt. Um die Endothelzellen mit den Microcarriern zusammen zu bringen, wurde die Wellplatte dann für 10 bis 15 Sekunden leicht geschwenkt. Nachfolgend wurde die Wellplatte in den Inkubator (37°C, 5% CO2) verbracht, wobei in der ersten Stunde nach der Aussaat der Endothelzellen alle 15 Minuten für 10 bis 15 Sekunden ein leichtes Schwenken der Wellplatte erfolgte, um die Anheftungsrate der BUVEC auf die Microcarrier zu verbessern. Für weitere 3 Stunden wurde die Wellplatte stündlich für 10 bis 15 Sekunden geschwenkt.

Nach Ablauf von 24 Stunden erfolgte der erste Mediumwechsel, für den die Wellplatte leicht schräg gehalten und in dieser Position arretiert wurde, bis die Sedimentation der Microcarrier erfolgte. Mit der Pipette wurde dann das Medium abgenommen, ohne dabei Microcarrier zu aspirieren. Im Weiteren erfolgte alle zwei Tage ein Mediumwechsel nach dem beschriebenen Verfahren, bis die Microcarrier nach Ablauf von circa 7 Tagen vollständig mit Endothelzellen bewachsen waren. Dies wurde während dieser Zeit täglich unter dem Lichtmikroskop überprüft.

3.1.10.4.2 Durchführung des Microcarrier-basierten Sprouting Assay

Sobald die Microcarrier vollständig mit Endothelzellen besiedelt waren, erfolgte die Einbettung der Microcarrier in die drei-dimensionale Matrix, welche gemäß dem unter Kapitel 3.1.10.1 beschriebenen Verfahren in 48-Well-Platten eingebracht wurden. Für den Microcarrier-basierten Sprouting Assay wurde bei der Herstellung der Gele serumreduziertes Medium verwendet. Die Lösung der einzubettenden Microcarrier erfolgte auch in diesem Medium. Dazu wurde die gewünschte Menge an Microcarrier-Suspension (25µl pro Gel) aus den Wells der mit Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) beschichteten Wellplatte in ein Röhrchen (Volumen 1,5ml) überführt. Nach Sedimentation der Microcarrier erfolgte der Austausch des Endothelzellvollmediums gegen serumreduziertes Medium. Durch Resuspendieren wurden die Microcarrier anschließend in dem serumreduzierten Medium verteilt.

Nach Polymerisation der Deckschicht wurden die auf dem Microcarriern befindlichen BUVEC mit den nachfolgend aufgeführten Medien und Faktoren stimuliert:

1. Endothelzellvollmedium 2. Serumreduziertes Medium 3. FGF2 (50ng/ml)

4. VEGF (30ng/ml) 5. IGF1 (50ng/ml) 6. bPL (200ng/ml)

Auch im Rahmen des Microcarrier-basierten Sprouting Assay kamen Endothelzellvollmedium und serumfreies Medium als Positiv- bzw. Negativkontrolle zum Einsatz. Der Versuch wurde mit den aufgeführten Medien und Faktoren im vierfachen Ansatz durchgeführt, wobei pro Versuchsansatz und Stimulanz zehn zufällig gewählte Microcarrier in die Auswertung eingingen. Die Versuchsdauer betrug vier Tage. An Tag vier nach der Einbettung der Microcarrier in die drei-dimensionale Matrix wurden mit dem Phasenkontrastmikroskop (Axiovert 200M, Firma Zeiss) bei 100facher Vergrößerung Fotoaufnahmen angefertigt (ein Foto pro Microcarrier, 10 Microcarrier pro Behandlung bzw. Well). Detaillierte Angaben zum verwendeten Objektiv sind Kapitel 9.5 zu entnehmen. An Hand der angefertigten Fotoaufnahmen erfolgte anschließend die Auswertung. Dazu fand das Bildbearbeitungssoftware ImageJ (ABRÀMOFF et al. 2004) mit dem Line Selection Tool (Segmented Line) Verwendung. Die Länge aller von den Microcarriern ausgehenden gefäßähnlichen Strukturen wurde gemessen und in Excel übertragen, wo die statistische Beschreibung durch die Bildung von Mittelwerten, Standardabweichung und SEM erfolgte. Alle gefäßähnlichen Strukturen, die die Länge von 50 µm überschritten, flossen in die finale Auswertung ein.

3.1.10.4.3 Immunfluoreszenz

Auch bei den Microcarrier-basierten Sprouting Assays wurde eine Immunfluoreszenz-Färbung mit dem Antikörper BS1-Lektin durchgeführt, um die im Versuchsverlauf entstandenen gefäßähnlichen Strukturen zu charakterisieren.

Wie schon bei den Venous Ring Sprouting Assays, wurde auch hier eine Hoechst-Kernfärbung durchgeführt, um die Zellkerne der im Versuch eingesetzten Endothelzellen anzufärben.

Die Durchführung der Immunfluoreszenzfärbung entspricht den in Kapitel 3.1.10.2.2 gemachten Angaben, wobei die Volumina der verwendeten Reagenzien dem 48-Well Format angepasst und somit halbiert wurden. Ausgewertet wurde das Färbeergebnis mit dem Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 200M, Firma Zeiss) bei 100- bis 200-facher Vergrößerung. Angaben zu den dabei verwendeten Objektiven sind Kapitel 9.5 zu entnehmen.

Nach Ablauf eines jeden Versuchsdurchganges erfolgte eine Immunfluoreszenz-Färbung. Alle gefäßähnlichen Strukturen, die mindestens 50µm lang waren und aus mindestens 3 Zellen bestanden, wurden für die Auswertung des Assays berücksichtigt.